CN110283898B - Snp位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒，具体提供了40个SNP位点在评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，结合特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，无需任何侵入式的检测，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒。
背景技术
目前实体器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行肾功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
发明内容
有鉴于此，本申请提供SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒，通过对移植后受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确的评估肾移植物的损伤状况和排斥风险，无需进行任何创伤检测。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是SNP位点在制备评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：rs1109341、rs2073623、rs1800880、rs2073702、rs1060376、rs2073804、rs429269、rs215165、rs687621、rs687289、rs392121、rs2073859、rs2073866、rs739442、rs2073874、rs2073900、rs2073973、rs2074000、rs178526、rs2074052、rs2074081、rs41170、rs2074122、rs208563、rs2074152、rs179785、rs28958、rs2074247、rs2074276、rs1799854、rs1264570、rs184949、rs223865、rs1527210、rs2066944、rs2074887、rs1049534、rs977624、rs207699、rs454532。
本发明研究表明，将上述40个SNP位点作为检测靶点，计算得到的受体游离DNA中供体游离DNA的含量(GcfDNA供受比)能够准确反映出移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本发明还提供了一种用于评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的引物及探针，所述引物为：
所述引物为：
用于检测rs1109341的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs2073623的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs1800880的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs2073702的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs1060376的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs2073804的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs429269的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs215165的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs687621的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs687289的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs392121的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs2073859的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs2073866的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs739442的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs2073874的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs2073900的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs2073973的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs2074000的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs178526的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
用于检测rs2074052的引物，其序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
用于检测rs2074081的引物，其序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
用于检测rs41170的引物，其序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
用于检测rs2074122的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs208563的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
用于检测rs2074152的引物，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs179785的引物，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs28958的引物，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
用于检测rs2074247的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs2074276的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs1799854的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs1264570的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs184949的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
用于检测rs223865的引物，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs1527210的引物，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
用于检测rs2066944的引物，其序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
用于检测rs2074887的引物，其序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
用于检测rs1049534的引物，其序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
用于检测rs977624的引物，其序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
用于检测rs207699的引物，其序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
用于检测rs454532的引物，其序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
所述探针为：
用于检测rs1109341的探针，其序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
用于检测rs2073623的探针，其序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
用于检测rs1800880的探针，其序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
用于检测rs2073702的探针，其序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
用于检测rs1060376的探针，其序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
用于检测rs2073804的探针，其序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
用于检测rs429269的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs215165的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
用于检测rs687621的探针，其序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；
用于检测rs687289的探针，其序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；
用于检测rs392121的探针，其序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；
用于检测rs2073859的探针，其序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；
用于检测rs2073866的探针，其序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；
用于检测rs739442的探针，其序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；
用于检测rs2073874的探针，其序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；
用于检测rs2073900的探针，其序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；
用于检测rs2073973的探针，其序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；
用于检测rs2074000的探针，其序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；
用于检测rs178526的探针，其序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；
用于检测rs2074052的探针，其序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；
用于检测rs2074081的探针，其序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；
用于检测rs41170的探针，其序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；
用于检测rs2074122的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs208563的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；
用于检测rs2074152的探针，其序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；
用于检测rs179785的探针，其序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；
用于检测rs28958的探针，其序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；
用于检测rs2074247的探针，其序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；
用于检测rs2074276的探针，其序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；
用于检测rs1799854的探针，其序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；
用于检测rs1264570的探针，其序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；
用于检测rs184949的探针，其序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；
用于检测rs223865的探针，其序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；
用于检测rs1527210的探针，其序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：138；
用于检测rs2066944的探针，其序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；
用于检测rs2074887的探针，其序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；
用于检测rs1049534的探针，其序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；
用于检测rs977624的探针，其序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；
用于检测rs207699的探针，其序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；
用于检测rs454532的探针，其序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160。
本发明还提供了一种用于评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，包括上述序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针。
优选的，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
优选的，SEQ ID No.81～160所示的探针中，用于检测SNP位点的探针对的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记NFQ和MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用的种类即可。在本发明提供的具体实施例中，检测SNP位点的两条探针的5’端分别标记FAM荧光基团和VIC荧光基团。
优选的，所述试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括：ddPCR TM ProbeSupermix和超纯水。
本发明还提供了一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～80所示的引物和序列SEQ ID No.81～160所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
优选的，所述检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～80所示的引物和序列SEQ ID No.81～160所示的探针，制备数字PCR反应微滴，将制备好的反应微滴转移至96孔板中，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果并独立分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
优选的，所述待测样品为移植受者血浆。
优选的，所述数字PCR反应的反应体系为：
| 成分 | 体积 |
| ddPCR<sup>TM</sup>Probe Supermix | 10μl |
| 所述引物+所述探针 | 各0.25μl，共0.5μl |
| 所述总游离DNA | 2μl |
| 超纯水 | 7.5μl |
| 共计 | 20μl |
优选的，所述数字PCR反应的反应程序为：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
本发明提供了SNP位点在评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的40个特定SNP位点进行检测，结合数字PCR技术以及特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
(1)无创，5～10ml静脉采血即可进行检测；
(2)灵敏，选择现有PCR技术中精准度最高的数字PCR设备作为检测平台；
(3)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
(4)特异，检测出的特定游离DNA直接来源于肾脏移植物，可特异性的反映出肾脏移植物的健康状况；
(5)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、DSA检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者血液样本即可完成。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供的SNP位点的应用及其检测试剂盒中所用试剂均可由市场购得。引物序列和探针序列由赛默飞公司合成。
实施例1采用本发明提供的试剂盒评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险血浆中总游离DNA提取
1、使用Streck无创采血管静脉采集一名肾移植术后2周受者血液10ml；
2、将Streck无创采血管采集的血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min；取上层血浆约4～6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心10min；取上层血浆4～6ml于新的15ml离心管中；
3、取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAampCirculatingNucleicAcidKit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10～40ng/ul。
制备数字PCR反应微滴
1、配置数字PCR反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行PCR反应；40个SNP位点的检测体系，共计40管，反应配制如下：
表1
| 成分 | 体积 |
| ddPCR<sup>TM</sup>Probe Supermix | 10μl |
| 引物+探针 | 各0.25μl，共0.5μl |
| 总游离DNA | 2ul |
| 超纯水 | 7.5μl |
| 共计 | 20μl |
其中，用于检测SNP位点的引物包含上、下游引物，各0.125μL，共0.25μL；探针为两条，各0.125μL，共0.25μl；
表1中本发明引物和探针如下：
表2
2、将配置好的反应体系加入到微滴发生卡DG8TM Cartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油Droplet GenerationOil for Probes，最后用封膜DG8TMGaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备。
3、将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行PCR反应，反应程序设置如下：
表3
结果分析
PCR反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果，见表4。
表4 40个SNP位点的原始数据
按照以下方法对表4的数据进行分析：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，采用碱基低含量/总含量，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
评价标准：GcfDNA供受比≤1％，表示受者肾脏移植物相对健康，排斥风险低；GcfDNA供受比＞1％，表示受者肾脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
根据表1的数据计算得到GcfDNA供受比(供者游离DNA/受者游离DNA)为3.8％，表示受者肾脏移植物存在较重损伤，排斥风险高。
实施例2
使用EDTA采血管采集实施例1中肾移植术后2周受者的血液2ml，进行肾功能常规检测，结果如表5所示。
表5受者肾功能常规检测结果
| 检测项目 | 结果 | 参考范围 |
| 肌酐 | 456.2 | 59-104 |
| 胱抑素C | 2.97 | 0.59-1.15 |
结果显示，该肾移植术后2周受者的肾脏移植物存在实质性损伤，和本发明检测结果吻合，此外，采用本发明提供的试剂盒对其他50名肾移植患者进行检测，检测结果均与肾功能功常规检测结果相吻合，表明本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反映肾脏移植物的健康状况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> SNP位点的应用及其引物、探针、检测试剂盒
<160> 160
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atattccctt gcttctgttc agctgagcac ttc 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgaagaga caagttcaag taaattgttg gta 33
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatctggga tgggtttgag gttaattgat gcc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagtcattac tagcaggggc ctgtagggac tgc 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttgggaag gtcttccttg ctgagtgcca caa 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttgaggtcc ccgtgccgca tatactcaaa gac 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaaataatc taatttaaat gactaaaata tgc 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaagaacaa gagttagtgt atctgacaca tta 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgactgaagt gaaatggtca tgcagcttta ggc 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacctcatct tgtaaaggag ggcaatagtc aac 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgtgacgct gggtgaattt tctccttcct ttg 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttccactg agtcctgcta acagcagagg agt 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctggtcttg aactcctgat cttaagtgat ctg 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catttggcaa agaacacatt aaaaatggac ggc 33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgcacagagt catccttgct ctgaccagag ctt 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgatcataag tgtagaggct gcagagggtc act 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggagagcaag ccccttgccc acaattgcgt ggc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagctgcaag gcctcgaggc aggtagggca agt 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggagggtg tgcttacttg ctcccttatt tta 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctcgccac gtcccacacc gggaggtggg cag 33
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctctcaaga tttagagcat cagccacaaa aca 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacatccagc agcccctcta ataatgacaa ctg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagttcctgg gtggattcga gtaacagatt cct 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctctccctgt acctggggga gctgggcatc ccg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gactgatgaa tgctcacctc tttccctaga ctg 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttatagaatc atcacacagt gctatgagta tta 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctcctgaaa gaaacgctag aagcctaaga act 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
taccaactgc cagcctgtgc taggctgagt agt 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgcgtttgc ccctcctccg cattcactgg cca 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtgcacgcg cacagtggcc ctgggggcgt cac 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccagcctgtg accctgccct gtacctacca gat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgcacaagga cgccagtccc accacccggg caa 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgttcttaa gtgtacaaat gtagtcatgg tgg 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccactaaaga accagaaaaa aagggaaatg ggg 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcaaggaggt tccataccaa aaagcaagtc cat 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgattcagtg ggtcaagtat ggagtacagg agt 33
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<212> DNA
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cagagggttc tgggggctga tgaggatgag gcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taaacttgca gcaaatagca gtctttttac cca 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttcgaccccg ctttccccac ccagtcggat ggc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggccaggct cctcaaacga gagaaacaac tac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
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<400> 47
cctccctctt gtcacaaaac actttctcca aat 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tggagttaca ggcatgactg ttgtcctaaa tgc 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggagccttg gctgcgctga gcagggctgt aac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gagagacaga cagatacaca ctcacacaca cac 33
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agcaaaggca cctttgccca ggttggggaa cca 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggcggaaac aaccctgcca gggagaagac gac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gcacctgcag tcctcacctg tctctgtccc cat 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gacccaggat ggtgtttctt gggaccacaa gga 33
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tagtaagagg tgaatacgta ctagtgatga tga 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ccactctaca cacacctgca cgcacacaca tca 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gagtccattc agcttcccaa aatccatgtt gac 33
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggttcttcag agccatacgc aggtttttgc atc 33
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aatcttcctg attttgtttc ttccacctga aac 33
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
agaagctggt acagttgggc caggcggagt aag 33
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gtttccactg catccctcag gaactggtct gtc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ctggggataa tgctatctgt gataatcaac tct 33
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aagtgttgtc aaggtagtcc cagagtcaat act 33
<210> 69
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aactctacaa ttcaaataga tatttaaagt aca 33
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<212> DNA
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<400> 70
ggtccagggg aaccatgcca gtaggccccc agt 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
actaacttcc ttctcttcct ccctcccttt ttc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
actgtccacg ttggagaatc agtagaaccc tct 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aattatagga cctcacattc tgcaagctgg caa 33
<210> 74
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
attaaggcag tgcccaagtc ctcagctgca gtg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
attaattccc aacacgtgct ttttctctat gcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cagatatttt tcctcttccc ctccataaag agc 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
cacaaaagca tgaac 15
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<211> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cacgaaagca tgaac 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tgggtgggct gccct 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tccctgtgaa gagga 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccttgtgaa gagga 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagctatcaa ctcct 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tgtctatctg atgca 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacacgctgc acccc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgcagcttg aagcc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgccgcttg aagcc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
ctgaccaagg cactg 15
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<400> 98
ctgatcaagg cactg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cggtctggaa acact 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tccctggact actag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tccttggact actag 15
<210> 103
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tggcttgttc tgctt 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tggtttgttc tgctt 15
<210> 105
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
agggtatctc taatg 15
<210> 106
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
aggttatctc taatg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
gcccacggag gcctc 15
<210> 108
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gcctcggagg cctc 14
<210> 109
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
agacgaagct ggcta 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
agatgaagct ggcta 15
<210> 111
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
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<210> 112
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
cgttgagtgc cagga 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ggaagattca tggcag 16
<210> 114
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
ggaggattca tggcag 16
<210> 115
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gccaaggaga aagaac 16
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
gcccaggaga aagaac 16
<210> 117
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ttcaaccaac aaag 14
<210> 118
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ttctaccaac aaag 14
<210> 119
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
actcaaaagt ggca 14
<210> 120
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
actgaaaagt ggca 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ctataggccc ccgt 14
<210> 122
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ctatgggccc ccgt 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gctacttgtc cctg 14
<210> 124
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gctgcttgtc cctg 14
<210> 125
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gaagttaccc tttg 14
<210> 126
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gaatttaccc tttg 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
acagaatcaa gcct 14
<210> 128
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
acataatcaa gcct 14
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ggacggtgga tgtgg 15
<210> 130
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
ggatggtgga tgtgg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
aggcaggcgt ggagg 15
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
aggcgggcgt ggagg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
acaagaagga gagtg 15
<210> 134
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
acaggaagga gagtg 15
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
ggcaactccc cacta 15
<210> 136
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
ggcgactccc cacta 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
cggactaata gcaaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cgggctaata gcaaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
ctgcaggcca gctgac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtaggcca gctgac 16
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 141
ctgagatgag cagcc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgggatgag cagcc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacaggtaaa tactt 15
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<212> DNA
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<400> 144
gacgggtaaa tactt 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gacagcttta gtcag 15
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 146
gacggcttta gtcag 15
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<212> DNA
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gggctctgga aatt 14
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<211> 14
<212> DNA
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gggttctgga aatt 14
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taaagctgac acagc 15
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taatgctgac acagc 15
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ttactttctc tcttc 15
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ttattttctc tcttc 15
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cctattttcc agctc 15
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cctgttttcc agctc 15
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ttactcagtg caaag 15
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ttattcagtg caaag 15
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ggagtagacc ccagaa 16
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ggattagacc ccagaa 16
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ctgcgtggcg ggacgc 16
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ctgtgtggcg ggacgc 16
Claims (10)
1.检测SNP位点的试剂在制备评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点由rs1109341、rs2073623、rs1800880、rs2073702、rs1060376、rs2073804、rs429269、rs215165、rs687621、rs687289、rs392121、rs2073859、rs2073866、rs739442、rs2073874、rs2073900、rs2073973、rs2074000、rs178526、rs2074052、rs2074081、rs41170、rs2074122、rs208563、rs2074152、rs179785、rs28958、rs2074247、rs2074276、rs1799854、rs1264570、rs184949、rs223865、rs1527210、rs2066944、rs2074887、rs1049534、rs977624、rs207699、rs454532组成。
2.一种用于评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的引物及探针的组合，其特征在于，
所述引物由用于检测SNP位点的40组引物组成，所述40组引物为：
用于检测rs1109341的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs2073623的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs1800880的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs2073702的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs1060376的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs2073804的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs429269的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs215165的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs687621的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs687289的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs392121的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs2073859的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs2073866的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs739442的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs2073874的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs2073900的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs2073973的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs2074000的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs178526的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
用于检测rs2074052的引物，其序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
用于检测rs2074081的引物，其序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
用于检测rs41170的引物，其序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
用于检测rs2074122的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs208563的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
用于检测rs2074152的引物，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs179785的引物，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs28958的引物，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
用于检测rs2074247的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs2074276的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs1799854的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs1264570的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs184949的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
用于检测rs223865的引物，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs1527210的引物，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
用于检测rs2066944的引物，其序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
用于检测rs2074887的引物，其序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
用于检测rs1049534的引物，其序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
用于检测rs977624的引物，其序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
用于检测rs207699的引物，其序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
用于检测rs454532的引物，其序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
所述探针由用于检测SNP位点的40组探针组成，所述40组探针为：
用于检测rs1109341的探针，其序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
用于检测rs2073623的探针，其序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
用于检测rs1800880的探针，其序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
用于检测rs2073702的探针，其序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
用于检测rs1060376的探针，其序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
用于检测rs2073804的探针，其序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
用于检测rs429269的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs215165的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
用于检测rs687621的探针，其序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；
用于检测rs687289的探针，其序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；
用于检测rs392121的探针，其序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；
用于检测rs2073859的探针，其序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；
用于检测rs2073866的探针，其序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；
用于检测rs739442的探针，其序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；
用于检测rs2073874的探针，其序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；
用于检测rs2073900的探针，其序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；
用于检测rs2073973的探针，其序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；
用于检测rs2074000的探针，其序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；
用于检测rs178526的探针，其序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；
用于检测rs2074052的探针，其序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；
用于检测rs2074081的探针，其序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；
用于检测rs41170的探针，其序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；
用于检测rs2074122的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs208563的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128；
用于检测rs2074152的探针，其序列为SEQ ID No：129和SEQ ID No：130；
用于检测rs179785的探针，其序列为SEQ ID No：131和SEQ ID No：132；
用于检测rs28958的探针，其序列为SEQ ID No：133和SEQ ID No：134；
用于检测rs2074247的探针，其序列为SEQ ID No：135和SEQ ID No：136；
用于检测rs2074276的探针，其序列为SEQ ID No：137和SEQ ID No：138；
用于检测rs1799854的探针，其序列为SEQ ID No：139和SEQ ID No：140；
用于检测rs1264570的探针，其序列为SEQ ID No：141和SEQ ID No：142；
用于检测rs184949的探针，其序列为SEQ ID No：143和SEQ ID No：144；
用于检测rs223865的探针，其序列为SEQ ID No：145和SEQ ID No：146；
用于检测rs1527210的探针，其序列为SEQ ID No：147和SEQ ID No：138；
用于检测rs2066944的探针，其序列为SEQ ID No：149和SEQ ID No：150；
用于检测rs2074887的探针，其序列为SEQ ID No：151和SEQ ID No：152；
用于检测rs1049534的探针，其序列为SEQ ID No：153和SEQ ID No：154；
用于检测rs977624的探针，其序列为SEQ ID No：155和SEQ ID No：156；
用于检测rs207699的探针，其序列为SEQ ID No：157和SEQ ID No：158；
用于检测rs454532的探针，其序列为SEQ ID No：159和SEQ ID No：160。
3.一种用于评估肾移植术后移植物损伤及排斥风险的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：ddPCR TMProbeSupermix和超纯水。
8.一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求2所述序列如SEQ ID No.1～80所示的引物和序列如SEQ ID No.81～160所示的探针；所述产品的使用方法包括如下步骤：
步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～80所示的引物和序列SEQ ID No.81～160所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比，即低含量/高含量＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比，即低含量/高含量＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比，即低含量/高含量＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍2±0.4，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述数字PCR反应的反应体系为：
10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述数字PCR反应的反应程序为：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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