CN109852682A

CN109852682A - Hla-a等位基因测序分型试剂盒

Info

Publication number: CN109852682A
Application number: CN201811597151.4A
Authority: CN
Inventors: 张倩; 刘克瑶; 周云丽; 王林林
Original assignee: Yinfeng Gene Technology Co Ltd; Yinfeng Biological Group Ltd
Current assignee: Yinfeng Gene Technology Co Ltd; Yinfeng Biological Group Ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明公开了HLA‑A基因检测试剂盒，包括用于扩增HLA‑A基因2、3、4外显子的1对特异性引物，如SEQ ID NO.1、2所示，以及用于测序测序2、3、4外显子的5条特异性引物，如SEQ ID NO.3～7所示。本发明还公开了HLA‑A基因分型的检测方法：利用SEQ ID NO.1、2所示的扩增引物进行PCR扩增，然后利用SEQ ID NO.3～7所示的测序引物进行测序，从而确定HLA基因的型别。本发明的试剂盒和方法，全部为自主研发的试剂，检测成本低，分型准确率和分辨率高，可用于大规模的HLA‑A分型。

Description

HLA-A等位基因测序分型试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于HLA-A等位基因测序分型的试剂盒，属于基因检测技术领域。

背景技术

人类白细胞抗原(简称HLA)编码基因位于6号染色体短臂上，是目前所知人类最复杂的遗传多态性系统，与人类的免疫系统密切相关，不仅与移植前供体与受体配型有关，而且与自身免疫性疾病也密切相关。HLA分型经历了血清学分型、细胞学分型和DNA分型三个阶段。目前基因分型成为HLA分型的主要方法，并已逐渐取代另外两种方法。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法是最准确最可靠的HLA基因分型方法，是世界卫生组织(WHO)推荐的HLA基因分型方法的“金标准”，PCR-SBT具有结果准确和自动化程度高等优点，能进行序列识别和分型。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种HLA-A等位基因测序分型试剂盒，本发明的HLA-A检测分型试剂盒中用的试剂全部为自主研发的试剂，检测成本低，分型准确率和分辨率高，可用于大规模的HLA-A分型。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种HLA-A基因检测试剂盒，包括用于扩增的1对特异性引物(用于扩增HLA-A基因2、3、4外显子)，以及用于测序分析的5条特异性引物(用于测序2、3、4外显子)，其中，用于扩增的1对特异性引物的核苷酸序列如下所示：

ampAF：5'-GACTGTGGGGAGAAGCTC-3'；如SEQ ID NO.1所示；

ampAR：5'-CCAAATGATGCCCACGATA-3'；如SEQ ID NO.2所示；

所述用于测序分析的5条特异性引物的核苷酸序列如下所示：

seqA2F：5'-TGGGGCAGGTCTCAGTC-3'；如SEQ ID NO.3所示；

seqA2R：5'-CACTCGGCCTCGCTCTGG-3'；如SEQ ID NO.4所示；

seqA3F：5'-GGGCTCGGCGGACTGGG-3'；如SEQ ID NO.5所示；

seqA3R：5'-GAGGCGCCGGCTGGC-3'；如SEQ ID NO.6所示；

seqA4F：5'-GTCCTGGAGGAGTCTCCC-3'；如SEQ ID NO.7所示。

其中，测序2外显子的引物为seqA2F、seqA2R，测序3外显子的测序引物为seqA3F、seqA3R，测序4外显子的测序引物为seqA4F。

进一步地，所述HLA-A基因检测试剂盒由扩增部分和测序部分组成，扩增部分包括以下组分：PCR buffer(含镁离子)，dNTP Mix，Taq酶和扩增引物ampAF和ampAR；所述Taq酶选用TAKARA LA Taq；测序部分包括以下组分：BigDye v3.1，BigDye v3.1Buffer，测序引物seqA2F，seqA2R，seqA3F，seqA3R、seqA4F。

HLA-A基因分型的检测方法，包括以下步骤：

(1)常规方法提取待测样本基因组DNA；

(2)利用上述用于扩增的2条特异性引物(SEQ ID NO.1、2所示)，对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到含有HLA-A基因2、3、4外显子的扩增产物；

(3)扩增产物段电泳，并纯化；

(4)纯化，利用上述用于测序分析的特异性引物(SEQ ID NO.3～7所示)分别测序2、3、4外显子，得到测序产物；

(5)测序产物变性、纯化、上机测序，得到测序结果；

(6)将上述测序结果与数据库(国际组织IMGT数据库)中的HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。

进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的反应条件为：96℃，2min；98℃，10s→66℃，30s→72℃，3min(35个循环)；72℃，5min；12℃保持。

进一步地，所述步骤(4)中测序的反应条件为：96℃，10s；96℃，10s→50℃，10s→60℃，2min(25个循环)；12℃保持。

本发明的基本原理是：HLA-A位点的多态性复杂，等位基因有4340个，因此要在有限的保守区设计能同时扩增HLA-A位点2、3、4外显子的扩增引物，并针对不同的外显子再设计测序引物。

本发明的HLA-A基因测序试剂盒的试剂均为自行配置并优化，大大降低了试剂成本。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：HLA-A基因扩增产物电泳图。

图2：HLA-A基因测序峰图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1引物的设计和筛选

本发明所涉及的引物都是使用引物设计软件Primer Premier 5设计所得，共设计扩增引物8对，2外显子测序引物5条，3外显子测序引物15条，4外显子测序3条。这8对引物扩增后通过电泳筛选出2对电泳条带单一、清晰且无非特异性条带的扩增引物，并命名为：

ampAF：5'-GACTGTGGGGAGAAGCTC-3'；SEQ ID NO.1；

ampAR：5'-CCAAATGATGCCCACGATA-3'；SEQ ID NO.2；

对这2对引物的扩增产物纯化并测序，测序引物使用自主设计的23条引物，根据测序结果选择测序峰图完整、单峰波形紧凑无杂峰、杂合峰不漏型的测序引物5条，并命名为：

seqA2F：5'-TGGGGCAGGTCTCAGTC-3'；SEQ ID NO.3；

seqA2R：5'-CACTCGGCCTCGCTCTGG-3'；SEQ ID NO.4；

seqA3F：5'-GGGCTCGGCGGACTGGG-3'；SEQ ID NO.5；

seqA3R：5'-GAGGCGCCGGCTGGC-3'；SEQ ID NO.6；

seqA4F：5'-GTCCTGGAGGAGTCTCCC-3'；SEQ ID NO.7。

上述引物通过已知型别的常见型和罕见型放大实验后，分型全部正确。

应用实例：HLA-A基因分型的检测

1.样本DNA提取：按照天根公司的全自动DNA提取试剂盒操作说明书进行提取，采用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行浓度测定，将提取得到DNA样品浓度调整至20-50ng/μl。

2、HLA-A基因PCR扩增：使用扩增引物对步骤1中提取的基因组DNA进行扩增，扩增过程和反应体系如下：

PCR扩增反应条件为：96℃，2min；98℃，10s→66℃，30s→72℃，3min(35个循环)；72℃，5min；12℃保持。

PCR反应体系为20μl，其组成如表1所示。

表1

扩增所得PCR产物的电泳图如图1所示，结果表明得到目的基因片段。

3、PCR产物纯化：EXO-rSAP法，纯化体系为9μl，其组成为：EXO-rSAP MIX：4μl；PCR产物：5μl。

纯化反应条件：37℃15min；80℃20min；4℃保持。

4.使用测序引物对纯化后的扩增产物进行测序扩增：

使用HLA-A位点第2、3、4测序引物seqA2F，seqA2R，seqA3F，seqA3R，seqA4F分别测序扩增HLA-A第2、3、4外显子，测序扩增程序和测序扩增反应体系如下：

测序反应条件：96℃，10s；96℃，10s→50℃，10s→60℃，2min(25个循环)；12℃保持。

测序反应体系为10μl，其组成如表2所示。

表2

BigDye v3.1	0.3μl
		BigDye v3.1 Buffer	1.7μl
测序引物(10pM)	1μl
		无核酸酶水	6μl
纯化产物	1μl

按照常规方法纯化测序产物。

5、测序上机

填写测序上机登记表，编辑测序反应文件名，据此顺序建立测序文件。使用ABI公司3730测序仪对纯化后的测序产物进行测序，测序结果如图2所示峰图完整、单峰波形紧凑无杂峰、杂合峰分散率在50％左右，无漏型风险。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 银丰基因科技有限公司

银丰生物工程集团有限公司

<120> HLA-A等位基因测序分型试剂盒

<141> 2018-12-26

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gactgtgggg agaagctc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccaaatgatg cccacgata 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tggggcaggt ctcagtc 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cactcggcct cgctctgg 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gggctcggcg gactggg 17

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gaggcgccgg ctggc 15

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gtcctggagg agtctccc 18

Claims

1.HLA-A基因检测试剂盒，其特征在于：包括用于扩增HLA-A基因2、3、4外显子的1对特异性引物，以及用于测序测序2、3、4外显子的5条特异性引物，其中，用于扩增的1对特异性引物的核苷酸序列如下所示：

ampAF：5'-GACTGTGGGGAGAAGCTC-3'；如SEQ ID NO.1所示；

ampAR：5'-CCAAATGATGCCCACGATA-3'；如SEQ ID NO.2所示；

所述用于测序分析的5条特异性引物的核苷酸序列如下所示：

seqA2F：5'-TGGGGCAGGTCTCAGTC-3'；如SEQ ID NO.3所示；

seqA2R：5'-CACTCGGCCTCGCTCTGG-3'；如SEQ ID NO.4所示；

seqA3F：5'-GGGCTCGGCGGACTGGG-3'；如SEQ ID NO.5所示；

seqA3R：5'-GAGGCGCCGGCTGGC-3'；如SEQ ID NO.6所示；

seqA4F：5'-GTCCTGGAGGAGTCTCCC-3'；如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的HLA-A基因检测试剂盒，其特征在于：所述HLA-A基因检测试剂盒由扩增部分和测序部分组成，扩增部分包括以下组分：PCR buffer(含镁离子)，dNTPMix，Taq酶和扩增引物ampAF和ampAR；所述Taq酶选用TAKARA LA Taq；测序部分包括以下组分：BigDye v3.1，BigDye v3.1Buffer，测序引物seqA2F，seqA2R，seqA3F，seqA3R、seqA4F。

3.权利要求1或2所述的HLA-A基因检测试剂盒在检测HLA-A基因分型中的应用。

4.HLA-A基因分型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)常规方法提取待测样本基因组DNA；

(2)利用SEQ ID NO.1、2所示的特异性引物，对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到含有HLA-A基因2、3、4外显子的扩增产物；

(3)扩增产物段电泳，并纯化；

(4)纯化，利用SEQ ID NO.3～7所示的特异性引物分别测序2、3、4外显子，得到测序产物；

(5)测序产物变性、纯化、上机测序，得到测序结果；

(6)将上述测序结果与数据库中的HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。

5.根据权利要求4所述的HLA-A基因分型的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增的反应条件为：96℃，2min；98℃，10s→66℃，30s→72℃，3min，35个循环；72℃，5min；12℃保持。

6.根据权利要求4所述的HLA-A基因分型的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中测序的反应条件为：96℃，10s；96℃，10s→50℃，10s→60℃，2min，25个循环；12℃保持。