CN106636333A - Pdgfra基因突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种PDGFRA基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑4；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PDGFRA基因Exon12和18两个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：5‑6；（3）2个装有PDGFRA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒中不同外显子的PCR扩增条件一致，能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

Description

PDGFRA基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因PDGFRA基因突变检测试剂盒。

背景技术

胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。PDGFRA基因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA)，为一种单链跨膜糖蛋白，与C-KIT同属III型酪氨酸蛋白激酶家族，且结构相似，两者的氨基酸序列有很高的同源性。PDGFRA与配体PDGF结合后形成受体配体复合物并活化PDGFRA，从而启动磷脂酰肌醇、cAMP及多种蛋白质的磷酸化通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，促进DNA合成，细胞分裂和增殖。当受体或配体发生异常突变，可导致恶性肿瘤。研究发现，PDGFRA基因D842V突变是导致GIST患者对格列卫产生原发耐药性的原因。PDGFRA突变与c-kit基因突变是相互独立的。因此，检测肿瘤患者PDGFRA基因突变的情况可用于判断格列卫(Imatinib/Glivec/Gleevec)治疗是否有效。

PDGFRA基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可以采用Sanger测序法检测PDGFRA基因的技术具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种PDGFRA基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PDGFRA基因主要突变位点型别，检测位点包括PDGFRA基因12和18两个外显子的主要突变位点，包括但不限于12号外显子上c. 1682T>A, p. V561D突变位点；18号外显子上c. 2525A>T, p. D842V突变位点。

本发明的PDGFRA基因突变检测试剂盒具体包括：

（1）用于扩增样本中PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，具体序列如下:

（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PDGFRA基因Exon12和18两个外显子进行测序分析，具体序列如下：

外显子	名称	序列号	Reverse 5’-3’
				12	SEQ-PD12	SEQ ID No.5	GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT
18	SEQ-PD18	SEQ ID No.6	ACCATGGATCAGCCAGTCTT

（3）2个装有PDGFRA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括12号外显子上c. 1682T>A, p. V561D突变位点；18号外显子上c. 2525A>T, p. D842V突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：

组份	体积（μl）
		10 PCR buffer	2.5
5 Q solution	5
		25mM MgCl2	0.75
25mM dNTPs	0.4
		H2O	11.1

其中10^× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH₄)₂SO₄，和15 mM MgCl₂；5^× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。

本试剂盒主是根据PDGFRA基因的Exon12和18两个外显子的保守序列分别设计PDGFRA基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon12和18两个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：

（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从PDGFRA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA，引物序列分别是SEQ ID NOs：1-4。。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ IDNOs：5-6。

（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。

（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因PDGFRA的Exon12和18两个外显子片段回收用于测序。

附图说明

以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1为 PDGFRA基因的Exon12和18两个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图1中各标号的具体表示如下：

1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；4：4号样本；5：5号样本；6：6号样本；P12：PDGFRA基因第12号外显子；P18：PDGFRA基因第18号外显子；M：DNA maker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。

图2-1为PDGFRA基因的Exon12外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。

图2-2为PDGFRA基因的Exon12外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。

图2-3为PDGFRA基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。

图2-4为PDGFRA基因的Exon18外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。

具体实施方式

1、引物设计

根据PDGFRA基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从PDGFRA基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID Nos：1-4。

测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID Nos：5-6。

2、PCR扩增

2.1、质控品准备

阳性质控品为PDGFRA野生型和突变型质粒按质量比1:1的比例混合，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。

2.2、试剂配制

提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。

确定反应数N，N=待检样本数（n）×2+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：

组分	PCR mix（即PCR反应预混液）	Taq酶
			体积（μl）	19.75×N	0.25×N

取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。

2.3、加样

将PDGFRA阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。

2.4、PCR扩增

配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：

3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收

由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。

序列表

<110> 广东凯普生物科技股份有限公司

<120> PDGFRA基因突变检测试剂盒

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFRAEx12-F

<400> 1

tccagtcact gtgctgcttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFRAEx12-R

<400> 2

gcaagggaaa agggagtctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFRAEx18-F

<400> 3

accatggatc agccagtctt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFRAEx18-R

<400> 4

tgaaggagga tgagcctgac c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ-PD12

<400> 5

gcaagggaaa agggagtctt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ-PD18

<400> 6

accatggatc agccagtctt 20

Claims (3)

1.用于PDGFRA基因突变检测的Exon12和18两个外显子的引物，引物序列分别是SEQ IDNos：1-6。

2. PDGFRA基因突变检测试剂盒，包括：

（1）用于扩增样本中PDGFRA基因Exon12和18两个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-4；

（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PDGFRA基因Exon12和18两个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：5-6；

（3）2个装有PDGFRA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括12号外显子上c. 1682T>A, p. V561D突变位点；18号外显子上c. 2525A>T, p. D842V突变位点。

3.权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下组份组成：

其中10^× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH₄)₂SO₄，和15 mM MgCl₂；5^× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。