CN112941174B

CN112941174B - 一种用于检测tnni3基因突变的引物探针组合物及其应用

Info

Publication number: CN112941174B
Application number: CN202110402355.3A
Authority: CN
Inventors: 张世梅; 赵跃
Original assignee: Dali University
Current assignee: Dali University
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-04-14
Also published as: CN112941174A

Abstract

本发明涉及一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物和探针，所述引物包括SEQ ID NO.1～2所示的核酸序列，所述探针包括野生型探针和突变型探针，所述野生型探针包括SEQ ID NO.3所示的核酸序列，所述突变型探针包括SEQ ID NO.4所示的核酸序列。所述引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，能够针对TNNI3基因新突变位点c.365T>C，利用其进行实时荧光PCR，可实现简便、快速、准确和经济地判断基因型。

Description

一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，尤其涉及一种检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物探针组合物及其应用。

背景技术

在心脏中，心室心肌形态上发生变化，数量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相对空间减小，血容量减少。常见的遗传性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病，肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种原发性的心肌疾病，表现为不明原因的左心室和/或右心室以及室间隔非对称性的肥厚，临床表现多样，可以无症状，亦可表现为心衰、心律失常、猝死等恶性心脏事件。

研究表明HCM为常染色体显性遗传的单基因疾病，即后代只要继承了父母任何一方(患病者)的含突变基因的染色体即可能发病，已经发现至少15个致病基因、超过700个突变位点与HCM发病有关。

TNNI3基因编码心脏特异性蛋白，只在心肌中表达，该基因定位于19q13.4，8个外显子共编码210个氨基酸残基的肌钙蛋白，是HCM的主要致病基因之一。研究表明，TNNI3基因突变的分子机制是通过突变改变了横桥的动力，在一定范围内降低了肌原纤维对Ca²⁺的敏感性以及Ca²⁺激活，增加了肌肉收缩时能量的消耗，从而影响心肌细胞的舒张功能和心肌收缩力，使心肌细胞产生代偿性肥大，最终导致HCM的发生。

对于心肌肥厚疾病的鉴别诊断传统的方法主要依靠临床表现、心电图、超声心动图和心脏核磁，但传统诊断方法存在明确诊断时间晚(症状出现后)、容易发生误诊、难以判断预后等问题。基因诊断的优势在于：特异性高，明确致病基因突变后，能够100％确诊；早期诊断，即可在症状出现前或不可逆病理改变前作出诊断；能够根据基因型判断良恶性临床转归和预后，提供针对性的“个体化治疗”；可根据基因型提供遗传咨询和生育指导。

CN102965428A公开了一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR和VCL全部外显子片段，但依赖大规模基因测序平台，过程十分繁琐，耗时较长，且价格十分昂贵。

综上所述，建立一种简便、快速、经济和准确的突变筛查方法，对于HCM的预防、辅助临床诊断和预后评估具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，利用所述引物探针组合物进行实时荧光PCR，根据荧光信号结果即可判断突变基因型，便捷且经济，对于HCM的预防、辅助临床诊断和预后评估具有重要意义。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因新突变位点c.365T>C(基因的编码区第365位碱基T突变为C)的引物和探针，所述引物包括SEQ ID NO.1～2所示的核酸序列，所述探针包括野生型探针和突变型探针，所述野生型探针包括SEQID NO.3所示的核酸序列，所述突变型探针包括SEQ ID NO.4所示的核酸序列。

SEQ ID NO.1(正向引物)：5’-CAACAACACACACCACGTTCCTC-3’。

SEQ ID NO.2(反向引物)：5’-AAGTCCCAGCCATCTCACCCTA-3’。

SEQ ID NO.3：GTCACCAAGAACATCACGGAGAT。

SEQ ID NO.4：AGTCACCAAGAACACCACGGAGAT。

本发明中，所述引物具备高特异性，能够特异性地对包含突变位点的序列(175bp)进行扩增，而所述探针亦具备高特异性，野生型探针和突变型探针分别与野生型位点和突变型位点特异性地结合，同时采用野生型探针和突变型探针，在一次实时荧光PCR反应中即可对基因突变及突变基因型进行判断，从而实现了快速、低成本检测，且检测结果准确性高。

优选地，所述探针为Taqman探针。

优选地，所述Taqman探针的核酸序列5’端标记有荧光基团。

优选地，所述Taqman探针的核酸序列3’端标记有淬灭基团。

优选地，所述荧光基团包括FAM或HEX。

优选地，所述淬灭基团包括MGB。

优选地，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团与所述突变型探针5’端标记的荧光基团不同。

优选地，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为FAM。

优选地，所述突变型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为HEX。

人为二倍体生物，细胞中含有两组染色体，因此突变基因型有三种，2个基因中基因的编码区第365位碱基T均突变为C(TNNI3-365CC)，2个基因中基因的编码区第365位碱基T均未发生突变(TNNI3-365TT)，仅1个基因中基因的编码区第365位碱基T突变为C(TNNI3-365TC)，本发明中，同时采用带有不同荧光信号的野生型探针和突变型探针，即可根据荧光信号结果判断突变基因型。

第二方面，本发明提供如第一方面所述的引物探针组合物在制备肥厚型心肌病致病基因检测产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测TNNI3基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。

优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg²⁺缓冲液、dNTPs和水。

优选地，所述染料包括Rox校正染料。

优选地，所述试剂盒还包括质控品。

优选地，所述质控品包括野生型质控品、突变型质控品和杂合突变型质控品。

本发明的试剂盒包括高特异性和灵敏度的引物探针组合物，以及PCR反应体系，能够便捷地配制实时荧光PCR体系。

优选地，所述质控品的制备方法包括以下步骤：

(1)以野生型或突变型的基因组作为模板，进行PCR扩增，所述的PCR扩增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，扩增长度为1441bp，PCR扩增的反应程序如表1所示，并对PCR产物进行纯化；

SEQ ID NO.5：5’-TCCCTCAGACCCAGGAGTCCAGT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-CAACATGTGATGCCCTGAGCATG-3’；

表1

(3)将纯化后的片段分别克隆到载体上，转化到大肠杆菌中，挑选单克隆，筛选出阳性克隆菌株，提取质粒；

(4)利用毛细管电泳仪对含有克隆目的片段后的质粒载体进行毛细管电泳检测；

(5)参照hg19人基因组靶基因TNNI3的基因序列为模板，利用DNAstar序列分析软件对变位点进行分析，获得野生型质控品(含有野生型片段的质粒)和突变型质控品(含有突变片段的质粒)，将野生型和突变型质控品按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型质控品。

本发明中所述质控品基因型已知，可用于验证本申请引物探针组合物的特异性及可靠性。

第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测TNNI3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述方法包括：

提取基因组，以基因组为模板，采用所述检测TNNI3基因突变的试剂盒进行实时荧光PCR检测，分析结果。

优选地，所述基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述实时荧光PCR检测的反应条件包括：

预变性：93～98℃(例如可以是94℃、95℃、96℃或97℃)，25～35s(例如可以是26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s或34s)；

循环延伸：93～98℃(例如可以是94℃、95℃、96℃或97℃)变性3～7s(例如可以是4s、5s或6s)，57～59℃退火及延伸30～40s(例如可以是31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s或38s)，35～45个循环(例如可以是36个、37个、38个、40个、42个、43个或44个)；

循环外延伸：62～66℃(例如可以是63℃、64℃或65℃)，1～3min。

作为优选的技术方案，所述检测TNNI3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法包括：

提取基因组，以基因组为模板，采用所述检测TNNI3基因突变的试剂盒进行实时荧光PCR检测，检测反应条件包括：93～98℃预变性25～35s；93～98℃变性3～7s、57～59℃退火及延伸30～40s，35～45个循环；62～66℃延伸1～3min，分析结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，能够针对TNNI3基因新突变位点c.365T>C，利用其进行实时荧光PCR，可实现简便、快速、准确和经济地判断基因型；

(2)本发明的试剂盒简单便捷，成本低，可高效应用于实时荧光PCR，获得的结果准确率可达100％，且具有良好的重复性。

附图说明

图1为实施例1中样本基因组模板的扩增结果，其中，阴性为阴性对照，1、2、3分别为3次技术重复，M为DNA分子量marker；

图2为本发明野生型质控品TNNI3，c.365T毛细管电泳检测；

图3为本发明突变型质控品TNNI3，c.365C毛细管电泳检测；

图4为TNNI3-365TT基因型的引物探针的灵敏性检验的扩增曲线；

图5为TNNI3-365TT基因型的引物探针的灵敏性检验的标准曲线；

图6为TNNI3-365CC基因型的引物探针的灵敏性检验的扩增曲线；

图7为TNNI3-365CC基因型的引物探针的灵敏性检验的标准曲线；

图8为以野生型质控品为模板的引物探针的特异性检测的扩增曲线，其中，FAM代表野生型探针，HEX代表突变型探针；

图9为以突变型质控品为模板的引物探针的特异性检测的扩增曲线，其中，FAM代表野生型探针，HEX代表突变型探针；

图10为以杂合突变型质控品为模板的引物探针的特异性检测的扩增曲线，其中，FAM代表野生型探针，HEX代表突变型探针；

图11为以不同基因型为模板的特异性检测的散点图分布，其中，横坐标代表碱基T，纵坐标代表碱基C；

图12为对29例已知基因型的肥厚型心肌病患者进行TNNI3，c.365T>C突变位点实时荧光检测的基因分型散点图分布，其中，横坐标代表碱基T，纵坐标代表碱基C。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

本发明实施例中，临床样本来自肥厚型心肌病患者，患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准；小量基因组提取试剂盒购自Axygen；ExTaq PCR反应液购自TaKaRa；DNA纯化试剂盒购自上海生工；PCR反应液购自大连宝生物；Rox校正染料购自大连宝生物。

实施例1

参照2011年美国心脏病协会肥厚型心肌病诊断指南，获取在大理大学第一附属医院心血管内科临床确诊的1例家族性肥厚型心肌病先证者(患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准)的外周静脉血，提取其基因组，通过全外显子测序技术寻找与HCM发病相关的致病性变异位点，通过对测序结果比对分析发现了与HCM相关的新突变位点TNNI3，c.365T>C(基因的编码区第365位碱基T突变为C)，该突变导致了TNNI3基因氨基酸发生I122T的改变，利用实时荧光PCR的突变筛查方法对该新突变位点进行检测验证。

本实施例构建野生型和突变型的阳性质控品，包括如下步骤：

(1)提取基因组：抽取1mL患者外周静脉血，EDTA抗凝后，采用商业化的小量基因组提取试剂盒(Axygen，美国)提取其全基因组，进行琼脂糖凝胶电泳，对浓度和OD值进行测定，OD_260/280为1.8-2.0之间为可用；

(2)以步骤(1)的基因组为模板，进行PCR扩增，其中，所述的PCR扩增引物的核酸序列如SEQ ID NO.5(5’-TCCCTCAGACCCAGGAGTCCAGT-3’)和SEQ ID NO.6(5’-CAACATGTGATGCCCTGAGCATG-3’)所示，扩增长度为1441bp，PCR扩增的反应条件如表2所示，所述PCR扩增的反应体系如下：

以无菌水为模板进行扩增作为阴性对照，并进行三次技术重复，PCR扩增反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，显示目的片段大小与预期大小一致，并使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒对其进行纯化；

表2

(3)将纯化后的片段克隆到PMD-18T载体上，转化到大肠杆菌JM109中，挑选单克隆，筛选出阳性克隆菌株，提取其质粒；

(4)利用ABI3130毛细管电泳仪对含有克隆目的片段后的质粒载体进行毛细管电泳检测；

(5)参照hg19人基因组靶基因TNNI3的基因序列为模板，利用DNAstar序列分析软件对变位点进行分析。

由图2和图3的毛细管电泳测序结果可知，成功构建野生型质控品(含有野生型片段的质粒)和突变型质控品(含有突变片段的质粒)，将野生型和突变型质控品按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型质控品。

实施例2

本实施例对本发明引物探针组合物的灵敏性及特异性进行验证。

(1)引物探针组合物的灵敏性及重复性

分别将TNNI3基因c.365T>C的野生型和突变型进行10倍梯度稀释后作为模板，采用本发明引物探针组合物进行实时荧光PCR检测(ABI7500实时荧光PCR仪)，反应体系如表3所示，反应条件如表4所示，检验引物探针组合物的灵敏性。

表3

反应组分	加入量(μL)
		PCR反应液	5
Rox校正染料	0.1
		正向引物	0.5
反向引物	0.5
		野生型探针	0.5
突变型探针	0.5
		模板	0.8
纯净水	2.1

表4

结果如图4-图7所示，随着模板起始拷贝数的降低，荧光阈值(Ct)值开始相应增加，标准曲线的线性关系较好(R²>0.98)，表明本发明引物探针组合物具有较高的扩增效率及灵敏性。

随后进行重复性验证，分别进行3次重复试验(批间和批内重复)，观察模板的Ct值，并计算其变异系数，变异系数(p)＝标准偏差(SD)/平均数(X)，测试检测方法的灵敏性和重复性。

批间和批内重复结果分别如表5和表6所示。

表5

表6

由表5和表6可知，批间和批内重复变异系数均小于2％，表明本发明引物探针组合物具有良好的重复性。

(2)引物探针组合物的特异性

特异性验证以实施例1制备的野生型、突变型和杂合突变型质控品为模板，按表3、表4所述进行实时荧光PCR检测，结果如图8-图11所示。

图8中的野生型样本反应的曲线表现为野生型探针(FAM)产生的荧光信号增高，而突变型探针(HEX)仅有很低的荧光信号；图9中的突变型样本反应的曲线表现为只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针仅有很低的荧光信号；图10中的杂合突变型样本能使野生型和突变型探针都表现出相对较高的荧光信号；此外，如图11所示，通过反应结果的散点图可以明显看出不同基因型的样本单独成簇，表明本发明的引物探针组合物具备较高的特异性，可根据荧光信号结果判断突变基因型。

实施例3

本实施例使用本发明的引物探针组合物对29例肥厚型心肌病患者(经毛细管电泳测序的已知基因型，患者知情同意，且得到大理大学医学伦理委员会批准)进行TNNI3，c.365T>C突变检测，采用本发明试剂盒按表3和表4所述进行实时荧光PCR反应，根据荧光信号分析结果，其中，TT基因型：具有较高FAM荧光信号，HEX荧光信较低；TC基因型：FAM荧光信号和HEX荧光信号均较高；CC基因型：具有较高HEX荧光信号，FAM荧光信号较低。如图12所示的基因分型散点图，TT基因型为23例，TC基因型为2例，CC基因型为4例，检测结果与毛细管电泳测序结果一致，准确率为100％。

综上所述，本发明的引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，能够针对TNNI3新突变位点c.365T>C，利用其进行实时荧光PCR，可实现简便、快速、准确和经济地判断基因型；所述检测试剂盒扩增效率及灵敏度较高，且具有良好的重复性与特异性，操作简单，准确性高，可以一次性检测多个样本，成本较低，耗时较短，具有极高的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 大理大学

<120> 一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用

<130> 20210402

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacaacaca caccacgttc ctc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtcccagc catctcaccc ta 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaccaaga acatcacgga gat 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtcaccaag aacaccacgg agat 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccctcagac ccaggagtcc agt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caacatgtga tgccctgagc atg 23

Claims

1.一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因突变的引物和探针；

所述引物的核酸序列如SEQ ID NO.1~2所示；

所述探针包括野生型探针和突变型探针；

所述野生型探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述突变型探针的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为Taqman探针。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述Taqman探针的核酸序列5’端标记有荧光基团。

4.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述Taqman探针的核酸序列3’端标记有淬灭基团。

5.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM或HEX。

6.根据权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括MGB。

7.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团与所述突变型探针5’端标记的荧光基团不同。

8.根据权利要求7所述的引物探针组合物，其特征在于，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为FAM。

9.根据权利要求7所述的引物探针组合物，其特征在于，所述突变型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为HEX。

10.一种检测TNNI3基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-9任一项所述的用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg²⁺缓冲液、dNTPs和水。

13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述染料包括Rox校正染料。

14.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括野生型质控品、突变型质控品和杂合突变型质控品。

16.一种权利要求10所述的检测TNNI3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述方法包括：

提取基因组，以基因组为模板，采用所述检测TNNI3基因突变的试剂盒进行实时荧光PCR检测，分析结果。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR检测的反应条件包括：

预变性：94~96℃，25~35 s；

循环延伸：94~96℃变性3~7 s、57~59℃退火及延伸30~40 s，35~45个循环；

循环外延伸：62~66℃延伸1~3 min。

19.根据权利要求16-18任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

提取基因组，以基因组为模板，采用所述检测TNNI3基因突变的试剂盒进行实时荧光PCR检测，检测反应条件包括：94~96℃预变性25~35 s；94~96℃变性3~7 s、57~59℃退火及延伸30~40 s，35~45个循环；62~66℃延伸1~3 min，分析结果。