CN107937487B - 一种用于hla-a基因pcr扩增、基因分型的方法、引物组及试剂盒 - Google Patents

一种用于hla-a基因pcr扩增、基因分型的方法、引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于HLA‑A基因扩增、基因分型的方法、引物组及试剂盒，属于基因检测领域。该试剂盒由PCR扩增引物组、测序引物组、PCR buffer、Sequencing buffer、MgCl2、dNTPs和水组成。本发明方法扩增产物较短(<1.5kb)，对模板的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短。本发明提供的试剂和方法，可以作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能够完成HLA‑A位点的准确分型鉴定，具有重要的应用价值。可以为临床HLA配型提供更加准确的依据，为患者提供合适的移植供者，降低移植过程中的排异反应，提高器官移植的成功率和患者生存率。

Description

一种用于HLA-A基因PCR扩增、基因分型的方法、引物组及试 剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于HLA-A基因PCR扩增和基因分型的特异性引物组及试剂盒。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)，编码基因位于6号染色体短臂上，全长约4000Kb，是目前所知人类最复杂的遗传多态性系统，与人类的免疫系统功能密切相关。HLA又被称为移植抗原，是决定移植排斥反应高低的重要因素。在进行器官移植时，供者和受者之间HLA相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官患者长期存活率就越高；反之，就越容易发生排斥反应。因此，对HLA进行高效准确的分型对器官移植至关重要。
HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法以及分子生物学分型法。随着分子生物学技术的飞速发展，传统的血清学和细胞学分型方法已逐步被分子生物学分型方法所取代。现阶段，HLA分子分型方法主要有：多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)，多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应(PCR-SSOP)，基因芯片和测序分型(PCR-SBT)等。
以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA-A测序分型(PCR-SBT)方法是最准确可靠HLA-A基因分型方法，是世界卫生组织(WHO)推荐的HLA-A基因分型方法的“金标准”。
国际专利文献WO2011035550A1公开一种HLA基因扩增和基因分型方法及其相关引物，该专利还提供了HLA基因分型的方法以及所述方法中使用的扩增引物对和测序引物，应用本发明提供的扩增引物对和测序引物以及基因分型方法，能够在扩增全长基因的基础上进行基因分型，但是该技术使用一对引物对HLA-A基因的8个外显子进行扩增，HLA-A的全长基因为2.5kb，片段相对较长，因此扩增难度比较大，对DNA模板的要求较高，同时需要高保真的酶，高保真酶的成本较高，不能满足大规模样本HLA-A基因分型的需求。
因此，需要一种成本较低，准确率和分辨率高的HLA-A基因分型方法，用于大规模样本的HLA-A基因分型。
发明内容
为此，针对现有技术存在的HLA-A基因全长片段较长，DNA模板完整性要求高，扩增难度大，扩增成本高，不能满足大规模样本HLA-A分型的问题，本发明提供一种用于HLA-A基因扩增和基因分型的特异性引物组及试剂盒。
为解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种新的用于HLA-A基因PCR扩增的方法，在同一反应体系和同一PCR扩增条件下对HLA-A基因的8个外显子区进行PCR扩增；采用第一组引物PCR扩增HLA-A基因第1个外显子至第3个外显子，采用第二组引物PCR扩增HLA-A基因第4个外显子至第8个外显子；
优选的，所述第一组引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第二组引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.5所示。
所述反应体系的组成如下：
10×PCR buffer:2μl
MgCl2(50mM):1μl
dNTP(25mM):0.5μl
A-F1(5μM):1.0μl
A-R1(5μM):1.0μl
A-F2-1(5μM):0.8μl
A-F2-2(5μM):0.8μl
A-R2(5μM):1.0μl
DNA模板(20-50ng/μl):2μl
Taq酶:0.15μl
加ddH2O至:20μl。
所述PCR扩增条件如下：
96℃2min
96℃30Sec,65℃30Sec,72℃2min(5个循环)
96℃30Sec,62℃30Sec,72℃2min(35个循环)
10℃∞。
所述第一组引物PCR扩增HLA-A基因片段长度为1.1kb，所述第二组引物PCR扩增HLA-A基因片段长度为1.4kb。
本发明还提供一种用于同一反应体系和同一PCR扩增条件下对HLA-A基因的8个外显子区进行PCR扩增的引物组，用于PCR扩增HLA-A基因第1个外显子至第3个外显子的第一组引物和用于PCR扩增HLA-A基因第4个外显子至第8个外显子的第二组引物；所述第一组引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第二组引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供一种HLA-A基因高分辨率测序分型的方法，包括如下步骤：
S1：从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA；
S2：以第一组引物和第二组引物作为PCR扩增引物，以S1中获得的DNA为模板，在一个PCR反应体系中同时PCR扩增出HLA-A基因的第1外显子至第3外显子，和第4外显子至第8外显子；
S3：将S2步骤中扩增出的PCR产物进行纯化后分别进行测序扩增；
S4：将步骤S3中的测序扩增结果与标准HLA-A基因序列进行比对，确定待测样本DNA中HLA基因的型别；
所述第一组引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第二组引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.5所示。
所述PCR扩增反应条件为：96℃预变性2min，随后96℃，30s；65℃，30s；72℃，2min，共5个循环，之后96℃，30s；62℃，30s；72℃，2min，共35个循环，最后将反应液放置于10℃保存。
所述S3步骤中测序扩增用的测序引物序列如SEQIDNO.6～SEQIDNO.11所示。
所述S3步骤中，测序扩增反应体系为：
测序引物(5μM):0.75μl
测序模板DNA:2.0μl
BigDyeTM Terminator Mix(ABI):0.25μl
5×Sequencing buffer(ABI):2.0μl
加ddH2O至:10μl。
所述S3步骤中，测序扩增程序如下：
96℃1min
96℃10Sec,60℃2min(40个循环)
10℃∞
本发明还提供一种用于人类白细胞抗原HLA-A基因的第2外显子、第3外显子和第4外显子正反向双向测序的测序扩增引物组，引物序列如SEQIDNO.6～SEQIDNO.11所示。
本发明还提供一种用于HLA-A基因PCR扩增和基因分型的试剂盒，包括第一组引物、第二组引物及测序引物；所述第一组引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第二组引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.5所示；以及如SEQIDNO.6～SEQIDNO.11所示的测序扩增引物序列。
本发明还包括PCR buffer、Sequencing buffer、MgCl2、dNTPs和水。
本发明技术方案与现有技术相比具有如下优点：
1.本发明提供的用于HLA-A基因扩增的方法，扩增的产物较短(<1.5kb)，对模板的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短。
2.本发明提供的用于HLA-A基因扩增的方法，可以分别对HLA-A基因的第1外显子至第3外显子，以及第4外显子至第8外显子进行特异性扩增，同时两个反应可在同一个体系内进行。
3.本发明提供的用于HLA-A基因扩增的方法，不需要使用长片段扩增专用的昂贵、高热稳定和高保真性的DNA聚合酶，并且一个反应体系内即可完成两个片段的同时性扩增，因此在不增加操作步骤的基础上，有效地降低了成本。
4.本发明提供的5条PCR扩增引物，在引物设计时考虑了等位基因序列不一致的情况，在序列不一致时，设计一条新的等位基因组特异性引物，因此比常规引物多1条引物，为5条引物。考虑等位基因序列不一致的情况，可以保证扩增序列的完整性，同时扩增效果好。
5.本发明提供的用于HLA-A基因扩增和基因分型的试剂盒包括了第一组引物、第二组引物、测序引物、PCR buffer、Sequencing buffer、MgCl2、dNTPs和水，可以与市面上大多数Taq酶配套使用，不仅有效降低了实验成本，同时增加了试剂盒适用性。
6.本发明提供的用于HLA-A基因扩增和基因分型的试剂盒可以满足大规模HLA-A基因分型的需求，具有高效、快速等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中引物组扩增区域示意图；
其中E，Exon外显子；In，intron内含子；F，fragment，扩增片段；
图2为本发明实施例1中8个样本HLA-A基因1-8号外显子多重PCR产物电泳检测结果；
图3为本发明实施例2中对96个样本进行HLA-A基因高分辨率分型的结果；
附图标记说明：
E-外显子；In-内含子；F-扩增片段。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1 HLA-A基因的扩增
1.样本DNA提取
使用QlAamp血液提取试剂盒(QIAGEN)对96份已知HLA-A基因型别的血液样本提取DNA。采用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行浓度测定，将提取得到DNA样品浓度调整至20-50ng/μl。
2.设计HLA-A基因扩增引物
根据IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)中最新的HLA-A基因序列，如图1所示，HLA-A基因有8个外显子，寻找多组(每组两个)合适的保守区域，并且保证每组保守区域能够覆盖HLA-A基因的8个外显子区。在找到的多组保守区域内，分别设计合适的扩增引物，当遇到几种等位基因序列不一致时，采用简并碱基，或设计一条新的等位基因组特异性扩增引物。最重要的是，保证设计出的每组候选引物具有相似的物理特性和反应动力学，以便能在同一条件下进行扩增反应。经过筛选确定两组引物，第一组引物为A-F1和A-R1，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，利用第一组引物能够扩增出HLA-A基因的第1外显子至第3外显子区域；第二组引物为A-F2-1、A-F2-2和A-R2，序列分别如SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.5所示，利用第二组引物能够扩增出HLA-A基因的第4外显子至第8外显子区域。
3.HLA-A基因PCR扩增
(1)向标记好的离心管加入表1所示的PCR反应混合液。首先将10×PCR buffer、MgCl2、dNTP、A-F1、A-R1、A-F2-1、A-F2-2和A-R2配制成PCR扩增预混液，然后将稀释好的DNA样品、PCR扩增预混液和Taq酶配成PCR反应液。
表1：PCR扩增反应体系
试剂名称 体积
10×PCRbuffer 2μl
MgCl<sub>2</sub>(50mM) 1μl
dNTP(25mM) 0.5μl
A-F1(5μM) 1μl
A-R1(5μM) 1μl
A-F2-1(5μM) 0.8μl
A-F2-2(5μM) 0.8μl
A-R2(5μM) 1μl
DNA模板(20-50ng/μl) 2μl
Taq酶 0.15μl
ddH<sub>2</sub>O 9.75μl
总体积 20μL
(2)将步骤(1)中的PCR反应液放到GeneAmp PCR system 9700仪上进行PCR反应，扩增条件如下:
(3)将步骤(2)得到的PCR反应产物取5μl进行1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测。图2显示了其中8个样品的HLA-A基因PCR扩增条带：每一个扩增样品均有两条特异性扩增条带，下方条带长度为1.1kb，表示第1外显子至第3外显子的长度；上方条带长度为1.4kb，表示第4外显子至第8外显子的长度。其他样品的结果与此相同。
上述结果表明第一组引物和第二组引物能够分别对HLA-A基因的第1外显子至第3外显子，以及第4外显子至第8外显子进行特异性扩增，同时两个反应可在同一个反应体系内进行，因此大大缩短了扩增时间，简化了反应步骤，有效地降低了成本。
实施例2 HLA-A基因分型
(1)PCR产物纯化和稀释
分别取2μl加入到实施例1中的得到的各PCR扩增产物中，将样品板放到PCR仪上，启动酶纯化程序：37℃温育15min，85℃酶灭活15min。纯化程序完成后，用无菌水按照1:3比例对样品进行稀释。
(2)测序扩增
分别配制HLA-A基因第2外显子、第3外显子和第4外显子的测序扩增反应体系，反应体系如表2所示。
表2：测序扩增反应体系
试剂名称 体积
正向测序引物(5μM) 0.75μl
反向测序引物(5μM) 0.75μl
测序模板DNA 2μl
BigDye<sup>TM</sup> Terminator Mix 0.25μl
5×Sequencing buffer 2μl
ddH<sub>2</sub>O 4.25μl
总体积 10μL
HLA-A基因第2外显子、第3外显子和第4外显子的测序正向引物分别为SA-2F、SA-3F和SA-4F，序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示；第2外显子、第3外显子和第4外显子的测序反向引物分别为SA-2R、SA-3R和SA-4R，序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示。
将正向测序引物、反向测序引物、5×Sequencing buffer和ddH2O预先配置成测序预混液，之后将7.75μl测序预混液，0.25μl BigDyeTM Terminator Mix(Cycle SequencingKit Version 3.1)，2μl步骤(1)中纯化稀释的PCR产物混合，震荡混匀后,瞬时离心，将样品放在GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)仪器上，按照以下测序扩增程序进行测序扩增：
(3)测序扩增产物纯化
将步骤(2)中得到的测序扩增产物采用乙醇/EDTA法进行纯化，具体步骤如下：
a.向测序扩增产物中加入2.5μl 125mM EDTA，震荡混匀，最大转速离心15s；
b.加入30μl无水乙醇，充分混匀，室温避光放置10min；
c.在4℃下，2250g离心30min；
d.将反应管倒扣，转速100g离心1min；
e.向反应管中加入50μl新鲜配制的80％乙醇，之后在4℃，2250g离心30min；
f.将反应管倒扣，100g离心1min；
g.取出反应管，室温避光放置10min，至乙醇彻底挥发；
h.向反应管中加入10μl高纯甲酰胺，充分震荡混匀后，瞬时离心，准备上机测序。
(4)上机测序
将步骤(3)中纯化好的样品放入ABI 3130xl测序仪中进行测序；
作为进一步的变性，还可以将步骤(3)中纯化好的样品放入ABI3730xl测序仪中进行测序。
(5)结果分析
参考IMGT的最新HLA数据库，使用专业分型软件Sequence Pilot对测序结果进行分析比对，得到HLA-A基因的分型结果。如图3所示，本实施的所有96个样本的分型结果均达到了高分辨率分型结果标准，且与已知的样本HLA-A分型结果完全一致。
对比例1
采用国际专利文献WO2011035550A1实施例1所公开的基因分型方法(记为X1)进行基因分型。
用已知分型的样品，采用本发明方法及X1分型方法对比，均与已知分型结果一致。
PCR扩增:用X1方法，基因扩增难度大，且必须用高保真Taq酶，而本发明方法，仅需要用普通Taq酶即可以扩增出目的条带。本发明方法扩增效果好，如图2所示，电泳图中可以清晰的看到PCR扩增产物为1.2kb(第1外显子至第3外显子)和1.4kb(第4外显子至第8外显子)两条特异性条带。
显然，上述实施例仅是为清楚说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司
<120> 一种用于HLA-A基因PCR扩增、基因分型的方法、引物组及试剂盒
<130> HA201702444
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
ggatactcac gacgcggac 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 2
ccaattgtct cccctccttg tg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
ggtgtsctgt ccattctcaa gata 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 4
ggtgtcctgt ccattctcaa gatg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 5
cacaaaggga agggcaggaa caa 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 6
cctctgyggg gagaagcaa 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 7
ctcggacccg gagactgt 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 8
gtttcatttt cagtttaggc ca 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 9
gaggccagcc cgggaga 17
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 10
tccattctca agatrgccac atg 23
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 11
gaggctcctg ctttccta 18

Claims (10)

1.一种用于HLA-A基因PCR扩增的方法，其特征在于，在同一反应体系和同一PCR扩增条件下对HLA-A基因的8个外显子区进行PCR扩增；采用第一组引物PCR扩增HLA-A基因第1个外显子至第3个外显子，采用第二组引物PCR扩增HLA-A基因第4个外显子至第8个外显子；所述第一组引物序列如SEQID NO.1和SEQID NO.2所示，所述第二组引物序列如SEQID NO.3～SEQID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的组成如下：
10×PCR扩增缓冲液，2μl
MgCl2，50mM，1μl
dNTP，25mM，0.5μl
第一组引物A-F1，其序列如SEQ ID NO.1所示，5μM，1.0μl
第一组引物A-R1，其序列如SEQ ID NO.2所示，5μM，1.0μl
第二组引物A-F2-1，其序列如SEQ ID NO.3所示，5μM，0.8μl
第二组引物A-F2-2，其序列如SEQ ID NO.4所示，5μM，0.8μl
第二组引物A-R2，其序列如SEQ ID NO.5所示，5μM，1.0μl
DNA模板，20-50ng/μl，2μl
Taq酶，0.15μl
加ddH2O至:20μl；
所述PCR扩增条件如下：
96℃2min；
96℃30Sec,65℃30Sec,72℃2min，共5个循环；
96℃30Sec,62℃30Sec,72℃2min，共35个循环；
10℃∞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一组引物PCR扩增HLA-A基因片段长度为1.1kb，所述第二组引物PCR扩增HLA-A基因片段长度为1.4kb。
4.一种用于同一反应体系和同一PCR扩增条件下对HLA-A基因的8个外显子区进行PCR扩增的引物组，其特征在于，用于PCR扩增HLA-A基因第1个外显子至第3个外显子的第一组引物和用于PCR扩增HLA-A基因第4个外显子至第8个外显子的第二组引物；所述第一组引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第二组引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5所示。
5.一种HLA-A基因高分辨率测序分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA；
S2：以第一组引物和第二组引物作为PCR扩增引物，以S1中获得的DNA为模板，在一个PCR反应体系中同时PCR扩增出HLA-A基因的第1外显子至第3外显子，和第4外显子至第8外显子；
S3：将S2步骤中扩增出的PCR产物进行纯化后分别进行测序扩增；
S4：将步骤S3中的测序扩增结果与标准HLA-A基因序列进行比对，确定待测样本的HLA基因的型别；
所述第一组引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第二组引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.5所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增反应条件为：96℃预变性2min，随后96℃，30Sec；65℃，30Sec；72℃，2min，共5个循环，之后96℃，30Sec；62℃，30Sec；72℃，2min，共35个循环，最后将反应液放置于10℃保存。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述S3步骤中测序扩增用的测序引物序列如SEQIDNO.6～SEQIDNO.11所示。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述S3步骤中，测序扩增反应体系为：
测序引物，5μM，各0.75μl
测序模板DNA，2.0μl
ABI的BigDyeTM Terminator Mix，0.25μl
ABI的5×测序缓冲液，2.0μl
加ddH2O至:10μl；
所述S3步骤中，测序扩增程序如下：
96℃1min；
96℃10Sec,60℃2min，共40个循环；
10℃∞。
9.一种用于HLA-A基因PCR扩增和基因分型的试剂盒，其特征在于，包括第一组引物、第二组引物及测序引物组；所述第一组引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第二组引物序列如SEQIDNO.3～SEQIDNO.5所示；以及如SEQIDNO.6～SEQIDNO.11所示的测序扩增引物序列。
10.根据权利要求9所述的用于HLA-A基因PCR扩增和基因分型的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增缓冲液、测序缓冲液、MgCl2、dNTPs和水。
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