CN110257505A - 一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测方法，非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂Ⅰ、PCR反应试剂Ⅱ、PCR反应试剂Ⅲ、PCR反应试剂Ⅳ、PCR反应试剂Ⅴ中的一种或多种；所述PCR反应试剂Ⅰ～Ⅴ分别包括作为参比对照的通用外引物对、特异性引物对、GC PCR Buffer缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水。本发明基于PCR‑CTPP法和/或MT‑PCR‑CTPP法结合凝胶电泳技术进行同时检测常见非缺失型α‑地中海贫血，针对已知的单核苷酸突变,在突变点的两侧设计两对引物,通过PCR扩增和电泳就可以直接检测突变是否发生。

Description

一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测 方法

技术领域

本发明属于分子生物学医药领域，具体涉及一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

地中海贫血(thalassemia,简称地贫)，又称海洋性贫血。是由珠蛋白基因缺失或者点突变所引起珠蛋白链合成障碍的常染色体单基因遗传性溶血性贫血。根据受累的氨基酸链来分类，通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以α和β地中海贫血较为常见。

地中海贫血最早于1925年由Cooley和Lee首先描述，最早发现于地中海区域，实际上，本病在世界各地均有发生，以地中海地区，中非洲，南太平洋地区发病较多，在我国南方也为多发区，总发病率为2.46％，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95％、4.11％、2.60％、1.92％和1.20％。

α-地中海贫血(以下简称α-地贫)，是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，使β链与δ链异常结合而导致HbA2减少的疾病。α-珠蛋白基因缺失或点突变均可导致α-地贫，分别称为缺失型或非缺失型α-地贫。在中国，目前已报道至少6种非缺失型α-地贫基因突变，其中Hb Constant Spring (Hb CS)， Hb Quong Sze (Hb QS) 和 Hb Westmead (Hb WS)，即CS、QS和WS三种点突变是最常见突变，这些突变均位于α2-珠蛋白基因上。

通常α2较α1基因的功能强，表达量较α1基因的多；当α珠蛋白发生基因突变时，α2基因的突变一般会比α1基因突变更能减少基因产物的表达。当α2基因发生非缺失型突变时，α-链的合成产量比α2基因发生缺失时明显减少。最常见的是α0-地贫复合α+地贫的缺失型Hb H病，资料表明中国α-地贫发病率最高的广西有45.8-53.3%的Hb H病患者携带非缺失型α地贫基因，然而α2-珠蛋白基因发生非缺失型突变的纯合子或复合杂合子会引起重度贫血的Hb H病也占有相当的比例,这类病人比那些缺了3个α珠蛋白基因所表现出来的临床症状更严重，贫血更严重。这些都给家庭和社会造成巨大压力。

目前已报道的基因突变检测方法很多，包括基于单链构象多态性(SSCP)、引物延伸技术、聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)、TaqMan探针技术、变性高效液相色谱（DHPLC)、高分辨熔解曲线检测技术(HRM)、DNA直接测序和DNA微阵列技术等。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。

现有的非缺失型α地中海贫血基因检测相关的专利和市场产品种类有几种，其主要是利用PCR反向结合点杂交法、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)等。这些PCR诊断性检测都是过程繁琐、耗时长、成本较高、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物，难以满足临床检测快速，低成本的要求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测方法，利用本试剂盒可以检测常见非缺失型α-地中海贫血的WS、QS和CS三种突变类型，该试剂盒具有操作简便、分型快速、费用低廉，结果判读直观的特点。

本发明的方案是通过这样实现的：

非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂Ⅰ、PCR反应试剂Ⅱ、PCR反应试剂Ⅲ、PCR反应试剂Ⅳ、PCR反应试剂Ⅴ中的一种或多种；所述PCR反应试剂Ⅰ～Ⅴ均包括作为参比对照的通用外引物对、GC PCR Buffer缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水；所述的作为参比对照的通用外引物对是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；

所述PCR反应试剂Ⅰ还包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅱ还包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅲ还包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅳ还包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅴ还包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的特异性引物对。

在本发明中所述的各组引物的各个引物序列如下表所示：

作为本发明的进一步说明，所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅰ、PCR反应试剂Ⅱ和PCR反应试剂Ⅲ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅳ或PCR反应试剂Ⅴ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅴ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅱ和PCR反应试剂Ⅳ。

作为本发明的进一步说明，所述的水为灭菌超纯水，所述灭菌超纯水的体积为4.8～11.4μl/管；所述的GC PCR Buffer缓冲液为宝生物工程（大连）有限公司生产的产品；所述的PCR扩增引物组的浓度为10μM为0.05～1μl/管；所述的dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液，其浓度为2.5mM，其体积为1～4μl/管；所述的DNA聚合酶为热启动Taq酶。

作为本发明的进一步说明，非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒还包括α地中海贫血的阴性对照液和阳性对照品，所述阴性对照液为不含有α-地中海贫血WS、QS和CS基因的Tris-EDTA缓冲液，Tris-EDTA缓冲液是由Tris、EDTA组成混合后经高压灭菌处理得到的无菌溶液，pH为8.00～8.03。所述阳性对照品为α-地中海贫血WS和/或QS和/或CS突变型DNA合成阳性模板和非缺失α-地中海贫血野生型DNA合成阴性模板。

一种非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

（a）采用常用DNA提取试剂对样本进行核酸提取，获取待检α-地中海贫血的DNA样品；

（b）将步骤（a）中获得的DNA样品进行PCR扩增，在PCR扩增步骤中使用该非缺失α-地中海贫血检测试剂盒；

（c）将步骤（b）中用于PCR扩增后进行电泳即可获知结果；

步骤（b）中所述的PCR扩增条件为：94～95℃进行3～5min，94℃进行5～30sec，53～60℃进行20～50sec为一个循环，进行30～35个循环。

作为本发明的进一步说明，所述样本选自含有核酸物质的待测临床样本，包含但不局限于抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、血斑样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质。

作为本发明的进一步说明，所述的PCR扩增的条件优选为：95℃进行5min，94℃进行30sec，56～58℃进行30sec为一个循环，进行35个循环；

作为本发明的进一步说明，所述电泳是将所述PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料。

本发明实现的技术原理是：

本发明试剂盒基于两对交叉引物PCR技术的方法（PCR with confronting two-pairprimers，PCR-CTPP，PCR-CTPP法）和/或多重交叉引物PCR技术的方法（multiplex PCR withconfronting two-pair primers，MT-PCR-CTPP法）结合凝胶电泳技术同时检测非缺失α地中海贫血。该试剂盒包含外引物和特异性内引物，用于检测由于点突变引起的α-地中海贫血。采用试剂盒中的PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的方法为PCR-CTPP法，采用试剂盒中的PCR反应试剂Ⅳ、Ⅴ的方法为MT-PCR-CTPP法。

本发明在对所述特异性引物对进行引物设计时，所述上游和下游引物的3’末端与待检位点碱基匹配或错配；所述特异性引物对中上游引物和下游引物的3’末端倒数第2或3或4位碱基引入错配碱基；优选的，所述的特异性引物对中上游引物和下游引物的3’末端倒数第3位碱基引入错配碱基。

本发明基本原理为利用Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶校正活性，当引物3′末端错配时延伸效率降低，扩增受阻；针对已知的单核苷酸突变，在突变点的两侧设计两对引物:一对特异性引物和一对外引物，内引物的3′终末端落在突变位点上，通过PCR扩增和电泳就可以直接检测突变是否发生；为提高方法的特异性，本发明在特异性引物3′末端第三位碱基引入错配碱基。本发明根据α珠蛋白基因中发生WS、QS和CS突变的区域基因序列，设计无数对引物。优选的，针对待检的WS、QS和CS位点的三个靶向区域设计一对通用外引物作为内对照和分别针对各个靶点设计一对特异性引物配对扩增野生型和突变型基因，设计并引入含优化的错配碱基的特异性引物对能特异性区别WS、QS和CS位点的野生型和突变型，引物可由专业合成公司合成，如上海生工、Invitrogen等。

利用本发明的试剂盒中的PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以同时在相同条件下检测三种非缺失型α-地中海贫血，分别是WS、QS和CS型非缺失型α-地中海贫血；亦可利用本试剂盒中的PCR反应试剂Ⅳ可以单管同时检测WS和CS基因型；亦可利用本试剂盒中的PCR反应试剂Ⅴ可以单管同时检测QS和CS基因型；亦可利用本试剂盒PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ中一种与PCR反应试剂Ⅳ或Ⅴ进行组合可以同时检测WS、QS和CS型非缺失型α-地中海贫血。

本发明具备以下良好效果：

1.本发明引入并优化错配碱基，能够增加PCR特异性；整个流程只需1.5小时即可完成检测。操作简单、检测时间短、PCR结束后通过30～35分钟电泳即可进行结果判读，克服了现有技术需要对PCR产物进行杂交、测序、探针设计与溶解曲线分析操作繁杂的问题，并且具有灵敏度高，特异性强、快速的特点，适合各个层次医院应用。

2.本发明所述用于检测非缺失型α地中海贫血的试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定可靠、适用范围广，适用于非缺失型α地中海贫血的人群筛查以及婚前或产前筛查，适合各个层次医院临床应用。

附图说明

图1：非缺失型α地中海贫血PCR-CTPP法示意图。

图2：非缺失型α地中海贫血PCR-CTPP法在已知DNA样本中的PCR扩增产物；其中，1：纯合子，2：杂合子，3：野生型，M:500 Marker。

其中，在图2中，纯合子是指同源染色体在同一位点 (locus) 上的两个等位基因相同的基因型个体 , 如AA，aa ；杂合子指同源染色体在同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体，如 Aa ；野生型（基因）指自然界中占多数的等位基因，在生物学实验中常作为标准对照基因。与之相对应的概念为突变型（基因）。纯合子、杂合子、野生型三者概念下同。

图3：非缺失型α地中海贫血MT-PCR-CTPP法在已知DNA样本中的PCR扩增产物；其中；1：双纯合子，2，3：单纯合子，4,5：单杂合子，6：双杂合子，7：野生型，M:500 Marker。图3中，双纯合子是指两个位点都是纯合子；单纯合子指一个位点是纯合子，另一个位点是野生型；单杂合子指一个位点是杂合子，另一个位点是野生型；双杂合子是指两个位点都是杂合子。

图4：非缺失型α地中海贫血PCR-CTPP法临床样本PCR产物；其中，M：500 Marker，1,2：WS野生型，3,4：WS杂合子，5,6：WS纯合子，7：QS野生型，8：QS阴性对照，9,10：QS杂合子，11,12：QS纯合子，13：CS野生型，14：CS阴性对照，15,16：CS杂合子，17,18：CS纯合子，19：WS阴性对照。

图5：非缺失型α地中海贫血MT-PCR-CTPP法同时检测WS和CS两位点临床样本PCR产物；其中，M：500 Marker，1：野生型，2：WS杂合子，3：WS纯合子，4,5：野生型，6：CS杂合子，7：CS纯合子。

图6：非缺失型α地中海贫血MT-PCR-CTPP法同时检测QS和CS两位点临床样本PCR产物；其中，M：500 Marker，1,2：野生型，3：阴性对照，4：QS杂合子，5：QS纯合子，6：CS杂合子，7：CS纯合子。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中用于非缺失型α-地中海贫血检测的引物序列如下表1所示。

表1. 引物序列

实施例1：

采用本发明的试剂盒运用PCR-CTPP法对已知基因型样本进行检测。

本实施例中试剂盒中各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，已知DNA样品加样量1为μl。PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各个组分含量及反应条件分别如下表2所示。

表2.PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各个组分含量及反应条件

本实施例采用的常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

1.1 收集待测临床样本。所述样本选自含有核酸物质的待测临床样本，包含但不局限于抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、血斑样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质。

1.2 DNA提取。可以采用手工（如NaI法和外周血DNA提取试剂盒（如天根生物有限公司）和/或全自动核酸提取仪进行DNA提取。DNA的纯度和丰度达到常规PCR要求即可。

1.3 PCR扩增。PCR反应体系和PCR反应条件按照表2进行即可，各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，已知DNA样品加样量1为μl。

1.4 PCR产物电泳分析。所述扩增PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料。

本实施例所得的结果判断如图2所示。

实施例2：

采用本发明的试剂盒运用MT-PCR-CTPP法对已知基因型样本进行检测。

本实施例中试剂盒中各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，已知DNA样品加样量1为μl。PCR反应试剂Ⅳ、Ⅴ各个组分含量及反应条件分别如下表3所示。

表3.PCR反应试剂Ⅳ、Ⅴ各个组分含量及反应条件

本实施例采用的常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

1.1 收集待测临床样本。同实施例1。

1.2 DNA提取。同实施例1。

1.3 PCR扩增。PCR反应体系和PCR反应条件按照表3进行即可，各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，已知DNA样品加样量1为μl。

1.4 PCR产物电泳分析。同实施例1。

本实施例所得的结果判断如图3所示。

实施例3：

采用本发明的试剂盒，运用PCR-CTPP法对临床样本中进行检测，该临床样本来源自经常规PCR-RDB技术确定基因型的样本，在该样本中确定的基因型有：WS杂合子、WS纯合子、QS杂合子、QS纯合子、CS杂合子、CS纯合子。

本实施例中试剂盒中各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，临床样本DNA样品加样量1为μl。PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各个组分含量及反应条件分别为实施例1中的表2所示。

本实施例采用的常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

（a）采用常规DNA提取试剂对临床样本进行核酸提取，获取待检α-地中海贫血的临床样本DNA样品；

（b）将步骤（a）中获得的临床样本DNA样品分别加入试剂盒中的PCR反应试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中进行PCR扩增；PCR扩增的条件为：以95℃进行预变性5min，94℃进行30sec，56～58℃进行退火35sec，此为一个循环，进行34个循环；然后在72℃5分钟，12℃12秒；

（c）将步骤（b）中用于试剂盒进行扩增得到的PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min即可获知结果；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料；

（d）将临床样本DNA样品替换成阴性对照品以及阴性模板重复步骤（b）、（c）；其中，阴性对照品为不含有α-地中海贫血WS、QS和CS基因的Tris-EDTA缓冲液。Tris-EDTA缓冲液是由浓度为1.0的mM Tris和浓度为0.1mM的EDTA经高压灭菌处理得到无菌溶液，pH为8.00～8.03；阴性模板为非缺失α-地中海贫血野生型DNA合成的模板。

本实施例所得的结果如图4所示。

实施例4：

采用本发明的试剂盒运用MT-PCR-CTPP法对临床样本中进行检测，该临床样本来源自经常规PCR-RDB技术确定基因型的样本，在该样本中确定的基因型有：WS杂合子、WS纯合子、QS杂合子、QS纯合子、CS杂合子、CS纯合子。

本实施例中试剂盒中各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，临床样本DNA样品加样量1为μl。PCR反应试剂Ⅳ组分含量及反应条件如下表4所示。

表4.PCR反应试剂Ⅳ组分含量及反应条件

本实施例采用的常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

（a）采用常规DNA提取试剂对临床样本进行核酸提取，获取待检α-地中海贫血的临床样本DNA样品；

（b）将步骤（a）中获得的临床样本DNA样品加入试剂盒中PCR反应试剂Ⅳ的中进行PCR扩增；PCR扩增的条件为：以95℃进行预变性5min，94℃进行30sec，56～58℃进行退火35sec，此为一个循环，进行34个循环；然后在72℃5分钟；12℃12秒；

（c）将步骤（b）中用于试剂盒进行扩增得到的PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min即可获知结果；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料；

（d）将临床样本DNA样品替换成阴性模板重复步骤（b）、（c）；其中，阴性模板为非缺失α-地中海贫血野生型DNA合成的模板。

本实施例所得的结果如图5所示。

实施例5：

采用本发明的试剂盒运用MT-PCR-CTPP法对临床样本中进行检测。

本实施例中试剂盒中各个PCR反应液反应总体积为20μl，其中，反应试剂为19μl，临床样本DNA样品加样量1为μl。PCR反应试剂Ⅴ组分含量及反应条件如下表5所示。

表5.PCR反应试剂Ⅴ组分含量及反应条件

本实施例采用的常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，包括以下步骤：

（a）采用常规DNA提取试剂对临床样本进行核酸提取，获取待检α-地中海贫血的临床样本DNA样品；

（b）将步骤（a）中获得的临床样本DNA样品加入试剂盒中PCR反应试剂Ⅳ的中进行PCR扩增；PCR扩增的条件为：以95℃进行预变性5min，94℃进行30sec，56～58℃进行退火35sec，此为一个循环，进行34个循环；然后在72℃5分钟；12℃12秒；

（c）将步骤（b）中用于试剂盒进行扩增得到的PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min即可获知结果；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料；

（d）将临床样本DNA样品替换成阴性对照品以及阴性模板重复步骤（b）、（c）；其中，阴性对照品为不含有α-地中海贫血WS、QS和CS基因的Tris-EDTA缓冲液和无菌溶液。Tris-EDTA缓冲液是由浓度为1.0的mM Tris和浓度为0.1mM的EDTA经高压灭菌处理得到，pH为8.00～8.03；阴性模板为非缺失α-地中海贫血野生型DNA合成的模板。

本实施例所得的结果如图6所示。

另外，采用本发明的试剂盒运用PCR-CTPP法和MT-PCR-CTPP法可以对临床样本进行检测。本发明试剂盒各PCR反应试剂扩增条件一致，因此可以采用PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅴ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅱ和PCR反应试剂Ⅳ分别组合同时进行三种常见非缺失型α地中海贫血点突变的检测。

产品性能指标：

1测定准确性

收集8份阴性样本和10份地贫样本，选择低、中、高3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与采用深圳益生堂生物企业有限公司的非缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。

2分析灵敏度

采用本发明试剂盒对三种非缺失型α地贫(WS、QS和CS)检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为4 ng/μL。

3分析特异性

通过干扰筛查试验，临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质；溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯(13.8mmol/L)和黄疸样本(361.3mmol/L)对本品检测无干扰。

用本产品检测10例本产品检测范围外的临床样本，包括2例α-地贫阴性样本、3例β-地中海贫血临床样本、2例缺铁性贫血临床样本、3例G-6-PD临床样本、1例感染衣原体的全血样本，均无交叉反应。

4重复性

采用本发明试剂盒不同批号产品，不同人(2人)操作，同一天做2次，共做2天，每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式，上述实施例中的实验方法和试验材料，如无特殊说明，均为常规方法和市售材料。

序列表

<110> 广西壮族自治区人民医院

<120> 一种非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒及检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaagacctac ttcccgcact tc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ccattgttgg cacattccg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agttcacccc tgcggtgtac 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aggaacttgt ccagggagtc c 21

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcggtgcacg cctctct 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agaagccagg aacttgtgcg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtgctgacct ccaaataccc tt 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caccgaggct ccagcatg 18

Claims (8)

1.非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应试剂Ⅰ、PCR反应试剂Ⅱ、PCR反应试剂Ⅲ、PCR反应试剂Ⅳ、PCR反应试剂Ⅴ中的一种或多种；所述PCR反应试剂Ⅰ～Ⅴ均包括作为参比对照的通用外引物对、GC PCR Buffer缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水；

所述的作为参比对照的通用外引物对是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；

所述PCR反应试剂Ⅰ还包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅱ还包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅲ还包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅳ还包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物对；

所述PCR反应试剂Ⅴ还包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物对。

2.根据权利要求1所述的非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅰ、PCR反应试剂Ⅱ和PCR反应试剂Ⅲ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅳ或PCR反应试剂Ⅴ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅴ，或者所述试剂盒包括PCR反应试剂Ⅱ和PCR反应试剂Ⅳ。

3.根据权利要求1所述的非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，其特征在于，所述的水为灭菌超纯水，所述灭菌超纯水的体积为4.8～11.4μl/管；所述的GC PCR Buffer缓冲液为宝生物工程（大连）有限公司生产的产品；所述的PCR扩增引物组的浓度为10μM为0.05～1μl/管；所述的dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液，其浓度为2.5mM，其体积为1～4μl/管；所述的DNA聚合酶为热启动Taq酶。

4.根据权利要求1所述的非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒，其特征在于，非缺失型α地中海贫血点突变快速检测试剂盒还包括α地中海贫血的阴性对照液和阳性对照品；所述阴性对照液为不含有α-地中海贫血WS、QS和CS基因的Tris-EDTA缓冲液，Tris-EDTA缓冲液是由Tris、EDTA组成混合后经高压灭菌处理得到的无菌溶液，pH为8.00～8.03；所述阳性对照品为α-地中海贫血WS和/或QS和/或CS突变型DNA合成阳性模板和非缺失α-地中海贫血野生型DNA合成阴性模板。

5.非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）采用常用DNA提取试剂对样本进行核酸提取，获取待检α-地中海贫血的DNA样品；

（b）将步骤（a）中获得的DNA样品进行PCR扩增，在PCR扩增步骤中使用该非缺失α-地中海贫血检测试剂盒；

（c）将步骤（b）中用于PCR扩增后进行电泳即可获知结果；

步骤（b）中所述的PCR扩增条件为：94～95℃进行3～5min，以94℃进行5～30sec，53～60℃进行20～50sec，72℃进行20～60sec为一个循环，进行30～35个循环。

6.根据权利要求5所述的非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，其特征在于，所述样本选自含有核酸物质的待测临床样本，包含但不局限于抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、血斑样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质。

7.根据权利要求5所述的非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件优选为：95℃进行5min，以94℃进行30sec，56～58℃进行35sec，72℃进行40sec为一个循环，进行35个循环。

8.根据权利要求5所述的非缺失型α地中海贫血点突变的检测方法，其特征在于，所述电泳是将所述PCR反应产物置于质量比为0.8～3.5％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电压下电泳约30～35min；所述琼脂糖凝胶中还添加有体积比0.005％核酸染料。