KR102241836B1 - 듀얼 체크 올리고를 이용한 유전자 다형성 검사 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생명체의 유전정보에서 나타나는 유전자 다형성의 검사방법에서 나타날 수 있는 판독 오류를 감소시키고, 유전자 검사의 정확성을 높이기 위해 대상이 되는 유전자에 인위적인 돌연변이를 도입하여 검출하고자 하는 유전자 다형성을 정확하게 확인 할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 SNP와 같이 특정 염기 서열의 변이가 한 개 또는 그 이상의 유전자를 검사할 때 나타날 수 있는 야생형 유전자형과 돌연변이형 유전자형, 그리고 이배체 이상의 생명체에서 나타날 수 있는 헤테로형 유전형의 비 특이적 증폭이나 동시 증폭과 같은 유전자 증폭의 문제를 해결할 수 있다. 또한 검사의 정확성을 높임에 따라 생명체의 질병 발생 가능성을 정확히 검사할 수 있으며, 이에 대한 치료 및 관리에 대한 정확한 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 유전자 다형성을 검출하는 방법에 관한 것이다.
동종 개체들 가운데에서 2개 이상의 대립 형질이 구별되는 것을 유전자 다형성이라 정의하고 있으며, 생명체의 유전질환이란 일반적으로 유전자 이상으로 생기는 질환을 통칭하여 말한다.
현대의학에서 유전 혹은 유전자는 생명현상의 기본 발현단위로서의 유전자의 의미와 어떤 증상 혹은 표현의 정보가 부모에서 그 자손 그리고 그 후손에게 전달되어 나타나 표현되는 유전의 의미를 포함한다.
일례로, 사람의 염색체는 2배체로 존재하며, 각 일배체(haploid)는 부모로부터 하나씩 받아 구성된다. 따라서 부모에게 전달받은 유전자의 유형에 따라 개인의 유전자 다형성은 결정된다.
이러한 생명체의 유전 질환 여부를 확인할 수 있는 대표적인 방법은 DNA나 RNA 또는 단백질과 같은 생체에서 유래된 유전정보, 단백질을 검사하여 확인하는 것이 가장 일반적이고 정확한 것으로 알려져 있으며, 이 중 DNA를 이용한 검사 방법은 정확도나 민감도, 특이도가 가장 높은 방법으로 인식되고 있다.
DNA를 이용하여 검사하는 방법 중의 일례로, 각막의 혼탁을 유발하는 대표적인 유전질환의 하나인 각막이상증은 발병 원인 중에 TGFb1 유전자 엑손 4번, 12번에 존재하는 유전자다형성이 있다.
현대의학에서는 소비자의 수요에 따라 라식, 라섹과 같은 레이저를 이용한 시력을 보정하는 시술이 증가하고 있는 추세이다. 시술 전 현미경 검사를 통해 안구 내 각막 이상을 검사하고 있으나, 그 질환의 진행 정도 및 검사자의 숙련도에 따라 발견되는 확률이 적어 시술 후 각막 혼탁이 빠르게 진행되고 이내 실명에 이르게 된다.
이러한 각막이상증을 유전적인 정보를 정확하게 확인하여 실명과 같은 위험을 방지하고 검사자의 숙련도에 따른 오차들을 배제하기 위해 유전자 검사법이 도입되어 시행되고 있다.
이러한 각막이상증에는 GFb1(BIGH3) 유전자의 엑손 4번에는 124번 코돈의 다형성에 따라 아벨리노 각막이상증 (Avellino dystrophy), 라이스-뷔클러 각막이상증 (Reis-Bueckler's dystrophy), 격자 각막이상증 (lattice dystrophy)과 같은 이상증이 있으며, 엑손 12번의 555번 코돈에 위치한 다형성에는 티엘 벤케 각막이상증 (Thiel-Behnke dystrophy), 과립 각막이상증 (granular dystrophy)이 포함된다.
IC3D(International Committee for Classification of Corneal Dystrophies)에서 카테고리 1, 원인 유전자와 돌연변이가 밝혀진 각막이상증으로 분류된 유전질환이다. 이러한 질환의 원인이 될 수 있는 유전자 부위를 검출하는 대표적인 방법이 대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응(allele specific polymerase chain reaction)이며, 부모에게서 유전된 각 대립유전자(allele)의 유전형을 확인하고, 이에 대한 질환 위험성을 확인하는 방법이다. (도 1 내지 5)
본 발명자들은 유전자의 변이된 부분을 정확하게 진단하기 위하여 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 유전자 증폭 방법을 이용한 검사 방법을 개발하고자 하였다. 또한, 유전자 검사에서 나타날 수 있는 비특이적 증폭 산물의 최소화 및 거짓 양성(false positive)과 거짓 음성(false negative) 검사 결과를 최소화 하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 BIGH3 유전자의 엑손 4번에 존재하는 124번의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; 이하, SNP)와 엑손 12번에 존재하는 555번의 단일염기다형성을 정확하게 진단할 수 있는 듀얼 체크 올리고 검사 방법을 개발하였다.
이에, 본 발명의 목적은 각막이상증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 각막이상증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
기존의 SNP 부위를 검출하는 방법은 대상 유전자 변이 부분을 야생형, 헤테로형, 돌연변이형으로 구분하는 방법이 특정 프로브의 결합력 차이로 구별하게 되어, 거짓 양성과 거짓 음성의 검사 결과 위험이 존재하였다. (도 6 내지 9)
또한, 해당 SNP부위를 검사하기 위한 기존의 프라이머와 프로브 디자인의 방식은 SNP 부위의 방향성 및 서열 결정을 기본 서열에서 변경하는데 제약이 존재하여, 같은 위치의 변이나 근접한 위치의 변이가 존재하는 경우 프라이머와 프로브를 디자인하는데 어려움이 있었다.
본 발명자들은 유전자의 변이된 부분을 정확하게 진단하기 위하여 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 유전자 증폭 방법을 이용한 검사 방법을 개발하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 BIGH3 유전자의 엑손 4번에 존재하는 124번의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; 이하, SNP)와 엑손 12번에 존재하는 555번의 단일염기다형성을 정확하게 진단할 수 있도록, 프라이머와 프로브에 돌연변이를 도입하며, SNP 부위를 프라이머, 프로브로 선별하는 듀얼 체크 올리고 기술을 개발하였다. 본 발명의 각막이상증 진단용 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제1 진단 조성물; 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제2 진단 조성물;을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 듀얼 체크 올리고 제작 방법은 대상 유전자 부위를 선정하는 유전자 선정 단계; 대상 유전자에 맞는 프라이머 부위 선정 및 프라이머 디자인 단계; 대상 유전자에 맞는 프로브 부위 선정 및 프로브 디자인 단계; 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브를 디자인하는 단계; 디자인된 프라이머, 프로브를 이용하여 컨트롤 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계; 및 선정된 프라이머, 프로브를 이용하여 혈액 및 구강세포에서 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계를 포함한다. 디자인한 프라이머와 프로브의 검출 정확도를 비교하기 위하여 제작된 컨트롤 DNA를 사용하여, 농도별로 순차 희석하여 사용하였으며, 종래의 PCR과 실시간 PCR을 이용하여 컨트롤 DNA의 양에 따른 검출 한계 측정 및 민감도와 특이도 검사를 진행하였다. 또한 기존의 대립유전자 특이적(allele specific) PCR의 기법과 듀얼 체크 올리고 기술의 민감도 특이도 비교 및 위양성과 위음성의 결과 발생 정도를 비교하였다. 본 발명의 방법에 의하면, 듀얼 체크 올리고 기술을 이용하여 SNP 부위의 변이 여부를 판단하는 데 있어 기존의 검출 방식보다 정확도가 높은 결과를 얻을 수 있다. 또한, 프라이머와 프로브에서 각각 선별을 하기 때문에 한 부위의 유전자 변이 부분에서 검출해야 하는 진단 방식의 정확도를 높일 수 있으며, 특히, 한 유전자 부위에 두 개 이상의 변이가 있을 경우 증폭의 정확성을 높여, 유전자 변이 여부를 보다 정확하게 확인할 수 있다.
이를 통해 검사 결과의 정확도를 높이고, 거짓 양성과 거짓 음성 결과의 위험을 최소화 하고자 하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 각막이상증 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 각막이상증 진단용 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제1 진단 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제1 진단 조성물은 GFb1(BIGH3) 유전자의 엑손 4번에는 124번 코돈의 다형성을 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제1 진단 조성물이 진단할 수 있는 각막이상증은 아벨리노 각막이상증 (Avellino dystrophy), 라이스-뷔클러 각막이상증 (Reis-B
ckler's dystrophy) 및 격자 각막이상증 (lattice dystrophy) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 각막이상증 진단용 조성물은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제2 진단 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제2 진단 조성물은 GFb1(BIGH3) 유전자의 엑손 12번의 555번 코돈의 다형성을 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제2 진단 조성물이 진단할 수 있는 각막이상증은 티엘 벤케 각막이상증 (Thiel-Behnke dystrophy) 및 과립 각막이상증 (granular dystrophy) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 각막이상증 진단용 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제1 진단 조성물; 및
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제2 진단 조성물;을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 각막이상증 진단용 조성물이 제1 진단 조성물 및 제2 진단 조성물을 포함하는 경우 GFb1(BIGH3) 유전자의 엑손 4번에는 124번 코돈의 다형성 및 GFb1(BIGH3) 유전자의 엑손 12번의 555번 코돈의 다형성을 동시에 탐지할 수 있다.
본 발명의 각막이상증 진단용 조성물이 제1 진단 조성물 및 제2 진단 조성물을 포함하는 경우, 본 발명의 각막이상증 진단용 조성물이 진단할 수 있는 각막이상증은 아벨리노 각막이상증, 라이스-뷔클러 각막이상증, 격자 각막이상증, 티엘 벤케 각막이상증 및 과립 각막이상증을 동시에 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 프로브는 각각 독립적으로 5'말단부위에 형광물질이 결합되어 있고 3'말단부위에는 퀸처가 결합되어 있거나, 또는 5'말단부위에 퀸처가 결합되어있고 3'말단부위에는 형광물질이 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 형광물질은 FAM, Cy5, JOE, VIC, HEX, CalRed 및 Texas Red로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 프로브에 결합된 형광물질은 프로브에 따라 각각 상이한 형광물질인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 퀸처는 BHQ, Dabsyl, Qxl 및 IRDye QC-1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 프로브에 결합된 퀸처는 프로브에 따라 각각 상이한 퀸처인 것일 수 있다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 듀얼 체크 올리고 제작 방법에 관한 것이다:
대상 유전자 부위를 선정하는 유전자 선정 단계;
대상 유전자에 맞는 프라이머 부위 선정 및 프라이머 디자인 단계;
대상 유전자에 맞는 프로브 부위 선정 및 프로브 디자인 단계;
프라이머 및 프로브를 이용하여 각 부위에 인위적인 돌연변이를 도입하여 디자인하는 단계;
디자인된 프라이머, 프로브를 이용하여 컨트롤 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계;
선정된 프라이머, 프로브를 이용하여 혈액 및 구강세포에서 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계.
본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세하게 설명한다.
유전자 선정 단계
현재 5가지 각막이상증의 유전자 다형성이 나타나는 TGFB1 유전자를 대상으로 듀얼 체크 올리고 기술을 도입하기로 하였으며, 엑손 4번, 12번에 존재하는 124번 위치의 SNP와 555번의 SNP 부위의 유전자 다형성을 통해 해당 기술을 확인하고자 하였다. 자세한 내용은 실시예에 기술하였다.
프라이머 부위 선정 및 디자인 단계
유전자 선정 단계에서 선정한 유전자 부위에 맞는 프라이머 부위를 선정하여 대상 유전자만이 증폭되고 다른 유전자 부위는 증폭되지 않는 부분을 선별하고자 하였다.
프로브 부위 선정 및 프라이머 디자인 단계
유전자 선정 단계에서 선정한 유전자에서 특정 유전자 변이(SNP)가 존재하는 부분을 검출할 수 있는 프로브 부위를 선정하였으며, 해당 SNP 부위가 3' 말단부위에 위치할 수 있도록 디자인 하였다.
프라이머 및 프로브를 이용하여 각 부위에 인위적인 돌연변이를 도입하는 듀얼 체크 올리고 디자인 단계
상기 선정한 프라이머와 프로브의 불특정 서열 위치에 인위적인 돌연변이를 도입하여 SNP 부위에 결합하는 결합 정도를 조절하고자 하였다. 인위적인 돌연변이는 한 부위 이상을 도입하여 디자인하였다.
디자인된 프라이머, 프로브를 이용하여 컨트롤 DNA(플라스미드)를 사용하여 종래의 PCR과 실시간 PCR을 통해 확인하는 단계
상기 디자인한 프라이머와 프로브의 검출 정확도를 비교하기 위하여 제작된 컨트롤 DNA를 사용하여, 농도별로 순차 희석하여 사용하였으며, 종래의 PCR과 실시간 PCR을 이용하여 컨트롤 DNA의 양에 따른 검출 한계 측정 및 민감도와 특이도 검사를 진행하였다. 또한 기존의 대립유전자 특이적(allele specific) PCR의 기법과 듀얼 체크 올리고 기술의 민감도 특이도 비교 및 위양성과 위음성의 결과 발생 정도를 비교하였다.
선정된 프라이머, 프로브를 이용하여 혈액 및 구강세포에서 추출한 DNA를 사용하여 종래의 PCR과 실시간 PCR을 통해 확인하는 단계
실제 검체로 사용되는 혈액과 구강세포에서 DNA를 추출하고, 선정된 프라이머와 프로브가 가진 검출 성능과 정확도를 비교하고자 하였다. 채혈한 혈액에서 핵산을 추출하고, 구강 내 세포를 채취하여 핵산을 추출하였다. 그 다음, 종래의 PCR을 진행하여 아가로즈 겔 전기영동을 통해 결과를 확인하였으며, 실시간 PCR을 통해 증폭에 대한 Ct value, 형광 증가 정도, 위양성 및 위음성 결과 발생 여부를 확인하였다.
본 발명의 방법에 의하면, 듀얼 체크 올리고 기술을 이용하여 SNP 부위의 변이 여부를 판단하는 데 있어 기존의 검출 방식보다 정확도가 높은 결과를 얻을 수 있다.
또한, 프라이머와 프로브에서 각각 선별을 하기 때문에 한 부위의 유전자 변이 부분에서 검출해야 하는 진단 방식의 정확도를 높일 수 있으며, 특히, 한 유전자 부위에 두 개 이상의 변이가 있을 경우 증폭의 정확성을 높여, 유전자 변이 여부를 보다 정확하게 확인할 수 있다.
또한, 기존의 프라이머와 프로브 디자인이 가진 한계를 극복하여 다양한 유전자 검사에 적용할 수 있다.
이를 통해 검사 대상자의 유전자 변이 여부를 위양성과 위음성의 발생 가능성을 최소화 하여 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 듀얼 체크 올리고 기술을 이용하여 SNP 부위의 변이 여부를 판단에 있어 기존의 검출 방식보다 정확도가 높은 결과를 얻을 수 있다. 또한, 프라이머와 프로브에서 각각 선별을 하기 때문에 한 부위의 유전자 변이 부분에서 검출해야 하는 진단 방식의 정확도를 높일 수 있고, 특히, 한 유전자 부위에 두 개 이상의 변이가 있을 경우, 증폭의 정확성을 높여 유전자 변이 여부를 보다 정확하게 확인할 수 있다. 또한, 기존의 프라이머와 프로브 디자인이 가진 한계를 극복하여 다양한 유전자 검사에 적용할 수 있다. 이를 통해 검사 대상자의 유전자 변이 여부를 위양성과 위음성의 발생 가능성을 최소화 하여 검출할 수 있다.
도 1은 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법을 도식화한 그림이다.
도 2는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 야생형(allele 1)의 샘플을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 돌연변이형(대립유전자의 샘플2)을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 헤테로형의 샘플을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 증폭된 형광 값이 대립유전자 차별(allelic discrimination) 표에 각 형(type)으로 표시되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 기존 검출 방법에 따라 야생형의 샘플을 테스트하여 돌연변이 신호가 같이 증폭되는 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 기존 검출 방법에 따라 헤테로형의 샘플을 테스트하여 야생형 신호와 돌연변이형 신호 값이 차이를 나타내는 그래프이다.
도 8은 기존 검출 방법에 따라 검체를 테스트하여 대립 형별 구도(allelic discrimination plot)로 유전형을 구분한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 기존 검출 방법에 따라 샘플을 테스트한 결과 각 대립유전자가 분리되지 않은 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 듀얼 체크 올리고 기술을 도식화한 그림이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 124번째 유전자부위의 SNP가 듀얼 체크 올리고로 작용하는 것을 나타낸 그림이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 555번째 유전자부위의 SNP가 듀얼 체크 올리고로 작용하는 것을 나타낸 그림이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 27은 본 발명의 일 실시에에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 대립 형별 구도를 확인한 결과이다.
도 28는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 대립형별 구도를 확인한 결과이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따라 검체에서 추출한 DNA를 사용하여 야생형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 결과 그림이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 40개의 검체 샘플에서 유전자형이 야생형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따라 검체에서 추출한 DNA를 사용하여 헤테로형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 그래프이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 16개의 검체 샘플에서 유전자형이 헤테로형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 돌연변이형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 그래프이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 10개의 테스트 샘플에서 유전자형이 돌연변이형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따라 검체 DNA를 사용하여 대립 형별 구도를 확인한 결과 그림이다.
도 2는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 야생형(allele 1)의 샘플을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 돌연변이형(대립유전자의 샘플2)을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 헤테로형의 샘플을 테스트하였을 때 증폭 형광이 측정되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 기존의 대립유전자 특이적 PCR 검출 방법에 따라 증폭된 형광 값이 대립유전자 차별(allelic discrimination) 표에 각 형(type)으로 표시되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 기존 검출 방법에 따라 야생형의 샘플을 테스트하여 돌연변이 신호가 같이 증폭되는 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 기존 검출 방법에 따라 헤테로형의 샘플을 테스트하여 야생형 신호와 돌연변이형 신호 값이 차이를 나타내는 그래프이다.
도 8은 기존 검출 방법에 따라 검체를 테스트하여 대립 형별 구도(allelic discrimination plot)로 유전형을 구분한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 기존 검출 방법에 따라 샘플을 테스트한 결과 각 대립유전자가 분리되지 않은 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 듀얼 체크 올리고 기술을 도식화한 그림이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 124번째 유전자부위의 SNP가 듀얼 체크 올리고로 작용하는 것을 나타낸 그림이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 555번째 유전자부위의 SNP가 듀얼 체크 올리고로 작용하는 것을 나타낸 그림이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 124번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 555번 유전자 변이에 대한 증폭 정도를 확인한 그래프이다.
도 27은 본 발명의 일 실시에에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 대립 형별 구도를 확인한 결과이다.
도 28는 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 대립형별 구도를 확인한 결과이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따라 검체에서 추출한 DNA를 사용하여 야생형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 결과 그림이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 40개의 검체 샘플에서 유전자형이 야생형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따라 검체에서 추출한 DNA를 사용하여 헤테로형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 그래프이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 16개의 검체 샘플에서 유전자형이 헤테로형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따라 컨트롤 DNA를 사용하여 돌연변이형의 대립유전자가 증폭됨을 확인한 그래프이다. 한 개의 그래프는 1개의 샘플의 결과를 나타내는 것으로, 총 10개의 테스트 샘플에서 유전자형이 돌연변이형일 때 특이적으로 증폭하는 것을 보여준다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따라 검체 DNA를 사용하여 대립 형별 구도를 확인한 결과 그림이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 듀얼 체크 올리고 대상 유전자 선정
유전자 다형성을 검출할 수 있는 대상 유전자를 선정하기 위해, 일반적인 대립유전자 특이적 PCR에서의 검출 시 위양성 및 위음성의 문제가 발생할 수 있는 유전자 검사 방법을 선정하여 듀얼 체크 올리고 기술을 적용하고자 하였다.
이에, 엑손 4번에 위치한 124번 코돈의 다형성에 의한 아벨리노 각막이상증 (Avellino dystrophy), 라이스-뷔클러 각막이상증 (Reis-Bueckler's dystrophy), 격자 각막이상증 (lattice dystrophy)을 선정하였으며, 엑손 12번의 555번 코돈에 위치한 다형성에 의한 티엘 벤케(Thiel-Behnke) 각막이상증 (Thiel-Behnke dystrophy), 과립각막이상증 (granular dystrophy)을 선정하였다.
실시예 2: 프라이머 부위 선정 및 디자인
실시예 1에서 선정한 5가지의 유전자에 대한 유전자 부위 선정 및 프라이머 디자인을 진행하였다. (도 10 및 11)
2-1. 아벨리노 각막이상증, 라이스-뷔클러 각막이상증, 격자 각막이상증
아벨리노 각막이상증, 라이스-뷔클러 각막이상증, 격자 각막이상증의 유전자 다형성을 나타내는 부위는 엑손 4번에 위치한 124코돈이며, 해당 유전자 부위의 유전자 서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 확인하였다.
그 다음, SNP 사이트가 3´ 말단 방향이 되도록 야생형 내부 프라이머(inner primer)와 돌연변이형 내부 프라이머를 결정하고, 내부 프라이머의 반대 방향으로 외부(outer) 프라이머를 결정하였다.
내부 프라이머의 길이는 다양하게 디자인하여 다양한 Tm 값을 가지는 프라이머를 디자인 하였으며, SNP 위치를 기준으로 한 개 이상의 인위적인 유전자를 도입하였다. 외부 프라이머의 길이는 다양하게 디자인하여 다양한 Tm 값을 가지는 프라이머를 디자인하였으며, 인위적인 유전자를 도입하지 않았다.
그 다음, 내부 프라이머와 외부 프라이머를 조합하여 종래의 PCR을 통해 최적의 조합을 선별하였다.
| 서열번호 | 명명 | 서열목록 | Mer | Tm |
| 1 | 124NF-11 | CTACCACTCTCAAACCTTTACGA | 23 | 60.9 |
| 2 | GARN2-2-R | ACTAGGGCCTCAGCTTCTCCTAGT | 25 | 66.9 |
| 3 | 124MT-R-1 | CGTGAGGCCTCAGCTTCTCCGCGAA | 25 | 72.3 |
| 4 | GRN2-26-2 | GGCCTCAGCTTCTCCGTCCGA | 21 | 67.3 |
2-2. 티엘 벤케 각막이상증, 과립각막이상증
티엘 벤케 각막이상증, 과립각막이상증의 유전자 다형성을 나타내는 부위는 엑손 12번에 위치한 555코돈이며, 해당 유전자 부위의 유전자 서열을 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 확인하였다.
그 다음, SNP 사이트가 3´ 말단 방향이 되도록 야생형 내부 프라이머와 돌연변이형 내부 프라이머를 결정하고, 내부 프라이머의 반대 방향으로 외부 프라이머를 결정하였다.
내부 프라이머의 길이는 다양하게 디자인하여 다양한 Tm 값을 가지는 프라이머를 디자인 하였으며, SNP 위치를 기준으로 한 개 이상의 인위적인 유전자를 도입하였다. 외부 프라이머의 길이는 다양하게 디자인하여 다양한 Tm 값을 가지는 프라이머를 디자인하였으며, 인위적인 유전자를 도입하지 않았다.
그 다음, 내부 프라이머와 외부 프라이머를 조합하여 종래의 PCR을 통해 최적의 조합을 선별하였다. (도 12)
| 서열번호 | 명명 | 서열목록 | Mer | Tm |
| 5 | 5R-63 | ATGGAGACGTGTACTTAAGTTGG | 23 | 60.9 |
| 6 | F5WT-3-1-F | CCTGCCACCAAGAGACCGT | 19 | 61.6 |
| 7 | 555MT-3-F | TATCCCCTGCCACCAAGAGGATA | 23 | 64.6 |
실시예 3: SNP 부위를 포함하는 컨트롤 플라스미드 제작 과정
실시예 2번에서 결정한 각 SNP 부위와 외부 프라이머를 포함하는 컨트롤 플라스미드를 제작하였다. 124코돈의 외부 프라이머의 양 말단을 기준으로 150 내지 200bp 정도를 더 포함하는 서열의 프라이머를 디자인하고, 555코돈의 외부 프라이머의 양 말단을 기준으로 200 내지 250bp 정도를 더 포함하는 서열의 프라이머를 디자인하였다. 야생형의 인간 게놈 DNA를 주형으로 사용하였으며, PCR에 사용되는 시약은 SolgTM 2X Pfu smart mix(Solgent, Korea)를 사용하였다.
자세한 조성은 SolgTM 2X Pfu smart mix 25ul, 정방향 프라이머(10pmole/uL) 1ul, 역방향 프라이머(10pmole/uL) 1ul, 인간 게놈 DNA(1ng/ul) 1ul, DDW 22ul를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 섞어준 후, PCR 튜브에 분주하여 ABI veriti thermal cycler PCR 머신에서 다음 조건으로 PCR을 진행하였다.
PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성(denaturation)한 후, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 세 단계를 35 사이클 반복하였다. 반복 후 72℃에서 5분간 마지막 합성을 진행한 후 아가로스 젤 전기영동을 통해 타겟 밴드만이 합성된 것을 확인한 후 T-blunt 클로닝을 진행하였다. 사용한 제품은 SolgTM T-blunt 클로닝 kit(Solgent, Korea)를 사용하였으며, PCR 정제을 통해 확보한 주형 DNA를 20ng/ul로 희석하여 사용하였다.
반응 조건은 6X 반응 버퍼 1ul, T-blunt 벡터 1ul, 주형 DNA 1ul, DDW 3ul를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 섞은 후 25℃에서 5분간 반응시킨 후, DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환한 후, 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석을 진행하고, 해당 서열이 정확하게 확인된 클론의 플라스미드를 Nano-drop 분광광도계(ThermoFisher scientific, USA)를 이용하여 정량한 후 다음 실험에 사용하였다.
돌연변이형은 미리 만들어 놓은 야생형 컨트롤 플라스미드를 주형으로 사용하였으며, 인버스 PCR 기법을 사용하였다. PCR에 사용되는 시약은 SolgTM 2X Pfu smart mix(SPD01-M50h)를 사용하였다. 자세한 조성은 SolgTM 2X Pfu smart mix(Solgent, Korea) 25ul, 정방향 프라이머(10pM) 1ul, 역방향 프라이머(10pM) 1ul, 야생형 컨트롤 플라스미드(10pg/uL) 1ul, DDW 22ul를 1.5ml 에펜도르프 튜브에 섞어준 후, PCR 튜브에 분주하여 ABI veriti thermal cycler PCR 머신에서 다음 조건으로 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성한 후, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 세 단계를 35 사이클 반복하였다. 반복 후 72℃에서 5분간 마지막 합성을 진행한 후 아가로스 젤 전기영동을 통해 타겟 밴드만이 합성된 것을 확인한 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 자가 결찰(self-ligation)을 진행하였다. 그 다음, Ligation product 10ul를 DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환한 후, 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석을 진행하고, 해당 서열이 정확하게 확인된 클론의 플라스미드를 Nano-drop 분광광도계를 이용하여 정량한 후 다음 실험에 사용하였다.
실시예 4: 프로브 부위 선정 및 디자인
실시예 3번에서 선정한 유전자 부위 중 SNP 부위에 맞는 프로브의 결합 부위를 선정하였다. 해당 SNP 부위에 대해 센스 가닥(sense strand)과 안티-센스 가닥(anti-sense strand)에 대한 프로브를 디자인 하였다. 또한, 다양한 사이즈를 고려하여 Tm 값을 선정하였다. 야생형을 검출하는 프로브의 5'말단부위에는 FAM 염료를 연결하였으며, 3'말단부위에는 BHQ1 퀸처(quencher)를 연결하였다. 돌연변이형을 검출하는 프로브의 5'말단부위에는 JOE 염료를 연결하였으며, 3'말단부위에는 BHQ1 퀸처(quencher)를 연결하였다. 각 3'말단부위가 SNP 부위가 되도록 선정한 후, 1개 이상의 돌연변이 서열을 도입하여 디자인하였다.
실시예 5: 프라이머, 프로브를 이용하여 각 부위에 인위적인 돌연변이를 도입하는 듀얼 체크 올리고 디자인
기존의 검출 방식인 대립유전자 특이적 PCR 방식으로 디자인한 프라이머와 프로브 조합과 듀얼 체크 올리고 기술을 사용한 프라이머와 프로브를 비교하기 위해, 해당 프라이머와 프로브의 특정 부분에 인위적인 염기 서열을 도입하여, 해당 프라이머와 프로브의 결합력을 조절하고, 이를 통한 정확도 향상과 위양성, 위음성 발생 가능성을 최소화 하고자 하였다. 이를 위해 해당 내부 프라이머의 3'말단부위를 기준으로 1 베이스(base) 이상의 돌연변이를 도입하였으며, 프로브 역시 5'말단부위를 기준으로 1 베이스 이상의 돌연변이를 도입하여 디자인하였다.
| 서열번호 | 명명 | 서열목록 | Mer | Tm |
| 8 | ACD-A-1 | CTGTACACGGACCACTAGGA | 20 | 60.5 |
| 9 | 124MT-P | CTGTACACGGACTTCGCGG | 19 | 61.6 |
| 10 | F5WT-P | CCAAGAGTCTGCTACGGTCT | 20 | 60.5 |
| 11 | 555MT3-P | CCAAGAGTCTGCTCTATCCTC | 21 | 61.2 |
실시예 6: 프라이머, 프로브를 이용하여 컨트롤 DNA(플라스미드)를 사용하여 종래의 PCR과 실시간 PCR을 통해 확인하는 과정
기존 방식으로 디자인된 프라이머와 프로브 세트와 듀얼 체크 올리고 로 디자인한 프라이머와 프로브의 성능을 비교하기 위하여 컨트롤 DNA를 이용하여 종래의 PCR로 1차적인 성능 비교를 진행하였다. 종래의 PCR을 테스트 에 사용한 시약은 SolgTM 2X multiplex PCR smart mix(Solgent, Korea)를 사용하였으며, 컨트롤 DNA는 다양한 농도로 희석하여 사용하였다. 한 샘플 당 SolgTM 2X multiplex PCR smart mix 10ul, 정방향 프라이머(10pM) 0.5ul, 역방향 프라이머(10pM) 0.5ul, 컨트롤 주형(100fg/uL) 1ul, D.D.W 8ul를 사용하여 총 부피 20ul로 진행하였다. PCR 조건은 initial PCR 스텝으로 95℃에서 15분간 반응하고, 95℃에서 15초 60℃에서 1분간 반응하는 사이클을 40번 반복하였다. Final extension으로 72℃에서 5분간 반응한 후, 3% 아가로스 젤에 전기영동하여 PCR 효율 및 non-specific 밴드형성 유무를 확인하였다. 다양한 조합의 PCR 산물을 비교하여 최적의 프라이머 조합을 선정한 후, 프로브 테스트를 진행하였다.
프로브 테스트를 진행하기 위하여 실시간 PCR을 진행하였으며, 기존 방식으로 디자인된 프라이머, 프로브와 듀얼 체크 올리고 기술로 디자인한 프라이머, 프로브를 비교하였다. 사용한 시약은 UDG 시스템이 적용되어 있는 DiaPlexQTM 2X Multiplex 실시간 PCR smart mix를 사용하였으며, 컨트롤 DNA는 순차희석하여 사용하였다. 한 샘플 당 DiaPlexQTM 2X Multiplex 실시간 PCR smart mix 10ul, 정방향 프라이머(10pM) 1ul, 역방향 프라이머(10pM) 1ul, 프로브(1pM) 5ul, 컨트롤 주형 1ul, D.D.W 2ul를 사용하여 총 부피 20ul로 진행하였다. PCR 조건은 UDG를 활성화시키기 위해 50℃에서 3분간 반응시킨 후, 프로브의 처음 형광 값을 기록하기 위해 pre-PCR reading을 60℃에서 1분간 진행하여 형광 값을 측정하였다. 이후 95℃에서 15분간 PCR 활성화를 진행한 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 반응한 후 매 사이클마다 형광 값을 측정하였다. 두 개의 스텝을 40사이클 반복하여 측정한 후, 50℃에서 1분간 반응하며 마지막 형광 값을 측정하였다. 나타난 형광 값을 기준으로 Ct value, RFU값을 비교하고, 각 대립유전자의 유전형 구분의 정확도를 비교하여, 그 결과를 도 13 내지 28에 나타내었다.
실시예 7: 혈액 및 구강세포에서 추출한 DNA를 사용하여 종래의 PCR과 실시간 PCR을 통해 확인하는 과정
실제 검체에서의 듀얼 체크 올리고 기술을 사용한 검출 방법의 정확도를 비교하기 위하여, 기존의 검출 방법과 듀얼 체크 올리고 기술을 적용한 검출방법을 비교하였다. 현재 국내에는 ACD를 제외한 환자의 발생률이 높지 않고, ACD의 경우도 돌연변이형의 경우 이른 나이에 발병을 하게 되어 검체를 확보하는 것이 어려워 실 검체 테스트는 야생형과 헤테로형의 유전형을 가진 검체를 대상으로 실시하였다. 실시예 6번에서 선정한 프라이머와 프로브를 이용하여, 검출 방법 별 정확도를 비교하였다. 혈액에서의 추출은 SolgTM gDNA prep kit for blood(Solgent, Korea)를 사용하여 추출하였으며, 추출한 DNA는 Nano-drop 분광광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 정량하여 사용하였다. 구강세포에서 채취한 상피 세포는 SolgTM Genomic DNA prep kit(for oral 상피 세포s)를 사용하여 추출하였으며, 추출한 DNA는 Nano-drop 분광광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 정량하여 사용하였다. 사용한 시약은 UDG system이 적용되어 있는 DiaPlexQTM 2X Multiplex 실시간 PCR smart mix를 사용하였으며, 컨트롤 DNA는 순차희석하여 사용하였다. 한 샘플 당 DiaPlexQTM 2X Multiplex 실시간 PCR smart mix 10ul, 정방향 프라이머(10pM) 1ul, 역방향 프라이머(10pM) 1ul, 프로브(1pM) 5ul, 컨트롤 주형 1ul, D.D.W 2ul를 사용하여 총 20ul volume으로 진행하였다. PCR 조건은 UDG를 활성화시키기 위해 50℃에서 3분간 반응시킨 후, 프로브의 처음 형광 값을 기록하기 위해 pre-PCR reading을 60℃에서 1분간 진행하여 형광 값을 측정하였다. 이후 95℃에서 15분간 PCR 활성화를 진행한 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 반응한 후 매 사이클마다 형광 값을 측정하였다. 두 개의 스텝을 40 사이클 반복하여 측정한 후, 50℃에서 1분간 반응하며 마지막 형광 값을 측정하였다. 나타난 형광 값을 기준으로 Ct value, RFU 값을 비교하고, 각 대립유전자의 유전형 구분의 정확도를 비교하여, 그 결과를 도 29 내지 32에 나타내었다.
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<213> Artificial Sequence
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<223> 555MT3-P
<400> 11
ccaagagtct gctctatcct c 21
Claims (6)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제1 진단 조성물; 및
서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 제2 진단 조성물;
로 이루어진 군에서 1종 이상의 진단 조성물을 포함하는 각막이상증 진단용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 프로브는 각각 독립적으로 5'말단부위에 형광물질이 결합되어 있고 3'말단부위에는 ??처가 결합되어 있거나, 또는 5'말단부위에 ??처가 결합되어있고 3'말단부위에는 형광물질이 결합되어 있는 것인, 각막이상증 진단용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM, Cy5, JOE, VIC, HEX, CalRed 및 Texas Red로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 각막이상증 진단용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 ??처는 BHQ, Dabsyl, Qxl 및 IRDye QC-1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 각막이상증 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 각막이상증은 제2형 과립형 각막 이상증(Avellino corneal dystrophy, ACD), 레이스 버클러스 각막 이상증(Reis-buecklers' corneal dystrophy, RBCD), 격자형 각막 이상증(Lattice corneal dystrophy, LCD), 제1형 과립형 각막 이상증(Granular corneal dystrophy type 1, GCD) 및 티엘-벵케 각막 이상증(Thiel-Behnke corneal dystrophy, TBCD)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 각막이상증 진단용 조성물.
- 하기의 단계를 포함하는 듀얼 체크 올리고 제작 방법.
대상 유전자 부위를 선정하는 유전자 선정 단계;
대상 유전자에 맞는 프라이머 부위 선정 및 프라이머 디자인 단계;
대상 유전자에 맞는 프로브 부위 선정 및 프로브 디자인 단계;
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프로브 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브를 디자인하는 단계;
디자인된 프라이머, 프로브를 이용하여 컨트롤 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계; 및
선정된 프라이머, 프로브를 이용하여 혈액 및 구강세포에서 추출한 DNA를 사용하여 PCR을 통해 확인하는 단계.
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|---|---|---|---|
| KR1020190071012A KR102241836B1 (ko) | 2019-06-14 | 2019-06-14 | 듀얼 체크 올리고를 이용한 유전자 다형성 검사 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2019
- 2019-06-14 KR KR1020190071012A patent/KR102241836B1/ko active IP Right Grant
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