CN104328182A - 一种用于检测pdgfra基因热点突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测PDGFRA基因突变的引物、探针、锁核酸探针、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。所述引物和探针，所述引物和所述探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述试剂盒包括：上述引物和探针。本发明提供的引物和探针能够高灵敏地检测出PDGFRA基因是否发生突变，同时，采用锁核酸探针可以大大提高了检测PDGFRA基因突变的灵敏度，采用本发明提供的试剂盒能够准确检测PDGFRA基因是否突变。

Description

一种用于检测PDGFRA基因热点突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测PDGFRA基因突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
血小板源性生长因子受体α多肽(platelet-derived growth factor receptoralpha，PDGFRA)是一种单链跨膜蛋白，属Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶家族。最常见的PDGFRA突变位点是编码位于第二酪氨酸激酶区活化环的区域(exon18)，少数突变发生在近膜区(exon12)，突变引起PDGFRA蛋白的功能改变，通常会导致非配体依赖性的二聚体形成、酪氨酸残基自主磷酸化及下游信号的激活。这种激活导致的最终结果是肿瘤的发生。
现有的检测PDGFRA基因突变的方法有Sanger测序法，但采用Sanger测序法检测PDGFRA基因突变时，其检测灵敏度低，不能准确检测出PDGFRA基因是否发生突变，使用者迫切需要一种高灵敏度的检测方法替换Sanger测序法。
发明内容
为了解决现有技术中检测PDGFRA基因突变的方法的灵敏度低的问题，本发明实施例提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针，所述用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及用于检测所述PDGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，
PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；
所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的锁核酸探针，所述锁核酸探针包括：
PDGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.7所示；
PDGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.8所示；
所述锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。
再一方面，本发明实施例提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：上述的引物和探针。
具体地，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述的锁核酸探针。
具体地，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
具体地，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/LdNTPs 1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl。
具体地，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
具体地，所述测序反应液包括：3μmol/L所述PDGFRA基因第12号外显子的正向引物1μl、3μmol/L所述PDGFRA基因第18号外显子的正向引物1μl、0.3μl 5×Bigdye和0.45μl 2.5×Buffer。
具体地，所述测序PCR产物纯化试剂包括0.75mol/L NaCl和纳米磁珠。
又一方面，本发明实施例提供了一种检测PDGFRA基因突变的方法，采用上述的试剂盒，所述方法包括：
提取样本的基因组DNA；
以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；
将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产物；
将所述测序PCR扩增产物进行纯化；
将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述PDGFRA基因对应的野生型进行测序分析对比，判定所述样本中的所述PDGFRA基因是否发生突变。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物和探针能够高灵敏地检测出PDGFRA基因是否发生突变，同时，锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中β-D-呋喃核糖的2'-O，4'-C位通过不同的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结构，环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，因此对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解。将锁核酸作为探针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使RNA/DNA的熔解温度(Tm值)较大幅度地下降，采用锁核酸探针可以大大提高了检测PDGFRA基因突变的灵敏度。本发明提供的试剂盒包括本发明实施例提供的引物、探针以及锁核酸探针，使得本发明实施例提供的试剂盒具有高灵敏度。本发明实施例提供的检测方法，能够准确检测PDGFRA基因是否突变，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，能显著提高突变型的检测灵敏度。PCR扩增产物采用碱性磷酸酶和核酸外切酶进行消化，这能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，此外，本发明实施例采用磁珠法对测序PCR产物进行纯化，与传统的乙醇/醋酸钠法相比操作简单快捷、对设备要求简单(只需一个磁力架)、纯化结果稳定，得到的测序峰图干净清晰、无染料峰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例四提供的PDGFRA基因第12号外显子V561D突变型的测序峰图；
图2是本发明实施例四提供的PDGFRA基因第18号外显子D842V突变型的测序峰图；
图3是本发明实施例四提供的加入了锁核酸探针后检测PDGFRA基因18号外显子的测序峰图；
图4是本发明实施例四提供的未加入锁核酸探针后检测PDGFRA基因18号外显子的测序峰图；
图5是本发明实施例四提供的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供一种用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针，用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测PDGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及用于检测PDGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，该引物包括：正向引物和反向引物，其中，
PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；
探针的5’端均连接有FAM荧光基团，探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。
本发明实施例提供的引物和探针具有高灵敏度，能够准确检测PDGFRA基因是否发生突变。
实施例二
本发明实施例提供了一种用于检测PDGFRA基因突变的锁核酸探针，改锁核酸探针包括：
PDGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.7所示；
PDGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.8所示；
锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。
本发明实施例提供的用于检测PDGFRA基因突变的锁核酸探针，锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中β-D-呋喃核糖的2'-O，4'-C位通过不同的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结构，环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，因此，锁核酸对DNA和RNA均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，将锁核酸作为探针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使RNA/DNA的熔解温度(Tm值)较大幅度地下降，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，进一步提高突变型的检测灵敏度，采用锁核酸探针可以大大提高检测PDGFRA基因突变的灵敏度，同时，PDGFRA基因检测的样本多来源于胃肠道间质瘤的病变细胞组织，该组织中往往含有正常细胞，影响检测，本发明实施例采用与野生型基因序列匹配的锁核酸，在进行PCR扩增时，锁核酸能够与野生型序列结合，从而阻滞PCR延伸，导致PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得PDGFRA基因突变型得到扩增，从而提高了PDGFRA基因突变的检出率。
实施例三
本发明实施例提供一种用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：本发明实施例一提供的引物和探针、本发明实施例二提供的锁核酸探针、PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
具体地，在试剂盒中，10μmol/L正向引物各0.75μl，10μmol/L反向引物各0.75μl，10μmol/L探针各0.5μl，10μmol/L锁核酸探针各0.5μl。
具体地，PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/L dNTPs1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl。
具体地，消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ，且碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ的酶活力比为2:5。
具体地，测序反应液包括：3μmol/L PDGFRA基因第12号外显子的正向引物1μl、3μmol/L PDGFRA基因第18号外显子的正向引物1μl、0.3μl 5×Bigdye和0.45μl 2.5×Buffer。该测序反应液用于检测PCR扩增产物。
具体地，测序PCR产物纯化试剂包括0.75M NaCl和纳米磁珠。
具体地，阴性质控品为含PDGFRA野生型基因片段的重组质粒。
具体地，阳性质控品为含有PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。
本发明提供的用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒，本发明提供的试剂盒包括本发明实施例提供的引物、探针以及锁核酸探针，使得该试剂盒能够准确检测PDGFRA基因是否发生突变，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，进一步提高突变型的检测灵敏度。
实施例四
本发明实施例提供一种检测PDGFRA基因突变的方法，采用本发明实施例三提供的试剂盒，具体检测方法如下：
1、提取样本的基因组DNA
样本收集：用石蜡包埋病理切片组织，且该切片中含有胃肠道间质瘤的病变细胞，为了保证病理切片组织含有足够比例的胃肠道间质瘤的病变细胞，需要加同一组织的HE(Hematoxylin-Eosin)染色片子一张(在显微镜下肿瘤细胞的比例＞70％)。选用石蜡DNA提取试剂盒QIAGEN QIAamp DNA FFPE TissueKit(Cat NO.56404)，对新鲜组织按照石蜡样本提取步骤进行，但无需加入二甲苯处理步骤，操作步骤详见该石蜡DNA提取试剂盒说明书，提取的样本的基因组DNA采用紫外分光光度计测定浓度及质量，测量OD260/OD280结果在1.8～2.0之间，提取的样本的基因组DNA浓度在20ng/μl以上。
其中，病理切片组织来源于胃肠道间质瘤患者的病变组织，经脱水处理后用石蜡包埋，切片后作为待检样本(该胃肠道间质瘤患者的病变组织的PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子均发生了突变)。
样本用量：每例石蜡包埋病理切片切5张，每张切片的厚度为8～10μm，胃肠道间质瘤的病变细胞的区域大于5mm×5mm，连续切片，封存于1.5ml离心管中。
样本质量：为确保样本的基因组DNA提取的成功率，选择1年以内的石蜡标本。
2、PCR扩增
准备2个PCR反应管，用微量加样器在每一个PCR反应管内加入引物、探针、锁核酸探针和PCR反应液，其中，10μmol/L正向引物各0.75μl，10μmol/L反向引物各0.75μl，10μmol/L探针各0.5μl，10μmol/L锁核酸探针各0.5μl，PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/L dNTPs 1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl，补水至23μl，其中，2个PCR反应管分别对应PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子，再向PCR反应管中加入提取的样本的基因组DNA、阴性质控品和阳性质控品各2μl，盖紧PCR反应管，经5000rpm离心数秒，得到上清液，取该上清液进行PCR扩增反应。
在荧光PCR仪上设置以下程序：
经过上述程序扩增后，得到PCR扩增产物，如图5所示，该扩增曲线均呈S型，且Ct值在20-30之间，可见扩增效果良好。
3、纯化PCR扩增产物
分别取PCR扩增产物、阴性质控品和阳性质控品的PCR产物各5μl分别加入4个PCR反应管中，分别加入3μl消化酶系并震荡均匀，经瞬时离心，将产物在PCR仪上进行反应，反应程序为：37℃15分钟，95℃2分钟，得到纯化的PCR扩增产物。
4、测序PCR扩增
取纯化的PCR扩增产物3μl作为模板，再加入3μl测序反应液(取相应检测位点测序反应液)，进行测序PCR扩增，扩增条件如下：
经上述扩增条件，得到测序PCR扩增产物。
5、纯化测序PCR扩增产物
测序PCR产物经磁珠法进行纯化，操作步骤如下：
1)将测序PCR扩增产物加入装有10μl测序PCR产物纯化试剂的反应管中，再加入30μl浓度为85％的乙醇，混匀后室温静置2min；其中，测序PCR产物纯化试剂包括0.75mol/L NaCl和纳米磁珠。
2)将反应管置于磁力架上直至磁珠完全吸附到管壁上，弃废液。
3)向反应管中加入150μl浓度为85％的乙醇，弃废液，再重复操作一次。
4)室温放置3～5min，使乙醇蒸发。
5)加入40μl的洗脱液(洗脱液为0.01mol/L NaCl)，充分混匀，室温孵育5min。
6)将反应管置于磁力架上作用3min或直至溶液清亮，保持反应管在磁力架上，转移35μl上清液至一个新的样品管。
7)将所得产物在95℃变性4min，并迅速在冰上骤冷4min，得到纯化的测序PCR产物。
6、结果分析
将纯化后的测序PCR扩增产物测序分析，并与PDGFRA基因对应的野生型进行对比，判定样本中PDGFRA基因突变是否发生突变，具体如下：
PDGFRA基因的第12号外显子突变为：第561位密码子由“GTC”突变为“GAC”。
PDGFRA基因的第12号外显子突变分析：将PDGFRA基因的第12号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，在“Edit”菜单下点击“Reverse+Complement”，按Ctrl+F键快速查找序列对比PDGFRA基因的第12号外显子的野生型序列，参见图1，其中，PDGFRA基因的第12号外显子的野生型碱基序列为：AAACCGAGGTATGAAATTCGCTGGAGGATTGAATCAATCAGCCCAGATGGACATGAATATATTTATGTGGACCCGATGCAGCTGCCTTATGACTCAAGATGGGAGTTTCCAAGAGATGGACTAGTGCTTGGT。通过对比分析确定病理切片组织在第561位密码子由“GTC”突变为“GAC”，该结果与病理切片的样本相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测PDGFRA基因突变的方法能够准确检测出PDGFRA基因的第12号外显子的突变。
PDGFRA基因的第18号外显子突变为：第842位密码子由“GAC”突变为“GTC”。
PDGFRA基因的第18号外显子突变分析：将PDGFRA基因的第18号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，在“Edit”菜单下点击“Reverse+Complement”，按Ctrl+F键快速查找序列CTGGCCAGA，对比PDGFRA基因的第18号外显子的野生型序列，参见图2，其中，PDGFRA基因的第18号外显子的野生型碱基序列为：TGTGTCCACCGTGATCTGGCTGCTCGCAACGTCCTCCTGGCACAAGGAAAAATTGTGAAGATCTGTGACTTTGGCCTGGCCAGAATCATGCATGATTCGAACTATGTGTCGAAAGGCAGT。通过对比分析确定病理切片组织在第842位密码子由“GAC”突变为“GTC”，该结果与病理切片的样本相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测PDGFRA基因突变的方法能够准确检测出PDGFRA基因的第18号外显子的突变。
本发明针对PDGFRA基因的第18号外显子，将加入锁核酸探针和未加入锁核酸探针参照上述反应过程进行对比；加入锁核酸探针的检测结果如图3所示，图3中为PDGFRA基因18号外显子突变；未加入锁核酸探针(对照)的检测结果如图4所示，图4中框内的基因为PDGFRA基因18号外显子的野生型，这是由于测序法本身的特点造成的，当样本中突变基因含量较低时，测序结果只能体现出优势组分，即野生型，由此可见，加入锁核酸探针在PCR过程中可对突变型样本进行富集，从而能显著的提高突变型的检测灵敏度。
本发明实施例提供的检测方法，能够准确检测PDGFRA基因是否突变，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，能显著提高突变型的检测灵敏度。PCR扩增产物采用碱性磷酸酶和核酸外切酶进行消化，这能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，此外，本发明实施例采用磁珠法对测序PCR产物进行纯化，与传统的乙醇/醋酸钠法相比操作简单快捷、对设备要求简单(只需一个磁力架)、纯化结果稳定，得到的测序峰图干净清晰、无染料峰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针，其特征在于，所述用于检测PDGFRA基因突变的引物和探针包括用于检测所述PDGFRA基因的第12号外显子的引物和探针、以及用于检测所述PDGFRA基因的第18号外显子的引物和探针中的至少一种，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，
PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
PDGFRA基因第12号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；
PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；
PDGFRA基因第18号外显子的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示；
所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团，所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。
2.一种用于检测PDGFRA基因突变的锁核酸探针，其特征在于，所述锁核酸探针包括：
PDGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.7所示；
PDGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQ ID NO.8所示；
所述锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。
3.一种用于检测PDGFRA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：如权利要求2所述的锁核酸探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/L dNTPs 1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述测序反应液包括：3μmol/L所述PDGFRA基因第12号外显子的正向引物1μl、3μmol/L所述PDGFRA基因第18号外显子的正向引物1μl、0.3μl 5×Bigdye和0.45μl 2.5×Buffer。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述测序PCR产物纯化试剂包括0.75mol/L NaCl和纳米磁珠。
10.一种检测PDGFRA基因突变的方法，采用权利要求3-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述方法包括：
提取样本的基因组DNA；
以获得的所述基因组DNA作为所述模板DNA，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；
将所述纯化的PCR扩增产物作为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产物；
将所述测序PCR扩增产物进行纯化；
将纯化后的所述测序PCR扩增产物测序分析，并与所述PDGFRA基因对应的野生型进行对比，判定所述样本中的所述PDGFRA基因是否发生突变。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104830991A (zh) * 2015-05-29 2015-08-12 沈阳优吉诺生物科技有限公司 检测pdgfra基因d842v多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
CN105986017A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒
CN106011253A (zh) * 2016-06-15 2016-10-12 昆明理工大学 用于检测微量组织中pdgfra基因突变的引物组合及其应用
CN106636333A (zh) * 2016-09-28 2017-05-10 广东凯普生物科技股份有限公司 Pdgfra基因突变检测试剂盒
CN110938696A (zh) * 2019-12-21 2020-03-31 武汉百泰基因工程有限公司 一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒
CN110964824A (zh) * 2019-12-21 2020-04-07 武汉百泰基因工程有限公司 一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒
CN113913514A (zh) * 2020-07-09 2022-01-11 铭炽生物科技(上海)有限公司 人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN114058701A (zh) * 2021-10-27 2022-02-18 上海科亦生物科技有限公司 一种C-kit和PDGFR突变检测试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294200A (zh) * 2007-04-27 2008-10-29 上海人类基因组研究中心 冠心病检测方法和试剂盒
CN102719530A (zh) * 2012-05-07 2012-10-10 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294200A (zh) * 2007-04-27 2008-10-29 上海人类基因组研究中心 冠心病检测方法和试剂盒
CN102719530A (zh) * 2012-05-07 2012-10-10 厦门艾德生物医药科技有限公司 一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R PENZEL等: "the location of KIT and PDGFRA gene mutations in gastrointestinal stromal tumours is site and phenotype associated", 《J CLIN PATHOL》 *
REMKO HERSMUS ET AL: "prevalence of c-KIT mutations in gonadoblastoma and dysgerminomas of patients with disorders of sex development (DSD) and ovarian dysgerminomas", 《PLOS ONE》 *
吕学诜: "《分子诊断学——基础与临床》", 31 July 2008 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105986017A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 上海赛安生物医药科技有限公司 Pdgfra基因突变检测体系及其试剂盒
CN104830991A (zh) * 2015-05-29 2015-08-12 沈阳优吉诺生物科技有限公司 检测pdgfra基因d842v多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
CN104830991B (zh) * 2015-05-29 2018-04-27 沈阳优吉诺生物科技有限公司 检测pdgfra基因d842v多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
CN106011253A (zh) * 2016-06-15 2016-10-12 昆明理工大学 用于检测微量组织中pdgfra基因突变的引物组合及其应用
CN106011253B (zh) * 2016-06-15 2019-11-08 昆明理工大学 用于检测微量组织中pdgfra基因突变的引物组合及其应用
CN106636333A (zh) * 2016-09-28 2017-05-10 广东凯普生物科技股份有限公司 Pdgfra基因突变检测试剂盒
CN110938696A (zh) * 2019-12-21 2020-03-31 武汉百泰基因工程有限公司 一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒
CN110964824A (zh) * 2019-12-21 2020-04-07 武汉百泰基因工程有限公司 一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒
CN113913514A (zh) * 2020-07-09 2022-01-11 铭炽生物科技(上海)有限公司 人ctnnb1基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN114058701A (zh) * 2021-10-27 2022-02-18 上海科亦生物科技有限公司 一种C-kit和PDGFR突变检测试剂盒

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