CN112609006B - 人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用 - Google Patents

人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对HLA的模棱两可分型引物组，以及包含其的HLA测序分型的特异性引物组合物，以及相应的HLA基因分型方法。本发明通过增加模棱两可分型引物组，将普通HLA测序分型方法因模棱两可型别需要复查的比例从10‑15％有效的控制到了0.1％以下，节省了宝贵的医疗时间、人力成本和试剂成本。

Description

人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用
技术领域
本发明具体涉及人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用。
背景技术
人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)的编码基因位于第6号染色体短臂上，是构成移植排斥反应的重要抗原物质，在进行骨髓和器官移植时，供受者之间HLA相容程度越高，排斥反应的发生率越低，移植成功率和移植器官长期存活率越高；反之，则容易发生排斥反应。器官移植成功与否的关键在于控制移植物排斥反应，目前主要通过移植前检测供者和受者的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQB1、HLA-DRB1位点匹配情况预测可能的移植排斥反应。随着生命科学的发展，HLA基因在疾病辅助诊断，临床用药，免疫治疗和法医鉴定等领域显示了越来越重要的价值。过去HLA分型鉴定都是以血清学的方式进行，但该方法影响因素较多，会导致假阴性和假阳性结果，使准确性较低，而且获得的是低分结果。为了保证HLA分型结果的准确性和扩展临床应用，能够进行高分辨率分型的HLA核酸分型检测试剂盒(PCR-SBT)应运而生。设计与HLA基因相结合的特异性扩增引物，当引物序列与待测目标序列能完全匹配时，进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR反应结果进行检测分析，以确定目的基因是否扩增。经电泳初步鉴定的反应扩增物会被纯化进行下一步的测序分析，再利用分型软件对人类白细胞抗原进行分型鉴定。测序引物设计区域位于HLA各位点外显子表达区域的上下游，以充分鉴定各个等位基因的序列。虽然测序方法能够准确的给出高分辨率的分型结果，但由于模棱两可型别的存在，第一次测序分型的成功率在85％左右，15％的样本需要再次进行模棱两可型别的区分，导致实验时间延长了将近一倍，不利于结果的按时报告，同时也增加了人力和试剂成本。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种简便快捷检测HLA基因分型的方法，并且将人群复核比例控制在0.1％以下，以解决现有技术对模棱两可型别复查比例居高不下的问题。
本发明所述的模棱两可型别见表7中的高频模棱两可型别。
本发明提供针对HLA的模棱两可分型引物组，所述模棱两可分型引物组由序列66-序列78的单链DNA组成。
本发明还提供HLA测序分型的特异性引物组合，由上述针对HLA的模棱两可分型引物组、测序引物组、扩增引物组组成；所述扩增引物组由序列表序列1-序列39的单链DNA组成；所述测序引物组由序列表序列40-序列65的单链DNA组成。
本发明所提供的一种HLA测序分型系统，由X1和X2组成；所述X1为所述HLA测序分型的特异性引物组合物，所述X2为X2.1和/或X2.2:
X2.1、进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器；
X2.2、进行PCR测序所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、transfastpfu酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述transfastpfu酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。
上述系统中，所述进行PCR测序所需的试剂可含有BigDye测序试剂和/或酶解纯化产物；所述进行测序所需的仪器可为测序仪。
上述系统中，所述HLA测序分型的特异性引物组合和所述进行PCR扩增所需的试剂、所述进行PCR测序所需的试剂均可独立包装。所述HLA测序分型的特异性引物组合中的各条单链DNA均独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。
本发明还保护成套试剂，所述成套试剂由所述HLA测序分型的特异性引物组合物与所述进行PCR扩增所需的试剂和/或所述进行PCR测序所需的试剂组成。
本发明还提供一种非诊断目的的HLA基因分型方法，包括以所述扩增引物组扩增样本DNA后，以测序引物组和HLA的模棱两可分型引物组测序，根据测序结果分型。
所述非诊断目的的HLA基因分型方法，具体包括如下步骤：
S1、以所述扩增引物组扩增样本DNA:
S1.1、以序列1、序列2扩增样本DNA的HLA-A基因；
S1.2、以序列3、序列4扩增样本DNA的HLA-B基因；
S1.3、以序列5、序列6扩增样本DNA的HLA-C基因；
S1.4、以序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14扩增样本DNA的HLA-DQB1基因的第二外显子；
S1.5、以序列15、序列16、序列17扩增样本DNA的HLA-DQB1基因的第三外显子；
S1.6、以序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、序列25、序列26、序列27、序列28扩增样本DNA的HLA-DRB1基因的第二外显子；
S1.7、以序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35、序列36、序列37、序列38、序列39扩增样本DNA的HLA-DRB1基因的第三外显子；
S2、测序引物组和HLA的模棱两可分型引物组测序：
S2.1、以序列40、序列41、序列42、序列43、序列44、序列45作为测序引物，以序列66、序列67、序列68作为模棱两可分型引物，对HLA-A基因进行测序；
S2.2、以序列46、序列47、序列48、序列49、序列50、序列51作为测序引物，以序列69、序列70作为模棱两可分型引物，对HLA-B基因进行测序；
S2.3、以序列52、序列53、序列54、序列55、序列56、序列57作为测序引物，以序列71、序列72、序列73作为模棱两可分型引物，对HLA-C基因进行测序；
S2.4、以序列58、序列59作为测序引物，以序列74、序列75作为模棱两可分型引物，对HLA-DQB1基因第二外显子进行测序；
S2.5、以序列60、序列61作为测序引物，对HLA-DQB1基因第三外显子进行测序；
S2.6、以序列62、序列63作为测序引物，以序列76、序列77、序列78作为模棱两可分型引物，对HLA-DRB1基因第二外显子进行测序；
S2.7、以序列64、序列65作为测序引物，对HLA-DRB1基因第三外显子进行测序；
S3、根据测序结果分型。
本发明还提供上述针对HLA的模棱两可分型引物组、上述HLA测序分型的特异性引物组合物、上述HLA测序分型系统、上述成套试剂、上述HLA基因分型方法在HLA基因分型中的应用。
本发明通过增加模棱两可分型引物组，配合高效的HLA分型软件，可有效将人群HLA分型复查比例控制在了0.1％以下，节省了宝贵的医疗时间、人力成本和试剂成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供的PCR引物、测序引物和模棱两可分型引物见表1：
表1PCR引物、测序引物和模棱两可分型引物
Figure BDA0002874225940000041
Figure BDA0002874225940000051
注：表中，字母K代表T/G中的任一种核苷酸，字母R代表A/G中的任一种核苷酸，字母M代表A/C中的任一种核苷酸，字母S代表C/G中的任一种核苷酸，字母Y代表C/T中的任一种核苷酸；引物设计为避免序列形成高级结构和二聚体，引入校正碱基，以保证引物符合设计目的。
以表1的引物对1000例健康查体人的抗凝骨髓或全血样本进行进行人类白细胞抗原一步测序分型，具体步骤如下：
1.样本准备
1.1.样本处理和核酸提取
样本处理采用商品化的核酸提取试剂盒：对抗凝骨髓或全血样本，推荐使用天根生化科技(北京)有限公司核酸提取纯化试剂(血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒)(体外诊断试剂备案号：京海械备20150047)；北京旌准医疗科技有限公司核酸提取纯化试剂(OptiPure Blood DNA Extraction Kit)(体外诊断试剂备案号：京经械备20190154)；北京旌准医疗科技有限公司核酸提取纯化试剂(Blood DNA Extraction Kit)(体外诊断试剂备案号：京经械备20190156)中的任一种，具体操作详见试剂盒说明书，并注意以下事项：
1)提取DNA纯度需满足OD260/OD280＝1.6～2.0。且浓度应介于10-40ng/μL，不可将核酸样本溶解于含有超过0.5mM的螯化物(如EDTA)的溶液。
2)DNA上样30ng～120ng。
3)提取完的DNA即为检测样本DNA，立即进行检测，否则于-20℃±5℃保存。
2.PCR扩增
2.1.PCR扩增反应体系配制
2.1.1.提前将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10s，快速离心15s。
2.1.2.确定反应数N为51，N＝待检样本数+1＝50+1。计算见表2。
表2 PCR扩增反应体系配制
试剂 用量(μL)
PCR预混液 6×N
扩增引物X-F 1×N
扩增引物X-R 1×N
无核酸酶水 1×N
总体积 9×N
注：X表示A、B、C、DQB1-2、DQB1-3、DRB1-2、DRB1-3中的任一种。
2.1.3.每个样品准备扩增7个扩增片段，每个扩增片段使用1个离心管，具体7个离心管使用的引物分别如下：
1)HLA-A基因：以A-F作为扩增引物X-F，以A-R作为扩增引物X-R；
2)HLA-B基因：以B-F作为扩增引物X-F，以B-R作为扩增引物X-R；
3)HLA-C基因：以C-F作为扩增引物X-F，以C-R作为扩增引物X-R；
4)HLA-DQB1-2基因(扩增HLA-DQB1基因的第二外显子)：以DQB1-2-F1、DQB1-2-F2、DQB1-2-F3、DQB1-2-F4(按1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-F，以DQB1-2-R1、DQB1-2-R2、DQB1-2-R3、DQB1-2-R4(按1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-R；
5)HLA-DQB1-3基因(扩增HLA-DQB1基因的第三外显子)：以DQB1-3-F1、DQB1-3-F2(按1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-F，以DQB1-3-R1作为扩增引物X-R；
6)HLA-DRB1-2基因(扩增HLA-DRB1基因的第二外显子)：以DRB1-2-F1、DRB1-2-F2、DRB1-2-F3、DRB1-2-F4、DRB1-2-F5、DRB1-2-F6(按1:1:1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-F，以DRB1-2-R1、DRB1-2-R2、DRB1-2-R3、DRB1-2-R4、DRB1-2-R5(按1:1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-R；
7)HLA-DRB1-3基因(扩增HLA-DRB1基因的第三外显子)：以DRB1-3-F1、DRB1-3-F2、DRB1-3-F3、DRB1-3-F4、DRB1-3-F5、DRB1-3-F6、DRB1-3-F7(按1:1:1:1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-F，以DRB1-3-R1、DRB1-3-R2、DRB1-3-R3、DRB1-3-R4(按1:1:1:1的摩尔比混合)作为扩增引物X-R。
按表2配制反应体系，涡旋振荡15s，2000rpm离心15s。
2.2.加样
针对每个样品，将3μL待检测样本DNA分别加入7个对应的PCR反应管中，盖紧管盖，瞬时离心10s，如有气泡，轻弹、离心直至气泡去除，然后立即进行PCR反应。
2.3.PCR扩增程序设置
2.3.1.ABI 2720 PCR仪
反应条件设置见表3：
表3 ABI 2720型PCR仪反应程序
Figure BDA0002874225940000071
3.PCR产物的酶解纯化
分别加2μL消化酶于每个PCR产物中，涡旋振荡10s，2000rpm离心15s，于PCR仪上进行酶解纯化，程序见表4。
表4 酶解纯化程序
Figure BDA0002874225940000072
Figure BDA0002874225940000081
4.测序PCR反应
测序PCR反应：分别取测序试剂和测序引物加入PCR反应管中，再分别加入待测样本和阳性质控品的酶解纯化产物，涡旋振荡10s，快速离心15s，于PCR仪上进行PCR扩增，体系配制见表5。
表5 测序PCR反应体系配制
试剂 用量(μL)
BigDye测序试剂 1.5
HLA各位点测序引物 2.5
酶解纯化产物 1.0
总计 5.0
置于PCR仪中进行测序PCR反应，具体程序设置见表6。
表6 测序PCR反应程序
Figure BDA0002874225940000082
5.测序产物纯化
5.1.在每个反应孔内加入2μL醋酸钠溶液，5μL无核酸酶水，30μL乙醇，并贴上PCR封膜。配合适当强度震荡混合乙醇，震荡2min左右，2000g离心30min。
5.2.移除PCR封膜，倒置反应板在纸巾上，100g离心10sec。
5.3在每个反应孔内加入70μL预冷的80％乙醇，贴上PCR封膜，2000g离心5min。
5.4重复5.2步骤去除多余乙醇。
5.5将板子在室温下避光30min使酒精挥发干净。
6.上测序仪前准备步骤
6.1测序前，每个反应孔加入10μL甲酰胺(HiDi)，并贴上PCR封膜。
6.2离心后，使用PCR仪进行变性，
Figure BDA0002874225940000083
2分钟，使双链DNA变性为单链状态，上机测序。
针对7个管的测序引物具体如下：
1)HLA-A基因：以A-2-SF、A-3-SF、A-4-SF作为测序上游引物，以A-2-SR、A-3-SR、A-4-SR作为测序下游引物；同时使用模棱两可分型引物gssp01、gssp02、gssp03进行测序。
2)HLA-B基因：以B-2-SF、B-3-SF、B-4-SF作为测序上游引物，以B-2-SR、B-3-SR、B-4-SR作为测序下游引物；同时使用模棱两可分型引物gssp04、gssp05进行测序。
3)HLA-C基因：以C-2-SF、C-3-SF、C-4-SF作为测序上游引物，以C-2-SR、C-3-SR、C-4-SR作为测序下游引物；同时使用模棱两可分型引物gssp06、gssp07、gssp08进行测序。
4)HLA-DQB1-2基因：以DQB1-2-SF作为测序上游引物，以DQB1-2-SR作为测序下游引物；同时使用模棱两可分型引物gssp09、gssp10进行测序。
5)HLA-DQB1-3基因：以DQB1-3-SF作为作为测序上游引物，以DQB1-3-SR作为测序下游引物进行测序。
6)HLA-DRB1-2基因：以DRB1-2-SF作为作为测序上游引物，以DRB1-2-SR作为测序下游引物；同时使用模棱两可分型引物gssp11、gssp12、gssp13进行测序。
7)HLA-DRB1-3基因：以DRB1-3-SF作为作为测序上游引物，以DRB1-3-SR作为测序下游引物进行测序。
7.基因分析仪程序设置
7.1ABI 3500Dx基因分析仪
1)面板设置：双击“3500Dx”图标，输入用户名和密码，打开软件。观察“Dashboard”界面中“Consumables Information”，确认所有试剂耗材是否满足本次要求。在Dashboard界面中，点击“Create Plate from Template”进入样品板设置界面，点击“Define PlateProperties”输入相应信息。点击“Assign Plate Contents”，进入样本设置界面，双击样本孔，编辑样本名称。在“Assays”中选择“Sequencing”目录下的“Fast-Seq-Assay-POP7”，在“File Name Conventions”和“Results Group”中选择文件命名格式及结果保存目录。
2)电泳：点击软件界面下方的“Link Plate for run”，在弹出的对话框点击OK。在“Load Plate forrun”界面核对信息，并开始运行。
7.2ABI 3130XL基因分析仪
1)仪器设置：打开Data Collection 3.0软件：选择Start>Programs>AppliedBiosystems>Data Collection>Run Data Collection v3.0.或双击桌面快捷方式。等待Service Console窗口中的指示灯全部变成绿色后，DC软件的界面打开。选择GAInstruments>ga3130>instrument name>Plate Manager.点击New按钮，在弹出窗口中分别输入以下信息(样本板名称，相应测序程序，选择96孔板，输入操作者所有者姓名)，点击ok，在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中，填入相关内容，在Sample Name栏中填入样品名，在Comments栏中填入相关描述，在Results Group、Instrument Protocol、Analysis Protocol栏中分别选择已创建好的选项。点击ok。
2)运行程序：选择GA Instruments>GA 3130>instrument name>Run Scheduler。将样品板放到自动进样器上，注意板的方向，此时RunScheduler界面中板的指示块由灰色变为黄色，点击Find All按钮，找到样品板的文件名，点击该文件名后，再点击黄色的板的指示块，此时，指示块将右黄色变为绿色，在DC软件的工具栏中，点击绿色开始键，在随后的对话框中点击OK来开始运行。
8.基因分析仪结果分析
ABI 3500Dx/ABI 3130XL基因分析仪获得的结果采用“HLA(SBT)计算机辅助人工分型软件”(软件名称：“Sanger测序HLA_SBT分型软件”，证书号：软著登字第6086504号)进行结果分析。毛细管电泳测序质量控制要求，峰图清晰，无连峰。
表7 高频模棱两可型别表
Figure BDA0002874225940000101
注：*为HLA命名规则中的基因分隔符；：用于区分不同的域；|为模棱两可型别之间的分隔符，前后型别互为模棱两可；_为模棱两可中每组两个等位基因的连接符。
利用上述所提供的特异性引物可实现一次测序完成99.9％人群的HLA高分辨率分型结果，将普通HLA测序分型方法因模棱两可型别需要复查的比例从10-15％有效的控制到了0.1％以下，达到了一步法测序分型即可完成高分辨率型别的报告。
本发明方法的局限性
(1)本发明方法的检测结果仅供临床参考。
(2)当样本DNA浓度低于试剂盒的最低检测限(10ng/μL)时，可能无法准确检出。
(3)存在多个等位基因在分析区内的序列完全相同的情况，其区分位点于所测序区域之外。
(4)两对等位基因之杂合碱基组合相同，且无法以本方法中的gssp引物区时，将出现模棱两可结果。
实施例2
根据实施例1所用的引物和试剂，制备试剂盒。该试剂盒包括特异性的HLA扩增引物，测序引物，高频模棱两可型区分引物，以及PCR扩增和测序试剂。具体如下：
试剂盒的主要成分
见表8(具体引物序列见表1):
表8 主要组成成分
Figure BDA0002874225940000111
Figure BDA0002874225940000121
Figure BDA0002874225940000131
Figure BDA0002874225940000141
注意：本试剂盒各组分不同批次间不可以相互替换，且不可与其他产品相应组分进行替换。
另外，本试剂盒不包含但实验必需的设备、试剂及耗材：PCR仪、基因分析仪、核酸提取试剂、生物安全柜、高速冷冻离心机、干式恒温仪、旋涡混合器、微型离心机、移液器及吸头、离心管、PCR反应管、96孔PCR板、无水乙醇、醋酸钠EDTA溶液(1.5M/250mM，pH>8)、Hi-Di Formamide。
试剂盒的储存条件和有效期
-20℃±5℃避光保存，有效期12个月。
开封后，-20℃±5℃条件下保质期为3个月，反复冻融不得超过3次。
试剂盒适用仪器
PCR仪器：适用于9700 ABI 2720型PCR仪、Veriti型PCR仪。
基因分析仪器：适用于ABI 3500 Dx型基因分析仪。
样本要求
1.样本类型：抗凝全血或骨髓。
2.样本采集：
常规全血采集方法抽取全血样本后置于EDTA抗凝管中，并立即上下颠倒混匀(5～10次，不可用力振荡)，使之与抗凝剂充分混匀。
3.样本保存：抗凝全血样本于2℃～8℃保存不超过7天，-20℃±5℃保存不超过6个月。
以上实施例表明本发明简便快速的利用一代测序技术进行HLA基因分型。利用本发明所提供的特异性引物可实现一次测序完成99.9％人群的HLA高分辨率分型结果，将普通HLA测序分型方法因模棱两可型别需要复查的比例从10-15％有效的控制到了0.1％以下，达到了一步法测序分型即可完成高分辨率型别的效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京思尔成生物技术有限公司
<120> 人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用
<130> GNCSY203388
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgaaccca gtccttct 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagaaaaccc catacgagca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcacttct tccagctgga t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccacasacac acctcgcg 18
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaaactggt ctctatgaga actatct 27
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaaagga acaattctag ccgact 26
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgacatgt aaaatcctca g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtcacatgt aaaatcctca g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtcacatgt aaaacaatca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtcacatgc aaaacaatca 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taagagcacg agccggcg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acaaaggcag aagccggcg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcaaaacgca taacgaggc 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcaaaatgc ataacgaggc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccacatctgg ttcccacaag 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctctaggtcc aaccagga 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacaatcagg gataagcaga ga 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caaaaagcct ggggacgatc a 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcacaaggat gaacgaagc 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctggaggatg agctgaag 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccttagggat cagctgaag 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcctagggga tcactagag 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctgaggaat cagctgaag 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcctatgctc aggacaatag 20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttgactccg gacaactg 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttgactggg gacaattg 18
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaacatcctt actcaagaca attg 24
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gctcaacaga tgcgggcg 18
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctcaaaatc taatgggtcc tcactatcac taaga 35
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctctacaaat ctaataggtc ctcactatca ctaaga 36
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgtacttcc tgactcattc tctcctctac 30
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgtcatgcat gacttattcc ctcttcta 28
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtctatcctg actcattccc tcttcta 27
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcttacctga ctccttccct cttcta 26
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtctatcctg actcattccc tcttcta 27
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctggacaggt gagaccactg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctggacaggc gagaccactg 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ycccatatac ttctcctctt catctc 26
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtcaacactg aacagttata aggctgttc 29
<210> 40
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctcatgygg caggga 16
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tcggaacccg cgggag 16
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cattattcag tttagctggc c 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tctaagtgtt ggtcccccca 20
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agtgatccca tcctkac 17
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gtcaagagag gctcctcct 19
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cccaaggctc ccgccac 17
<210> 47
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggccaggcag ggt 13
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggggaccagc agggt 15
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gaaaaactca tgycattcat ctc 23
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gtcaacatgg gtggctgtcc 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cagaaagggc tcctcct 17
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccgcagcagg gccgagg 17
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtggagggat grgcgggag 19
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcggaggctc gggggcggac g 21
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tggraaggcc atsccgcagg ga 22
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggagatgtcs caagagagat rccrcaa 27
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aggaacttct gctttcycay ctg 23
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctgaacyggc csgtgattca tccy 24
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gggcagacga ccccgct 17
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cctgatctgt tactgcccac cty 23
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
taacaagaaa ctcaatatcc ccycc 25
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tgycacccmc accagca 17
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acctcgcckc tgcacygtga agc 23
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
aagaacycag ccccccc 17
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcttargtgg gtgagaaatc tttta 25
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
caggtaatcg ctctcaa 17
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ctccattcga ggtatttctc 19
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cgggtaccac tccagt 16
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cttggctcag acgatgtat 19
<210> 70
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ctgcagcgtc tc 12
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gacgccgctc gagtcca 17
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tctcatccat catccaga 18
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ggtatttcta cactccgct 19
<210> 74
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcgtgttacg tct 13
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cggagctctc aactg 15
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
agtgaatgct ctcca 15
<210> 77
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tggacatcga tacttct 17
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggcagtccta agagg 15

Claims (9)

1.针对HLA的模棱两可分型引物组，其特征在于：由序列66-序列78的单链DNA组成。
2.HLA测序分型的特异性引物组合物，其特征在于：由权利要求1所述的针对HLA的模棱两可分型引物组、测序引物组、扩增引物组组成；所述测序引物组由序列表序列40-序列65的单链DNA组成；所述扩增引物组由序列表序列1-序列39的单链DNA组成；序列表的序列中，字母K代表T/G中的任一种核苷酸，字母R代表A/G中的任一种核苷酸，字母M代表A/C中的任一种核苷酸，字母S代表C/G中的任一种核苷酸，字母Y代表C/T中的任一种核苷酸。
3.一种HLA测序分型系统，其特征在于：由X1和X2组成；所述X1为权利要求2所述的HLA测序分型的特异性引物组合物，所述X2为X2.1和/或X2.2：
X2.1、进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器；
X2.2、进行PCR测序所需的试剂和/或仪器。
4.成套试剂，由权利要求2所述的HLA测序分型的特异性引物组合物与权利要求3所述进行PCR扩增所需的试剂和/或权利要求3所述进行PCR测序所需的试剂组成。
5.一种非诊断目的的HLA基因分型方法，其特征在于：包括以权利要求2所述的扩增引物组扩增样本DNA后，以权利要求2所述的测序引物组和权利要求2所述的HLA的模棱两可分型引物组测序，根据测序结果分型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、以所述扩增引物组扩增样本DNA：
S1.1、以序列1、序列2扩增样本DNA的HLA-A基因；
S1.2、以序列3、序列4扩增样本DNA的HLA-B基因；
S1.3、以序列5、序列6扩增样本DNA的HLA-C基因；
S1.4、以序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14扩增样本DNA的HLA-DQB1基因的第二外显子；
S1.5、以序列15、序列16、序列17扩增样本DNA的HLA-DQB1基因的第三外显子；
S1.6、以序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、序列25、序列26、序列27、序列28扩增样本DNA的HLA-DRB1基因的第二外显子；
S1.7、以序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35、序列36、序列37、序列38、序列39扩增样本DNA的HLA-DRB1基因的第三外显子；
S2、测序引物组和HLA的模棱两可分型引物组测序：
S2.1、以序列40、序列41、序列42、序列43、序列44、序列45作为测序引物，以序列66、序列67、序列68作为模棱两可分型引物，对HLA-A基因进行测序；
S2.2、以序列46、序列47、序列48、序列49、序列50、序列51作为测序引物，以序列69、序列70作为模棱两可分型引物，对HLA-B基因进行测序；
S2.3、以序列52、序列53、序列54、序列55、序列56、序列57作为测序引物，以序列71、序列72、序列73作为模棱两可分型引物，对HLA-C基因进行测序；
S2.4、以序列58、序列59作为测序引物，以序列74、序列75作为模棱两可分型引物，对HLA-DQB1基因第二外显子进行测序；
S2.5、以序列60、序列61作为测序引物，对HLA-DQB1基因第三外显子进行测序；
S2.6、以序列62、序列63作为测序引物，以序列76、序列77、序列78作为模棱两可分型引物，对HLA-DRB1基因第二外显子进行测序；
S2.7、以序列64、序列65作为测序引物，对HLA-DRB1基因的第三外显子进行测序；
S3、根据测序结果分型。
7.权利要求1所述模棱两可分型引物组、或权利要求2所述HLA测序分型的特异性引物组合物在非诊断目的的HLA基因分型中的应用。
8.权利要求3所述的HLA测序分型系统、或权利要求4所述的成套试剂在非诊断目的的HLA基因分型中的应用。
9.权利要求5或6所述的非诊断目的的HLA基因分型方法在HLA基因分型中的应用。
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