CN111334573B - 一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高血压用药基因检测试剂盒，涉及抗高血压药β1受体阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、钙离子拮抗剂，包括用于检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3和ACE(I/D)基因的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品。本发明还提供了一种高血压用药基因检测试剂盒的使用方法。解决了检测基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题。

Description

一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法。
背景技术
我国高血压患者人数高达数亿，并且发病率仍呈上升趋势，导致的并发症成为我国第二大死因。目前通过药物治疗控制血压以减少高血压并发症成为了高血压的主要治疗手段。然而治疗高血压的药物在临床上出现个体反应差异十分普遍，有20～50％接受药物治疗的患者的血压并没有得到良好的控制。其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象。遗传药理学和药物基因组学的研究进展表明药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。如细胞色素氧化酶CYP2D6发生基因突变，在相同剂量条件下，其所介导代谢的β受体阻滞剂在突变型纯合子中的血药浓度比野生型纯合子高2-3倍，如不根据基因型调节剂量，突变型纯合子患者可能发生严重的毒副反应；相反，如果β受体发生功能性突变，在突变型纯合子个体中依然使用β受体阻滞药，往往会导致治疗失败。这不仅延误治疗，而且导致了医疗资源的浪费。因此，根据个体与药物治疗相关的代谢酶转运体和受体的遗传变异指定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化不仅是当今遗传药理学和临床药物治疗学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济意义。人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，对疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。目前常用的β受体阻断药、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、利尿剂、钙拮抗剂(CCB)这五类降压药，在不同个体间药物代谢酶的活性差异会引起不同甚至相反的药效差异。人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，对疾病临床表现的多样性，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。
目前针对基因多态性检测的技术有很多，最常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、一代测序、二代测序和基因芯片法等技术，但是这些技术有各自的应用缺陷，有的操作繁琐，检测周期长，无法进行高通量多位点同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3和ACE(I/D)型基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等问题，提供一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法。本试剂盒具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对高血压个体化用药基因多态性进行检测。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种高血压用药基因检测试剂盒，涉及抗高血压药β1受体阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、钙离子拮抗剂，包括用于检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3和ACE(I/D)基因的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品。
进一步的，所述引物具体检测的是CYP2D6*10基因的rs1065852位点、CYP2C9*3基因的rs1057910位点、ADRB1基因的rs1801253位点、AGTR1基因的rs5186位点、NPPA基因的rs5065位点、CYP3A5*3基因的rs776746位点和ACE(I/D)基因的rs1799752位点的多态性。
进一步的，所述引物对、探针和抑制剂序列如下：
用于检测CYP2D6*10引物对、探针和抑制剂：
CYP2D-WR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACC
CYP2D-MR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACT
CYP2D-F1:TCCCTCACCTGGTCGAAGCAGT
CYP2D-P1:FAM-TCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTT–TRAMA
CYP2D-WB:CGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCC-ddC
CYP2D-MB:CGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCC-ddC
用于检测ADRB1引物对、探针和抑制剂：
ADRB1-WR2:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGCC
ADRB1-MR4:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGTG
ADRB1-F:CTTCAACTGGCTGGGCTACG
ADRB1-P1:VIC-ATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACT-TRAMA
ADRB1-WB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCCCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC
ADRB1-MB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCGCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC
用于检测CYP2C9*3引物对、探针和抑制剂：
CYP2C9-WF4:GTGCACGAGGTCCAGAGATCTA
CYP2C9-MF3:GTGCACGAGGTCCAGAGATATC
CYP2C9-R:aCATGGAGTTGCAGTGTAGGAG
CYP2C9-P1:FAM-CATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTC-TRAMA
CYP2C9-WB:ACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC
CYP2C9-MB:ACGAGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC
用于检测AGTR1引物对、探针和抑制剂：
AGTR1-WF4:GCACTTCACTACCAAATGATTA
AGTR1-MF4:GCACTTCACTACCAAATGATTC
AGTR1-R1:AGCTTTTGTTCAGAGCTTTAGAA
AGTR1-P1:VIC-ATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGA-TRAMA
AGTR1-WB:TTCACTACCAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGAA-ddC
AGTR1-MB:TTCACTACCAAATGAGCCTTAGCTACTTTTCAGAA-ddC
用于检测ACE(I/D)引物对、探针：
ACE-IF1:GTCTCGATCTCCTGACCTCGT
ACE-DF1:AGGCCGGGGACTCTGTAAGCCA
ACE-FR1:GAATAAAATTGGCGAAACCACAT
ACE-IP1:FAM-CTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATT-TRAMA
ACE-DP1:VIC-CCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTC-TRAMA
用于检测NPPA引物对、探针和抑制剂：
NPPA-WF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAA
NPPA-MF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAG
NPPA-R:GGCACACTCATACATGAAGCTGAC
NPAA-P1:FAM-ATATCTGGCTTGGTGACCTGGCTGT-TRAMA
NPAA-WB:CTGGCTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC
NPAA-MB:CTGGCTGTTATCTTCGGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC
用于检测CYP3A5*3引物对、探针和抑制剂：
CYP3A-WR3:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCCG
CYP3A-MR4:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTACA
CYP3A5-F：ACAGCAAGAGTCTCACACAGG
CYP3A-P1:VIC-TATGATGAAGGGTAATGTGGTCCAA-TRAMA
CYP3A-WB:GCTCTTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCCTGTT-ddC
CYP3A-MB:GCTCTTTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTT-ddC。
进一步的，所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。
进一步的，所述探针5’端荧光基团为FAM或VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。
进一步的，所述抑制剂3’端采用C3spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。
进一步的，所述抑制剂3’端采用ddC修饰。
进一步的，所述PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。
进一步的，所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、NPPA、CYP3A57个基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。
进一步的，所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
一种高血压用药基因检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)取含有EDTA抗凝剂的真空血液样本进行核酸提取(本发明中核酸提取采用美基生物生产的HiPure Blood DNA Mini Kit试剂盒)；
2)预混分装基因检测试剂分别得到PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4、PCR反应液5、PCR反应液6、PCR反应液7，同时形成阴性对照的PCR反应液8，共同组成PCR反应体系；
3)将步骤1)得到的DNA加入步骤2)中的PCR反应体系中，混匀后进行PCR扩增；
4)反应结束后进行基因分型判读。
PCR反应体系中检测位点如下表。
Figure BDF0000017761790000041
进一步的，步骤3)中所述PCR扩增的条件为：
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
基因分型判读：在上述PCR反应体系和循环程序条件下，阳性质控品1-7号FAM和VIC荧光检测信号应该形成对数扩增“S”型曲线，8号应无扩增曲线或者Ct值为0；阴性质控品1-8号应无扩增曲线或者Ct值为0；观察1-8号的FAM和VIC荧光检测信号是否形成对数扩增“S”型曲线。
以上满足的情况下，观察待测样本反应管扩增曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线，该待检测样本含有相应的碱基多态位点；如果无对数扩增“S”型曲线或者Ct值为0，则无相应的碱基多态位点。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将7种相关基因分装在一个8联PCR反应条中，预混包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，降低成本的同时提升了检测效率；
(2)本发明具有高灵敏度、低成本、高特异性、操作简便、检测周期短等特点，可以快速精准的对高血压个体化用药基因多态性进行检测。
附图说明
图1为本发明一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法的阳性质控品扩增曲线。
图2为本发明一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法的阴性质控品扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
发明人通过分析临床上高血压病人常用药物的使用和代谢及药效的个体差异，筛选出与五大类抗高血压药物密切相关基因的7个多态性位点，并制备出检测该7个多态性位点的组合物和使用该组合物的检测试剂盒，并建立准确的检测方法用以对五大类抗高血压药物实现有效的用药指导。其中五大类抗高血压药物是利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂。
实施例1：引物和探针组合设计及使用
1、用于识别CYP2D6>C的引物和探针组合：
CYP2D-WR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACC
CYP2D-F1:TCCCTCACCTGGTCGAAGCAGT
CYP2D-P1:FAM-TCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTT–TRAMA
CYP2D-MB:CGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCC-ddC
用于识别CYP2D6>T的引物和探针组合：
CYP2D-MR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACT
CYP2D-F1:TCCCTCACCTGGTCGAAGCAGT
CYP2D-P1:FAM-TCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTT–TRAMA
CYP2D-WB:CGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCC-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
2、用于识别ADRB1>G的引物和探针组合：
ADRB1-WR2:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGCC
ADRB1-F:CTTCAACTGGCTGGGCTACG
ADRB1-P1:VIC-ATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACT-TRAMA
ADRB1-MB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCGCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC
用于识别ADRB1>C的引物和探针组合：
ADRB1-MR4:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGTG
ADRB1-F:CTTCAACTGGCTGGGCTACG
ADRB1-P1:VIC-ATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACT-TRAMA
ADRB1-WB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCCCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
3、用于识CYP2C9>G的引物和探针组合：
CYP2C9-WF4:GTGCACGAGGTCCAGAGATCTA
CYP2C9-R:aCATGGAGTTGCAGTGTAGGAG
CYP2C9-P1:FAM-CATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTC-TRAMA
CYP2C9-MB:ACGAGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC
用于识别CYP2C9>C的引物和探针组合：
CYP2C9-MF3:GTGCACGAGGTCCAGAGATATC
CYP2C9-R:aCATGGAGTTGCAGTGTAGGAG
CYP2C9-P1:FAM-CATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTC-TRAMA
CYP2C9-WB:ACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
4、用于识别AGTR1>A的引物和探针组合：
AGTR1-WF4:GCACTTCACTACCAAATGATTA
AGTR1-R1:AGCTTTTGTTCAGAGCTTTAGAA
AGTR1-P1:VIC-ATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGA-TRAMA
AGTR1-MB:TTCACTACCAAATGAGCCTTAGCTACTTTTCAGAA-ddC
用于识别AGTR1>C的引物和探针组合：
AGTR1-WF4:GCACTTCACTACCAAATGATTA
AGTR1-R1:AGCTTTTGTTCAGAGCTTTAGAA
AGTR1-P1:VIC-ATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGA-TRAMA
AGTR1-WB:TTCACTACCAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGAA-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
5、用于识别ACE>I的引物和探针组合：
ACE-IF1:GTCTCGATCTCCTGACCTCGT
ACE-FR1:GAATAAAATTGGCGAAACCACAT
ACE-IP1:FAM-CTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATT-TRAMA
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。
用于识别ACE>D的引物和探针组合：
ACE-DF1:AGGCCGGGGACTCTGTAAGCCA
ACE-FR1:GAATAAAATTGGCGAAACCACAT
ACE-DP1:VIC-CCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTC-TRAMA
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。
6、用于识别NPPA>T的引物和探针组合：
NPPA-WF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAA
NPPA-R:GGCACACTCATACATGAAGCTGAC
NPAA-P1:FAM-ATATCTGGCTTGGTGACCTGGCTGT-TRAMA
NPAA-MB:CTGGCTGTTATCTTCGGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC
用于识别NPPA>C的引物和探针组合：
NPPA-MF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAG
NPPA-R:GGCACACTCATACATGAAGCTGAC
NPAA-P1:FAM-ATATCTGGCTTGGTGACCTGGCTGT-TRAMA
NPAA-WB:CTGGCTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
7、用于识别CYP3A5>G的引物和探针组合：
CYP3A-WR3:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCCG
CYP3A5-F：ACAGCAAGAGTCTCACACAGG
CYP3A-P1:VIC-TATGATGAAGGGTAATGTGGTCCAA-TRAMA
CYP3A-MB:GCTCTTTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTT-ddC
用于识别CYP3A5>A的引物和探针组合：
CYP3A-MR4:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTACA
CYP3A5-F：ACAGCAAGAGTCTCACACAGG
CYP3A-P1:VIC-TATGATGAAGGGTAATGTGGTCCAA-TRAMA
CYP3A-WB:GCTCTTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCCTGTT-ddC
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1，更优选方案为5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。上述抑制剂3’端采用特殊修饰，优选方式为C3spacer、磷酸化、硫代、MGB和双脱氧胞苷(ddC)等，更优选的方案为用于特异性模板扩增的抑制剂3’端采用ddC修饰。
上述引物和探针可用于特异性地检测样本中的CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3、ACE(I/D)等7个基因多态性,如下表所示。
编号 基因 RS编号 核酸变异
1 CYP2D6*10 rs1065852 c.100C>T
2 ADRB1 rs1801253 c.1165G>C
3 CYP2C9*3 rs1057910 c.1075A>C
4 AGTR1 rs5186 c.1166A＞C
5 ACE rs1799752 (I/D)
6 NPPA rs5065 c.2238T＞C
7 CYP3A5*3 rs776746 c.6986G>A
实施例2：阳性质控品的获取
所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、NPPA、CYP3A57个基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为阳性质控品。
CYP2D6>C质控品序列如SEQ ID NO.1所示，CYP2D6>T质控品序列如SEQ ID NO.2所示，ADRB1>G质控品序列如SEQ ID NO.3所示，ADRB1>C质控品序列如SEQ ID NO.4所示，CYP2C9>A质控品序列如SEQ ID NO.5所示，CYP2C9>C质控品序列如SEQ ID NO.6所示，AGTR1>A质控品序列如SEQ ID NO.7所示，AGTR1>C质控品序列如SEQ ID NO.8所示，NPPA>T质控品序列如SEQ ID NO.9所示，NPPA>C质控品序列如SEQ ID NO.10所示，CYP3A5>G质控品序列如SEQID NO.11所示，CYP3A5>A质控品序列如SEQ ID NO.12所示，ACE>I质控品序列如SEQ IDNO.13所示，ACE>D质控品序列如SEQ ID NO.14所示。
实施例3：PCR反应液的配置
本发明试剂盒采用8联PCR反应条设计，1-7号管由基因检测试剂组成，分别指示CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3和ACE(I/D)不同基因多态位点，8号管由阴性对照的检测试剂组成。1-8号管的反应液分别对应PCR反应液1-8，PCR反应液1-8的组成如表1-表8。
表1 PCR反应液1
Figure BDF0000017761790000091
表2 PCR反应液2
Figure BDF0000017761790000092
Figure BDF0000017761790000093
表3PCR反应液3
Figure BDF0000017761790000101
表4 PCR反应液4
Figure BDF0000017761790000102
Figure BDF0000017761790000111
表5 PCR反应液5
Figure BDF0000017761790000112
表6 PCR反应液6
Figure BDF0000017761790000121
Figure BDF0000017761790000122
表7 PCR反应液7
Figure BDF0000017761790000123
表8 PCR反应液8
Figure BDF0000017761790000131
仪器通道及反应体积选择：
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(ReferenceDye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
实施例4：基因检测试剂盒的使用
1、样本收集
本实施例收集了10例患者外周血，分别编号为1-10。使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。
2、样本处理
将1-10号样本利用商业化试剂盒进行核酸提取，本发明采用美基生物生产的HiPure Blood DNA Mini Kit(货号：D3111)，实验步骤参考说明书进行。
在1.5ml离心管中，加入25μl Proteinase K，转移10-250μl抗凝血液，血清，血浆，牛奶，唾液，或其它液体样品至装有蛋白酶的离心管中。轻轻振荡混匀，加入250μlBufferAL至样品中，颠倒3-5次混匀，最高速度涡旋30秒混匀，70℃水浴10分钟，其间涡旋混匀一次。加入250μl无水乙醇至样品中，涡旋30秒混匀，短暂离心收集管壁的液滴。把DNA柱装在新的收集管中，转移混合液至柱子中。10000×g离心1分钟，丢弃收集管和流出液。把DNA柱装在新的收集管中，加入500μl Buffer DW1至柱子上，颠倒混匀几次，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入650μl Buffer DW2(已用乙醇稀释)至柱子中，10000×g离心30-60秒，倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10000×g离心2分钟，可彻底去除柱子中残留的乙醇。将柱子转移至新的1.5ml离心管中。加入30-100μl预热至70℃ElutionBuffer或BufferTE至柱子的膜中央，放置3分钟后，10000×g离心1分钟。再加入30-100μl预热至70℃Elution Buffer或Buffer TE至柱子的膜中央，放置3分钟，10000×g离心1分钟，丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
3、反应体系配制
反应体系配制按照实施例3中的PCR反应液1-8配制反应体系。
4、PCR反应
将1-10号样本提取的DNA加入配制好的反应体系中，加入的模板量1-200ng。在进行PCR反应时需要将待测样本、阳性质控品和阴性质控品一起平行上机检测，每个样本需要同时加入1-8号管进行反应。
5、仪器通道及反应体积选择
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
6、PCR反应程序
预变性的条件为：95℃，2分钟；
第一个阶段由5个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒；延伸：72℃，20秒；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：变性：95℃，15秒；退火：60℃，30秒，设置荧光信号采集；延伸：72℃，30秒。
7、实验结果
反应程序结束后保存结果并进行判读。
阳性质控品1-7号反应管中FAM和VIC荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，8号管无扩增曲线(见附图1)；
阴性质控品1-8号管应无扩增曲线(见附图2)；
1-10号样本检测结果如下：
Figure BDF0000017761790000141
Figure BDF0000017761790000151
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司
<120> 一种高血压用药基因检测试剂盒及使用方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cctggcttct ggtccagcct gtggtttcac ccaccaccca tgtttgctgg tggtggggca 60
tcctcaggac ctctgccgcc ctccaggacc tcctccctca cctggtcgaa gcagtatggt 120
gtgttctgga agtccacatg cagcaggttg cccagcccgg gcagtggcag ggggcctggt 180
gggtagcgtg cagcccagcg ttggcgccgg tgcatcaggt ccaccaggag caggaagatg 240
gccactatca cggccagggg caccagtgct tctagcccca tacctgcctc actaccaaat 300
gggctcctct ggacacacct ggca 324
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cctggcttct ggtccagcct gtggtttcac ccaccaccca tgtttgctgg tggtggggca 60
tcctcaggac ctctgccgcc ctccaggacc tcctccctca cctggtcgaa gcagtatggt 120
gtgttctgga agtccacatg cagcaggttg cccagcccgg gcagtggcag ggggcctggt 180
gtgtagcgtg cagcccagcg ttggcgccgg tgcatcaggt ccaccaggag caggaagatg 240
gccactatca cggccagggg caccagtgct tctagcccca tacctgcctc actaccaaat 300
gggctcctct ggacacacct ggca 324
<210> 3
<211> 338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgctgggcat catcatgggc gtcttcacgc tctgctggct gcccttcttc ctggccaacg 60
tggtgaaggc cttccaccgc gagctggtgc ccgaccgcct cttcgtcttc ttcaactggc 120
tgggctacgc caactcggcc ttcaacccca tcatctactg ccgcagcccc gacttccgca 180
aggccttcca gggactgctc tgctgcgcgc gcagggctgc ccgccggcgc cacgcgaccc 240
acggagaccg gccgcgcgcc tcgggctgtc tggcccggcc cggacccccg ccatcgcccg 300
gggccgcctc ggacgacgac gacgacgatg tcgtcggg 338
<210> 4
<211> 338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgctgggcat catcatgggc gtcttcacgc tctgctggct gcccttcttc ctggccaacg 60
tggtgaaggc cttccaccgc gagctggtgc ccgaccgcct cttcgtcttc ttcaactggc 120
tgggctacgc caactcggcc ttcaacccca tcatctactg ccgcagcccc gacttccgca 180
aggccttcca gcgactgctc tgctgcgcgc gcagggctgc ccgccggcgc cacgcgaccc 240
acggagaccg gccgcgcgcc tcgggctgtc tggcccggcc cggacccccg ccatcgcccg 300
gggccgcctc ggacgacgac gacgacgatg tcgtcggg 338
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaattgctac aacaaatgtg ccatttttct ccttttccat cagtttttac ttgtgtctta 60
tcagctaaag tccaggaaga gattgaacgt gtgattggca gaaaccggag cccctgcatg 120
caagacagga gccacatgcc ctacacagat gctgtggtgc acgaggtcca gagatacatt 180
gaccttctcc ccaccagcct gccccatgca gtgacctgtg acattaaatt cagaaactat 240
ctcattccca aggtaagttt gtttctccta cactgcaact ccatgttttc gaagtcccca 300
aattcatagt atcattttta aacctctacc atcaccgggt gagagaagtg cataactcat 360
atgtatggca gtttaactgg actttctctt gtt 393
<210> 6
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gaattgctac aacaaatgtg ccatttttct ccttttccat cagtttttac ttgtgtctta 60
tcagctaaag tccaggaaga gattgaacgt gtgattggca gaaaccggag cccctgcatg 120
caagacagga gccacatgcc ctacacagat gctgtggtgc acgaggtcca gagatacctt 180
gaccttctcc ccaccagcct gccccatgca gtgacctgtg acattaaatt cagaaactat 240
ctcattccca aggtaagttt gtttctccta cactgcaact ccatgttttc gaagtcccca 300
aattcatagt atcattttta aacctctacc atcaccgggt gagagaagtg cataactcat 360
atgtatggca gtttaactgg actttctctt gtt 393
<210> 7
<211> 388
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcaaaccttt caacaaaaat gagcacgctt tcctaccgcc cctcagataa tgtaagctca 60
tccaccaaga agcctgcacc atgttttgag gttgagtgac atgttcgaaa cctgtccata 120
aagtaatttt gtgaaagaag gagcaagaga acattcctct gcagcacttc actaccaaat 180
gagcattagc tacttttcag aattgaagga gaaaatgcat tatgtggact gaaccgactt 240
ttctaaagct ctgaacaaaa gcttttcttt ccttttgcaa caagacaaag caaagccaca 300
ttttgcatta gacagatgac ggctgctcga agaacaatgt cagaaactcg atgaatgtgt 360
tgatttgaga aattttactg acagaaat 388
<210> 8
<211> 388
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcaaaccttt caacaaaaat gagcacgctt tcctaccgcc cctcagataa tgtaagctca 60
tccaccaaga agcctgcacc atgttttgag gttgagtgac atgttcgaaa cctgtccata 120
aagtaatttt gtgaaagaag gagcaagaga acattcctct gcagcacttc actaccaaat 180
gagccttagc tacttttcag aattgaagga gaaaatgcat tatgtggact gaaccgactt 240
ttctaaagct ctgaacaaaa gcttttcttt ccttttgcaa caagacaaag caaagccaca 300
ttttgcatta gacagatgac ggctgctcga agaacaatgt cagaaactcg atgaatgtgt 360
tgatttgaga aattttactg acagaaat 388
<210> 9
<211> 307
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tgtgagaagt gttgacagga agctgcagct tagatgggat gatcacaact ccatggcaac 60
aagatgacac aaatgcagca gagaccccag gggacaggag cctcttgcag tctgtcccta 120
ggcccagccc tgcttgtcct ccctggctgt tatcttcagt actgcaaaga gaacacagac 180
atatctggct tggtgacctg gctgtcctgg aaaagtcagc ttcatgtatg agtgtgccca 240
tcctctgaac ttgattactg accacctgct tcccaccggc ccccacccca gcctgatgac 300
cctctga 307
<210> 10
<211> 307
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgtgagaagt gttgacagga agctgcagct tagatgggat gatcacaact ccatggcaac 60
aagatgacac aaatgcagca gagaccccag gggacaggag cctcttgcag tctgtcccta 120
ggcccagccc tgcttgtcct ccctggctgt tatcttcggt actgcaaaga gaacacagac 180
atatctggct tggtgacctg gctgtcctgg aaaagtcagc ttcatgtatg agtgtgccca 240
tcctctgaac ttgattactg accacctgct tcccaccggc ccccacccca gcctgatgac 300
cctctga 307
<210> 11
<211> 316
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cccaggaagc cagactttga tcattatgtt atgtaatcca tacccctagt tgtacgacac 60
acagcaacct taggttctag ttcattaggg tgtgacacac agcaagagtc tcacacagga 120
gccacccaag gcttcatatg atgaagggta atgtggtcca aacagggaag agatactgaa 180
agacaaaaga gctctttaaa gagattatgg ttagaaatga cagtagagca ttcgttaagc 240
tgggtggtac atacgtgggt atctcctatg ccactctcca taatgtttta tatgtttaaa 300
atacttcatt atcaaa 316
<210> 12
<211> 316
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cccaggaagc cagactttga tcattatgtt atgtaatcca tacccctagt tgtacgacac 60
acagcaacct taggttctag ttcattaggg tgtgacacac agcaagagtc tcacacagga 120
gccacccaag gcttcatatg atgaagggta atgtggtcca aacagggaag agatattgaa 180
agacaaaaga gctctttaaa gagattatgg ttagaaatga cagtagagca ttcgttaagc 240
tgggtggtac atacgtgggt atctcctatg ccactctcca taatgtttta tatgtttaaa 300
atacttcatt atcaaa 316
<210> 13
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aggagaggag agagactcaa gcacgcccct cacaggactg ctgaggccct gcaggtgtct 60
gcagcatgtg gccccaggcc ggggactctg taagccactg ctggagagcc actcccatcc 120
tttctcccat ttctctagac ctgctgccta tacagtcact tttttttttt ttttgagacg 180
gagtctcgct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcggg atctcggctc actgcaagct 240
ccgcctcccg ggttcacgcc attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggaccacagg 300
cgcccgccac tacgcccggc taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccgtt 360
ttagccggga tggtctcgat ctcctgacct cgtgatccgc ccgcctcggc ctcccaaagt 420
gctgggatta caggcgtgat acagtcactt ttatgtggtt tcgccaattt tattccagct 480
ctgaaattct ctgagctccc cttacaagca gaggtgagct aagggctgga gctcaaggca 540
ttcaaacccc taccagatct gacgaatgtg atggccacgt cccggaaat 589
<210> 14
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aggagaggag agagactcaa gcacgcccct cacaggactg ctgaggccct gcaggtgtct 60
gcagcatgtg gccccaggcc ggggactctg taagccactg ctggagagcc actcccatcc 120
tttctcccat ttctctagac ctgctgccta tacagtcact tttatgtggt ttcgccaatt 180
ttattccagc tctgaaattc tctgagctcc ccttacaagc agaggtgagc taagggctgg 240
agctcaaggc attcaaaccc ctaccagatc tgacgaatgt gatggccacg tcccggaaat 300

Claims (6)

1.一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：涉及抗高血压药β1受体阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、钙离子拮抗剂，包括用于检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1、AGTR1、NPPA、CYP3A5*3和ACE(I/D)基因的引物对、探针和抑制剂，PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品；
所述引物对、探针和抑制剂序列如下：
用于检测CYP2D6*10引物对、探针和抑制剂： CYP2D-WR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACCCYP2D-MR1:CAACGCTGGGCTGCACGCTACT CYP2D-F1:TCCCTCACCTGGTCGAAGCAGT CYP2D-P1:FAM-TCTGGAAGTCCACATGCAGCAGGTT–TRAMA CYP2D-WB:CGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCC-ddC CYP2D-MB:CGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCC-ddC
用于检测ADRB1引物对、探针和抑制剂： ADRB1-WR2:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGCC ADRB1-MR4:TGCGCGCGCAGCAGAGCAGGTG ADRB1-F:CTTCAACTGGCTGGGCTACG ADRB1-P1:VIC-ATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACT-TRAMA ADRB1-WB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCCCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC ADRB1-MB:GCGCGCAGCAGAGCAGTCGCTGGAAGGCCTTGCGGAA-ddC 用于检测CYP2C9*3引物对、探针和抑制剂： CYP2C9-WF4:GTGCACGAGGTCCAGAGATCTA CYP2C9-MF3:GTGCACGAGGTCCAGAGATATC CYP2C9-R:aCATGGAGTTGCAGTGTAGGAG CYP2C9-P1:FAM-CATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTC-TRAMA CYP2C9-WB:ACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC CYP2C9-MB:ACGAGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCCACCAG-ddC
用于检测AGTR1引物对、探针和抑制剂： AGTR1-WF4:GCACTTCACTACCAAATGATTA AGTR1-MF4:GCACTTCACTACCAAATGATTC AGTR1-R1:AGCTTTTGTTCAGAGCTTTAGAA AGTR1-P1:VIC-ATTGAAGGAGAAAATGCATTATGTGGA-TRAMA AGTR1-WB:TTCACTACCAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGAA-ddC AGTR1-MB:TTCACTACCAAATGAGCCTTAGCTACTTTTCAGAA-ddC
用于检测ACE(I/D)引物对、探针：
ACE-IF1:GTCTCGATCTCCTGACCTCGT ACE-DF1:AGGCCGGGGACTCTGTAAGCCA ACE-FR1:GAATAAAATTGGCGAAACCACAT ACE-IP1:FAM-CTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATT-TRAMA ACE-DP1:VIC-CCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTC-TRAMA
用于检测NPPA引物对、探针和抑制剂： NPPA-WF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAA NPPA-MF4:GTCCTCCCTGGCTGTTATCTGAG NPPA-R:GGCACACTCATACATGAAGCTGAC NPAA-P1:FAM-ATATCTGGCTTGGTGACCTGGCTGT-TRAMA NPAA-WB:CTGGCTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC NPAA-MB:CTGGCTGTTATCTTCGGTACTGCAAAGAGAACAC-ddC
用于检测CYP3A5*3引物对、探针和抑制剂： CYP3A-WR3:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCCGCYP3A-MR4:CTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTACA CYP3A5-F：ACAGCAAGAGTCTCACACAGG CYP3A-P1:VIC-TATGATGAAGGGTAATGTGGTCCAA-TRAMA CYP3A-WB:GCTCTTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCCTGTT-ddC CYP3A-MB:GCTCTTTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTT-ddC。
2.如权利要求1所述一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX荧光报告基团，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1荧光淬灭基团。
3.如权利要求1所述一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述抑制剂3’端采用C3 spacer、磷酸化、硫代、MGB或双脱氧胞苷(ddC)修饰。
4.如权利要求1所述一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质。
5.如权利要求1所述一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品的获取方法为：根据NCBI数据库公布的CYP2D6、ADRB1、CYP2C9、AGTR1、ACE、NPPA、CYP3A5 7个基因序列进行质粒构建合成序列基因片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，将各质控品质粒等比例混合即为所述阳性质控品。
6.如权利要求1所述一种高血压用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为DEPC处理过的去离子水。
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