CN109385482B - 牙鲆育性相关的snp分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

牙鲆育性相关的snp分子标记及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牙鲆育性相关的SNP分子标记及其筛选方法和应用。首先分别选择可育牙鲆和不育DH牙鲆进行cyp21a基因重测序，以初步筛选差异性SNP位点；选择在繁殖季节能正常产卵的可育群体和不能产卵的DH不育群体进行上述SNP位点的大规模验证；利用多重SNaPshot SNP分型方法对牙鲆在步骤（1）得到的SNP位点进行分型；用SPSS软件对分型成功的SNP位点基因型频率进行统计，利用卡方检验进行差异显著性分析，筛选出与牙鲆育性相关的SNP位点。本发明建立了一种牙鲆育性研究模型，提供了一种快速大量建立21OHD动物模型的方法，筛选得到了育性相关的cyp21a基因的SNP位点。

Description

牙鲆育性相关的SNP分子标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及21OHD(21羟化酶缺陷症)牙鲆模型育性相关的cyp21a基因SNP分子标记、筛选方法和应用。
背景技术
cyp21a定位于人类6p21.3，有真基因和假基因两个基因组成。cyp21a为编码21羟化酶的功能基因，其发生突变可导致21羟化酶结构改变而失去或降低活性，从而产生负反馈作用促使CRH、ACTH合成增加，导致肾上腺皮质增生，临床上表现为女性男性化，不育等症状(CAH)。目前为了研究由cyp21a突变引起的CAH，即21OHD，人们构建了自然突变的21OHD老鼠模型和cyp21a敲除后的斑马鱼模型，而老鼠模型存在很难养活的问题，斑马鱼模型存在仅能出现cyp21a敲除这一种突变体存在的问题。而人类的21OHD病因复杂，通常包括纯合子突变和复杂杂合子突变，其中纯合子突变以Val281Leu突变最为常见，其次是Pro30Leu，Arg339His，Pro453Ser突变，这些位点可能导致酶活性下降30％-60％。
所以，目前的人类育性相关的实验动物模型难以满足研究需要；因此需要构建一种能够满足人类育性相关的实验模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种牙鲆育性相关的SNP分子标记及其筛选方法和应用，并提供该分子标记的应用，以弥补现有技术的不足。
本发明发现通过雌核发育手段制备的双单倍体(DH)雌性牙鲆大多表现为不育，而不育个体的雄激素水平较高，ACTH激素水平显著性提高，同时，DH牙鲆的转录组结果显示：DH不育牙鲆cyp21a基因表达显著性降低。这一症状与人类由21羟化酶缺陷引起的CAH症有较多相似之处。现已确定与DH育性相关的SNP标记，可用于牙鲆分子标记辅助选育，同时可利用该标记筛选出仔鱼期的不育DH牙鲆作为21OHD动物模型，进行人类21OHD疾病的深入研究。同时，DH牙鲆存在制备手段简单，突变种类多，个体纯合度高，突变个体较多甚至能做到大规模制备的水平的优点。
本发明对可育牙鲆和不育DH牙鲆的cyp21a基因进行重测序，筛查SNP，与DH牙鲆育性性状进行关联分析，确定与育性性状相关的SNP标记，利用该标记用于牙鲆分子标记辅助选育，同时可利用该标记筛选出仔鱼期的不育DH牙鲆作为21OHD动物模型，进行人类21OHD疾病的深入研究。
一种牙鲆育性相关的SNP分子标记，如下：
SNP1-10，C-G位置Extron11-165，密码子CAG-GAG，氨基酸谷氨酰胺-谷氨酸，氨基酸位置487，非同义突变；
SNP3-1，C-G，位置Extron9-72，密码子CAG-CAC，氨基酸谷氨酰胺-组氨酸,氨基酸位置365，非同义突变；
SNP4，C-T位置Extron8-90,密码子GTT-GTC，氨基酸缬氨酸,氨基酸位置333，同义突变；
SNP7，C-T，位置Extron6-72,密码子TCC-TCT，氨基酸丝氨酸,氨基酸位置233，同义突变；
SNP9，A-G，位置Extron5-79,密码子TTG-CTG，氨基酸亮氨酸,氨基酸位置204，同义突变。
一种牙鲆育性相关的SNP分子标记筛选方法，包括以下步骤：
(1)分别选择可育牙鲆和不育DH牙鲆进行cyp21a基因重测序，以初步筛选差异性SNP位点；
(2)验证群体的选择：选择在繁殖季节能正常产卵的可育群体和不能产卵的DH不育群体进行上述SNP位点的大规模验证；
(3)利用多重SNaPshot SNP分型方法对牙鲆在步骤(1)得到的SNP位点进行分型；
(4)用SPSS软件对分型成功的SNP位点基因型频率进行统计，利用卡方检验进行差异显著性分析，筛选出与牙鲆育性相关的SNP位点。
上述DH牙鲆育性相关的SNP分子标记，能够用于构建人类21OHD动物实验模型，用于人类21OHD疾病研究。
本发明的优点和有益效果：
本发明建立了一种牙鲆育性研究模型，提供了一种快速大量建立21OHD动物模型的方法，筛选得到了育性相关的cyp21a基因的SNP位点。利用得到的SNP位点，筛选出仔鱼期的不育DH牙鲆可作为21OHD动物模型，进行人类CAH疾病的深入研究。
具体实施方式
1.cyp21a基因的SNP位点筛选
选择5龄可育牙鲆9尾和5龄不育双单倍体(DH)牙鲆9尾，分别进行cyp21a基因重测序，序列比对后确定显著性差异SNP位点。
1.1重测序实验方法
根据已公布的cyp21a基因序列设计引物(表1)，对每个个体进行PCR扩增和重测序。
表1.重测序用引物序列
Figure BDA0001869959840000021
Figure BDA0001869959840000031
1).PCR反应体系：(DNA 1ul，10*buffer 5ul，MgCL2 5ul，DNTP 1ul，引物1ul/条，Taq酶0.6ul，H2O补至50ul。)；反应条件：94℃预变性3min；94℃变性15s，55复性℃15s，72℃延伸30s，35cycles；72℃延伸3min。
2).PCR产物切胶纯化：
第一步，通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中。尽可能多地去掉不含目标DNA的琼脂糖。每管琼脂糖凝胶块不要超过400mg，否则导致溶胶不完全。切胶过程尽可能快，减少DNA在紫外线中的暴露时间以降低对DNA的损伤。
第二步，根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖加300～600μl的比例加入Buffer B2。
第三步，将离心管置于50℃水浴5～10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。胶块完全溶化即可，过长时间的处理可能导致DNA损伤。
第四步，将溶化好的溶液全部移入吸附柱，5000转离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
第五步，向吸附柱中加入500μl Wash Solution，5000转离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
第六步，重复步骤5一次。
第七步，将空吸附柱和收集管放入离心机，10000转离心1min。此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
第八步，在吸附膜中央加入30μl Elution Buffer，室温静置1～2min，1000转离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
3).测序反应:
第一步，确定测序反应体系：总体系5μl，单向引物1μl(测序时引物为实验前稀释好的单向引物，如正向或反向引物，用量固定为3.2μM)，纯化的PCR产物2μl(纯化的PCR产物所加的量根据琼脂糖凝胶检测的情况而定。若PCR扩增条带较弱，则多加一点，如加至3μl，此时则减少引物的体积(加1μl)以保证总体积5μl，但是引物总的含量不变，此时应调整引物的稀释倍数：稀释后的浓度应为3.2μmol/l)，BigDye Mix kit 1μl(Mix kit为标准用量的1/12，Mix Kit分装成40μl/管，每次用前先取90μl灭菌ddH2O于其中，反复吸打以混匀)。
第二步，设定反应程序：94℃1min；94℃20sec，50℃10sec，60℃4min；28cycles：4℃30min。
第三步，进行NH4AC.EDTA纯化：待测序反应结束后，将96孔板以3700rpm离心0.5min；每个孔中加1μl NH4AC.EDTA溶液，3700转离心0.5min；置于混匀器上震荡0.5min，3700转离心0.5min。
第四步，100％酒精沉淀：每个孔中加入18μl的100％乙醇溶液；将收集好的产物(96孔板)放置在-20℃下沉淀30min(或过夜)，然后在高速离心机下4500rpm离心30min；将96孔板倒扣(下垫2～3层吸水纸)400rpm离心2min。
第五步，75％酒精洗涤：每孔加50μl的75％酒精；4500rpm离心10min；将96孔板倒置(垫2～3层吸水纸)，400rpm离心2min。
第六步，干燥与变性：将96孔板竖起来，用风扇吹干10min；每孔加6μl Hi-Di，3700rpm离心1min，-20℃存放待上测序仪。
1.2重测序结果
经序列比对后，共获得23个SNP位点，其中9个SNP无多态性位点。运用一般线性模型(GLM)将剩余的14个有多态性位点的SNP的基因型与育性性状进行关联分析，具有显著性差异的SNP位点预设为育性相关SNP位点。
结果显示，5个SNP位点与18尾牙鲆的育性有显著关联。这5个SNP位点均位于编码区，其详细信息如下：SNP1-10，C-G位置Extron11-165,密码子CAG-GAG，氨基酸谷氨酰胺-谷氨酸，氨基酸位置487，非同义突变；SNP3-1，C-G，位置Extron9-72，密码子CAG-CAC，氨基酸谷氨酰胺-组氨酸,氨基酸位置365，非同义突变；SNP4，C-T位置Extron8-90,密码子GTT-GTC，氨基酸缬氨酸,氨基酸位置333，同义突变；SNP7，C-T，位置Extron6-72,密码子TCC-TCT，氨基酸丝氨酸,氨基酸位置233，同义突变；SNP9，A-G，位置Extron5-79,密码子TTG-CTG，氨基酸亮氨酸,氨基酸位置204，同义突变。筛选出相关的SNP位点后，进行大规模群体验证确定其与育性的相关性。
2.大规模验证群体的选择
在繁殖季节将能正常产卵并且受精卵能正常孵化仔鱼的5龄雌性群体定义为可育群体，而将不能产卵的5龄DH群体定义为不育群体。随机选取3尾可育个体和3尾不育个体进行组织学切片，鉴定其性腺发育程度，作为育性判别的标准之二。性腺的组织学切片结果显示不育牙鲆性腺抑制在发育前期，不能达到正常产卵状态。根据这一判断标准，共选出71个可育个体和63个不育个体作为5个SNP位点的大规模验证群体。
3.大规模验证群体的SNP分型
利用多重SNaPshot SNP分型方法对134尾牙鲆在5个SNP位点进行分型。
3.1技术原理：SNaPshot SNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP位点进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI3730测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。
3.2实验流程
1).位点信息及引物序列
根据cyp21a基因序列设计引物(表2,3)。
表2.大规模验证用引物序列
Figure BDA0001869959840000051
表3.延伸引物序列及延伸产物
Figure BDA0001869959840000052
Figure BDA0001869959840000061
2).多重PCR扩增
将合成好的引物用1*TE溶解到浓度为10pmol，将一组中的引物加到一起，混匀，离心。
配制PCR体系：
Figure BDA0001869959840000062
将配制的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2ulDNA样品，离心，上PCR仪。
扩增条件：
Figure BDA0001869959840000063
3).PCR产物纯化
PCR扩增后取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP
Figure BDA0001869959840000064
37℃15min，80℃15min，纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。
4).延伸反应
体系：
Figure BDA0001869959840000065
条件：
Figure BDA0001869959840000071
5).取1ul延伸产物，加10ul上样Hidi，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。
4.大规模群体验证结果
用SPSS软件对分型成功的5个SNP位点各在71尾可育群体和63尾不育群体中的基因型频率进行统计，利用卡方检验进行差异显著性分析，筛选牙鲆双单倍体不育相关基因标记，寻找不育相关位点，筛选出与DH牙鲆育性显著相关的SNP位点。结果如表4所示，经分析，这5个SNP位点的基因型频率在不育组和可育组中均为差异极显著(P<0.001)。进一步分析表明，不育群体在这些位点的纯合化与双单倍体牙鲆的不育性状显著性关联(P<0.001)(表4)。此外，SNP5和SNP6均为非同义突变，其中SNP5编码的蛋白质由谷氨酰胺突变为谷氨酸，SNP6编码的蛋白质由谷氨酰胺突变为组氨酸。而剩下的3个SNP均为同义突变。
表4.SNP标记基因型验证结果
Figure BDA0001869959840000072
注：F：可育群体；S：不育群体
序列表
<110> 中国水产科学研究院北戴河中心实验站
<120> 一种牙鲆育性相关的SNP分子标记及其应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtgttatg ccttgatgcc at 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctcaatct cctacagtta aagtg 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtacaagaat acaatcaaa 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atatacgagt gtgtgcaatt tggt 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagcagcgt gaccatct 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgttaagt accaccatgg 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accacactcg caacacct 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaggagagg gaggaggat 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgactcagg tcgggcagag acgcct 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgtctctga tggctctgtg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggtgcatg aggagttgtg 20
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgactgact gactgagcac aggacgggga gtct 34
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaatgttccc tgcctcgg 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctcctcaca gacactcac 19
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgactgact gactgactga ctgcctggct gaactggact gt 42
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagtctcctc gtgcttcc 18
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttagtatgac aagagttcct caga 24
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgactgact gactgactga ctgactgact tccagagcag taatccaggg 50
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaccaaact gtggagtgaa aga 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gattatcaag gaagtgctgt ggat 24
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctgactgact gactgactga ctgactgact gactccagta atgtcatcac cacc 54

Claims (2)

1.一种牙鲆育性相关的SNP分子标记引物序列组合，其特征在于，如下：
SNP1-10：上游引物：accacactcgcaacacct，下游引物：ggaggagagggaggaggat，延伸引物：ctgactcaggtcgggcagagacgcct；
SNP3-1：上游引物：ctgtctctgatggctctgtg，下游引物：atggtgcatgaggagttgtg，延伸引物：ctgactgactgactgagcacaggacggggagtct；
SNP4：上游引物：aaatgttccctgcctcgg，下游引物：gctcctcacagacactcac，延伸引物：ctgactgactgactgactgactgcctggctgaactggactgt；
SNP7：上游引物：gagtctcctcgtgcttcc，下游引物：ttagtatgacaagagttcctcaga，延伸引物：ctgactgactgactgactgactgactgacttccagagcagtaatccaggg；
SNP9：上游引物：aaaccaaactgtggagtgaaaga，下游引物：gattatcaaggaagtgctgtggat，延伸引物：ctgactgactgactgactgactgactgactgactccagtaatgtcatcaccacc。
2.权利要求1所述的牙鲆育性相关的SNP分子标记引物序列组合在构建人类21OHD动物实验模型中的应用，该应用不包括疾病的诊断和治疗目的 。
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