CN113736871A - Snp标志物、snp位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒 - Google Patents

Snp标志物、snp位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了SNP标志物、SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒，具体提供了40个SNP位点在评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，获得GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，无需任何侵入式的检测，准确性和灵敏度高，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。

Description

SNP标志物、SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及SNP标志物、SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒。
背景技术
目前实体器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行肝功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
发明内容
有鉴于此，本申请提供公开了SNP标志物、SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒，通过对移植后尿液中受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，结合特定的计算方法，最终获得GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，无需任何侵入式的检测，准确性和灵敏度高，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的SNP标记物，所述SNP标记物为SNP位点rs2293840、rs2293841、 rs2293843、rs163792、rs1569959、rs2250911、rs1903858、rs2293871、rs2293877、 rs817363、rs2293890、rs2293990、rs704326、rs2249102、rs2294047、rs2295499、 rs2294111、rs208244、rs572496、rs2294822、rs2295167、rs2295166、rs2295164、 rs1321666、rs2295632、rs2295147、rs2974、rs1547093、rs2295072、rs1322775、 rs2255090、rs2294992、rs1022811、rs786906、rs1738051、rs2294897、rs2294895、 rs2294886、rs2294871和rs926587的组合。
本发明还提供了SNP位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：rs2293840、rs2293841、rs2293843、rs163792、 rs1569959、rs2250911、rs1903858、rs2293871、rs2293877、rs817363、rs2293890、 rs2293990、rs704326、rs2249102、rs2294047、rs2295499、rs2294111、rs208244、 rs572496、rs2294822、rs2295167、rs2295166、rs2295164、rs1321666、rs2295632、 rs2295147、rs2974、rs1547093、rs2295072、rs1322775、rs2255090、rs2294992、 rs1022811、rs786906、rs1738051、rs2294897、rs2294895、rs2294886、rs2294871和 rs926587。
优选的，所述产品通过检测待测样品尿液中的受体游离DNA中供体游离DNA 含量来评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
优选的，所述产品通过检测受体游离DNA中供体游离DNA含量来评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险为评估肝脏移植物相对健康，排斥风险低；或
肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
优选的，所述产品通过检测待测样品尿液中的受体游离DNA中供体游离DNA 含量，计算GcfDNA供受比来评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险，GcfDNA供受比≤2.5％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；GcfDNA供受比＞2.5％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
本发明将上述40个SNP位点作为检测靶点，计算得到的受体游离DNA中供体游离DNA的含量(GcfDNA供受比)能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本发明还提供了一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针，
所述引物为：
用于检测rs2293840的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs2293841的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs2293843的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs163792的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs1569959的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs2250911的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs1903858的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs2293871的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs2293877的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs817363的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs2293890的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs2293990的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs704326的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs2249102的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs2294047的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs2295499的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs2294111的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs208244的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs572496的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
用于检测rs2294822的引物，其序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
用于检测rs2295167的引物，其序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
用于检测rs2295166的引物，其序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
用于检测rs2295164的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs1321666的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
用于检测rs2295632的引物，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs2295147的引物，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs2974的引物，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
用于检测rs1547093的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs2295072的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs1322775的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs2255090的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs2294992的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
用于检测rs1022811的引物，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs786906的引物，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
用于检测rs1738051的引物，其序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
用于检测rs2294897的引物，其序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
用于检测rs2294895的引物，其序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
用于检测rs2294886的引物，其序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
用于检测rs2294871的引物，其序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
用于检测rs926587的引物，其序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
所述探针为：
用于检测rs2293840的探针，其序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
用于检测rs2293841的探针，其序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
用于检测rs2293843的探针，其序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
用于检测rs163792的探针，其序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
用于检测rs1569959的探针，其序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
用于检测rs2250911的探针，其序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
用于检测rs1903858的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs2293871的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
用于检测rs2293877的探针，其序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；
用于检测rs817363的探针，其序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；
用于检测rs2293890的探针，其序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；
用于检测rs2293990的探针，其序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；
用于检测rs704326的探针，其序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；
用于检测rs2249102的探针，其序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；
用于检测rs2294047的探针，其序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；
用于检测rs2295499的探针，其序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；
用于检测rs2294111的探针，其序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；
用于检测rs208244的探针，其序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；
用于检测rs572496的探针，其序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；
用于检测rs2294822的探针，其序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；
用于检测rs2295167的探针，其序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；
用于检测rs2295166的探针，其序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；
用于检测rs2295164的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs1321666的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；
用于检测rs2295632的探针，其序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；
用于检测rs2295147的探针，其序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；
用于检测rs2974的探针，其序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；
用于检测rs1547093的探针，其序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；
用于检测rs2295072的探针，其序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；
用于检测rs1322775的探针，其序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；
用于检测rs2255090的探针，其序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；
用于检测rs2294992的探针，其序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；
用于检测rs1022811的探针，其序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；
用于检测rs786906的探针，其序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：138；
用于检测rs1738051的探针，其序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；
用于检测rs2294897的探针，其序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；
用于检测rs2294895的探针，其序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；
用于检测rs2294886的探针，其序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；
用于检测rs2294871的探针，其序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；
用于检测rs926587的探针，其序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160。
本发明还提供了所述引物和探针在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，包括上述序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针。
优选的，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
优选的，所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
优选的，所述试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括：ddPCRTMProbeSupermix和超纯水。
本发明还提供了一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，包括如下步骤：步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～80 所示的引物和序列SEQ ID No.81～160所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA 的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在 SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
优选的，所述待测样品为尿液。
优选的，所述数字PCR反应的反应体系为：
Figure RE-GDA0002637704330000071
Figure RE-GDA0002637704330000081
优选的，所述数字PCR反应的反应程序为：95℃、10min预变性；95℃、15s， 57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明提供了SNP位点在评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，结合数字PCR技术以及特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA 供受比，根据GcfDNA供受比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
(1)无创，采用尿液作为生物样品，尿液收集低廉、快速且非侵入性，尿液收集便捷可以实现频繁监测，相对于采用血液作为生物样品，监测效果更好。
(2)灵敏，采用本发明引物、探针、试剂盒，检测灵敏度高；且选择现有PCR 技术中精准度最高的数字PCR设备作为检测平台；
(3)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
(4)特异，用本发明引物、探针、试剂盒，检测特异性高，可特异性的反映出肝脏移植物的健康状况；
(5)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、DSA检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者尿液样本即可完成。
附图说明
图1为本发明SNP标记物的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的SNP标记物，所述SNP标记物为SNP位点rs2293840、rs2293841、rs2293843、rs163792、rs1569959、rs2250911、 rs1903858、rs2293871、rs2293877、rs817363、rs2293890、rs2293990、rs704326、 rs2249102、rs2294047、rs2295499、rs2294111、rs208244、rs572496、rs2294822、 rs2295167、rs2295166、rs2295164、rs1321666、rs2295632、rs2295147、rs2974、 rs1547093、rs2295072、rs1322775、rs2255090、rs2294992、rs1022811、rs786906、 rs1738051、rs2294897、rs2294895、rs2294886、rs2294871和rs926587的组合。
一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，包括表1中序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针，ddPCRTMProbeSupermix和超纯水；
所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
表1
Figure RE-GDA0002637704330000091
Figure RE-GDA0002637704330000101
Figure RE-GDA0002637704330000111
Figure RE-GDA0002637704330000121
Figure RE-GDA0002637704330000131
Figure RE-GDA0002637704330000141
Figure RE-GDA0002637704330000151
Figure RE-GDA0002637704330000161
Figure RE-GDA0002637704330000171
Figure RE-GDA0002637704330000181
Figure RE-GDA0002637704330000191
实施例2
采用本发明提供的试剂盒评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险
1、尿液中总游离DNA提取
采集一名肝移植术后8周受者尿液10ml，将尿液按3000rpm离心5min。
取4ml离心后尿液上清液，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating NucleicAcidKit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10～30ng/ul。
2、制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应
2.1、配置数字PCR反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行PCR反应；40 个SNP位点的检测体系，共计40管，反应配制如下：
表2
Figure RE-GDA0002637704330000192
其中，用于检测SNP位点的引物包含上、下游引物，各0.125μL，共0.25μL；探针为两条，各0.125μL，共0.25μl；表2中本发明引物和探针如表1所示。
2.2、将配置好的反应体系加入到微滴发生卡DG8TM Cartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油Droplet Generation Oil for Probes，最后用封膜DG8TM Gaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备。
2.3、将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行PCR反应，反应程序设置如下：
表3
Figure RE-GDA0002637704330000201
3、反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比
3.1PCR反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果，见表4。
表4 40个SNP位点的原始数据
Figure RE-GDA0002637704330000202
Figure RE-GDA0002637704330000211
Figure RE-GDA0002637704330000221
3.2按照以下方法对表4的数据进行分析：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNP No#1和SNP No#2为例，SNP No#1的碱基比约等于SNP No#2 的两倍(2±0.4)，则判定SNP No#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，采用碱基低含量 /总含量，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
评价标准：GcfDNA供受比≤2.5％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；GcfDNA供受比＞2.5％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
根据表4的数据计算得到GcfDNA供受比(供者游离DNA/受者游离DNA)为 6.8％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
实施例3
纳入100例诊断出移植排斥的肝移植受者，以及100例诊断为移植物正常的肝移植受者，按照实施例2收集他们的尿液，提取尿液中总游离DNA，制备数字PCR 反应微滴，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，计算GcfDNA 供受比，设定2.5％为参考值区分移植排斥(GcfDNA供受比＞2.5％)和移植物正常组(GcfDNA供受比≤2.5％)病人。
使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图1)，AUC＝0.88，灵敏度＝82.86％，特异度＝72.41％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反映肝脏移植物的健康状况，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> SNP标志物、SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒
<160> 160
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaaccagtg atttctagaa tgtaagtggt gtcctacttg 40
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttagtctctg gtttaataat gttaatcatt attctgg 37
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcaggctca ttttattaac attctactgt catcattg 38
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtgtgtgt tgggagttga actagaacct gtattgac 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaatttgtt gatgtaagtt gactataaat taatatgg 38
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggtggtaa gaacaatgta ttaaccccct tctactga 38
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgctcctg cctcagctgc ccgagtacct gggattac 38
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaccagcac ggcatccctg acgagacctg caacaact 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgcccaggg aactggtgag gactgcagga agtattgc 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacatcacac acacactaaa tgcaactgca gggatgtc 38
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagagttct agaacatcta ttcagcaagt gtgtatct 38
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttccaaaat tgttctcagg ctatgaagtg tgtgctta 38
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttactacat catcaatatt gttcctgtat acgccttca 39
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtttttgac ataaagtact ttagttctgt gatgtata 38
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacccactga tggtttgaat tattctaagt tcgccaccg 39
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cactgtgatc atgatatctt cattacccct gcggacca 38
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggagctactg tcttaaacgc aattgtactt tttatcaag 39
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtaatttac tccattgtgt gggctctttt cctttctc 38
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccagacaatt cagatagtcc tcctctcgtg tgctagcat 39
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acttgtccgc ggcctccggg ttgtcggggt tcttgtcg 38
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acaatggcgt cctcttcata ggtgtggcca cacacttta 39
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggccaagtga cagtactgcc actggattcc ctgcattt 38
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcccagccat cttcttaagc cttcctggtg gagcatggc 39
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caacaggtga tctggtcatt ctaggctcca cattcttg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agggctaagg caggacacct ccagggcaac tggctaaac 39
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaatggtttc aaaggcagga tgcaggttga aaacatca 38
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctcaaatcgg gtattaagca cctagatatc cttatgct 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgctttttga gacaatagtg aagccattcc taaataatc 39
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctggaagct gaaagtggga aagggacagt gtgtgcca 38
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
catacactga gagtcagtcc tccttaaggt cctcctac 38
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atggcaagca cacagtcacc acggtttcag acacagcc 38
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tataatgacc agtcacatgg ggagtctagg ttctggca 38
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggctgacctg ccccaccctc tcccggccca gcctaagacc 40
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgggcaaagt cggggcacag cagcgtgtgt ttcttcttg 39
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acagctctgg gagagcctct ggccagaagg cccacctt 38
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaataggcta gtactagtac ctccctcatc atgtcat 37
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagtagtgaa actgtacatg tcactgggaa aaagaa 36
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cttgacattt ataggtagta taagatatgt gacttcca 38
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
catatctatc ttgttcactt tctaagaaac acttactctg 40
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctggacttt tgtaatgaca tttatactta acaatttat 39
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gctacaataa catgaaaaga ccacgaatta tggtaatag 39
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctgacgcatg gagaccaaag gacaagccaa agtaagct 38
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
catatgtctt ccagataatg ttgtagttgc actggccttc 40
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ccaaaccaaa agtcttctac cttgtaagtc ttgaccagg 39
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
actcagaaaa ctgcatctgg tacttcttat atgtttcc 38
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgagttttca taagcaatac aaatttagtt ctaacatca 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgaaacagc tgtgagtcta aaatagtaat aaatcttgc 39
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atgtctactc acctcttttg ggtactattt tcatctttc 39
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tgctggggga tacaagcctg cacccctcct gtgggtga 38
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctcacactct ctgcagccca gcctagtcag ggcacagc 38
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gcatttagag cagaggaaat cattatgaca tgctgaggc 39
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tagatacttg tttctggatg gagacagcca ctatgaaat 39
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gagactgaga ttagaaacca ctcacagtgc aaaagtca 38
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgacaagccg tttgagatgg aatgtaggcc ctgatgt 37
<210> 55
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agttgagtgc atagccactg atgagcatac tctccat 37
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aattttatgc aaattgatat caatagagag gagtaatg 38
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aggttgtttg gttgtagcca ggatagatga tggggctgc 39
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaaacagttt gtctccccta tcttttctgg caattct 37
<210> 59
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aagatcagct ggagtatcat atccgcaagc acacaggc 38
<210> 60
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gactgataga taaatgacca tttatcatca tcgttttg 38
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
attacagccc tgtcacatgt gcccagcact ccgccccat 39
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cctataaccc cagcagttaa cttgcaaagc ctcaacctt 39
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aggtgtgggg ccccatcttc ttgtccctca cccgctggg 39
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ctcacccacc tggaagcctc ggacaccagg ggctccggg 39
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
agagaaaaaa tgtctaataa tgcttttaga gggagata 38
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaccccacag agatatcgtg atgatgtgct ttacaaggc 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aatcgcttga atccgggagg cggaggttgc agtgagcc 38
<210> 68
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ctcaagctcc tgtgcctact acagtgccag tggttgatg 39
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gcagcattag ggccaggcca gagctagggc ccaagcatc 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggcagcac ggacaccaca tctttctgtg ttattgct 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gtttgatctg cacctatttt agaatataat ccatttaa 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ttctaatcta cccttaaaag agtttcagga gtaatttg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
caataggctg atgtacacag gaacccacta aatagttcc 39
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gtccctgttc ctattcccct aaccatggta gacattgc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ttgaaacctg gcacacacaa attaggcagc tcattaggc 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctcccctt ctcagtcctc tgacctttgt tctcacaag 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cagataaaag gttagcctgg tttttcatct agctgtgtc 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgaggagtt cgcggaagca ttggcaggcc tggactctc 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
acattgaagg aaatcagctg aagaaaattg agatgaaa 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
agcctgagat tccaaacagt gttggagagg gtggagtg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tttaagtctc acact 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tttcagtctc acact 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccatctaaa ggctt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccttctaaa ggctt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacgaagtt gattt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctatgaagtt gattt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
cctaatggtc aagag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcatggtc aagag 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggcctgtg aaggc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtcctgtg aaggc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaaaacgga atgac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ttagaacgga atgac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
aagctttccc cacta 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
aagttttccc cacta 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
acacgaaaca ttgcc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
acatgaaaca ttgcc 15
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<212> DNA
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ctccacctga caaac 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ctctacctga caaac 15
<210> 99
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gtccctggcc cctgc 15
<210> 100
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gtctctggcc cctgc 15
<210> 101
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tagctgtttc gtcct 15
<210> 102
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
taggtgtttc gtcct 15
<210> 103
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ctgaaagagt aacat 15
<210> 104
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
ctgtaagagt aacat 15
<210> 105
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cggcggggtc catac 15
<210> 106
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cggtggggtc catac 15
<210> 107
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tatccctttt ctcct 15
<210> 108
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tatgcctttt ctcct 15
<210> 109
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ggccgcctct ccagt 15
<210> 110
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
ggctgcctct ccagt 15
<210> 111
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
aacagaagaa atcat 15
<210> 112
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
aacggaagaa atcat 15
<210> 113
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
tgtaggtggg tgagg 15
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tgtgggtggg tgagg 15
<210> 115
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ctgcgcttct cctcc 15
<210> 116
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ctgtgcttct cctcc 15
<210> 117
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
cttcggcaga acacc 15
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ctttggcaga acacc 15
<210> 119
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
tcacaccaac ttatc 15
<210> 120
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tcataccaac ttatc 15
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
aagacttaca aggta 15
<210> 122
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
aagtcttaca aggta 15
<210> 123
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
taggtaaaaa gatcg 15
<210> 124
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tagttaaaaa gatcg 15
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gtccaaggaa atttt 15
<210> 126
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gtctaaggaa atttt 15
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
aaacctagat tatcc 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
aaatctagat tatcc 15
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
caaaccccac cctca 15
<210> 130
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
caacccccac cctca 15
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
cgcaaaagag gaaag 15
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
cgcgaaagag gaaag 15
<210> 133
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
cctctcatcc atacc 15
<210> 134
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
cctttcatcc atacc 15
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
aagaagcaag catta 15
<210> 136
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
aagcagcaag catta 15
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
gtgcaagtgg taaag 15
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
gtgtaagtgg taaag 15
<210> 139
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
cctatgagcc ataag 15
<210> 140
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
cctttgagcc ataag 15
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
aggaaagctg ttgtc 15
<210> 142
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
agggaagctg ttgtc 15
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
actgccctgg gaggt 15
<210> 144
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
acttccctgg gaggt 15
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
caaatacagg gatat 15
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
caagtacagg gatat 15
<210> 147
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
atcacttata gaaga 15
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
atcgcttata gaaga 15
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
tgcatgccca ggccg 15
<210> 150
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
tgcgtgccca ggccg 15
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gacaaaaaat attga 15
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
gacgaaaaat attga 15
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
agcacaaaag tttcc 15
<210> 154
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
agcgcaaaag tttcc 15
<210> 155
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ggcaaggttc acagc 15
<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
ggcgaggttc acagc 15
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tttgttcaaa agaga 15
<210> 158
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
ttttttcaaa agaga 15
<210> 159
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
gacaggtgtg caagt 15
<210> 160
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gactggtgtg caagt 15

Claims (10)

1.一种评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的SNP标记物，其特征在于，所述SNP标记物为SNP位点rs2293840、rs2293841、rs2293843、rs163792、rs1569959、rs2250911、rs1903858、rs2293871、rs2293877、rs817363、rs2293890、rs2293990、rs704326、rs2249102、rs2294047、rs2295499、rs2294111、rs208244、rs572496、rs2294822、rs2295167、rs2295166、rs2295164、rs1321666、rs2295632、rs2295147、rs2974、rs1547093、rs2295072、rs1322775、rs2255090、rs2294992、rs1022811、rs786906、rs1738051、rs2294897、rs2294895、rs2294886、rs2294871和rs926587的组合。
2.SNP位点在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：rs2293840、rs2293841、rs2293843、rs163792、rs1569959、rs2250911、rs1903858、rs2293871、rs2293877、rs817363、rs2293890、rs2293990、rs704326、rs2249102、rs2294047、rs2295499、rs2294111、rs208244、rs572496、rs2294822、rs2295167、rs2295166、rs2295164、rs1321666、rs2295632、rs2295147、rs2974、rs1547093、rs2295072、rs1322775、rs2255090、rs2294992、rs1022811、rs786906、rs1738051、rs2294897、rs2294895、rs2294886、rs2294871和rs926587。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述产品通过检测待测样品尿液中的受体游离DNA中供体游离DNA含量来评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述产品通过检测待测样品尿液中的受体游离DNA中供体游离DNA含量，计算GcfDNA供受比来评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险，GcfDNA供受比≤2.5％，表示受者肝脏移植物相对健康，排斥风险低；GcfDNA供受比＞2.5％，表示受者肝脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
5.一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针，其特征在于，
所述引物为：
用于检测rs2293840的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs2293841的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs2293843的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs163792的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs1569959的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs2250911的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs1903858的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs2293871的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs2293877的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs817363的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs2293890的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs2293990的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs704326的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs2249102的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs2294047的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs2295499的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs2294111的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs208244的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs572496的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
用于检测rs2294822的引物，其序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
用于检测rs2295167的引物，其序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
用于检测rs2295166的引物，其序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
用于检测rs2295164的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs1321666的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
用于检测rs2295632的引物，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs2295147的引物，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs2974的引物，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
用于检测rs1547093的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs2295072的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs1322775的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs2255090的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs2294992的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
用于检测rs1022811的引物，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs786906的引物，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
用于检测rs1738051的引物，其序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
用于检测rs2294897的引物，其序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
用于检测rs2294895的引物，其序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
用于检测rs2294886的引物，其序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
用于检测rs2294871的引物，其序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
用于检测rs926587的引物，其序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
所述探针为：
用于检测rs2293840的探针，其序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
用于检测rs2293841的探针，其序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
用于检测rs2293843的探针，其序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
用于检测rs163792的探针，其序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
用于检测rs1569959的探针，其序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
用于检测rs2250911的探针，其序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
用于检测rs1903858的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs2293871的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
用于检测rs2293877的探针，其序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；
用于检测rs817363的探针，其序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；
用于检测rs2293890的探针，其序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；
用于检测rs2293990的探针，其序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；
用于检测rs704326的探针，其序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；
用于检测rs2249102的探针，其序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；
用于检测rs2294047的探针，其序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；
用于检测rs2295499的探针，其序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；
用于检测rs2294111的探针，其序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；
用于检测rs208244的探针，其序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；
用于检测rs572496的探针，其序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；
用于检测rs2294822的探针，其序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；
用于检测rs2295167的探针，其序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；
用于检测rs2295166的探针，其序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；
用于检测rs2295164的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs1321666的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；
用于检测rs2295632的探针，其序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；
用于检测rs2295147的探针，其序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；
用于检测rs2974的探针，其序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；
用于检测rs1547093的探针，其序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；
用于检测rs2295072的探针，其序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；
用于检测rs1322775的探针，其序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；
用于检测rs2255090的探针，其序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；
用于检测rs2294992的探针，其序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；
用于检测rs1022811的探针，其序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；
用于检测rs786906的探针，其序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：138；
用于检测rs1738051的探针，其序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；
用于检测rs2294897的探针，其序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；
用于检测rs2294895的探针，其序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；
用于检测rs2294886的探针，其序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；
用于检测rs2294871的探针，其序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；
用于检测rs926587的探针，其序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160。
6.权利要求5所述引物和探针在制备评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用。
7.一种用于评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
10.一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～80所示的引物和序列SEQ IDNo.81～160所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317723A (zh) * 2022-01-25 2022-04-12 成都仕康美生物科技有限公司 用于评估实体器官移植状况的snp标志物、引物、试剂盒及其使用方法
CN114381511A (zh) * 2021-12-31 2022-04-22 上海药明奥测医疗科技有限公司 一种评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009117346A2 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 Lovelace Respiratory Research Institute System and method for determining the health of a subject using polymorphic risk markers
CN101880715A (zh) * 2010-06-22 2010-11-10 复旦大学附属中山医院 一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒
CN107058562A (zh) * 2017-05-17 2017-08-18 成都仕康美生物科技有限公司 Snp位点的应用及其检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009117346A2 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 Lovelace Respiratory Research Institute System and method for determining the health of a subject using polymorphic risk markers
CN101880715A (zh) * 2010-06-22 2010-11-10 复旦大学附属中山医院 一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒
CN107058562A (zh) * 2017-05-17 2017-08-18 成都仕康美生物科技有限公司 Snp位点的应用及其检测试剂盒

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114381511A (zh) * 2021-12-31 2022-04-22 上海药明奥测医疗科技有限公司 一种评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险的检测方法
CN114317723A (zh) * 2022-01-25 2022-04-12 成都仕康美生物科技有限公司 用于评估实体器官移植状况的snp标志物、引物、试剂盒及其使用方法

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