CN106480200A - 一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法：步骤1.突变DNA模板制备和引物设计：人工分别合成了含有4个突变位点的TGFBI基因片段，用于检测突变位点的检出效率。同时我们设计了分别针对正常位点和突变位点的特异性扩增引物，以及相对应的反向引物，3个引物组合形成引物预混液；此外，两条正向引物5'端分别连接有不同的检测引物序列，用于荧光检测；步骤2.PCR检测体系的建立；步骤3.结果判读。与现有技术相比，该技术具有检测结果准确可靠、通量较高、实验设计灵活、操作简便快捷、检测速度快、易于推广，而且成本低廉。

Description

一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测 方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体为通过定量PCR与等位基因特异性扩增相结合的方法，对角膜营养不良相关的4个突变位点进行检测。

背景技术

角膜营养不良(Corneal dystrophies,CDS)是一种少见的具有遗传性和双眼原发性的病理组织特征改变的疾病。在临床上，该类疾病通常是由于角膜基质中的不溶性物质沉积混浊，进一步导致视力障碍。临床医学研究发现，角膜营养不良的多种病理特征与转化生长因子β诱导的分泌蛋白基因(transforming growth factorβ-induced,TGFBI)相关。目前，在TGFBI基因上已经发现有50多个不同的突变位点与多种类型的角膜营养不良相关，包括I型颗粒状角膜营养不良(granular cornea dystrophy type I,GCD1)、II型颗粒状角膜营养不良(granular cornea dystrophy type II,GCD2)、I型晶格类型角膜营养不良(lattice corneal dystrophy type I,LCD1)、异型晶格类型角膜营养不良(variantLCD)、Thiel-Behnke角膜营养不良、Reis-Buckler角膜营养不良和上皮基底膜角膜营养不良(epithelial basement membrane corneal dystrophy)。

在目前发现的TGFBI基因突变中，存在有4个热点突变位点与II型颗粒状角膜营养不良相关，分别为371G>A(p.Arg124His)、1526T>C(p.Leu509Arg)、1649T>C(p.Leu550Pro)和1856T>A(p.Met619Lys)。携带有任何4个突变位点之一的个体易患II型颗粒状角膜营养不良疾病，发病年龄多在成年之后。但是，在角膜受到创伤的情况下，如用于治疗近视的角膜屈光手术或其他外力冲撞，可导致疾病发生或者疾病发生时间提前，时间从几年到十几年时间不等。因此，对于TGFBI基因突变位点携带者，或者有角膜营养不良家族史的个体，需要对上述TGFBI基因的4个热点突变位点进行筛查，以做到早期预防。对于需要通过角膜屈光手术进行视力矫正的个体，尤其需要对上述位点进行检测，从而做到预防或延缓相应疾病的发生。

目前，对于基因突变位点的检测，存在有多种方法，比如PCR-直接测序法、质谱法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交(ISH)等等。每种方法都存在有各自的优缺点，比如PCR-直接测序法通量低、速度慢、灵敏度不高(尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果)；质谱法虽然具有很高的通量，但实验不够灵活，需要特殊试剂和仪器有特殊要求，不易普及；PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-限制性片段长度多态性和原位杂交(ISH)方法都需要对PCR产物进行进一步处理，效率不高，操作相对繁琐，而且容易出现假阳性或者假阴性结果；实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高；等位基因特异性PCR法可用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测，缺点是假阳性率较高。

本发明旨在采用实时荧光定量PCR与等位基因特异性扩增结合的方法来检测TGFBI基因的4个热点突变位点。该方法与其他常见的基因分型方法相比，兼具有实时荧光定量PCR和等位基因特异性扩增PCR共有的有点，即灵敏度高、通量高、结果准确、操作简便快捷、成本低廉等优点。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明针对现有技术的缺点，采用实时荧光定量PCR与等位基因特异性扩增结合的方法来检测TGFBI基因的4个热点突变位点。该方法与其他常见的基因分型方法相比，兼具有实时荧光定量PCR和等位基因特异性扩增PCR共有的有点，即灵敏度高、通量高、结果准确、操作简便快捷、成本低廉等优点。

本发明的技术方案如下：

一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法，其步骤如下：

步骤1.突变DNA模板制备和引物设计：

人工分别合成了含有4个突变位点的TGFBI基因片段，用于检测突变位点的检出效率。同时我们设计了分别针对正常位点和突变位点的特异性扩增引物(两个引物仅末端碱基不同，分别用F1和F2表示)，以及相对应的反向引物(R表示)，3个引物组合形成引物预混液；

此外，两条正向引物5'端分别连接有不同的检测引物序列，用于荧光检测。

具体4个位点的引物序列如下：

TGFBI-371G-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTCAGCTGTACACGGACCG-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACTCAGCTGTACACGGACCA-3′

R:5′-CCCCTCCATCTCAGGCCTCA-3′

TGFBI-1526T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCA-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCG-3′

R:5′-CAATGGGGACTGTCATGGATGTC-3′

TGFBI-1649T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCC-3′

R:5′-GTCTGCTCCGTTCTCTTGGTGG-3′

TGFBI-1856T-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAA-3′

R:5′-GTGATGACATGGACCACGCCATTTG-3′；

步骤2.PCR检测体系的建立：

PCR扩增体系包含有商业购买的2x Mix(包含Taq酶、4种dNTPs、与正向引物的检测引物序列相对应的两个探针)。PCR体系如下：

PCR扩增体系(10μL)：

PCR扩增程序如下:

荧光值读取：

在低于40℃的环境下，读取荧光值。

结果判读：

如果个体只含有正常的基因位点，仅有正常位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为蓝色，即荧光值读取时仅可以读取到蓝色荧光，表明该个体为正常位点纯合；如果个体只含有突变的基因位点，仅有突变位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为红色，即荧光值读取时仅可以读取到红色荧光，表明该个体为突变位点纯合；如果个体同时含有正常和突变的基因位点，正常位点和突变位点的特异性引物都能够得到扩增，结果可以同时读取到两种荧光，表明个体为杂合子。

本发明的有益之处在于：

本发明采用实时荧光定量PCR与等位基因特异性扩增结合的方法来检测TGFBI基因的4个热点突变位点。该方法与其他常见的基因分型方法相比，兼具有实时荧光定量PCR和等位基因特异性扩增PCR共有的有点，即灵敏度高、通量高、结果准确、操作简便快捷、成本低廉等优点。

附图说明

图1为突变位点检测结果示意图。

具体实施方式

实施例1突变DNA模板制备和引物设计：

为了在实验室内部模拟真实病例情况，我们人工分别合成了含有4个突变位点的TGFBI基因片段，用于检测突变位点的检出效率。同时我们设计了分别针对正常位点和突变位点的特异性扩增引物(两个引物仅末端碱基不同，分别用F1和F2表示)，以及相对应的反向引物(R表示)，3个引物组合形成引物预混液。此外，两条正向引物5'端分别连接有不同的检测引物序列，用于荧光检测。

具体4个位点的引物序列如下：

TGFBI-371G-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTCAGCTGTACACGGACCG-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACTCAGCTGTACACGGACCA-3′

R:5′-CCCCTCCATCTCAGGCCTCA-3′

TGFBI-1526T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCA-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCG-3′

R:5′-CAATGGGGACTGTCATGGATGTC-3′

TGFBI-1649T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCC-3′

R:5′-GTCTGCTCCGTTCTCTTGGTGG-3′

TGFBI-1856T-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAA-3′

R:5′-GTGATGACATGGACCACGCCATTTG-3′

实施例2PCR检测体系的建立：

PCR扩增体系包含有商业购买的2x Mix(包含Taq酶、4种dNTPs、与正向引物的检测引物序列相对应的两个探针)。PCR体系如下：

PCR扩增体系(10μL)：

PCR扩增程序如下:

荧光值读取：

在低于40℃的环境下，读取荧光值。

结果判读：

如果个体只含有正常的基因位点，仅有正常位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为蓝色，即荧光值读取时仅可以读取到蓝色荧光，表明该个体为正常位点纯合；如果个体只含有突变的基因位点，仅有突变位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为红色，即荧光值读取时仅可以读取到红色荧光，表明该个体为突变位点纯合；如果个体同时含有正常和突变的基因位点，正常位点和突变位点的特异性引物都能够得到扩增，结果可以同时读取到两种荧光，表明个体为杂合子。具体如如附图1所示。

实施例3临床样本收集和验证：

共收集80分临床样本，对该检测方法的准确性进了分析。首先通过上述方法，对80个临床样品进了突变位点检测，检测结果如表1所示。进一步对发现的突变位点进行测序验证，结果显示测序结果与定量PCR检测检测的结果完全一致。说明该方法在检测的80个临床样品中能够达到100％的准确性，可以用于临床基因检测。

表1.80个样品的检测结果。

可见，与现有技术相比，该技术具有检测结果准确可靠、通量较高、实验设计灵活、操作简便快捷、检测速度快、易于推广，而且成本低廉。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法，其步骤如下：

步骤1.突变DNA模板制备和引物设计：

人工分别合成了含有4个突变位点的TGFBI基因片段，用于检测突变位点的检出效率。同时我们设计了分别针对正常位点和突变位点的特异性扩增引物(两个引物仅末端碱基不同，分别用F1和F2表示)，以及相对应的反向引物(R表示)，3个引物组合形成引物预混液；

此外，两条正向引物5'端分别连接有不同的检测引物序列，用于荧光检测；

步骤2.PCR检测体系的建立；

步骤3.结果判读。

2.如权利要求1所述的一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：

具体4个位点的引物序列如下：

TGFBI-371G-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTCAGCTGTACACGGACCG-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACTCAGCTGTACACGGACCA-3′

R:5′-CCCCTCCATCTCAGGCCTCA-3′

TGFBI-1526T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCA-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCTAAAGCGATTGTCTCCCTTCG-3′

R:5′-CAATGGGGACTGTCATGGATGTC-3′

TGFBI-1649T-C

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAATGAAGCCTTCCGAGCCCC-3′

R:5′-GTCTGCTCCGTTCTCTTGGTGG-3′

TGFBI-1856T-A

F1:5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAT-3′

F2:5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTGTTGCCGAGCCTGACATCAA-3′

R:5′-GTGATGACATGGACCACGCCATTTG-3′。

3.如权利要求2所述的一种快速高效的与角膜营养不良相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：

所述结果判读为：

如果个体只含有正常的基因位点，仅有正常位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为蓝色，即荧光值读取时仅可以读取到蓝色荧光，表明该个体为正常位点纯合；如果个体只含有突变的基因位点，仅有突变位点的特异性引物能够扩增，相应的荧光信号为红色，即荧光值读取时仅可以读取到红色荧光，表明该个体为突变位点纯合；如果个体同时含有正常和突变的基因位点，正常位点和突变位点的特异性引物都能够得到扩增，结果可以同时读取到两种荧光，表明个体为杂合子。