TWI812047B - 用於多工偵測與眼科病況有關的對偶基因之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於偵測來自人類個體之檢體中至少兩個與角膜營養不良有關之基因組對偶基因的系統及方法，其中該個體之細胞(例如上皮細胞)黏著於基材之頂端。讓基材頂端在可溶解黏著於該基材之細胞的溶解溶液中攪拌。此攪拌完成後，自該溶解溶液中取出該基材。培育所得溶解溶液，隨後分離來自該溶解溶液之基因組DNA，形成gDNA溶液。由此，使用至少兩對寡核苷酸引子及該gDNA溶液測定人類TGFβI基因中所存在之至少兩個核苷酸的一致性。此至少兩個核苷酸位於TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之各別獨立單核苷酸多形現象(SNP)的各別獨立位置。

Description

用於多工偵測與眼科病況有關的對偶基因之方法
本申請案大體上係關於分離及偵測與疾病有關之遺傳對偶基因的方法。詳言之，本申請案係關於一種用於偵測與阿韋利諾角膜營養不良(Avellino corneal dystrophy)有關之對偶基因的改良方法。
可使用即時PCR偵測具有實質上一致序列之核酸序列之間的差異。經由使用經區別標記之螢光核酸探針(例如結合於野生型序列之探針及結合於突變體序列之探針)，可快速且可靠地偵測人類基因組中之單核苷酸變化。此解析能力已應用於醫學診斷，其中單核苷酸多形現象(SNP) (亦即蛋白質之編碼及/或非編碼序列內存在的單一鹼基變化)與人類疾病有關。 然而，即時PCR分析高度依賴於高品質檢體之收集及分離。不良檢體收集及/或分離需要使用較長分析條件及較大量之即時PCR試劑，兩者均造成成本增加及生產力降低。此外，即時PCR單核苷酸多形現象偵測分析的失敗可能使得需要再收集檢體，從而造成時間及資源的甚至更大損失。 因此，極其需要使檢體收集及分離改良之方法，該等方法改良分析之總成功率，減少分析所需之試劑且降低對後續再收集檢體之要求。此外，用較少量之檢體物質執行即時PCR SNP偵測分析之方法亦降低與收集及分離高品質檢體有關的挑戰。 角膜營養不良可為一種常染色體顯性遺傳疾病，其最初在患者之角膜中心呈現出模糊視覺。模糊視覺逐漸朝角膜周邊擴散，從而隨著患者年齡增長而使其視覺惡化。已表徵數種類型角膜營養不良，包括阿韋利諾角膜營養不良、顆粒狀角膜營養不良、格子狀I型角膜營養不良、蒂爾-本克角膜營養不良(Thiel-Behnke corneal dystrophy)及瑞斯-巴克勒角膜營養不良(Reis-bucklers corneal dystrophy)。已知角膜營養不良至少在一些情形下藉由編碼βIG-H3蛋白(亦稱為TGFβI蛋白、TGFBI蛋白及角膜上皮蛋白)之轉型生長因子β誘導(TGFβI)基因突變引起。 罹患阿韋利諾角膜營養不良之異型接合患者隨著年齡增長視覺喪失增加，從而在生命後期變得很嚴重。相比之下，同型接合患者在6歲呈現出嚴重至完全喪失視覺。在約1988年，首次將阿韋利諾角膜營養不良識別為獨特類型之角膜營養不良。在此之前，很可能將其錯分為顆粒狀角膜營養不良。現今，已知阿韋利諾角膜營養不良為世界範圍內基質角膜營養不良之最常見形式。在韓國，認為阿韋利諾角膜營養不良之發病率為870人中有約1人(參見Lee, J. H.等人, Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010；亦參見Holland, E. J.等人, Ophthalmology,99:1564, 1992；Kennedy, S. M.等人, Br. J. Ophthalmol.,80:489, 1996；Dolmetsch, A. M.等人, Can. J. Ophthalmol.,31:29, 1996；Afshari, N. A.等人, Arch. Ophthalmol.,119:16, 2001；Stewart, H. S. H um. Mutat.,14:126, 1999)。 先前發現異型接合個體(例如，具有一個野生型βIG-H3對偶基因及一個突變體βIG-H3對偶基因)在雷射近視手術(LASIK)手術後極易加速視覺喪失。值得注意地，術後兩年在侵襲性增加之此等患者中觀察到角膜混濁，從而最終造成視覺完全喪失(Jun, R. M.等人, Opthalmology, 111:463, 2004)。先前進行眼部手術以期望LASIK或準分子雷射術去除罹患角膜營養不良之患者的視覺模糊。以罹患阿韋利諾角膜營養不良之異型接合患者的最小估計值1/1000計，對於假設數量300,000例LASIK手術，將有300人喪失其視覺。經歷LASIK手術之患者主要在其20歲至30歲期間進行生產性活動；因此，其視覺喪失在社會及經濟方面引起嚴重問題。 另外，2000年美國批准LASIK手術後，已發現罹患阿韋利諾角膜營養不良且經歷LASIK手術之非洲裔美國人喪失眼部視力，從而推斷全世界可能存在大量類似病例。 因此，儘管需要精確診斷阿韋利諾角膜營養不良以藉由LASIK手術阻止阿韋利諾角膜營養不良之進展，但診斷阿韋利諾角膜營養不良僅藉由顯微鏡觀察(例如，裂隙燈檢查)角膜混濁進行，因此醫生經常未覺察患者潛在症狀而執行LASIK手術，從而造成視覺喪失。因此，需要快速且精確地遺傳診斷角膜營養不良。 開發出一種用於偵測βIG-H3基因突變之DNA晶片，其中βIG-H3基因突變會造成阿韋利諾角膜營養不良(韓國專利特許公開案第10-2007-0076532號)。然而，使用該DNA晶片診斷阿韋利諾角膜營養不良不利地需要數個步驟，包括擴增檢體中之DNA的步驟，將經擴增之DNA與DNA晶片雜交之步驟，洗滌經雜交DNA晶片之步驟及偵測陽性反應之步驟。 鑒於以上先前技術，此項技術中需要用於偵測與角膜營養不良有關之多個突變對偶基因的改良方法。
本發明提供用於偵測一或多個與人類疾病有關之對偶基因的改良方法。下述方法減少與執行獲得關於個體之醫學資訊的分析有關的時間及成本。舉例而言，在一些實施例中，改良方法使得可以對於患者降低之成本當天偵測與阿韋利諾角膜營養不良有關之基因組標記物。 在一些實施例中，本發明提供用於偵測來自個體之檢體中至少兩個與角膜營養不良有關之基因組對偶基因的方法，該方法包含：(A)提供個體之黏著於基材頂端的上皮細胞；(B)在溶解黏著於基材之細胞的溶解溶液中攪拌基材之頂端；(C)攪拌(B)完成後自溶解溶液取出基材；(D)取出(C)後，培育溶解溶液；(E)自溶解溶液分離基因組DNA，形成gDNA溶液；及(F)使用至少兩對寡核苷酸引子及gDNA溶液測定TGFβI基因中所存在之至少兩個核苷酸之一致性，其中至少兩個核苷酸位於TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之各別獨立單核苷酸多形現象(SNP)之各別獨立位置。 在一些實施例中，在人類基因組中，TGFβI基因中所存在之至少兩個核苷酸由至少一個核苷酸分隔。 在一些實施例中，至少兩對寡核苷酸引子中之至少一對包含具有包含SEQ ID NO:1之核苷酸序列的正向PCR引子及具有包含SEQ ID NO:2之核苷酸序列的反向PCR引子。 在一些實施例中，至少兩對寡核苷酸引子中之至少一對包含具有包含SEQ ID NO:43之核苷酸序列的正向PCR引子及具有包含SEQ ID NO:44之核苷酸序列的反向PCR引子。 在一些實施例中，至少兩對寡核苷酸引子包含第一對擴增引子及第二對擴增引子。第一對擴增引子包含具有包含SEQ ID NO:1之核苷酸序列的正向PCR引子及具有包含SEQ ID NO:2之核苷酸序列的反向PCR引子。第二對擴增引子包含具有包含SEQ ID NO:43之核苷酸序列的正向PCR引子及具有包含SEQ ID NO:44之核苷酸序列的反向PCR引子。 在一些實施例中，測定(F)進一步包含使用：(i)具有包含SEQ ID NO:25之核苷酸序列的第一野生型偵測探針及具有包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49之核苷酸序列的第一突變體偵測探針；及(ii)具有包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47之核苷酸序列的第二野生型偵測探針及具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50之核苷酸序列的第二突變體偵測探針。 在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測角膜營養不良之方法，該方法包含：(A)使用包含至少第一對擴增引子及至少第二對擴增引子之反應混合物擴增來自人類個體之生物檢體的至少兩個TGFβI基因序列，該至少兩個TGFβI基因序列包括包含編碼胺基酸殘基124之核苷酸的第一TGFβI基因序列及包含編碼胺基酸殘基555之核苷酸的第二TGFβI基因序列；(B)使第一對偵測寡核苷酸探針之第一偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交；(C)使第二對偵測寡核苷酸探針之第二偵測探針與第二TGFβI基因序列雜交；及(D)基於使用包括第一對偵測寡核苷酸探針及第二對偵測寡核苷酸探針之至少兩對偵測探針偵測第一TGFβI基因序列及/或第二TGFβI基因序列中之一或多個突變。 在一些實施例中，偵測第一TGFβI基因序列及/或第二TGFβI基因序列中之一或多個突變包括偵測第一TGFβI基因序列及/或第二TGFβI基因序列中之兩個或兩個以上突變，且在人類基因組中該兩個或兩個以上突變由至少一個核苷酸分隔。 在一些實施例中，至少第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，其中第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且其中第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。 在一些實施例中，至少第二對擴增引子包含第三擴增引子及第四擴增引子，其中第三擴增引子由核苷酸序列SEQ ID NO:43表示，且其中第四擴增引子由核苷酸序列SEQ ID NO:44表示。 在一些實施例中，第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:2，第二對擴增引子包含第三擴增引子及第四擴增引子，第三擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且第四擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。 在一些實施例中，所編碼TGFBI蛋白質中之一或多個突變中之一者對應於胺基酸124之精胺酸突變為半胱胺酸(R124C)，精胺酸突變為組胺酸(R124H)，及/或精胺酸突變為白胺酸(R124L)。 在一些實施例中，所編碼TGFBI蛋白質中之一或多個突變中之一者對應於胺基酸555之精胺酸突變為色胺酸(R555W)及/或精胺酸突變為麩醯胺酸(R555Q)。 在一些實施例中，至少兩對偵測寡核苷酸探針各個別地包括第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針包含個別地選自由以下組成之群的成對核苷酸序列：SEQ ID NO:25-26、SEQ ID NO:25及48、SEQ ID NO:25及49、SEQ ID NO:27-28、SEQ ID NO:29-30、SEQ ID NO:31-32、SEQ ID NO:33-34、SEQ ID NO:35-36、SEQ ID NO:37-38、SEQ ID NO:39-40、SEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:45-46及SEQ ID NO:46-47、SEQ ID NO:45及50以及SEQ ID NO:47及50。 在一些實施例中，第一對偵測寡核苷酸探針包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:46。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:48。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:49。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50。 在一些實施例中，第二對偵測寡核苷酸探針包含第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針，其中第三偵測寡核苷酸探針及第四偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:50。 在一些實施例中，第一偵測探針與第一標記偶合，且第二偵測探針係與第二標記偶合。 在一些實施例中，第一標記為VIC，且第二標記為FAM。 在一些實施例中，雜交(B)及雜交(C)在相同溶液中同時進行。 在一些實施例中，雜交(B)及雜交(C)在相同溶液或不同溶液中同時或在不同時間進行。 在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測人類個體之角膜營養不良的反應混合物，該反應混合物包含：(A)至少第一對擴增引子及第二對擴增引子，其用於擴增及測定(1)來自個體之生物檢體的至少兩個TGFβI基因序列中之第一TGFβI基因序列，該序列包含編碼胺基酸殘基124之核苷酸及(2)來自個體之生物檢體的至少兩個TGFβI基因序列中之第二TGFβI基因序列，該序列包含編碼胺基酸殘基555之核苷酸；及(B)至少兩對偵測探針，其中該至少兩對偵測探針各者中之偵測探針與至少兩個TGFβI基因序列中之至少一者雜交。 在一些實施例中，第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。 在一些實施例中，第二對擴增引子包含第三擴增引子及第四擴增引子，第三擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且第四擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。 在一些實施例中，使用至少兩對偵測探針中之至少一者偵測所編碼TGFBI蛋白質中對應於胺基酸124之精胺酸突變為半胱胺酸(R124C)、精胺酸突變為組胺酸(R124H)及/或精胺酸突變為白胺酸(R124L)的突變。 在一些實施例中，使用至少兩對偵測探針中之至少一者偵測所編碼TGFBI蛋白質中對應於胺基酸555之精胺酸突變為色胺酸(R555W)及/或精胺酸突變為麩醯胺酸(R555Q)的突變。 在一些實施例中，該至少兩對偵測探針中之每一對偵測探針個別地包括第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針包含個別地選自由以下組成之群的成對核苷酸序列：SEQ ID NO:25-26、SEQ ID NO:25及48、SEQ ID NO:25及49、SEQ ID NO:27-28、SEQ ID NO:29-30、SEQ ID NO:31-32、SEQ ID NO:33-34、SEQ ID NO:35-36、SEQ ID NO:37-38、SEQ ID NO:39-40、SEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:45-46及SEQ ID NO:46-47、SEQ ID NO:45及50以及SEQ ID NO:47及50。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:46。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:48。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:49。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50。 在一些實施例中，至少兩對偵測探針中之一者包含第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針，其中第一偵測寡核苷酸探針及第二偵測寡核苷酸探針分別包含成對核苷酸序列SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:50。 在一些實施例中，至少兩個偵測探針中之第一偵測探針與第一標記偶合，且至少兩個偵測探針中之第二偵測探針係與第二標記偶合。 在一些實施例中，第一標記為VIC，且第二標記為FAM。 在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測人類個體之角膜營養不良的反應混合物，該反應混合物包含：(A)至少第一對擴增引子，其用於擴增及測定來自個體之生物檢體的TGFβI基因序列；及(B)一組至少三個偵測探針，其中該一組至少三個偵測探針中的一個偵測探針在暴露於TGFβI基因序列時與TGFβI基因序列雜交。 在一些實施例中，TGFβI基因序列包含來自個體之生物檢體的編碼胺基酸殘基124的核苷酸。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少一個選自由SEQ ID NO:25-42及48-49組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少兩個或兩個以上選自由SEQ ID NO:25-42及48-49組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少三個或三個以上選自由SEQ ID NO:25-42及48-49組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括第一偵測探針SEQ ID NO:25及第二偵測探針SEQ ID NO:26。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括選自由SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:49組成之群的第三偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括不同於第三偵測探針且選自由SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:49組成之群的第四偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括兩個或兩個以上選自由SEQ ID NO:26及48-49組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。 在一些實施例中，反應混合物進一步包含：(C)至少第二對擴增引子，其用於擴增及測定來自生物檢體之第二TGFβI基因序列；及(D)第二組至少三個偵測探針，其中第二組至少三個偵測探針中的一個偵測探針在暴露於第二TGFβI基因序列時與第二TGFβI基因序列雜交。 在一些實施例中，第二TGFβI基因序列包含來自個體之生物檢體的編碼胺基酸殘基555的核苷酸。 在一些實施例中，第二組至少三個偵測探針包括至少一個選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，第二組至少三個偵測探針包括至少兩個或兩個以上選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，第二組至少三個偵測探針包括至少三個或三個以上選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，第二組至少三個偵測探針包括為SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47之第一偵測探針、為SEQ ID NO:46之第二偵測探針及為SEQ ID NO:50之第三偵測探針。 在一些實施例中，第二對擴增引子包含第三擴增引子及第四擴增引子，第三擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且第四擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。 在一些實施例中，TGFβI基因序列包含來自個體之生物檢體的編碼胺基酸殘基555的核苷酸。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少一個選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少兩個或兩個以上選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括至少三個或三個以上選自由SEQ ID NO:45-47及50組成之群的偵測探針。 在一些實施例中，一組至少三個偵測探針包括為SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47之第一偵測探針、為SEQ ID NO:46之第二偵測探針及為SEQ ID NO:50之第三偵測探針。 在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測角膜營養不良之方法，其包含：(A-1)使用包含至少第一對擴增引子及一組至少三個偵測探針的反應混合物擴增來自人類個體之生物檢體的第一TGFβI基因序列；(B-1)使一組至少三個偵測探針中的第一偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交；及(C-1)基於(i)一組至少三個偵測探針中的第一偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交及(ii)一組至少三個偵測探針中的第二及第三偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交失敗偵測第一TGFβI基因序列中之突變。 在一些實施例中，該方法進一步包含：(A-2)使用相同反應混合物擴增來自生物檢體之第二TGFβI基因序列，其中該反應混合物包含至少第二對擴增引子及第二組至少三個偵測探針；(B-2)使第二組至少三個偵測探針中的第一偵測探針與第二TGFβI基因序列雜交；及(C-2)基於(i)第二組至少三個偵測探針中的第一偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交及(ii)第二組至少三個偵測探針中的第二偵測探針及第三偵測探針與第一TGFβI基因序列雜交失敗偵測第二TGFβI基因序列中之突變。 在一些實施例中，用生物檢體之相同等分試樣進行擴增(A-1)、擴增(A-2)、雜交(B-1)、雜交(B-2)、偵測(C-1)及偵測(C-2)。 在一些實施例中，擴增第一TGFβI基因序列(A-1)與擴增第二TGFβI基因序列(A-2)同時進行。 在一些實施例中，雜交(B-1)與雜交(B-2)同時進行。 在一些實施例中，偵測(C-1)與偵測(C-2)同時進行。 在一些實施例中，反應混合物具有一些上述特徵。為簡潔起見，本文中不重複此類細節。 在一些實施例中，本發明提供以上任何部分中所述之反應混合物之用途，其用於經由偵測人類個體之異型接合角膜營養不良來預測個體之眼部雷射手術後併發症之風險。 在一些實施例中，眼部雷射手術包含Lasik及準分子雷射手術。 在一些實施例中，本發明提供一種用於偵測來自人類個體之檢體中與角膜營養不良有關之基因組突變的方法，該方法包含：(A)提供人類個體之黏著於基材頂端的上皮細胞；(B)在溶解黏著於基材之細胞的溶解溶液中攪拌基材之頂端；(C)攪拌(B)完成後自溶解溶液取出基材；(D)取出(C)後，培育溶解溶液；(E)自溶解溶液分離基因組DNA，形成gDNA溶液；及(F)使用至少第一對引子、一組至少三個偵測探針及gDNA溶液藉由使gDNA溶液同時暴露於至少三個偵測探針來測定TGFβI基因中所存在之至少一個核苷酸的一致性，其中：該至少一個核苷酸位於TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之單核苷酸多形現象(SNP)之特定位置，且一組至少三個偵測探針中的至少兩個偵測探針之組態分別在於偵測TGFβI基因之特定位置的不同突變。 在一些實施例中，方法進一步包含：(G)使用至少第二對引子、第二組至少三個偵測探針及gDNA溶液藉由使gDNA溶液同時暴露於一組至少三個偵測探針及第二組至少三個偵測探針來測定TGFβI基因中所存在之至少一個第二核苷酸之一致性，其中：該至少一個第二核苷酸位於第二特定位置，該位置與TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之第二單核苷酸多形現象(SNP)的至少一個核苷酸之位置無關，且第二組至少三個偵測探針中的至少兩個偵測探針之組態在於偵測TGFβI基因之第二特定位置的各別突變。 在一些實施例中，測定(F)與測定(G)同時進行。 在一些實施例中，測定(F)與測定(G)使用相同gDNA溶液進行。
I. 前言 偵測疾病相關之SNP為對於診斷及預後各種醫學病況愈來愈重要之手段。舉例而言，TGFβI基因之外顯子4中單核苷酸變化之存在與阿韋利諾角膜營養不良極其有關。發現此SNP之異型接合個體在LASIK手術後視覺喪失之風險高。儘管LASIK為大大改良許多人生活品質之醫學程序，但對於攜帶G/A TGFβI SNP之個體，其通常經四至十八個月之時間引起逐步視覺損傷，從而可能導致視覺喪失。視覺損傷可在更長或更短時間內發生。幸而可進行篩選以鑑別應避免進行LASIK程序之攜帶該突變的個體。 本發明至少部分基於改良檢體分離、製備及分析之方法的發現。在一些實施例中，提供使得可再使用患者檢體(例如在分析失敗或需要進行另一後續測試時)之方法。在一些實施例中，此等改良方法包括使帶有自患者口腔膜剝落之細胞的基材(例如，頂端為嫘縈或頂端為棉花之塗藥器)在室溫下在溶解溶液中平緩渦旋30-45秒(而非在高溫下長時間培育20分鐘)。隨後在45℃下培育溶解溶液30分鐘以改良溶解且提高基因組檢體之產量。有利地，可隨後儲存(例如，冷凍或冷藏)頂端為嫘縈或頂端為棉花之塗藥器以用於再分離基因組DNA而供再測試用。 在一些實施例中，本文所提供之改良經由使用較少量之基因組DNA模板進行即時PCR偵測分析來提供。在一些實施例中，其藉由增加所進行之即時PCR循環數(例如，約40個循環)及/或藉由在95℃下使用3秒變性循環時間來達成。有利地，因為所需檢體量藉由此等方法而減少，故對即時PCR試劑之需要亦減少。因為診斷分析中所用之多種試劑為專有的，故該等試劑可能很昂貴。減少所用試劑之量亦可顯著降低與該試劑有關之成本。 預期可使用用於進行各此等個別步驟之特定條件(例如，檢體處理、培育溫度、反應體積、反應循環數、反應循環時間、反應循環溫度)的所有組合執行本文所述之方法來偵測疾病相關之SNP，諸如TGFβI基因之外顯子4中發現的阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP。 II. 選擇定義 如本文所用之術語「本發明」並非意欲限於本發明之任何一個特定實施例，而是大體上適用於申請專利範圍及說明書中所述之本發明之任何及所有實施例。 除非上下文另外明確規定，否則如本文所用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個參考物。因此，例如，提及「該方法」包括一或多種本文所述類型之方法及/或步驟，其將在熟習此項技術者閱讀本發明後變得顯而易見。 如本文所用之術語「多形現象」及其變化形式指不同基因組或個體之間或不同基因組或個體中出現兩個或兩個以上替代性基因組序列或對偶基因。術語「遺傳突變」或「遺傳變化」及其變化形式包括多形現象。 如本文所用之術語「單核苷酸多形現象」(「SNP」)及其變化形式指一個核苷酸之位點在對偶基因之間變化。單核苷酸多形現象(SNP)為單一鹼基變化或點突變，但亦包括所謂「indel」突變(核苷酸插入或缺失)，從而引起個體之間的遺傳變化。構成所有人類遺傳變化之約90%的SNP在每30億個鹼基之人類基因組中有100至300個鹼基發生。然而，在其他生物(如病毒)中，SNP之發生可頻繁得多。SNP可在基因組之編碼區或非編碼區中發生。編碼區中之SNP可改變或可不改變蛋白質產物之胺基酸序列。非編碼區中之SNP可改變啟動子或加工位點且可影響基因轉錄及/或加工。知曉個體在相關基因組區域中是否具有特定SNP可提供足夠資訊來產生多種疾病之診斷、預防及治療應用。在一些實施例中，本發明係關於位於與阿韋利諾角膜營養不良有關之TGFβI基因之外顯子4中的鳥嘌呤向腺嘌呤變化之SNP的偵測。 術語「引子」及其變化形式指充當PCR反應中DNA合成之起始點的寡核苷酸。引子之長度通常為約15至約35個核苷酸且與互補於標靶序列之區域雜交。 術語「探針」及其變化形式(例如偵測探針)係指在PCR反應中與標靶核酸雜交之寡核苷酸。標靶序列係指核酸之欲分析區域且包含相關多形位點。 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者所通常瞭解相同之含義。儘管可使用與本文所述類似或等效之任何方法及材料來實踐或測試本發明，但本文特別描述方法及材料之各種實施例。 III. 檢體製備 在一些實施例中，本發明提供用於分離即時PCR單核苷酸多形現象偵測分析中所用之基因組檢體的改良方法。在一些實施例中，改良方法100使用圖1中所概述之步驟的組合。 在一些實施例中，方法包括提供來自個體之細胞的檢體。在一些實施例中，藉由使患者之細胞表面與能夠使細胞可逆地固定於基材上的基材接觸來收集細胞。 所揭示之方法適用於自多種檢體獲得之多種細胞類型。在一些實施例中，用於所揭示方法之細胞類型包括（但不限於）上皮細胞、內皮細胞、結締組織細胞、骨胳肌肉細胞、內分泌細胞、心肌細胞、尿細胞、黑素細胞、角質細胞、血細胞、白血球、白血球層、毛細胞(包括例如毛根細胞)及/或唾液細胞(salival cell)。在一些實施例中，細胞為上皮細胞。在一些實施例中，細胞為囊下血管周細胞(上皮細胞1型)；淺色細胞(上皮細胞2型)；中等顏色細胞(上皮細胞3型)；深色細胞(上皮細胞4型)；未分化細胞(上皮細胞5型)；及大髓質細胞(上皮細胞6型)。在一些實施例中，細胞為口腔上皮細胞(例如使用口腔抹拭收集之上皮細胞)。在一些實施例中，所揭示方法中所用之細胞的檢體包括以上鑑別之細胞類型的任何組合。 在一些實施例中，該等方法包括提供(102)來自個體之細胞的檢體。在一些實施例中，所提供之細胞為口腔上皮細胞。 藉由許多種可以使個體細胞依可逆性結合於基材的方法中之任一者收集細胞檢體。在一些實施例中，所使用之基材係與含有個體之細胞的檢體呈物理性交互作用，以使細胞可逆性結合於基材。在一些實施例中，所使用之基材係直接與個體之身體呈物理性交互作用，以使細胞可逆性結合於基材。在一些實施例中，檢體為口腔細胞檢體且藉由使個體之口腔膜(例如，其臉頰之內部)與能夠使自膜移離之細胞可逆性固定之基材接觸，來收集口腔細胞之檢體。在該等實施例中，以等同於個人刷牙之力道(例如，較輕施力或加壓)，拿拭子摩擦個體臉頰內部。任何可使個體之細胞可逆性結合於基材之方法均可用於所揭示之方法。 在一些實施例中，宜以非侵入性方式收集檢體，因而此等檢體收集法可在任何地方且幾乎可由任何人完成。舉例而言，在一些實施例中，在醫師辦公室、在個體家中或在正進行或欲進行LASIK手術之設備中收集檢體。在一些實施例中，由患者、患者之醫生、護士或醫師之助理或其他臨床人員收集檢體。 在一些實施例中，基材由與細胞可逆地結合的多種材料中之任一者製成。例示性基材包括由以下製成之基材：嫘縈、棉花、二氧化矽、彈性體、蟲膠、琥珀、天然或合成橡膠、纖維素、膠木、耐綸、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈或其他材料或其組合。在一些實施例中，基材為具有嫘縈頂端或棉花頂端之拭子。 隨後在溶解溶液中攪拌基材之頂端(例如嫘縈拭子或棉花拭子之頂端)約10秒至60秒(1分鐘)、或約20秒至60秒、約20秒至約45秒、或約20秒至約30秒、約15秒至約60秒、約15秒至約45秒、或約15秒至約30秒、約10秒至約60秒、約10秒至約45秒、或約10秒至約30秒、約10秒至約15秒或約10秒至約20秒。在一些實施例中，攪拌進行約60秒或約1分鐘。在一些實施例中，攪拌進行小於1分鐘(例如小於60秒)。在一些實施例中，攪拌進行不超過15秒、20秒、30秒、45秒、60秒、90秒、120秒或120秒以上。在一些實施例中，攪拌進行不超過45秒。在一些實施例中，攪拌進行不超過30秒。在一些實施例中，攪拌進行不超過20秒。在一些實施例中，攪拌進行不超過15秒。 在一些實施例中，攪拌包括基材在溶解溶液中之任何移動。在一些實施例中，基材之頂端(例如嫘縈拭子或棉花拭子之頂端)在溶解溶液中平緩地移動以使得複數個口腔細胞仍附著於基材而在後續時間及/或隨後時間進行分離。在溶解溶液中之此類移動包括渦旋運動、側向運動、上下運動及/或浸漬運動，或基材在溶解溶液中之使複數個口腔細胞仍附著於頂端同時使一些口腔細胞可分散於溶解溶液中的任何其他移動。 在一些實施例中，攪拌步驟在室溫下、例如在約15℃至約30℃、約18℃至約28℃、約18℃至約25℃或約20℃至約25℃之溫度下進行。 攪拌後，取出基材(例如具有嫘縈頂端或棉花頂端之拭子)，且在一些實施例中儲存以在需要再測試或進一步(例如不同或另一)測試之情況下供後續使用。在一些實施例中，將基材(例如具有嫘縈頂端或棉花頂端之口腔拭子)置放於容器中且冷凍儲存。在一些實施例中，將基材(例如具有嫘縈頂端或棉花頂端之口腔拭子)冷藏。在一些實施例中，將基材儲存在多種溫度中之任一者下歷時多種時間中之任一者而仍保持適用於一或多次額外提取。 在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存0週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週或12週以上。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存及/或含有檢體之基材可儲存0週至12週、1週至12週、2週至12週、3週至12週、4週至12週、5週至12週、6週至12週、7週至12週、8週至12週、9週、10週至12週或11週至12週。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、30或36個月或36個月以上。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至36個月、2個月至36個月、3個月至36個月、4個月至36個月、5個月至36個月、6個月至36個月、7個月至36個月、8個月至36個月、9個月至36個月、10個月至36個月、12個月至36個月、14個月至36個月、16個月至36個月、18個月至36個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至30個月、2個月至30個月、3個月至30個月、4個月至30個月、5個月至30個月、6個月至30個月、7個月至30個月、8個月至30個月、9個月至30個月、10個月至30個月、12個月至30個月、14個月至30個月、16個月至30個月或18個月至30個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至24個月、2個月至24個月、3個月至24個月、4個月至24個月、5個月至24個月、6個月至24個月、7個月至24個月、8個月至24個月、9個月至24個月、10個月至24個月、12個月至24個月、14個月至24個月、16個月至24個月、18個月至24個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至22個月、2個月至22個月、3個月至22個月、4個月至22個月、5個月至22個月、6個月至22個月、7個月至22個月、8個月至22個月、9個月至22個月、10個月至22個月、12個月至22個月、14個月至22個月、16個月至22個月、18個月至22個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至20個月、2個月至20個月、3個月至20個月、4個月至20個月、5個月至20個月、6個月至20個月、7個月至20個月、8至20個月、9至20個月、10個月至20個月、12個月至20個月、14個月至20個月、16個月至20個月、18個月至20個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至18個月、2個月至18個月、3個月至18個月、4個月至18個月、5個月至18個月、6個月至18個月、7個月至18個月、8個月至18個月、9個月至18個月、10個月至18個月、12個月至18個月、14個月至18個月、16個月至18個月或17個月至18個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存1個月至12個月、2個月至12個月、3個月至12個月、4個月至12個月、5個月至12個月、6個月至12個月、7個月至12個月、8個月至12個月、9個月至12個月、10個月至12個月或11個月至12個月。 在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃或約8℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約2℃至約8℃、約3℃至約8℃、約4℃至約8℃、約5℃至約8℃、約6℃至約8℃或約7℃至約8℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約-25℃、約-24℃、約-23℃、約-22℃、約-21℃、約-20℃、約-19℃、約-18℃、約-17℃、約-16℃或約-15℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約-25℃至約-15℃、約-22℃至約-17℃、約-20℃至約-15℃或約-25℃至約-20℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約-90℃、約-89℃、約-88℃、約-87℃、約-86℃、約-85℃、約-84℃、約-83℃、約-82℃、約-81℃、約-80℃、約-79℃、約-78℃、約-77℃、約-76℃、約-75℃、約-74℃、約-73℃、約-72℃、約-71℃、約-70℃、約-69℃、約-68℃、約-67℃、約-66℃或約-65℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在約-90℃至約-65℃、約-85℃至約-65℃、約-80℃至約-65℃、約-75℃至約-65℃或約-70℃至約-65℃下。在一些實施例中，將含有檢體之基材儲存在-90℃至-65℃下。 在一些實施例中，將含有檢體之基材凍融一或多次(例如在冷凍後，將含有檢體之基材融化，根據本發明方法使用且再冷凍)及或用於本發明方法中。在一些實施例中，將含有檢體之基材凍融1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或20次以上。在一些實施例中，將含有檢體之基材用於本發明方法中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或20次以上。在一些實施例中，將含有檢體之基材凍融1至20次、2至20次、3至20次、4至30次、5至20次、6至20次、7至20次、8至20次、9至20次、10至20次、11至20次、12至20次、13至20次、14至20次、15至20次、16至20次、17至20次、18至20次、19至20次、5至15次、5至10次、1至10次或1至5次。在一些實施例中，將含有檢體之基材用於本發明方法中1至20次、2至20次、3至20次、4至30次、5至20次、6至20次、7至20次、8至20次、9至20次、10至20次、11至20次、12至20次、13至20次、14至20次、15至20次、16至20次、17至20次、18至20次、19至20次、5至15次、5至10次、1至10次、1至5次、1至4次、1至3次或1至2次。 在一些實施例中，將含有檢體之基材在室溫或約15℃至約30℃下儲存1週。在一些實施例中，將檢體在約2℃至約8℃或約4℃下儲存約1、2或3週。在一些實施例中，將含有檢體之基材在約-25℃至約-15℃或約-20℃下儲存約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。在一些實施例中，將含有檢體之基材在約-90℃至約-65℃或約-80℃下儲存約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。 有利地且出乎意料地，發現自基材提取之細胞數減少可藉由使自個體細胞之核酸提取增加來彌補。在一些實施例中，使提取增加藉由相較於標準實踐培育細胞較長時間、相較於標準實踐在高溫下培育細胞或兩者之組合來完成。 在一些實施例中，使細胞之核酸提取增加藉由相較於標準實踐進行提取培育增加或較長之時間來完成。在一些實施例中，進行提取培育約45分鐘，例如45±5、45±10、45±15或45±20分鐘。在一些實施例中，進行提取培育約25分鐘至約65分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約35分鐘至約55分鐘、約45分鐘至約65分鐘、約45分鐘至約55分鐘或約40分鐘至約50分鐘。在一些實施例中，提取培育時間為約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘或約65分鐘。 在一些實施例中，使細胞之核酸提取增加藉由相較於標準實踐在增加或較高之溫度下進行提取培育來完成。在一些實施例中，在約45℃(例如45±2℃、45±5℃或45±10℃)下進行提取培育。在一些實施例中，提取培育溫度為約35℃至約55℃、約40℃至約50℃或約43℃至約47℃。在一些實施例中，提取溫度為約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃或約55℃。在一些實施例中，使用一個以上提取溫度。舉例而言，在一些實施例中，對於一部分提取使用標準溫度，且對於另一部分提取使用高溫。 在一些實施例中，自基材釋放實質上少量細胞以用於根據本發明之系統及方法進行後續溶解。在一些實施例中，在攪拌期間自基材釋放至少1個細胞、至少2個細胞、至少5個細胞、至少10個細胞、至少15個細胞、至少20個細胞、至少50個細胞、至少75個細胞、至少100個細胞、至少125個細胞、至少150個細胞、至少175個細胞、至少200個細胞、至少250個細胞、至少300個細胞、至少350個細胞、至少400個細胞、至少450個細胞、至少500個細胞或500個細胞以上。 在一些實施例中，用所述方法自單一個體使用(獲得)約1 ng/µL至約50 ng/µL、約1 ng/µL至約40 ng/µL、約1 ng/µL至約30 ng/µL、約1 ng/µL至約20 ng/µL、約1 ng/µL至約10 ng/µL、約1 ng/µL至約5 ng/µL、約1 ng/µL至約4 ng/µL、約1 ng/µL至約3 ng/µL或約1 ng/µL至約2 ng/µL核酸，其純度為約0.55至2.00、約0.6至約2.00、約0.7至約2.00、約0.8至約2.00、約0.9至約2.00、約1.0至約2.00、約1.1至約2.00、約1.2至約2.00、約1.3至約2.00、約1.4至約2.00、約1.5至約2.00、約1.6至約2.00、約1.7至約2.00、約1.8至約2.00或約1.9至約2.00。在一些實施例中，用所述方法自單一個體使用(獲得)1 ng/µL至50 ng/µL，其純度為約0.55至2.00。 IV. 溶解溶液 多種溶解溶液已描述且為熟習此項技術者所已知。此等熟知溶解溶液中之任一者可用於本發明方法以自檢體分離核酸。例示性溶解溶液包括可購得之溶解溶液，諸如由INVITROGEN®、QIAGEN®、LIFE TECHNOLOGIES®及其他製造商出售之溶解溶液，以及可由熟習此項技術者在實驗室環境中產生的溶解溶液。溶解緩衝液亦充分描述且多種溶解緩衝液可用於所揭示之方法，包括例如Molecular Cloning (三卷裝, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)中所述之溶解緩衝液，兩者均以引用的方式併入本文中以用於所有目的。 細胞溶解為自細胞內回收核酸之通常實踐方法。在諸多情形下，使細胞與溶解溶液接觸，該溶解溶液通常為包含清潔劑之鹼性溶液、或溶解酶之溶液。此類溶解溶液通常含有鹽、清潔劑及緩衝劑以及熟習此項技術者瞭解而使用之其他試劑。完全及/或部分溶解後，自溶解溶液回收核酸。 在一些實施例中，將細胞再懸浮於水性緩衝液中，該水性緩衝液之pH值在約pH 4至約10、約5至約9、約6至約8或約7至約9範圍內。 在一些實施例中，緩衝液鹽濃度為約10 mM至約200 mM、約10 mM至約100 mM或約20 mM至約80 mM。 在一些實施例中，緩衝液進一步包含螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。 在一些實施例中，溶解溶液進一步包含其他化合物以輔助自細胞釋放核酸，諸如多元醇，包括例如（但不限於）蔗糖，以及糖醇，諸如麥芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇及/或異麥芽糖。在一些實施例中，多元醇在約2%至約15% w/w、或約5%至約15% w/w或約5%至約10% w/w範圍內。 在一些實施例中，溶解溶液進一步包含界面活性劑，諸如（但不限於）Triton X-100、SDS、CTAB、X-114、CHAPS、DOC及/或NP-40。在一些實施例中，此類界面活性劑在約1%至約5% w/w、約1%至約4% w/w或約1%至約3% w/w範圍內。 在實施例中，溶解溶液進一步包含離液劑，諸如（但不限於）尿素、十二烷基硫酸鈉及/或硫脲。在一些實施例中，所用離液劑之濃度在約0.5 M至8 M、約1 M至約6 M、約2 M至約6 M或約1 M至3 M範圍內。 在一些實施例中，溶解溶液進一步包含一或多種其他溶解試劑，且此類溶解試劑為此項技術中所熟知。在一些實施例中，此類溶解試劑包括細胞壁溶解酶，諸如（但不限於）溶菌酶。在一些實施例中，溶解試劑包含鹼性清潔劑溶液，諸如含有0.5%十二烷基硫酸鈉之0.1氫氧化鈉水溶液。 在一些實施例中，溶解溶液進一步包含糖水溶液，諸如蔗糖溶液；及螯合劑，諸如EDTA，例如STET緩衝液。在某些實施例中，藉由將細胞懸浮液與具有兩倍所要濃度(例如0.2氫氧化鈉、1.0%十二烷基硫酸鈉)之等體積溶解溶液混合來製備溶解試劑。 在一些實施例中，達成所要程度之溶解後，將包含溶解溶液及經溶解細胞之混合物與中和或淬滅試劑接觸以調節條件而使得溶解試劑不會不利地影響所要產物。在一些實施例中，將pH調節為約5至約9、約6至約8、約5至約7、約6至約7或約6.5至7.5之pH以使細胞內含物、包括例如（但不限於）核酸之降解達最少及/或阻止其降解。在一些實施例中，當溶解試劑包含鹼性溶液時，中和試劑包含酸性緩衝液，例如鹼金屬乙酸鹽/乙酸緩衝液。在一些實施例中，溶解條件(諸如溫度及溶解試劑之組成)經選擇以使得溶解實質上完成而同時使所要產物、包括例如（但不限於）核酸之降解達最少。 在一些實施例中，將第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第二十種溶解溶液用於該等方法。在一些實施例中，所用溶解緩衝液之體積為約10 µL、約20 µL、約30 µL、約40 µL、約50 µL、約60 µL、約70 µL、約80 µL、約90 µL、約100 µL、約120 µL、約130 µL、約140 µL、約150 µL、160 µL、約170 µL、約180 µL、約190 µL、約200 µL、約220 µL、約230 µL、約240 µL、約250 µL、約260 µL、約270 µL、約280 µL、約290 µL、約300 µL、約320 µL、約330 µL、約340 µL、約350 µL、約360 µL、約370 µL、約380 µL、約390 µL、約400 µL、約450 µL、約500 µL、約550 µL、約600 µL、約650 µL、約700 µL、約750 µL、約800 µL、約850 µL、900 µL、950 µL、1000 µL、1500 µL或2000 µL。在一些實施例中，溶解緩衝液為約10 µL至約1000 µL、約10 µL至約800 µL、約10 µL至約600 µL、約10 µL至約400 µL、約20 µL至約400 µL、約50 µL至約300 µL、約50 µL至約200 µL、約50 µL至約400 µL、約100 µL至約400 µL、約10 µL至約300 µL或約100 µL至約200 µL。 熟習此項技術者可使用以上之任何組合以及與其他已知及常規方法之組合，且本發明涵蓋此類組合。 V. 自溶解緩衝液純化核酸 在一些實施例中，在進行後續分析前自溶解緩衝液分離核酸，包括例如（但不限於）基因組DNA。在一些實施例中，在進行其他分析(諸如(但不限於)即時PCR分析)前自溶解緩衝液分離核酸。所揭示方法之各種實施例可使用適用於分離少量核酸之多種方法中之任一者。其包括(但不限於)沈澱、凝膠過濾、密度梯度及固相結合。此類方法亦描述於例如Molecular Cloning (三卷裝, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)中，該等文獻均以引用的方式併入本文中以用於所有目的。 核酸沈澱為熟習此項技術者已知的用於分離之熟知方法。此項技術中亦已知多種固相結合方法，包括(但不限於)利用珠粒(例如二氧化矽珠粒、磁性珠粒)、柱、膜形式或此項技術中已知的多種其他實體形式中之任一者的固相的固相結合方法。在一些實施例中，所揭示方法中所用之固相可逆地結合核酸。此類固相之實例包括所謂「混合床」固相，其為至少兩種不同固相之混合物，該兩種不同固相各具有在不同溶液條件下結合核酸之能力及在不同條件下釋放核酸之能力；諸如美國專利申請案第2002/0001812號中所述之固相，出於所有目的，其以全文引用的方式併入本文中。根據所揭示之方法，固相對核酸之親和力可經由通常用於使溶質結合於基材之多種方式中之任一者達成。此類方式之實例包括(但不限於)離子相互作用(例如陰離子交換層析)及疏水性相互作用(例如反相層析)、pH值差異及變化、鹽差異及變化(例如濃度變化、離液鹽/試劑之使用)。基於pH值之例示性固相包括(但不限於)INVITROGEN ChargeSwitch標準化口腔套組磁性珠粒中所用之固相，其在低pH值(＜6.5)下結合核酸且在高pH值(＞8.5)下釋放核酸；及單胺基-N-胺基乙基(MANAE)，其在小於7.5之pH值下結合核酸且在大於8之pH值下釋放核酸。例示性基於離子交換之基材包括(但不限於)DEA-SEPHAROSE™、Q-SEPHAROSE™及DEAE-SEPHADEX™ (來自PHARMACIA, Piscataway, N.J.), DOWEX® I (來自The Dow Chemical Company, Midland, Mich.)、AMBERLITE® (來自Rohm & Haas, Philadelphia, Pa.)、DUOLITE® (來自Duolite International, In., Cleveland, Ohio)、DIALON TI及DIALON TII。 任何個別方法預期可用於單獨使用或與其他方法組合使用，且此類有用組合為熟習此項技術者所熟知且瞭解。 VI. 核酸分析 使用所揭示之方法分離核酸(諸如基因組DNA(gDNA))以用於多種核酸分析，包括基因組分析。在一些實施例中，此類分析包括偵測多種遺傳突變，其包括(但不限於)一或多個缺失、插入、轉換及顛換。在一些實施例中，突變為單核苷酸多形現象(SNP)。 用於分析此類經分離核酸(例如(但不限於)基因組DNA(gDNA))之多種方法為此項技術中已知，且包括PCR法(諸如即時PCR分析)、微陣列分析、雜交分析及核酸序列分析，以及分析核酸組成且為熟習此項技術者所已知的多種其他方法。參見例如Molecular Cloning (三卷裝, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)。 a. 即時 PCR 為設計即時PCR分析，協調數個部分，包括側接兩個引子且隨後擴增之DNA片段(通常稱為擴增子)、該兩個引子及欲使用之偵測探針。 即時PCR依賴於結合於短多核苷酸(稱為「偵測探針」)之螢光染料的視覺發光，該等短多核苷酸與基因組對偶基因以序列特異性方式締合。單核苷酸不同之即時PCR探針可在即時PCR分析中藉由結合及偵測在不同波長下發螢光之探針來區分。即時PCR可用於偵測應用(診斷應用)、定量應用及基因分型應用。 此項技術中揭示進行即時PCR之數種相關方法，包括依賴於以下之分析：TAQMAN®探針(美國專利第5,210,015號及第5,487,972號，及Lee等人, Nucleic Acids Res.21:3761-6, 1993)、分子信標探針(美國專利第5,925,517號及第6,103,476號，及Tyagi及Kramer, Nat. Biotechnol.14:303-8, 1996)、自探測擴增子(蠍形探針)(美國專利第6,326,145號，及Whitcombe等人, Nat. Biotechnol.17:804-7, 1999)、Amplisensor (Chen等人, Appl. Environ. Microbiol.64:4210-6, 1998)、Amplifluor (美國專利第6,117,635號，及Nazarenko等人, Nucleic Acids Res.25:2516-21, 1997), 置換雜交探針(Li等人, Nucleic Acids Res.30:E5, 2002)、DzyNA-PCR (Todd等人, Clin. Chem.46:625-30, 2000)、螢光限制酶偵測(Cairns等人, Biochem. Biophys. Res. Commun.318:684-90, 2004)及相鄰雜交探針(美國專利第6,174,670號，及Wittwer等人, Biotechniques22:130-1, 134-8, 1997)。 在一些情況下，即時PCR可偵測多種基因突變，包括例如(但不限於)SNP。在一些實施例中，使用即時PCR基於藉由使用經繫栓淬滅部分使用分子內淬滅螢光分子來進行特定基因候選者中SNP之偵測。因此，根據例示性實施例，即時PCR法亦包括使用分子信標技術。分子信標技術利用具有經內淬滅螢光團之髮夾形分子，其螢光藉由結合於相關DNA標靶恢復(參見例如Kramer, R.等人, Nat. Biotechnol.14:303-308, 1996)。在一些實施例中，使用分子信標探針與積聚之PCR產物的增加之結合來特異性偵測基因組DNA中所存在之SNP。 多種適合基因分型程序中之一者為TAQMAN®對偶基因辨別分析。在此分析之一些情況下，利用如下寡核苷酸探針，其在探針之5'端標記有螢光報導染料且在探針之3'端標記有淬滅染料。淬滅基因與完整探針之接近使報導基因保持低螢光。在PCR反應期間，DNA聚合酶之5'核酸酶活性使探針裂解且使染料與淬滅基因分離。從而使報導基因之螢光增加。藉由監測報導染料之螢光增加來直接偵測PCR產物積累。DNA聚合酶之5'核酸酶活性僅在探針與標靶雜交且在PCR期間擴增時才使報導基因與淬滅基因之間的探針裂解。探針經設計以僅在特定SNP對偶基因存在時才跨越標靶SNP位置且與核酸分子雜交。 舉例而言，為擴增位於TGFβI基因之外顯子4中的阿韋利諾角膜營養不良相關SNP，如美國專利公開案第2012/0077200號中所述建構正向及反向PCR引子對(圖2中之SEQ ID NO:1至24)。在一些實施例中，本文所揭示之改良方法中使用其中所揭示之任何正向及反向引子對。在一較佳實施例中，本文所提供之改良方法中使用SEQ ID NO:1(正向)與SEQ ID NO:2(反向)之正向及反向引子對。 為偵測TGFβI基因之外顯子4中的鳥嘌呤向腺嘌呤之突變，如美國專利公開案2012/0077200中所述建構經螢光標記之即時PCR成對探針，以偵測具有圖3中所示之SEQ ID NO:25至42之核苷酸序列的野生型(「G」)及阿韋利諾角膜營養不良相關突變體(「A」)對偶基因。在一些實施例中，本文所揭示之改良方法中使用任何野生型及突變體探針。在一較佳實施例中，本文所提供之改良方法中使用SEQ ID NO:25(野生型)與SEQ ID NO:26(突變體)之野生型及突變體成對探針。為區分野生型對偶基因與疾病相關對偶基因，用VIC標記野生型探針且用FAM標記突變體探針。將小溝結合子(MGB)連接於探針以促進結合於互補基因片段。 b. 即時 PCR 循環 即時PCR法包括多個步驟或循環作為擴增方法之一部分。此等循環包括使雙股核酸變性，使正向引子、反向引子及標靶基因組DNA序列之偵測探針退火，及自經退火之正向引子及反向引子合成(亦即複製)第二股DNA。此三步過程在本文中稱為一個循環。 在一些實施例中，使用約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個循環。在一些實施例中，使用約10至約60個循環、約20至約50個或約30至約40個循環。在一些實施例中，使用40個循環。 在一些實施例中，使雙股核酸變性之步驟在約80℃至100℃、約85℃至約99℃、約90℃至約95℃之溫度下進行約1秒至約5秒、約2秒至約5秒或約3秒至約4秒。在一些實施例中，使雙股核酸變性之步驟在95℃之溫度下進行約3秒。 在一些實施例中，使正向引子、反向引子及標靶基因組DNA序列之偵測探針退火之步驟在約40℃至約80℃、約50℃至約70℃、約55℃至約65℃下進行約15秒至約45秒、約20秒至約40秒、約25秒至約35秒。在一些實施例中，使正向引子、反向引子及標靶基因組DNA序列之偵測探針退火之步驟在約60℃下進行約30秒。 在一些實施例中，自經退火之正向引子及反向引子合成(亦即複製)第二股DNA之步驟在約40℃至約80℃、約50℃至約70℃、約55℃至約65℃下進行約15秒至約45秒、約20秒至約40秒、約25秒至約35秒。在一些實施例中，使正向引子、反向引子及標靶基因組DNA序列之偵測探針退火之步驟在約60℃下進行約30秒。 在一些實施例中，發現可將約1 µL、約2 µL、約3 µL、約4 µL或約5 µL根據本文所述之本發明方法製備之基因組DNA檢體與僅約0.05 µL、約0.10 µL 約0.15 µL、約0.20 µL、約0.25 µL或約0.25 µL 30×、35×、40×、45×、50×或100× 即時PCR分析混合物及蒸餾水組合形成PCR主混合物。在一些實施例中，PCR主混合物之最終體積為約5 µL、約6 µL、約7 µL、約8 µL、約9 µL、約0 µL、約11 µL、約12 µL、約13 µL、約14 µL、約15 µL、約16 µL、約17 µL、約18 µL、約19 µL或約20 µL或20 µL以上。在一些實施例中，發現可將2 µL如上述製備之基因組DNA檢體與僅約0.15 µL 40×即時PCR分析混合物及2.85 µL蒸餾水組合而形成PCR主混合物。 儘管本文描述例示性反應，但熟習此項技術者應瞭解如何基於探針設計改變溫度及時間。此外，本發明方法涵蓋以上時間及溫度之任何組合。 c.   PCR 引子及引子設計 在一些實施例中，在實驗室環境中測試且設計引子。在一些實施例中，藉由基於電腦之電子雜交法設計引子。引子序列基於擴增子或欲擴增之標靶核酸序列之序列。相較於較長之擴增子，較短之擴增子通常更有效複製且引起更有效擴增。 在設計引子時，熟習此項技術者應瞭解需要基於所設計引子以及第二結構考慮(GC含量增加可產生增加之第二結構)之GC及AT含量考慮熔融溫度(T m；引子-標靶雙螺旋解離且變成單股之溫度，且其為雙螺旋穩定性之指示；T m增加表明穩定性增加)。T M可使用此項技術中已知之多種方法計算，且熟習此項技術者可容易地瞭解此類用於計算T M之各種方法；此類方法包括例如(但不限於)線上工具中可獲得之方法，諸如在全球資訊網(World Wide Web)之promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm上可獲得之T M計算器。引子特異性由其完整序列與3'端序列之組合定義，該3'端序列為由Taq聚合酶拉長之部分。在一些實施例中，3'端應具有至少5至7個在標靶序列中之任何其他位置不會發現之獨特核苷酸以輔助降低不正確擴增產物之錯誤引發及產生。正向及反向引子通常以類似效率結合於標靶。在一些情況下，使用諸如NCBI BLAST(位於全球資訊網之ncbi.nlm.nih.gov上)之工具來進行比對及輔助引子設計。 熟習此項技術者應完全知曉關於標靶核酸序列之引子設計的基礎，且多個參考手冊及教科書關於此類方法具有大量教示，包括例如Molecular Cloning (三卷裝, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及Current Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)及Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnostics to Characterization (Ian M. MacKay, Calster Academic Press; 2007)；全球資訊網之primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html上可獲得之PrimerAnalyser Java工具及Kalendar R等人 ( Genomics, 98(2): 137-144 (2011))，其均全文併入本文中以用於所有目的。 引子設計之另一方面為引子複雜性或序列語法複雜性(參見Kalendar R等人 ( Genomics, 98(2): 137-144 (2011))。具有較大序列語法複雜性(例如核苷酸排列及組成)之引子通常較有效。在一些實施例中，使用序列語法複雜性計算方法檢索比較序列之間的保守區以偵測低複雜性區域，包括簡單重複序列、正向或反向重複序列、多嘌呤及多嘧啶三股cDNA結構及四股結構(諸如G-四聚體)。在一些實施例中，使用字母表容量L-gram法(參見A. Gabrielian, A. Bolshoy, Computer & Chemistry23:263-274 (1999)及Y.L. Orlov, V.N. Potapov, Complexity: an internet resource for analysis of DNA sequence complexity, Nucleic Acids Res.32: W628-W633(2004))沿全序列長度進行語言複雜性(LC)量測，且以序列中1至L大小之字詞的所觀察範圍(xi)的總和除以此序列長度之預期(E)值的總和的形式計算。一些富含G(及富含C)之核酸序列摺疊成含有G-四聚體之堆疊的四股DNA結構(參見全球資訊網之quadruplex.org)。在一些情況下，此等四聚體藉由兩個或四個DNA分子之分子間締合、含有兩個G鹼基之序列二聚合或藉由含有四個鳥嘌呤之嵌段的單股的分子間摺疊形成(參見P.S. Ho, PNAS,91:9549-9553 (1994)；I.A. Il'icheva, V.L. Florent'ev, Russian Journal of Molecular Biology26:512-531(1992)；D. Sen, W. Gilbert, Methods Enzymol.211:191-199 (1992)；P.A. Rachwal, K.R. Fox, Methods 43:291-301  (2007)；S. Burge, G.N. Parkinson, P. Hazel, A.K. Todd, K. Neidle, Nucleic Acids Res.34:5402-5415  (2006)；A. Guédin, J. Gros, P. Alberti, J. Mergny, Nucleic Acids Res.38:7858-7868 (2010)；O. Stegle, L. Payet, J.L. Mergny, D.J. MacKay, J.H. Leon, Bioinformatics25:i374-i382  (2009))；在一些情況下，因為其低語言複雜性(對於(TTAGGG) 4，LC=32%)而將其自引子設計去除。 此等方法包括用於在具有GC偏移((G−C)/(G+C))、AT偏移((A−T)/(A+T))、CG−AT偏移((S−W)/(S+W))或嘌呤-嘧啶((R−Y)/(R+Y))偏移之序列中關於CG含量及熔融溫度進行模式分析的各種生物資訊工具，且提供用於測定序列語法複雜性分佈之工具。舉例而言，對於滑動窗n(其中n為正整數)中之GC偏移，以一個鹼基為步長根據式(G−C)/(G+C)來計算鹼基，其中G為窗口中所有序列之鳥嘌呤之總數且C為窗口中所有序列之胞嘧啶之總數(Y. Benita等人, Nucleic Acids Res. 31:e99 (2003))。正GC偏移值表明G鹼基過多，而負GC偏移值表示C鹼基過多。類似地，在序列中計算其他偏移。在一些實施例中，使用此類方法以及其他方法來測定引子複雜性。 根據非限制性例示性實施例，使用核酸外切酶引子(TAQMAN®探針)進行即時PCR。在該等實施例中，引子利用熱穩定聚合酶(諸如Taq)之5'核酸外切酶活性來裂解擴增反應中所存在之雙標記探針(參見例如Wittwer, C.等人, Biotechniques 22:130-138, 1997)。儘管與PCR產物互補，但此分析中所用之引子探針不同於PCR引子且用能夠發螢光之分子與能夠淬滅螢光之分子雙標記。當探針完整時，DNA探針內螢光信號之分子內淬滅使信號極小。當在擴增期間藉由Taq之核酸外切酶活性釋放螢光分子時，淬滅大大減少，從而使螢光信號增加。螢光探針之非限制性實例包括6-羧基-螢光素部分及類似部分。例示性淬滅基因包括Black Hole淬滅基因1部分及類似部分。 多種PCR引子可用於所揭示之方法。例示性引子包括(但不限於)本文所述之引子。適用於所揭示方法之引子亦見於美國專利公開案第20120077200號，其以引用的方式併入本文中以用於所有目的。在一些實施例中，適用於本發明方法之PCR引子包括(但不限於)表1中所列之以下引子且可用於偵測TGFβI基因。表2及表3提供各引子之生物物理學參數，其使用全球資訊網之primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html計算。 表 1 ： TGF β I 基因之例示性引子
引子名稱 SEQ ID NO: 引子序列
ACD Fw引子 SEQ ID NO: 1 5'-TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA
ACD Re引子 SEQ ID NO: 2 5'-CCA TCT CAG GCC TCA GCT T (60 bp)
AV Fw引子 SEQ ID NO: 3 5'-TGC AGC CCT ACC ACT CTC AA
AV Re引子 SEQ ID NO: 4 5'-AGG CCT CGT TGC TAG G (150 bp)
Real Fw引子 SEQ ID NO: 5 5'-TAG TCT CTT ATT CTA ATA GA
Real Re引子 SEQ ID NO: 6 5'-GCT GCA GAC TCT GTG TTT AA (860 bp)
ACD Fw2引子 SEQ ID NO: 7 5'-CCA TCC CTC CTT CTG TCT TCT G
ACD Re2引子 SEQ ID NO: 8 5'-CGG GCC CCT CCA TCT C (140 bp)
ACD Fw3引子 SEQ ID NO: 9 5'-CAG AGA AGG GAG GGT GTG GTT
ACD Re3引子 SEQ ID NO: 10 5'-GGG CGA AGA TGG TGA AGC T (190 bp)
ACD Fw4引子 SEQ ID NO: 11 5'-TCC TCG TCC TCT CCA CCT GTA
ACD Re4引子 SEQ ID NO: 12 5'-AGC TGG CAA GGA GGC CC
ACD Fw5引子 SEQ ID NO: 13 5'-TTT GGG CTT TCC CAC ATG C
ACD Re5引子 SEQ ID NO: 14 5'-GGC AGA CGG AGG TCA TCT CA
ACD Fw6引子 SEQ ID NO: 15 5'-GTA GTA CCG TGC TCT CTG
ACD Re6引子 SEQ ID NO: 16 5'-AGT TCC CCA TAA GAA TCC CCC
ACD Fw7引子 SEQ ID NO: 17 5'-GGC TGG ACC CCC AGA GG
ACD Re7引子 SEQ ID NO: 18 5'-ACC CCT CGG GGA AGT AAG G
ACD Fw8引子 SEQ ID NO: 19 5'-AAC CTT TAC GAG ACC CTG GGA
ACD Re8引子 SEQ ID NO: 20 5'-GAC TCC CAT CCA TCA TGC CC
ACD Fw9引子 SEQ ID NO: 21 5'-AGT CGT TGG ATC CAC CAC CA
ACD Re9引子 SEQ ID NO: 22 5'-GAC GTC ATT TCC TAC TGT TTC AGG
ACD Fw10引子 SEQ ID NO: 23 5'-CCC CCC AGA AAC AGC CTG
ACD Re10引子 SEQ ID NO: 24 5'-TTC TAA GGG GTT AAG GAG AAA GCT T
GCD1 Fw引子 SEQ ID NO: 43 5'-ACA CAG TCT TTG CTC CCA CAA A
GCD1 Re引子 SEQ ID NO: 44 5'-ACT TAA GTT GGT CTT TAC CCA AGA GTC T
表 2 ：正向引子之生物物理學參數
正向引子 長度 Tm1 Tm2 GC 含量 複雜性 % PCR 效率
SEQ ID NO:1 19 55.4 57.8 57.9 70 70
SEQ ID NO:3 20 57.1 58 55 81 66
SEQ ID NO:5 20 40.2 45.7 25 73 38
SEQ ID NO:7 22 55.9 60.2 54.5 62 43
SEQ ID NO:9 21 57.5 60.2 57.1 64 40
SEQ ID NO:11 21 57.6 60.2 57.1 66 57
SEQ ID NO:13 19 55.4 55.7 52.6 81 80
SEQ ID NO:15 18 50.6 55.3 55.6 75 66
SEQ ID NO:17 17 57.8 62.2 76.5 74 60
SEQ ID NO:19 21 56.6 58.2 52.4 82 73
SEQ ID NO:21 20 57.4 58 55 78 46
SEQ ID NO:23 18 56.5 59.9 66.7 69 69
平均值 19.67 54.96 57.80 56.05 72.69 59.85
中位值 20 56.55 58.1 55.3 73.5 63
標準偏差 1.50 5.00 4.24 11.78 6.84 14.10
表 3 ：反向引子之生物物理學參數
反向引子 長度 Tm1 Tm2 GC 含量 複雜性 % PCR 效率
SEQ ID NO:2 19 55.5 57.8 57.9 72 52
SEQ ID NO:4 16 52.1 54.5 62.5 78 78
SEQ ID NO:6 20 52.4 53.9 45 84 41
SEQ ID NO:8 16 55.2 59.6 75 63 53
SEQ ID NO:10 19 56.5 57.8 57.9 78 69
SEQ ID NO:12 17 58.5 59.8 70.6 74 66
SEQ ID NO:14 20 57.6 60.1 60 84 74
SEQ ID NO:16 21 54.9 58.2 52.4 71 51
SEQ ID NO:18 19 56.6 60 63.2 78 60
SEQ ID NO:20 20 56.5 60.1 60 65 65
SEQ ID NO:22 24 55.5 58.7 45.8 88 67
SEQ ID NO:24 25 55.3 57.2 40 74 40
平均值 19.69 55.61 58.13 57.33 76.54 60.69
中位值 19.5 55.5 58.45 58.95 76 62.5
標準偏差 2.77 1.86 2.10 10.33 7.52 12.30
在一些實施例中，用於所揭示方法之即時PCR引子的序列語法複雜性為至少70%、至少72%、至少75%、至少77%、至少80%、至少82%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%或至少99%。 d. 偵測探針設計及偵測探針 多種偵測探針可用於所揭示之方法且用於基因分型及或定量。熟習此項技術者通常使用之偵測探針包括(但不限於)水解探針(亦稱為TAQMAN®探針、5'核酸酶探針或雙標記探針)、雜交探針及蠍形引子(其將引子及偵測探針組合在一個分子中)。在一些實施例中，由熟習此項技術者依據所需之探針標靶來確定偵測探針設計，以使得探針與所用PCR引子相容(例如在即時PCR分析中，引子與探針不應干擾彼此之功能)。在一些實施例中，探針之設計應具有高於引子之T m，以促進產生有效信號。可使用此項技術中已知多種方法及熟習此項技術者咸瞭解之彼等用於計算T m之各種方法中之任何方法來計算T m；此類方法包括例如線上工具中可獲得之方法，諸如在全球資訊網之promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm上可獲得之計算器。在一些實施例中，增加偵測探針之T m可以使該偵測探針在引子被聚合酶延長之前先結合。 在一些實施例中，偵測探針含有各種修飾。在一些實施例中，偵測探針包括經修飾之核酸殘基，諸如(但不限於)2'-O-甲基核糖核苷酸修飾、硫代磷酸酯主鏈修飾、二硫代磷酸酯主鏈修飾、胺基磷酸酯主鏈修飾、甲基膦酸酯主鏈修飾、3'端磷酸酯修飾及/或3'烷基取代。 在一些實施例中，偵測探針由於修飾而提高對標靶序列之親和力。此類偵測探針包括長度延長之偵測探針以及含有化學修飾之偵測探針。此類修飾包括(但不限於)2'-氟(2'-去氧-2'-氟-核苷)修飾、LNA(鎖核酸)、PNA(肽核酸)、ZNA(拉鏈核酸)、嗎啉基、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、聚陽離子結合物及2'-芘修飾。在一些實施例中，偵測探針含有一或多個修飾，包括2'氟修飾(亦稱為2'-去氧-2'-氟-核苷)、LNA(鎖核酸)、PNA(肽核酸)、ZNA(拉鏈核酸)、嗎啉基、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯及/或聚陽離子結合物。 在一些實施例中，偵測探針含有可偵測部分，諸如本文所述之可偵測部分以及熟習此項技術者已知之任何可偵測部分。此類可偵測部分包括例如(但不限於)螢光標記及化學發光標記。此類可偵測部分之實例亦可包括FRET對之成員。在一些實施例中，偵測探針含有可偵測實體。 螢光標記之實例包括(但不限於)AMCA、DEAC (7-二乙基胺基香豆素-3-甲酸)；7-羥基-4-甲基香豆素-3；7-羥基香豆素-3；MCA (7-甲氧基香豆素-4-乙酸)；7-甲氧基香豆素-3；AMF (4'-(胺基甲基)螢光素)；5-DTAF (5-(4,6-二氯三嗪基)胺基螢光素)；6-DTAF (6-(4,6-二氯三嗪基)胺基螢光素)；6-FAM (6-羧基螢光素；亦稱為FAM；包括TAQMAN® FAM TM)；TAQMAN VIC®；5(6)-FAM屍胺；5-FAM屍胺；5(6)-FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC (FITC異構體I；螢光素-5-異硫氰酸酯)；5-FITC屍贋鹼；螢光素-5-順丁烯二醯亞胺；5-IAF (5-碘乙醯胺基螢光素)；6-JOE (6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基螢光素)；5-CR110 (5-羧基若丹明110)；6-CR110 (6-羧基若丹明110)；5-CR6G (5-羧基若丹明6G)；6-CR6G (6-羧基若丹明6G)；5(6)-羧基若丹明6G屍胺；5(6)-羧基若丹明6G乙二胺；5-ROX (5-羧基-X-若丹明)；6-ROX (6-羧基-X-若丹明)；5-TAMRA (5-羧基四甲基若丹明)；6-TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)；5-TAMRA屍胺；6-TAMRA屍胺；5-TAMRA乙二胺；6-TAMRA乙二胺；5-TMR C6順丁烯二醯亞胺；6-TMR C6順丁烯二醯亞胺；TR C2順丁烯二醯亞胺；TR屍胺；5-TRITC；G異構體(四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯)；6-TRITC；R異構體(四甲基若丹明-6-異硫氰酸酯)；丹磺醯屍胺(5-二甲基胺基萘-l-(N-(5-胺基戊基))磺醯胺)；EDANS C2順丁烯二醯亞胺；胺螢；NBD；及吡咯亞甲基及其衍生物。 化學發光標記之實例包括(但不限於)用於南方墨點及西方墨點方案之彼等標記(參見例如Sambrook及Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第3版) (2001)；其以全文引用的方式併入本文中)。實例包括(但不限於)-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧雜環丁烷(AMPPD)；經吖錠酯及金剛烷基穩定之1,2-二氧雜環丁烷及其衍生物。 探針之標記為此項技術中已知。使用經標記探針在擴增期間在擴增區域內雜交。探針經修飾以避免其充當擴增用之引子。用兩個螢光染料標記偵測探針，一個螢光染料能夠淬滅其他染料之螢光。一個染料連接於探針之5'端且另一染料連接於固有位點以使得當探針呈非雜交狀態時發生淬滅。 通常，即時PCR探針由染料對(報導染料及受體染料)組成，該等染料參與螢光共振能量轉移(FRET)，由此受體染料淬滅報導染料之發光。一般而言，經螢光標記之探針提高擴增子定量之特異性。 如由熟習此項技術者鑒於本發明確定，用於所揭示方法之一些實施例中的即時PCR亦包括使用一或多個雜交探針(亦即偵測探針)。作為非限制性實例，此類雜交探針包括(但不限於)所述方法中所提供之雜交探針中之一或多者。熟習此項技術者瞭解例示性探針，諸如HEX通道及/或FAM通道探針。 根據例示性實施例，偵測探針及引子宜例如使用電子雜交分析使用引子設計軟體且交叉引用寄存在美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI) 的基因及基因組之可獲得的核苷酸資料庫來選擇。在一些實施例中，可使用一些其他準則來選擇引子及/或探針。舉例而言，在一些實施例中，引子及探針經選擇以使得其靠在一起但不重疊。在一些實施例中，引子可具有相同(或接近之T M)(例如在約58℃與約60℃之間)。在一些實施例中，探針之T M比選用於引子之T M者高約10℃。在一些實施例中，探針及引子之長度經選擇以在約17個鹼基對與39個鹼基對之間等。在一些情況下，熟習此項技術者使用此等及其他準則來選擇適當引子及/或探針。 適用於本發明方法之探針包括(但不限於)表4中所列之以下例示性探針。 表 4 ： TGFβI 基因之例示性探針
探針名稱 SEQ ID NO: 探針序列
正常探針1 SEQ ID NO: 25 VIC-CAC GGA CCG CAC GGA-NFQ (15 bp)
突變體探針1 SEQ ID NO: 26 FAM-CAC GGA CCA CAC GGA-NFQ
正常探針2 SEQ ID NO: 27 VIC-ACA CGG ACC GCA CG-NFQ
突變體探針2 SEQ ID NO: 28 FAM-ACA CGG ACC ACA CG-NFQ (14 bp)
正常探針3 SEQ ID NO: 29 VIC-TAC ACG GAC CGC A-NFQ
突變體探針3 SEQ ID NO: 30 FAM-TAC ACG GAC CAC A-NFQ (13 bp)
正常探針4 SEQ ID NO: 31 VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG-NFQ
突變體探針4 SEQ ID NO: 32 FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG-NFQ (18 bp)
正常探針5 SEQ ID NO: 33 VIC-CTG TAC ACG GAC CGC ACG GAG-NFQ
突變體探針5 SEQ ID NO: 34 FAM-CTG TAC ACG GAC CAC ACG GAG-NFQ (21 bp)
正常探針6 SEQ ID NO: 35 VIC-GCT GTA CAC GGA CCG CAC GGA GAA-NFQ
突變體探針6 SEQ ID NO: 36 FAM-GCT GTA CAC GGA CCA CAC GGA GM-NFQ
正常探針7 SEQ ID NO: 37 VIC-ACC GCA CGG AGA AGC-NFQ
突變體探針7 SEQ ID NO: 38 FAM-ACC ACA CGG AGA AGC-NFQ
正常探針8 SEQ ID NO: 39 VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ
突變體探針8 SEQ ID NO: 40 FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC-NFQ
正常探針9 SEQ ID NO: 41 VIC-ACC GCA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ
突變體探針9 SEQ ID NO: 42 FAM-ACC ACA CGG AGA AGC TGA GGC CTG-NFQ
正常探針10 SEQ ID NO: 45 VIC-CAC CAA GAG AAC GGA-NFQ
突變體探針10 SEQ ID NO: 46 FAM-CAC CAA GAG AAT GG-NFQ
正常探針10a SEQ ID NO: 47 VIC-CAC CAA GAG AAC GGA G-MGB NFQ
#TGFBI R124C SEQ ID NO: 48 FAM-CAC GGA CTG CAC GGA-MGB NFQ
#TGFBI R124L SEQ ID NO: 49 FAM-CAC GGA CCT CAC GGA-MGB NFQ
#TGFBI R555Q-1 SEQ ID NO: 50 FAM-AC CAA GAG AACA GA G--MGB NFQ
VII. 診斷測試 在一些實施例中，使用診斷測試來藉由偵測多種突變中之任一者確定一或多個遺傳病況。在一些實施例中，在基於例如實體表現、病徵及/或症狀以及家族病史資訊懷疑特定病況時使用診斷測試來確認診斷。在一些實施例中，診斷測試之結果輔助熟習醫學技術者確定既定患者之適當治療方案且使得可獲得更個人化且更有效之治療方案。在一些實施例中，如由熟習此項技術者所確定，治療方案包括多種醫藥治療、手術治療、生活方式改變或其組合中之任一者。 藉由所揭示方法獲得之核酸適用於多種診斷測試，包括用於偵測突變(諸如缺失、插入、顛換及轉換)之測試。在一些實施例中，此類診斷適用於鑑別攜帶疾病之基因的一個複本的未感染個體，該疾病需要兩個複本來進行疾病表現，鑑別攜帶疾病之基因的一個複本的未感染個體，其中該資訊可用於產生治療方案、移植前遺傳診斷、產前診斷測試、新生兒篩選、譜系DNA測試(用於遺傳譜系學目的)、用於預測成人發作型病症(諸如亨廷頓氏病(Huntington's disease))之症狀前測試、用於估計產生成人發作型癌症及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之風險的症狀前測試、確認性診斷有症狀之個體及/或法醫/身分測試。在一些實施例中，本發明方法可用於偵測角膜營養不良。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP (諸如引起TGFβI基因中之R124突變的SNP，包括例如(但不限於) TGFβI基因之核苷酸418處由G向A轉變引起且亦稱為C(G/A)C SNP之R124H突變)來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測顆粒狀角膜營養不良相關之SNP (諸如引起TGFβI基因中之R555突變的SNP，包括例如(但不限於) TGFβI基因之核苷酸1663處由C向T轉變引起且亦稱為(C/T)GG SNP之R555W突變)來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測格子狀營養不良相關之SNP (諸如引起TGFβI基因中之R124及/或626突變的SNP，包括例如(但不限於) TGFβI基因之核苷酸417處由C向T轉變引起且亦稱為(C/T)GC SNP之R124C突變或TGFβI基因之核苷酸1924處由A向C轉變引起之H626P突變)來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP (諸如引起TGFβI基因中之R124突變的SNP，包括例如(但不限於) TGFβI基因之核苷酸418處由G向T轉變引起且亦稱為C(G/T)C SNP之R124L突變)來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP (諸如引起TGFβI基因中之R555突變的SNP，包括例如(但不限於) TGFβI基因之核苷酸1664處由G向A轉變引起且亦稱為C(G/A)G SNP之R555Q突變)來偵測。 在一些實施例中，新生兒篩選包括出生後立即使用以鑑別遺傳病症之任何遺傳篩選。在一些實施例中，新生兒篩選可用於鑑別遺傳病症以使得在生命早期確定治療方案。此類測試包括(但不限於)測試嬰兒之苯酮尿症及先天性甲狀腺功能低下。 在一些實施例中，使用攜帶者測試鑑別攜帶基因突變之單一複本者。在一些情形下，當存在於兩個複本中時，突變可引起遺傳病症。在一些情形下，一個複本足以引起遺傳病症。在一些情形下，存在兩個複本表明特定治療方案之禁忌症，諸如存在阿韋利諾突變及進行手術程序前之預篩選以確保對既定患者實行適當治療方案。在一些實施例中，此類資訊亦適用於考慮生育之個體且輔助個體做出經告知之決策以及輔助熟習醫學技術者向個別患者以及患者親屬提供重要建議。 在一些實施例中，使用預測型及/或症狀前型測試偵測與多種病症有關之基因突變。在一些情形下，此等測試有助於家族成員患有遺傳病症但在測試時可能未展現病症之特徵者。在一些實施例中，預測測試鑑別提高個人產生具有遺傳依據之病症(包括例如(但不限於)某些類型之癌症)的幾率的突變。在一些實施例中，症狀前測試適用於在任何實體病徵或症狀出現前判定個人是否會產生遺傳病症。預測及症狀前測試之結果提供關於個人產生特定病症之風險的資訊且輔助患者以及患者之親屬做出關於適當醫學治療方案之決策。在一些實施例中，預測測試亦用於偵測表明某些治療方案之禁忌症的突變，諸如存在阿韋利諾突變表明進行LASIK手術及/或其他屈光程序(諸如(但不限於)光治療性角膜切除術(PTK)及/或屈光性角膜切除術(PRK))之禁忌症。舉例而言，展現阿韋利諾突變之患者不應進行LASIK手術或其他屈光程序。 在一些實施例中，診斷測試亦包括藥物基因組學，其包括確定遺傳變化對藥物反應之影響的遺傳測試。來自此類藥物基因組學分析之資訊可用於確定且開發適當治療方案。熟習醫學技術者使用關於遺傳變化存在及/或不存在之資訊設計適當治療方案。 在一些實施例中，使用本發明方法確定遺傳譜之疾病包括(但不限於)眼病、癌症、糖尿病、高血壓、精神分裂症及最常見之先天性畸形(諸如裂唇、裂顎、神經管缺陷、軟骨發育不全)、α-1抗胰蛋白酶缺乏、抗磷脂症候群、自閉症、常染色體顯性多囊性腎病、恰克-馬利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth)、結腸癌、貓叫症候群(Cri du chat)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)、囊腫性纖維化、德爾肯氏病(Dercum Disease)、唐氏症候群(Down Syndrome)、杜恩氏症候群(Duane Syndrome)、杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne Muscular Dystrophy)、萊登第五因子易栓病(Factor V Leiden Thrombophilia)、家族性高膽固醇血症、家族性地中海熱、X脆折症候群、戈謝病(Gaucher Disease)、血色素沈著症、血友病、前腦無裂畸形、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、克氏症候群(Klinefelter syndrome)、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、肌緊張性營養不良、神經纖維瘤、努南氏症候群(Noonan Syndrome)、成骨不全、帕金森氏病(Parkinson's disease)、苯酮尿症、波蘭氏異常(Poland Anomaly)、卟啉症、早老症、色素性視網膜炎、嚴重複合免疫缺乏(SCID)、鐮狀細胞疾病、脊髓性肌萎縮、泰薩二氏病(Tay-Sachs)、地中海貧血、三甲基胺尿症、特納症候群(Turner Syndrome)、顎心臉症候群(Velocardiofacial Syndrome)、WAGR症候群、威爾遜氏病(Wilson Disease)以及具有遺傳組分之任何其他疾病。眼病及/或包括眼科組分之病症包括(但不限於)瞼板腺囊腫、瞼腺炎、倒睫、瞼內翻、瞼外翻、兔眼、瞼炎、淚囊炎、眼眶蜂窩織炎、翼狀胬肉、翼狀胬肉角膜營養不良、結膜炎、新生兒眼炎、細菌性角膜潰瘍、真菌性角膜潰瘍、青光眼、富克斯氏營養不良(Fuchs Dystrophy)、圓錐形角膜、黃斑變性晚期、色素性視網膜炎、白內障、視網膜病、黃斑變性、糖尿病性眼部問題(例如糖尿病性視網膜病變)、瞼裂狹小-上瞼下垂-內眥贅皮倒轉症候群(BPES)、眼部皮膚白化症、馬凡氏症候群、斯蒂克勒症候群(Stickler syndrome)及CHARGE(眼組織缺損、心臟異常、後鼻孔閉鎖、生長及發育遲緩、生殖器/泌尿系統異常、耳部異常或聾)症候群。角膜營養不良包括(但不限於)阿韋利諾角膜營養不良、顆粒狀角膜營養不良、格子狀I型角膜營養不良、富克斯營養不良、蒂爾-本克角膜營養不良及瑞斯-巴克勒角膜營養不良。癌症包括(但不限於)癌瘤、肉瘤、母細胞瘤、淋巴瘤、白血病性生殖細胞腫瘤及未知病因之癌症。在一些實施例中，癌症包括(但不限於)頭頸癌、皮膚癌、結腸癌、口腔癌、神經膠母細胞瘤、乳癌、喉癌、食道癌、內皮癌、子宮內膜癌、卵巢癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直腸癌、前列腺癌、腎臟癌、黑色素瘤、腎癌、胰臟癌、腸胃癌、血癌、肝癌、子宮癌及腦癌以及病毒誘發性癌症(諸如乳頭狀瘤病毒誘發性癌症)。 在一些實施例中，本發明方法可藉由提供基因組DNA用於開發個人化醫學治療方案，該基因組DNA用於確定個體之遺傳譜。在一些實施例中，熟習此項技術者使用此類遺傳譜資訊來確定及/或開發治療方案。在一些實施例中，熟習此項技術者使用藉由所述方法分離之核酸中所鑑別之各種遺傳變化及突變的存在及/或不存在作為個人化醫學治療方案或計劃之一部分。舉例而言，在一些實施例中，將使用所揭示方法獲得之資訊與資料庫或其他現有資訊比較以確定對指定疾病之診斷及或確定治療方案。在一些情形下，將關於特定患者中遺傳突變之存在或不存在的資訊與資料庫或其他標準資訊來源比較以關於所提議之治療方案做出決定。在一些情形下，遺傳突變之存在表明實行特定治療方案。在一些情形下，遺傳突變之不存在表明不實行特定治療方案。 在一些實施例中，使用關於特定遺傳突變之存在及/或不存在的資訊確定對治療實體之治療的治療功效以及調適對治療實體之治療的治療方案。在一些實施例中，使用關於遺傳突變之存在及/或不存在的資訊判定是否實行治療方案。在一些實施例中，使用關於遺傳突變之存在及/或不存在的資訊判定是否繼續治療方案。在一些實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否停止治療方案。在其他實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否修改治療方案。在一些實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否增加或減少作為治療方案之一部分投與之治療的劑量。在其他實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否改變作為治療方案之一部分投與之治療的給藥頻率。在一些實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否改變治療之每天、每週劑量數、每天之次數。在一些實施例中，使用遺傳突變之存在及/或不存在判定是否改變治療之劑量。在一些實施例中，在開始治療方案前及/或在已開始治療方案後判定遺傳突變之存在及/或不存在。在一些實施例中，判定遺傳突變之存在及/或不存在且與關於遺傳突變之存在或不存在的預定標準資訊比較。 在一些實施例中，使用所揭示方法產生一個以上遺傳突變之存在及/或不存在的複合結果且此類複合結果包括關於一個以上遺傳突變之存在及/或不存在的任何資訊集合。在一些實施例中，檢測2個或2個以上、3個或3個以上、4個或4個以上、5個或5個以上、6個或6個以上、7個或7個以上、8個或8個以上、9個或9個以上、10個或10個以上、20個或20個以上、30個或30個以上個或40個或40個以上遺傳突變之存在或不存在且用於產生複合結果。在一些實施例中，例示性資訊包括核酸或蛋白質資訊，或關於核酸及/或蛋白質遺傳突變之資訊兩者的組合。一般而言，複合結果包括關於遺傳突變之存在及/或不存在的資訊。在一些實施例中，使用此等複合結果與預定標準資訊比較以實行、維持或停止治療方案。 在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測2、3、4或5個選自(但不限於)阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP、顆粒狀角膜營養不良相關之SNP、格子狀營養不良相關之SNP、瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP及/或蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP的SNP來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP以及顆粒狀角膜營養不良相關之SNP、格子狀營養不良相關之SNP、瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP及/或蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測顆粒狀角膜營養不良相關之SNP以及阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP、格子狀營養不良相關之SNP、瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP及/或蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP來偵測。在一些實施例中，例如經由偵測格子狀營養不良相關之SNP以及阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP、顆粒狀角膜營養不良相關之SNP、瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP及/或蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP來偵測角膜營養不良。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP以及阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP、顆粒狀角膜營養不良相關之SNP、格子狀營養不良相關之SNP及/或蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測蒂爾-本克角膜營養不良相關之SNP以及阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP、顆粒狀角膜營養不良相關之SNP、格子狀營養不良相關之SNP及/或瑞斯-巴克勒角膜營養不良相關之SNP來偵測。 在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測2、3、4、5及/或6個選自阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP的SNP來偵測。在一些實施例中，SNP包括在由人類TGFβI基因編碼之多肽之位置124、555及/或626處產生突變的SNP。此等突變包括引起TGFβI基因中之R124突變的突變(包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸418處由G向A轉變引起且亦稱為C(G/A)C SNP的R124H突變)；顆粒狀角膜營養不良相關之SNP，諸如引起TGFβI基因中之R555突變的SNP(包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸1663處由C向T轉變引起且亦稱為(C/T)GG SNP的R555W突變)；格子狀營養不良相關之SNP，諸如引起TGFβI基因中之R124突變的SNP(包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸417處由C向T轉變引起且亦稱為(C/T)GC SNP的R124C突變)；瑞斯-巴克勒角膜營養不良之SNP，諸如引起TGFβI基因中之R124突變的SNP(包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸418處由G向T轉變引起且亦稱為C(G/T)C SNP的R124L突變)；及/或蒂爾-本克角膜營養不良之SNP，諸如引起TGFβI基因中之R555突變的SNP(包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸1664處由G向A轉變引起且亦稱為C(G/A)G SNP的R555Q突變)。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP(諸如引起TGFβI基因中之R124突變的SNP，包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸418處由G向A轉變引起且亦稱為C(G/A)C SNP的R124H突變)以及顆粒狀角膜營養不良相關之SNP(諸如引起TGFβI基因中之R555突變的SNP，包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸1663處由C向T轉變引起且亦稱為(C/T)GG SNP的R555W突變)來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測阿韋利諾角膜營養不良相關之SNP(諸如引起TGFβI基因中之H626P突變的SNP，包括例如(但不限於)TGFβI基因之核苷酸1924處由A向C轉變引起之H626P突變)來偵測。 在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P中之2、3、4、5及/或6者來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R124C、R124H、R124L、R555W及/或R555Q中之2、3、4及/或5者來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R124C以及R124H、R124L、R555W及/或R555Q中之一或多者來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R124H以及R124C、R124L、R555W及/或R555Q中之一或多者來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R555W以及R124C、R124H、R124L及/或R555Q中之一或多者來偵測。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測R555Q以及R124C、R124H、R124L及/或R555W中之一或多者來偵測。在一些實施例中，偵測R124H以及R555W。在一些實施例中，角膜營養不良例如經由偵測H262P以及R124C、R124H、R124L、R555W及/或R555Q中之一或多者來偵測。在一些實施例中，偵測R124C、R124H、R124L、R555W及/或R555Q中之全部。在一些實施例中，偵測R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P中之全部。 VIII. 診斷套組 在一些實施例中，上述試劑中之任一者或全部封裝在診斷套組中。此類套組包括引子、探針、緩衝液及/或本文所述其他試劑之任何組合中的任一者及/或全部。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P中之2、3、4、5及/或6者的試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q中之2、3、4及/或5者的試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H及R124L之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555W及R555Q之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124H之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124L之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555W之試劑。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555Q之試劑。 在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P中之2、3、4、5及/或6者的引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q中之2、3、4及/或5者的引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C、R124H及R124L之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555W及R555Q之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124C之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124H之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R124L之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555W之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測R555Q之引子及探針。在一些實施例中，套組包括用於偵測H626P之引子及探針。 在一些實施例中，試劑以凍乾粉形式包括在套組中。在一些實施例中，試劑以凍乾粉形式與復原說明一起包括在套組中。在一些實施例中，試劑以液體形式包括在套組中。在一些實施例中，試劑包括在塑膠及/或玻璃瓶或其他適當容器中。在一些實施例中，引子及探針均包含在套組中之個別容器中。在一些實施例中，引子一起封裝在一個容器中，且探針一起封裝在另一容器中。在一些實施例中，引子及探針一起封裝在單一容器中。 在一些實施例中，套組進一步包括對照gDNA及/或DNA檢體。在一些實施例中，所包括之對照DNA檢體為正常TGFBI R124。在一些實施例中，所包括之對照DNA檢體對應於所偵測之突變，包括R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q及/或H626P之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R124C、R124H、R124L、R555W及/或R555Q之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA及對應於R124C、R124H及/或R124L之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R555W及/或R555Q之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R124C之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R124H之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R124L之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R555W之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於R555Q之突變體DNA檢體。在一些實施例中，包括對應於正常TGFBI R124之對照DNA檢體及對應於H626P之突變體DNA檢體。在一些實施例中，對照DNA檢體之濃度為5 ng/µL、10 ng/µL、20 ng/µL、30 ng/µL、40 ng/µL、50 ng/µL、60 ng/µL、70 ng/µL、80 ng/µL、90 ng/µL、100 ng/µL、110 ng/µL、120 ng/µL、130 ng/µL、140 ng/µL、150 ng/µL、160 ng/µL、170 ng/µL、180 ng/µL、190 ng/µL或200 ng/µL。在一些實施例中，對照DNA檢體之濃度為50 ng/µL、100 ng/µL、150 ng/µL或200 ng/µL。在一些實施例中，對照DNA檢體濃度濃度為100 ng/µL。在一些實施例中，對照DNA檢體具有相同濃度。在一些實施例中，對照DNA檢體具有不同濃度。 在一些實施例中，套組可進一步包括緩衝液，例如GTXpressTAQMAN®試劑混合物或任何等效緩衝液。在一些實施例中，緩衝液包括本文所述之任何緩衝液。 在一些實施例中，套組可進一步包括用於選殖之試劑，諸如載體(包括例如M13載體)。 在一些實施例中，套組進一步包括用於純化DNA之試劑。 在一些實施例中，套組進一步包括使用套組偵測個體之角膜營養不良的說明。在一些實施例中，此等說明包括本文所述之方案的各種態樣。 實例 實例 1 ： DNA 提取 (DNA 提取全試劑 ， ThermoFisher)如下所述且根據本文所提供之揭示內容自口腔上皮或毛根或全血提取DNA。 為自口腔上皮或毛根提取DNA，首先在1×PBS 300 µL中預處理檢體。隨後，將30 µL溶解溶液添加至管中且使混合物渦旋。隨後在95℃下培育混合物3分鐘。接著，添加30 µL DNA穩定溶液(來自Life Technologies/Thermo Scientific,USA)且使混合物渦旋。隨後將混合物在13,000 RPM下離心1分鐘。 為自全血提取DNA，以3 µL全血為起始物質，首先在1×PBS 300 µL中預處理檢體。隨後，將30 µL溶解溶液添加至管中且使混合物渦旋。隨後在95℃下培育混合物3分鐘。接著，添加30 µL DNA穩定溶液(來自Life Technologies/Thermo Scientific,USA)且使混合物渦旋。隨後將混合物在13,000 RPM下離心1分鐘。 以上程序完成後，使用市售Tecan® Infinite® 200 PRO NanoQuant讀取DNA濃度。為進行定量，將100 µL溶離劑吸於透明96孔盤中。隨後，向孔H12中添加100 µL所製備之空白溶液。隨後使用與NanoQuant一起提供之製造商之說明讀取濃度。 使用以下在表5及6中所述之探針及引子製備反應混合物。 表 5 ： 探針序列
探針 序列
正常TGFBI R124 (SEQ ID NO: 25) VIC-CAC GGA CCG CAC GGA-MGB NFQ
TGFBI R124H (SEQ ID NO:26) FAM-CAC GGA CCA CAC GGA-MGB NFQ
TGFBI R124C (SEQ ID NO: 48) FAM-CAC GGA CTG CAC GGA-MGB NFQ
TGFBI R124L (SEQ ID NO:49) FAM-CAC GGA CCT CAC GGA-MGB NFQ
正常TGFBI R555 (SEQ ID NO:45) VIC-CAC CAA GAG AAC GGA-MGB NFQ
TGFBI R555W (SEQ ID NO:46) FAM-CAC CAA GAG AAT GG-MGB NFQ
TGFBI R555Q (SEQ ID NO:50) FAM-AC CAA GAG AAC AGA G-MGB NFQ
表 6 ：引子序列
引子 序列
TGFBI 124 F (SEQ ID NO:1) TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA
TGFBI 124 R (SEQ ID NO:2) CCA TCT CAG GCC TCA GCT T
TGFBI 555 F (SEQ ID NO:43) ACA CAG TCT TTG CTC CCA CAA A
TGFBI 555 R (SEQ ID NO:44) ACT TAA GTT GGT CTT TAC CCA AGA GTC T
例示性反應混合物中所用之組分及比率如下展示於表7中。 表 7 ： 反應混合物
全試劑抽出物(全血)    3.00 µl
GTXpress TaqMan®    10.00 µl
引子(124R) (反向) 10 pMol 0.50 µl
引子(124F) (正向) 10 pMol 0.50 µl
引子(555R) (反向) 10 pMol 0.50 µl
引子(555F) (正向) 10 pMol 0.50 µl
探針(NL/VIC) 10 pMol 0.20 µl
探針(R124H/FAM) 10 pMol 0.30 µl
探針(R124C/FAM) 10 pMol 0.20 µl
探針(R124L/FAM) 10 pMol 0.50 µl
探針(R555N/VIC) 10 pMol 0.20 µl
探針(R555Q-1/FAM) 10 pMol 0.20 µl
探針(R555W/FAM) 10 pMol 0.20 µl
DW    3.20 µl
例示性PCR循環條件如下展示於表8中。 表 8 ： PCR 循環
前讀取 保持階段 循環階段 40 個循環 後讀取
60℃ 95℃ 95℃ 64℃ 60℃
1分鐘 20秒 3秒 30秒 1分鐘
使用以上方案產生圖4至圖8中所提供之即時PCR資料。 引用所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，熟習此項技術者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題之各種態樣的有用性。 本文中引用之所有參考文獻以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特別且個別地表明以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的一般。 如熟習此項技術者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行多種修改及改變。本文所述之特定實施例及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍所授權之等效物的全部範疇限制。
無 TGFβI 基因序列 (NCBI 參考編號 NG_012646.1) TGFβI 基因蛋白質產物 (βIG-H3 蛋白質序列； NCBI 參考編號 NG_012646.1)
圖 1A-1B說明用於根據一些實施例偵測與疾病有關之基因組對偶基因的改良方法100。 圖 2提供適用於根據一些實施例即時PCR偵測與阿韋利諾角膜營養不良有關之單核苷酸多形現象的正向及反向PCR引子對之序列(SEQ ID NO:1-24)的清單。 圖 3提供適用於根據一些實施例即時PCR偵測與阿韋利諾角膜營養不良有關之單核苷酸多形現象的野生型及成對突變體偵測探針的序列(SEQ ID NO:25-42)的清單。 圖 4提供圖5至圖8中所示之對偶基因偵測實驗中所用的探針序列及引子的清單。 圖 5提供關於使用圖4中所述之探針偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q突變體之實驗資料。圖5A提供使用指定試劑混合物及指定循環條件(右側圖)獲得之對偶基因辨別趨勢圖(左側圖)。圖5B提供各種突變體相較於正常對照之即時PCR曲線。圖5C提供各種突變體相較於同型接合對照之即時PCR曲線。 圖 6提供關於使用圖4中所述之探針偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q突變體的實驗資料。圖6A提供使用指定試劑混合物及指定循環條件(右側圖)獲得之對偶基因辨別趨勢圖(左側圖)。圖6B提供各種突變體相較於正常對照之即時PCR曲線。圖6C提供各種突變體相較於同型接合對照之即時PCR曲線。 圖 7提供關於使用圖4中所述之探針偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q突變體的實驗資料。圖7提供使用指定試劑混合物及指定循環條件(右側圖)獲得之對偶基因辨別趨勢圖(左側圖)。 圖 8提供關於使用圖4中所述之探針偵測R124C、R124H、R124L、R555W及R555Q突變體的實驗資料。詳言之，圖8提供使用指定試劑混合物及指定循環條件(右側圖)獲得之對偶基因辨別趨勢圖。對偶基因辨別圖(左側圖)中之標示「B」表明在進行即時PCR分析前用溶解緩衝液預處理檢體。對偶基因辨別圖(左側圖)中之標示「DW-A」表明在進行即時PCR分析前用蒸餾水預處理檢體。不同檢體點周圍之環分別展示所偵測之各對偶基因的兩個相比檢體，「B」及「DW-A」(參見左側圖)；各環內有兩個點，一個用於檢體「B」，且一個用於檢體「DW-A」。 
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          <![CDATA[<120> 用於多工偵測與眼科病況有關的對偶基因之方法]]>
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          agctggcaag gaggccc	17
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          tttgggcttt cccacatgc	19
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
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          <![CDATA[<210> 16]]>
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          agttccccat aagaatcccc c	21
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          ggctggaccc ccagagg	17
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          acccctcggg gaagtaagg	19
          <![CDATA[<210> 19]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          aacctttacg agaccctggg a	21
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          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          gactcccatc catcatgccc	20
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          agtcgttgga tccaccacca	20
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          gacgtcattt cctactgttt cagg	24
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          ccccccagaa acagcctg	18
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 25]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 引子]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          ttctaagggg ttaaggagaa agctt	25
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          cacggaccgc acgga	15
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          cacggaccac acgga	15
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          acacggaccg cacg	14
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          acacggacca cacg	14
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          tacacggacc gca	13
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          tacacggacc aca	13
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          ctgtacacgg accgcacg	18
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          ctgtacacgg accacacg	18
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          ctgtacacgg accgcacgga g	21
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          ctgtacacgg accacacgga g	21
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          gctgtacacg gaccgcacgg agaa	24
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          gctgtacacg gaccacacgg agaa	24
          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
          accgcacgga gaagc	15
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          accacacgga gaagc	15
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          accgcacgga gaagctgagg c	21
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 40]]>
          accacacgga gaagctgagg c 21
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 41]]>
          accgcacgga gaagctgagg cctg 24
          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          accacacgga gaagctgagg cctg 24
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          acacagtctt tgctcccaca aa   22                                             
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          acttaagttg gtctttaccc aagagtct   28                                       
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正常探針 10]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          caccaagaga acgga   15
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  突變體探針 10]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          caccaagaga atgg   14
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正常探針 10a]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          caccaagaga acggag   16         
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  #TGFBI R124C]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          cacggactgc acgga   15      
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  #TGFBI R124L]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          cacggacctc acgga   15    
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  #TGFBI R555Q-1]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          accaagagaa cagag   15    
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  34810]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基因序列]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg       60
          tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc      120
          ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg      180
          ggtaagccga gccgcctggc caggggctgc ggaaggtcag gtagtcgggg ctcggagcgc      240
          aagccgctgg gggcattgaa ctgggctggg ggcgcagggg acaaagcccg aactaaaaac      300
          cttgcagcat ggagcgctcg gacaccagcc ctgcacgcgg tggaaggaga gagggaggga      360
          ggtggaggac catggaggga aagcgggagg ccgccgcttt gtagaaggga gtggggaagt      420
          ggaccagaga ctttcgacgc aggccaagag cctgagacgg acagcgcttt cagcttctcc      480
          tcccagccac tgcagaaagg gggaaatggc aactctttgg ccataatcac cgtgggaggg      540
          tgccaagggc aaagcccacc cagcagtaca cctattccaa cccagccagg cccccggcca      600
          gcgactccag acaagaacct gggccacaca cggtggcagc atctaaggtg ccccaggctc      660
          ctgtgctcct ggccaggccc tgcactcaga cactgctggc acccgacact gctctctggg      720
          tacagcaagg gcaatgtggc acttcttgtc ctgcccgatg aagagcagga gaatgcactg      780
          ggccctcaca cacactgttc aaatggggaa actgagtcct gagtggttcc actttcccac      840
          agtcctgaag tgtgcactgg agccaggatt ggagtctgtc ttaaagtaat agctgggttt      900
          gtaaatgtag gacactatca ttgcaggaat tcctttgaga ccctgaagat gtgttggctt      960
          taggagacaa actcaagcag aaggtctggt ctgatagtgg ccctaatact gacccaggca     1020
          gaggcaggca acatttctac ctcaaaaacc aggccatacc tgcgtcacaa atacccaggc     1080
          tttgctgcag cttccagcct acctggttgc accaacttct ttttcataac taggtaaaac     1140
          tatatatgag tagaatcttg tagtgactcc tcagaggaag cctaaatacc atcggggtct     1200
          ggcgttcaca cccacaagca atgcccaaac ctccaagaga ctgggcagat ctgtgctcaa     1260
          atcaaaactc attgttgggg gtgatagagt tgacttcaca ggccctgaaa gtcttggctc     1320
          cttgcactag gagtgctctg ggtacgggta caggctgccc cttgtagggc atagttgctc     1380
          ttgtttcctc tacttgtggc tttatggtct aggcctttca ggagtttggg gctctggcgg     1440
          agagggcctg ctgggagcac atctggccac cctgcagagt gaaatcaaac caggcctggc     1500
          tgcaacctca acaccctcct ggaaagagga gaatactggg gatatcctgg ggtctttctg     1560
          gaagtgggag aatcagcttt gacttgggca gtgtgcagaa tagagtgagg ggggatgtca     1620
          gaaagatgag agggatatga ggcctcaaca tcaaaatgca agcacctggc atttttatta     1680
          tctctgccca cctctccgtt ggtctctctg cctttcctgc caatgaattg tgttatgttt     1740
          gggtgcctca atttgcctag gagggttcta tttcttctgt atcttcgcca ctaagtcagg     1800
          agaagatcct tatagcatgc cctgcaacag tgtcacctgt aagggcatct ctctgcacag     1860
          ccacagtgaa ggatcctcaa aggtattgag ggctttccat caagagccat ctttacagca     1920
          aacctctttc ccttcagagc ccagaagagt gctgaccagc tggaaaacag ggtttttttc     1980
          ttaaatgcag atgctcttga ttatgagttc cagatattag atcaacttcc ccaccatacc     2040
          cctgcaggca aagcctctta attagcttcc tgcagcacag ctggaaaggc ctattgtaat     2100
          ctgtgatggg cagagtaatc taagaagtca caggagcacc cctgtcccag tagaatctgg     2160
          atgcgcaggc acatgaacca tggcaaaatg gttgcaggca cagttgtatt tactctgatc     2220
          taactgtccc tgttaatgcc acagggctgc ctggcctggc acacagggct gtggcgcctt     2280
          gtgcaaatgg ataacgttgt tctagctcca gcctttcatt caaagtgaaa actgttagaa     2340
          agggaaggaa aactttgcta ttttaaggaa ttgtagcgtg ctgcctgata tgaaggaaga     2400
          aataacagct gtgccttgct tgtgcgcagc actcgattgc cgcttttgct ttcgacctca     2460
          ccacaacaca gtgagatcta ctgttcatgt tcccatttta caggaggtga aactgcagct     2520
          tagtgaggta gagagtgact tagttcagac acagaatgct gttgggagag taataactat     2580
          gatatggtct cttgactccc agctatatct gtgttgctat agggaagggg aaaaataata     2640
          ctgaaagaga agtaaaaata caatcacact tccaaacatc aaccaccaaa aactgaactg     2700
          aatttcctga agcacttggt tttcaaatct aagctgaaca tcaatgctgt tattcttgag     2760
          gcccagaagc aacttgctca tttcaattaa gcttcagcat gaacttccta tgtacacagc     2820
          ccacccacac tccccgatgt gagaaggaga gggtcacagc cgcccccagc ctctgctgct     2880
          gccacaagga cagcagcagt ggaaacattc agcaaaggaa tgttggagcc acatccacaa     2940
          gagactcact gaagattcgc caaacgccta cggaaagtgg cagggaattc attgacagta     3000
          attgtttcct gcttgatcag attgaagagc ttctgggatt ctgtaacaat aaataggacc     3060
          gggggctgga gtatggccag caaggactct tcaggggtta ttcagggact gtctaacctg     3120
          tgaatcctag gcagcaaaca gaaaccaggt attcagaaat ctggaggatt tggtcaggcc     3180
          cagctaggac tagggaggca tgggcctctg ctggctgtgg tcccttctcc agccttcact     3240
          tctcttgtcc ctagatcctt acatggattc attaatgctc attgtccctc ctgggcccac     3300
          tcactttcac ctgttgaaca aaaaactggc caagaggtga cagtcatatc accgcagaag     3360
          agacagggca gagaaatgaa ggggcagaat ggactcccac ccaaaagcct gactctgaat     3420
          atttgagaat tgttcaagtt cctgcagagg aatcatgatg gggacagtag gtgtagtttt     3480
          tactgcaata ttggtgtctt cttaacaaat acgctgcaca tcaagtgatg tctgtggatg     3540
          gcattcttaa agtaacaggg aaattgatgt taaagaaata cttcatcctt tgggtgatac     3600
          ctgaagttct ctgagcttgg aggtcttgtg aaagccctca gtattgtttg ttttatttgc     3660
          tttcctctga cttgtgattc agtcagatgc atgcctgcct ctggctcagg aagatcaacc     3720
          ctctcctgac tgaccacgcc tctcctgact gaccacgtag cacagcagct tcctttccct     3780
          aggggctcct aatgaagctt tcacaatcac ctggcctgag cacagtttgg gtcaggactt     3840
          ggtatacttg aaaaaaacat gcaaaaccaa aatcctgtgg ttctggaaaa ggcttcttag     3900
          cagaaccccc agacatttac actctgcttt ttcacagggt ccctgaggat tctttggatc     3960
          tgggtagttt ggggagcagt attttcaaca agttcatttc gtgctccttc tacaccctgc     4020
          ctggatgcta ggccccatct agaatgtgaa caacagaaca aggcagaaca cttgtcctca     4080
          aggttctgtt gagtgttaga tgcagagaag agacaccccc cacctccccg catcacttac     4140
          aggaattctg tttggaaccc aacatcaaat aaggaccgta tccactgtca gaggatggga     4200
          agcagcatgt catctgggac attggagaaa ggctcctggg ggaagtggga cttgagctgt     4260
          gatctaagta atgaacaact gagagttaaa tgggagagca tcccctatca gggtcctgag     4320
          agcaaccagc catggtttaa accagctata aagcctcggg tttataggat agacagtaac     4380
          aatggcttgt ctttgggagc caagcagctg gtccaggcat gcagagcatg tctgtatgga     4440
          gagctgcctg agagatgctt ttgtttacac ttatcaattg cccatgtcaa agaaggatat     4500
          gtacatgaag ttacatcagt atgtaagaga gattttaaca atttttgcag gggaagcttt     4560
          catgggggct gatgggaatc taggtaaaca gaaccaaagt ctaaacccaa gatatcccca     4620
          gtaccaagac tgaaatgact ctctcctcta tctctagaaa gttccagtga cccaaggagg     4680
          caaacacgat gggagtcatt aaagtggggt ggacgtgctg atcatcttcc taattctgct     4740
          gcttttgttt tcagccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag     4800
          tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacgtgagta     4860
          tctgtaacca gccaggagac caagctgtat gcacgctggc tgcagttccc cagggcctgg     4920
          gccagccttc tagaaggtca ggttgcctaa aaagccatga agatgcatgt gcgaacatgt     4980
          ctgggacctg cgtgctaggg agtggcattt ttaggaagct ggccaatttt gttttgcatt     5040
          tttaaggctg ctgacaagac ttggagacat ttttcagggc tggtttgggt ttgcaagaaa     5100
          catgaaacac tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttctc aatcctcata aaataataca     5160
          gatatgcagt ggagaagcca ccagcatgtg actctggaaa agaaagccca ttggtgaatc     5220
          tgtactaaag aatgccatcc ctatcttaca gtcctaaggt aaacacccca aaaagactta     5280
          gagcactaaa catatgcaga ttatgagaca gcatagcata taatatttgc acagacttcc     5340
          tcattcaaac cctagctcta cctgggccag tcgattcatc tttagaaccc tccattgctt     5400
          tacctgaaaa gttcgtataa caaaaggacc caccttatgg ggttgttaca aggattgaat     5460
          gaaataatgt acataagaga ctgaatatgg tgcccagcat atatcagtgc tcaataaatg     5520
          ctagctacta ttattattat caccctagat ttgcaaatct agaccacaca agcagaagta     5580
          agagtgccaa cggggtgtgg accagtgtgg ttacaatagg gcttgttgat gtctgtttca     5640
          gcaaggaggg aggcagcttt taccccactg cccagctccc tggtggaatc aggtgcatgt     5700
          tctaacaatt ctggggaaac ctaatctgtt ttggcactgt caacagatct caaagctggc     5760
          tgtctcctat agctaggaag atgtgtatga caaatctcct gagccacttg tgaaggcctg     5820
          accttcctcc tgtctccata cataatggga tgattaagaa actctaagcc actctcttaa     5880
          gcacttttca atgttaggga tttttaagtt tattgttgtg acattgcttt tgagcagaca     5940
          tctcctccaa tttaatagcc aactgaaaga agagaaaatg ctctttcctt aaactgtatg     6000
          tggaaataaa tattccaatg tgtgaccctg attatgttag gcaattagca atcctaatat     6060
          gaattgaggg aagttgggat tcatggcaca gctggggaga taccagcagt ccctgggagc     6120
          ctgtccaggg caggtccatg gcagcttgct ccatgcctga ttgacagccc agcctgcaag     6180
          ctaaaagttg agtgagctag gaggacacac tgccaagatt cagctaacag acacccagcg     6240
          atattcttgc tgctatgaac aaaaggagac tatgcaaatt atacaccacc cattcttcca     6300
          ggatgcctga cttaaaaaat aagaaaaaag atgggccggg cacagtggct cacgcctgta     6360
          atcccaacac tttgggaggc cgaggtgggc ggatcacaag gtcaggagac agagaccatc     6420
          ctggctaaca tggtgaaacc ccgtctctac taaaaaaata caaaaatatt agcgggcgtg     6480
          gtggcgggca cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcgtgaacc     6540
          tgggaggcgg agcttgcagt gagccaagat cgtgccactg cagtccagcc tgggtgacag     6600
          agtgagacac cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaaa gaaaaccttt agtactgatt     6660
          gattttttcc catgtgtgta tattatctac tcaaattaac aattaattac ttaattaaac     6720
          acaaagccag gcctcaccta attgcttctt ggaaggtgac cagagtgcta gtgccaagca     6780
          aacaactctt ctatatctca agagccctgg gcttcagagg gccatctttt ttgttaattc     6840
          aagtttctct gaaaatggag acccgtttat gatgacaagc tggctacagg gtagcatctg     6900
          ccacactgtt tcgggggtgc cgctgggctg aagcatttgc ccagctagtt aacaatagct     6960
          cgataacatt ccctatcagt gtccaggctg agaatactgt cagtgatgag tcgccttggc     7020
          tcttgtacct gtatctttgt gtgccaggac aaggcacaag caacagagct gtgtgttgcc     7080
          aaaatgttcc tgatgagcag gtcaacccct cgggggcagg tttggatatg ataatgtggt     7140
          gatgtggtgg cgcagctccc ttacccagtg agcacaaggg gagtcctcta ggaaaaggaa     7200
          gaaatgtctg gatgaggtgg ggagatgggg ttcagagtgg actcaggcaa agcccgatgc     7260
          ccagtcccag ctgttggcct agtctcacaa agccagaagg atatgacatt tacattcaac     7320
          tcttgaattt gtggccactg ctttgggcaa cttcaaagag agaaaatgaa gatagaaaaa     7380
          tattatttga tataaaactt ctaggacaag agaggccctt cctggaacat tacatgtagt     7440
          attaggaagg tggagctgcc ctggaaaaga tccagagaac tcagagagag gaagaggtgg     7500
          aacccatctc tgttcttgta gagagctcag taagagtggc ttggcagggc tcctgtgtac     7560
          ctgagaccaa gaccagtgag gaggctactg tctgaccacc atacggtcag aattcagtgc     7620
          catgggtggt caggtgggaa ggggagagga ctgtgctggc tggagttgat gttatcctgg     7680
          ggaaagtagg tccctagatg cctttagttg agtgaggagc agactgggaa atgggagcac     7740
          agtagtggtt ggggcaaaaa ggactgtctc tgcatgaggt ccataggcag ttggaatttt     7800
          ctcagcaaga ctccagagaa ggaggctgga gcagaggtgt atgttgggat gaaaaggagt     7860
          aaagtatcat gggggaggag gcagctcagg ttgtcaaggg tcaagaaacc agaaggagaa     7920
          tttcaccttg gaagcagaca acgggtacca agcatacagg ggaatacttt gtggtgagag     7980
          gtcacacaga gatacaggag ccgacctggt gagacaggag cctggagcca cctgcctgct     8040
          tttgtgaggc cccagactcc actgctatca tcaggtgaag ctctgttgcc tgcacacaaa     8100
          agcttttctg catttacaaa gagagaaggg cctgagtttc tggtgcaatg cgtcaagctg     8160
          acatatggac tttattacag gaagtggtta ccagtgggtc cctatttagt ggctgttatt     8220
          gtgaatttta ttgttcggaa attcacttta gcatttattt cagatcctaa atagcaccgg     8280
          agtgatacaa tggctaatca aacaaagagg gctgtgggga gcagacagtc agcatccccc     8340
          tctgtgattt caggccctgg tttgattagt agccataaaa ttttttacgt gtggcacttt     8400
          gagcaaaggt gcaggaaatt gtggtcagga agcctggctg cctctcgaca ggcttccttt     8460
          gtgctagccc cagggagagg aggcctattt aacagccaag tccaagttga catcatggga     8520
          ctggaatagt catagcagga gctcagacat cataaacgtg gcatagggag ggctggtgga     8580
          ggagctagcg ggtatgggtg gcagctattc attccaaaag tcttgaaatt gtttcacgag     8640
          caacacattt cacaagtgcg aagcccttct ctggagccaa gatgagctgg cagagcactc     8700
          ctgtttctct agtagcaagt gttcctttgc ccaggggcaa aaatattaat actccttcag     8760
          cactgcatta atgcttaaag atttaacttt taaagagatc agctggtgca tggtcgagct     8820
          tttccatcag ctggcagggc tttttcagta ggtgtccttc tgggcagggc actggggaca     8880
          gctgacgtga aggtgaagaa gagctgtcgt tttcctccct tatatcccac aaccttggtc     8940
          ccaagaggaa aaaaaagaag atggtgagaa gtcatccaag cagaccccag acccatacta     9000
          gtgcctcctt tcctgtttca tatccctgtg cagccagctg ggatctcttg aataatctgc     9060
          tctgggggca ctgagattgg acatacacca aacagcggag atcgaccaaa cgcctctgtt     9120
          gggcagtgtt tcctgagggt tctgtcccat tctgtaaact aggaggctga ctagctgaca     9180
          aggaatttta ttctgttggg tatttacatg aacctatgtg ccacctgggg taagaccctg     9240
          tggtaggtag aaacatgact tcccaaaaat gtccacatcc taatctctaa ttctgtaaat     9300
          atattccctt actggaaaaa gagactttgc aggtgtgatt aaattaagga tcataagagg     9360
          gagagattat ccaggattat ttgatgagtc taatataatc atcagggtac ttaaaagagg     9420
          gaggcaggct gtgcctggtg gttcacgcct ttaatcccag cactttggga gactgaggcg     9480
          agcgggtcac gaggacagga gttggagacc agcctgacca acatggtgaa actccccctc     9540
          tagtaaaaaa aaaaatacaa aaattagcca ggcatggtgg tacacacctg taatcccagc     9600
          tactcaggag gctgaggcgg gagaattgct tgaacccagg aggcagaggt tgtggtgagc     9660
          tgagatcgca ccactgccct ccagcctggg caacagagca agactccatc tcaaaaaaaa     9720
          aaaaagaggg aggcagtggg atcagagtca gagaaggcaa cgtgatgatg aaagctgaca     9780
          tttgagtgat gcaaccacaa gccaaggaat gcaggcagct tctcaaagct ggaaaggacg     9840
          agcaatggat tcttccctac agcctctgtg aggaatgcag cctttgattt taaccccata     9900
          aggccgattt ctgactctag cctctggaat tgtaagataa tttgcatgat ctcaagccac     9960
          taaatttgtg gtaatttgtc acagaaagca atgggaagcc aacacaggcc ttatttgttg    10020
          acttatagat gcatttttct ttatttcaat gtacttttat caatggtctc atgtagggta    10080
          ttgctttcaa tgaagatatt aacatagttt caactttaag gtttatatct ggagtttctt    10140
          tagaagcttc acaactgacc acttagtaaa cagtaagcat ctgttaagtg cttctcatat    10200
          gtaagttcat tcaattctca caatcacact ataagataaa tatgattatt agcccattta    10260
          cagatgagga gacaggctca aaagactttt atgcaacctg gtcaaagtca ttcactggta    10320
          agctgaggag gtctgtccac ttccttttgc tgcccccagg gggtatcaag cctggcagtt    10380
          agtgtcagcg acttaggagg tgaacaagtg agcaggcctg taggacctgg ctaaactgcc    10440
          ccaggtctct gtctacagcc tcaaacctgt ggctgtgggt cccagagaca aggcctcctc    10500
          agcatcagag aaggatgcct ttgtctcagg gtcatcaacc ttctccaggt tgctcacccc    10560
          ctgctgtaaa ggggatcccc aagaccgctc atcagacaag gagcttggga actgaggaga    10620
          cacagtcagc ctccaggagt gcccaaaatg ccctcacatg ctgcatacag attgccacaa    10680
          ataaagtaca tccacattct gaagactctg tcctcatcac caaccaggct ggcccctggt    10740
          gagggctgta gtggttgagg cctttgttgg tagacagtag gttaaagcaa gccatgattt    10800
          tctattggga ggcttcagaa tcagctcagc tgtgtttcca agaccaggag ggcagaaagc    10860
          aaaccatccc aggcaagcag tccatgggcc atgtcagatg tctagacgtt atgggtctgt    10920
          gtttgctctg ccattcctct cggaaactat gatgccctgt atggtttacc ttcagtcaca    10980
          ggtgactggc ctacagggcc attccttgtt ccaacgactt ctcgagtata attaatcccc    11040
          aggcatttac ggccagagca gccggccaaa tccgtgaagt gcagtggttg ttttaaatta    11100
          tattaacttc ttggaaactt attttaggga gagaaaactc agtacttctc tctatccaat    11160
          cttgagtaaa aatgttagaa gggactggtg gagagcctcc cagacatccc tacacataga    11220
          ctttgggttg acattatctc tttgcacctt ccttgaaact ttcttctaaa ttaggtgcct    11280
          tccctaattt aggcaccttc ccagtactag tctgtgacct gttaggaacc aggccacaca    11340
          gcaggagttg agtggcaggg agtgagcatt attgcctgag ctccgcctcc tgtcagatca    11400
          gcagtggcat tagattctca tagcagtccg aatactattg tgaactgtgc gtgtaaggga    11460
          tctagcttgt gcattcctta tgagaatcta atgcccgatg gtctgagatg gaagagtttc    11520
          ataccaaaac caccccttcc ccctgccacc atctggggaa atattgtcta ccacgaaact    11580
          gatccctggt gccaaaaagg ttggggaccg ctgtcctaag ggatctgctt tttctgacct    11640
          gaggtttttc tttattagac tgtatctggc tgaggagaag cctgaagcct ttaatcggaa    11700
          cagctttggc tgatgagatt agattcagaa accaacagat tggtcttttc tatgcaggga    11760
          agcctaggaa ctggggggct atggctggga agccccctat tgtttccatc ctttcctatg    11820
          ttcatcctgg aggaatggca tcagacccat gcctctgtga ttgctcccag cccatccaac    11880
          cacagcatct atgttctgcc tgggaccagg gccagggagc atggcacact gagctgagta    11940
          taaggagagt ggagcaggcc actgccagcc cagaaaattt tggtcaaagt tgcctgaaat    12000
          cttctcagcc ttcgattcac agctgctctc tgctgctctg gggccatgca gaccagttca    12060
          gaaaagagtt aatttgttgg ggcagttgga ggcaggtgga ctgccagctt tgacaccttc    12120
          ccagcccaca ggctgctgca ctggggctga aggcgtggct aacccctgca cacctagaga    12180
          gtgacagaga tgccagactg ggcagcagga aggcaagagg attaagagag agcttcctgg    12240
          ctgaaagcca cactcggtta accaggaaaa agcccttggc acgagaagac tcagtggcct    12300
          gagggactga gccttggttg ttgggcatgt gctgcataag ccatccatgt gtgacagtag    12360
          agtgtagtcc agccactgtg ggacatgggt gctgaaagac cacatggaga ggaacagtga    12420
          gtgctgacaa gggctagcct tgatcacttt ggagacaccc cctgtgtctt ctagatgtca    12480
          gactttccaa atctgtctgc tatcctccaa acgtgcattt tcaagagcaa tggaaaaagg    12540
          attggacttg atggaatgca gcaagagtcc taggtctgtt actacctacc tatgacctta    12600
          agaaactcct tcacccctca gaacccttac agctttcttt ctgattctat cctgagttac    12660
          tctactccaa gctgagactt ttctgcttag atctatccct tcctcctaaa cccccaacct    12720
          ccatttctcc tggtgtcttt ctttacacac ccctcagcat acacacacac ctagccacag    12780
          gaaccaatga gttaatattt gaggagttgg ttttcttttg tcctcaatga gatcctggtg    12840
          aggccacttg agctgttcag ctcccttgcg gtattttggg gatggaactc agaagccaac    12900
          aatatagaaa aagagtcttt ggccagcttt cccaggggct ccatgccata gagagtactg    12960
          cacccgtgtg cacagggggc cctgacatga ggactttgag gataacacta ttcctccaac    13020
          tctgcttcag catctccatg gattttcaca cagacacttt aggaaagaaa ctaagtttgg    13080
          ggggacttga cctaatccca catcacagcc ccagtaatac agccctggaa tttatcacag    13140
          aaagcctaga atcccatgca tatcccatgc atatgcatcc ctagtcctat gggttcaagg    13200
          cttggagctc tccctggatt tagctgggaa aagttggcag acagttcttc tctgtcttct    13260
          agaaatatgg actagaatcg tgagtgtgag attgcaagta acttttaaaa tcatctagtt    13320
          taacttcacc ccatttcata gaccaagaaa ctgagaccag agagagaaat ggactttcaa    13380
          gttcaccctg ctagttactg atggatcaca agtcaaatct cctgattcta gcactgtttc    13440
          tcttacacca caccaccttt gaaagtgtgt caatcaaatc ttactttagt tgcagaggat    13500
          gactttagtt tctgaagata aaattgtgag tcaatcaaga tgagtcccaa gacaatagcc    13560
          tgtttagccc ttataagttc agggatgaaa ggttagaaag aaacaggatg gaaggaggac    13620
          tggagaaaaa aacaaaagag gaaggaagga ggaggaagca aacaggaaaa aaaaagaatg    13680
          tgcatagctt gtcactcctc agtcatttcc tgggagccca tttctagcaa agtgacagct    13740
          gcaactccct ggccacctga gcatcttagc tgatctgtct ctgaaacacc ccctggagaa    13800
          cagatgaatc aggcttcatc ttcgcttaac taagtcttcc ctgagacgac tccatttaaa    13860
          tgaacaagag caggatttcc tgggcacact gagagcacct tccagaggcc cctccagagc    13920
          cctaaagcct gtatttcttc cagtcggcct gtttctttcc tggtgatgtc attaaacgcc    13980
          ctttgagagt cccacagtga gcagttctgc ggtaaaaccc gctgcaatta aagtctgagt    14040
          cctttcctgt ctcaaagggc atattcatat agaagaaagg aaaaggaagg actggctgtt    14100
          tgcatttggt tccaggcctg ttgagtagag gtcgtgctca ctccaccgaa ggtacagggt    14160
          agccttcagc agaacctggg gatttggttt taagcaagtc tttcttaggt gtgggctttc    14220
          agaacacttc cttccttgca atattatttg aaattctcag tgttttagcc gtccccagaa    14280
          tattggttcg ttaaagctgt gtatttcaga tctccagaca gtggtcactg tttgtatatt    14340
          ttcaatttca aaccagaaaa caaaagttct tattgattac tttttttatt taaaaaataa    14400
          aaagtaagta tcttcgtaag aggagctttg ttttaatttt aaagtttaaa atttgattgt    14460
          gaagacagag aaaaacttga tgattgtaga tatattcccc tctttggcta ttcaatcaga    14520
          gaactagaaa atcatgagag atttaatgac cactgcctga tacacatatg tgttttacag    14580
          atgaggaaac tgagacccag agagatgatg aaattggctg aggatggccc agctggtcag    14640
          tgaaagactc agagccagag ctggtgcagg gctctttcta ttccttcctg ttccctttca    14700
          ggaacactca ccatcggctt tcctgtgaat aatgttgaga taaaatcctt ggtgcattat    14760
          gttttctagt cacaacattg actaggctgc cagagtcctc tgttctccca gttggttggc    14820
          tgtaggtgtt ggcagccgcc aggagcattc tacagaacag aggaggagtg agactctcct    14880
          tgctcaggaa aggcagacct atgacttagc aaataactcc taagaggaga gtgtttcacc    14940
          caccattcct cttccttggc tgtggaggca acttagtgga gaggggccag atgacctgtg    15000
          aggaacagtg aagccctgcc taacacaatg tatggttgtc ttgttacaga gtcatcagct    15060
          acgagtgctg tcctggatat gaaaaggtcc ctggggagaa gggctgtcca gcaggtgaat    15120
          gaatcctccg ggccttgcct gttggtgtgg gtggaaggga atggtgggag agaggagtac    15180
          ccacataaaa ggcagcagag tgtgaatggg ggcagtggca caaggacatg gcattctccc    15240
          cacgtgccca ctggccccag gctctatgcg aggggctgag gaatggaagc tggaaacagc    15300
          gcatttcctg agctgctcct cctggcctcc ttaccacact ggtggagtag actccaactg    15360
          tggcctgtcc atgcccttcc cagcaggcac aggctcaggc tcaggctctt ggcctctgcc    15420
          tctggctggg agtgattcta aacacatcca gcagggtcag cctgatagcc catcagtttc    15480
          cgatcagctc tgctagagag ccgatgggat gtgggaggag ggggtcactg gtgggctggc    15540
          aaccccaagc catccccatc tccctctgtg tctaaacttg gccctttgga gttcggtagg    15600
          gagaagagcc ataggccagg tgggctcacc cagagtcagc agagagtccc acaaatggtt    15660
          gcactgggcg aaagacagca tggcacctgt gaattttatt agagcttttc ttttagtgct    15720
          acacacaagt gactgtacag gggagttagt attttgtttt aattttgaaa tagagtcatc    15780
          ttttggtatc tgcgggggat tgattctagg acccattcta ggatgccata tcctcagatg    15840
          ttcaagtccc tgatataaag tggtatagta tttgcatgta atctatgcat attcttccat    15900
          gtactttaaa tcatctcaag attacttata ataccaaata taatgtaaat cctatgtaag    15960
          tagttgttat accctctttt aaatttttgt attatctttt attgtatttc aaaaaatatt    16020
          tttggtccat gtttagttga atctgtgggt gaagaaccca cagatacgaa gggccaactg    16080
          tattggctat ttttttagtt aagaatgtga gactgaggcc aggcgcagtg gctcatgcct    16140
          ttgattccag cactttggga ggccaagagg ggacgatcac ctgagccaag aattcgagac    16200
          cagcagcccg tgcaacatag tgagaccttg tctcttaaag attgtgagac tgggctgggc    16260
          acggtggctc acgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggcaggtg gatcaactga    16320
          ggtcaggagt ttgagatcag cctggctaac atagtgaaac tctgtctcta ctaaaaatac    16380
          aaaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctataatcc cagctactca ggaggctgag    16440
          gcaggagaat cgcttgtatc caggaggcgg aggttgcagt gagctgagat agggccgttg    16500
          cactccagcc tgggcaagaa gagcaaaact ccatctcaaa aataaataaa taaataaata    16560
          aataaatcat gagactgaga cataacagga aggagggcaa tttggttggt tccaaggttc    16620
          ctagagtatg tgatgggaga ggttggtgcg ggtggggcca tggaggtact gactcaagtg    16680
          gagggacagg tggggaaatg ggatgggaaa agaagattga ccttagaagg ggagctcaac    16740
          ctctgaaccc taatttcaga cccttcaaaa tgaatattaa gctcattttg gtctaagaaa    16800
          caaaaaacaa atgaacatga aactcatttt ggtcttataa ggtctgagaa accccttcta    16860
          aacttcaagc tgctttaaga aataacattt tattacctgc aaatacacac agtactttgg    16920
          agatttataa tagtctctta ttctaataga agccattagg gaaccagttt caataaacag    16980
          gtaaatctgt aagactagtt tgtaattagg atatctgttt ccagtgtcca ttcctgcctc    17040
          tgttatctaa atgtctggga acaagagctg tgctctgctg tgtttaaaat gattaaaaat    17100
          caccaattag ttgagttcac gtagacaggc atttgactta ttgagttgtt ttaagaagac    17160
          tataacaagc cttaagcccc ccagaaacag cctgtctttg ggctttccca catgcctcct    17220
          cgtcctctcc acctgtagat gtaccgtgct ctctgtcaga gaagggaggg tgtggttggg    17280
          ctggaccccc agaggccatc cctccttctg tcttctgctc ctgcagccct accactctca    17340
          aacctttacg agaccctggg agtcgttgga tccaccacca ctcagctgta cacggaccgc    17400
          acggagaagc tgaggcctga gatggagggg cccggcagct tcaccatctt cgcccctagc    17460
          aacgaggcct gggcctcctt gccagctgtg agatgacctc cgtctgcccg ggggactctt    17520
          atggggaact gccttacttc cccgaggggt gggcatgatg aatgggagtc tgcagtcatt    17580
          tcctactgtt tcaggaagct ttctccttaa ccccttagaa aaggctgtgg aacttgagct    17640
          aaaatatgtc ttaccaggtt gcgtctaatg ccccccgttc cctactgggc agaaagactt    17700
          gggtgcttcc tgaggaggga tccttggcag aagagaggcc tgggctcacg agggctgaga    17760
          acatgtttcc cagagttgca aggacccatc tcttaaacac agagtctgca gcccctaact    17820
          gacaccctgt ccttcctcct aggaagtgct ggactccctg gtcagcaatg tcaacattga    17880
          gctgctcaat gccctccgct accatatggt gggcaggcga gtcctgactg atgagctgaa    17940
          acacggcatg accctcacct ctatgtacca gaattccaac atccagatcc accactatcc    18000
          taatggggta ggggatcccc agccatactg catggccctt ggtgcataat gaacccattt    18060
          ctgttccatg tgtgggctgg tttctggggt ttaagctgta gacaacccac cctctttgtg    18120
          cctgcttctc cttgggccct ctattccaca gcttgtggaa cccacatttt gctactgtgt    18180
          ttgaaaacac tgttttctcc tcccggggct ttgggactat gcctctgttg tgttgactgc    18240
          tcatccttgc tgcttctctg ggcagattgt aactgtgaac tgtgcccggc tgctgaaagc    18300
          cgaccaccat gcaaccaacg gggtggtgca cctcatcgat aaggtcatct ccaccatcac    18360
          caacaacatc cagcagatca ttgagatcga ggacaccttt gagacccttc gggtaaggga    18420
          ctgccctggg tggaggccca ggcttgggac acattgcctc ccaagagggg cctagcagga    18480
          actcttctgc aggagaggta gaggatggct cctgtagggg aacatagagc aggttcccct    18540
          gaatgccctt gaacatggag aattcattga ccagacattc agcttgacct aacctgtgaa    18600
          attctccatc ttctttataa agtgttccct tccttgcctc ccctggaaag gtcagtggtg    18660
          tgtggctgca gcagcacagt gtcctctgag ccctggacct gcactgtggc ttccagaggt    18720
          ggcagttccc acatggggta ctagaataaa tggcctatca ggctgtgtgt gctttgggat    18780
          cacatgtccc caccctagga ccctggttcc aaccatacgc atgttctctt ggagcccaga    18840
          acagcagaga agccaccagt gtggacacag aagtcaaggg tctgatttcc agcctggctt    18900
          ctgactgctc tggggccgca ggaatacggt tccttccccc atgcccagca ggcatttgtc    18960
          ttacaactgg aggggaaggc atgttcctct tggcaaggac tgctcaggag gaagtggagg    19020
          caggctgccc tgtcagggtt tttgccttga ttcaaggaga acttcctaac cacaaaggat    19080
          acaagtggga gtgaggcgga ccctccctag agatctccaa cacagagaga caaacacgct    19140
          ggggctggct ggcactgaca ggcctcgcag gtgtggatgg ctgttagctg ggagcttcgc    19200
          tgtctaagct cctctcccat gcttttcttc tgggttgctc gaaggacggg ggtctgcaag    19260
          aaaatgatgt tcccacatag ttggcagcac gtgaacagca attgatccct ttgcatcacc    19320
          tcctcttact gtttagattt ggtaaatatt tcttccttcc ctcttctgac cctccatttt    19380
          gccgatcttt ccttcttata acacatactt actaggtacc tgctacttcc cgggtgggcc    19440
          tatgtgccag gagtatagag gtgaacaagg aaggcaaagt tctattctca gtagagctaa    19500
          tactctatct ggagagagac aacaaacaaa tcaacaaggt agccaggggc tgtgataatt    19560
          tatgtcaagt gggcaggtaa atcgggagtg acagtagtgc agggaggatt ggaaagtcag    19620
          ggagttctct ctggaggagg tggcttttga tctgcagcct aaaggatgag aatgggtcca    19680
          ttatacaaaa tgctggggca agagcacacc cagtagaggg gagagtaata gcaaaggctc    19740
          agggcaggaa gggcaaggga gaggccagtg ggtgaggtca catgtgaagg gcatacaatg    19800
          ggcaaagaca aggccagagt ggccaggccc aatcctccag gacttgcaga cctgggaaag    19860
          agtgcatctc catcctggga gcagcaggaa accactcagg cctttagaag atccttctgg    19920
          cagctgtgta gagaatgggt ggtgtgatcc ttccatgcat gggctcatgt acgtgattac    19980
          cagtaactgt cgagtgacag tgtgaggagg gctgcaagcc atgagtgtag gcacagcaga    20040
          cagactcacc tttgtctggc ggtgagatgg ggtgggaagt gtgccaagtt gacctcccaa    20100
          agaaatgata ttttagtgga agaatgaata gaatcagaga agcaaagtaa gagggaagag    20160
          cagagaggac agcagggaca aggacttggg ggcaggaaga ggaaaggcag gttaaggaca    20220
          tgaaagatgg ccaggctggc tggagctcag gcccagcaag gccccctggg ggccatggtc    20280
          atgggtgagc ttgggtttgg cttctgtttt cgtcttgggc ttctgtgaaa gcctcgagcc    20340
          cttgcgggga accagtgaag ctgtgtgtgc atcttctgtg gggagtgcca gagtcttcag    20400
          ggagcactcc atcttctctc ctccccacag gctgctgtgg ctgcatcagg gctcaacacg    20460
          atgcttgaag gtaacggcca gtacacgctt ttggccccga ccaatgaggc cttcgagaag    20520
          atccctagtg agactttgaa ccgtatcctg ggcgacccag aagccctgag aggtgagcat    20580
          cctttggctc ctgctgctgc ctcatttgtg cagctagatt gagcccaaga cctgctctgg    20640
          tccaagatga acataccacc tgccatgagg tgaccctcag gatatccact gcagccatgg    20700
          gctggggtca tcctgtcctg ttgcttcagc taaccgtgtc tctagcagcc acactactct    20760
          gagggctgac tacagaatcc agcagctttt gtctgggaga gctggactga agagaggcat    20820
          agctggagac ccatagctgg ccctggccag aaacagggag agtgaaaggc tggaatagcc    20880
          aaggccagag caaggctaat aggtagagca acagcttaca ggtgtggggg tggcagatac    20940
          tggcaccctt gaaatggatt cctcatgccc acgcttcact attcttctct gtggctaggg    21000
          gatttatgga taaaccaaaa ttacagttaa aaaccagcca taggccaggc acagtgactc    21060
          acgcctttaa tatcagcact ttgggaggac aaggtgggcg gatcacctga gatctggaat    21120
          ttgagaccag cctggccaac atggcgaaac cccatctcta ctaaaaatac aaaaattagc    21180
          tgggcatggt ggtgggcacc tgtaatccca gttactcagg ggctgaggca ggagaaccac    21240
          ttgaacccag gaggtggagg ttgcagtgag ccaagcttgc accactgcac tccagcctgg    21300
          gtgacacagc gacactccgt ctcaagaaaa aaaaaaaaaa aaacagttat agtagtcaac    21360
          ttttgactct ccatttcaga tttcgtcatg ccctcctcaa tgagctgcta agttaggcag    21420
          tgcattgatt attgctgcag gagagggaag gaaggagcta acgtgttttc acatgttttc    21480
          cttttggaga tgagaaagga ggactctgcc ttccccctac cctgcccctt tctactccag    21540
          gacctctgaa aggccatgag cacaaagctg ctgcctgagt cccctgaaat gcagggtacg    21600
          ccccaggtct ctgatgtacc ccaccacact tttcctctca aacatattcc aggatcactt    21660
          gatttctttt gaatctattt aaacccaccg tgtcaatgtg ctatataaaa tgtctaatgc    21720
          atttcagaca ccctatacat ctatacattt aaagtgttct ccttctatct gtgcagggat    21780
          gggaaagggc atatttctga aagcacagat gggaagacgg gatttgttcc gtgtccaggt    21840
          gattatggta cctctatgcg cctggccggc actggggaca gaggccatga aaatgaatac    21900
          agcacagcct ttgcctccaa gaaacttaag acctagtaga aatggcaggc tttaaaacag    21960
          gttgttggga tctgatttgg tgagtgcaat gacagagata ctcacagcac aaaatgggga    22020
          atgagggcgg gcattgggac acacatagcc ttaaggggcc caaaggcttt tagaactgta    22080
          ttccctatta aaacatgatt tgcacagagc acattctttg ctttggagac ctcagaactc    22140
          cttactatag gccgggcatg gttataatcc cagcactttg ggaagccaag gcgggcagat    22200
          cacttgaggc tgagagttca agaccagcct ggccaacatg gtaaaacccc gtctctacta    22260
          aaaatacaaa aattagctgg gtgtggtggt ggccacctgt aatcccagct actcaggagg    22320
          ctgaggtagg agaatcactt gaacctggga ggcagaagtt gcaataagcc cagatcatgc    22380
          cactgcactc cagcctgggc aacaaagcta gactctctca aaagaaaaaa acaaaacaaa    22440
          acaaaacaaa acaaaaaaaa ctccttatta taaactgtaa gaaaaaaaag gcccctactt    22500
          cgtccctttt gcaaatctgc cttttcctac tcactaacca gctggttcag agcaaggaca    22560
          ctctgtttgg tgccatcgct gcagactgga aggaagaggt ccttgcccca cacccaacag    22620
          tctcctgctg ttaccggcag gttggcaggc aggcaggcga gaagcagcca gggctggtgg    22680
          tgtgtccagt ttgaagacta gtttccagcc ctggccctgc tcaccctcca agtggccctg    22740
          gcaggttcct ctaccacatc gtggacttca ccttccttct ctaagaagct caatccccaa    22800
          ggcctcattc ccataggcct tctcaccctt tttctttccc tctggctgaa tgtggccagc    22860
          acgggcttcc aaggccatca actcgtctgc agcagcccca tgccttgcag ggcctcagag    22920
          cttcctcctg cctatgacag tgtggttttg gttcccacac ttgggatcag attgaaactc    22980
          gcctccgtgg tgagaatatg ggacatagag cctcggtgac cttggtgagc agcagtccag    23040
          gccacctgct cagcctgggg ttgggggggg ctcctcctcc ttgactggtc cttgcatttg    23100
          cctccatcca gcctgtctgg gctctccgag gcaatggaga ccagcaggag tcacgatggg    23160
          tcaggagccc cctttgggcc tcagccctgc cctgccccct aaagtagcac ttggataagc    23220
          aaataaatta ttatacttac tatttatggg tgtggtgaat gggatggcaa aggccaagtc    23280
          ttactgatca ccaaacctta agatatatcc tggcagctag tagacccttg ggctaaatga    23340
          acagaaaact ggacaaataa agtgtacaca aataactcaa agctgtcatt tgtacacttt    23400
          tcgtcttttc ctactacagt ttacattttt ataaaggtga gtagatttct aaaatcccgt    23460
          ggtaggctct cttgagtttt tcttgtatcc ctgaagttca gctacaaata agctaatcac    23520
          taacatttgt tgagcattta ctctgttgtc aggccccgtg ccgagtgctt taggttcaga    23580
          atttcatgtc atccccacag cagccctagg agatgaatgc aattcttatg tccacttgac    23640
          tgataaggaa gttgaggttc aaagaggcta aatgactctc ccagggtccc acagctggaa    23700
          agtggccaca gggccccagc tggttttcta gggcagcagg cagaaggcga ggaggatctg    23760
          ggccctgtgg tgccccagcc tcatctgagg gtcctcatct gagagaacag gatcctcaca    23820
          gcatgggcag gctgcaagtg gtccctgagg ttatcgtgga gtggaccctg acttgacctg    23880
          agtctgtttg gaccccagac ctgctgaaca accacatctt gaagtcagct atgtgtgctg    23940
          aagccatcgt tgcggggctg tctgtagaga ccctggaggg cacgacactg gaggtgggct    24000
          gcagcgggga catgctcact atcaacggga aggcgatcat ctccaataaa gacatcctag    24060
          ccaccaacgg ggtgatccac tacattgatg agctactcat cccagactca ggtaggccag    24120
          gcctccgggg gccttggccc tgcctggccc accatctctt ctgccatcct ttgtggcggg    24180
          ggaggggaaa ttcagagatc tttgggcgac ttccctgcct ggacccagct cacagcttct    24240
          cggccactgc aaatgtgtgg gttgtgacca gactgatgtg tcttgagctt caggcttgca    24300
          agtgcagtgg agaggcagtg gggagctatt gaaggggtct ggggacagac tcaatcacag    24360
          aggcctttca gaagatctgc ctgctgtgca tgggcaaaga gggccacttg ctgacctcag    24420
          agcatgtgct ttctcagtag tgcccaagct gtcccatggt cactgaccca gttagaatga    24480
          ctgaatggac tttggcttgt gtctcattag gaatcctagc cccattctag tcttccagtg    24540
          agatctgtcc atgagtgaag gaatctcaca ggaaaaaaca aaatgcttct atgggtgtgg    24600
          ttgctggcct tatctacacc acagaagcca tcacacagac tgtctttctt cccattgtta    24660
          gaatgtgccc tgaccaagca gcccacaggg cctgggacag aggctgatct ctgcctaact    24720
          gagctcacct ctcctccctc tcctcctgac tggttagatt ttctaggtga ctgttcccct    24780
          gatgacacaa gcccgctggg ccccagcagt gtttagaggg gttgttgact cacgagatga    24840
          cattcctgct gatgtgtgtc atgccctggg gtggatgaat gataaatgaa aacagcgctt    24900
          ttaacttttg aacccacttt ctccttcctt gtagccaaga cactatttga attggctgca    24960
          gagtctgatg tgtccacagc cattgacctt ttcagacaag ccggcctcgg caatcatctc    25020
          tctggaagtg agcggttgac cctcctggct cccctgaatt ctgtattcaa aggtaacatg    25080
          gggaaggcat ccctgttaga ttgtccctgg aggcagcttc cccacccctg tcacctccac    25140
          aacactctcc gatttacagc accccatggg acattagaac ttccactcag ctcaaccaaa    25200
          agcagatgtg acttcagcag aaacttcaga ggctctgttg tttcattagg cagtgcagag    25260
          aatgcctttg gggagccgtt cctcagaact caagacttga catctgggag gcagccgttc    25320
          ctcagaactc aagacttgac atctgggaga gcagagcatt cccttgcctt tctatttgca    25380
          gggtcacttg ccaatgtata gtcaagaggt cagagtgagg gtacagctga gctgcagccc    25440
          caggaaggca gagaaggggg ccaagttgtg tgcgtgcctg cccttccctc ttagggcaaa    25500
          actccaaaca cccttgatta tctggatctt ctttaattct ccatagaaga taccagatgt    25560
          taaggaatat tggcagcttc acttggtttc tcaatccctg tttccaaact caaggaggga    25620
          tgggcttttt cactgtattt atctctcatc actctcttca ttgcaggagc acatctctct    25680
          ggacctaacc atcacccttt cttgtagatg gaacccctcc aattgatgcc catacaagga    25740
          atttgcttcg gaaccacata attaaagacc agctggcctc taagtatctg taccatggac    25800
          agaccctgga aactctgggc ggcaaaaaac tgagagtttt tgtttatcgt aatgtaagtt    25860
          ctgggtccta aatcatgctc ctgggaagct ccttactgtg ggacttgtat tagtgtaaaa    25920
          aaaaatgtcc tcaataagca ggagtttgca tgagaactgg ttgctgacaa ggaaggaaat    25980
          aatttctgga aaatatagat aacaaaatga gatcctgcag aaggattgga atctcttttt    26040
          ctggaggcct ttgagaataa accacacaat tatccaacct gtattgtgaa ggaataagtc    26100
          cttcttgaat tcaggaatta acacctggga ggagggatgg agttcagact ctttctgagc    26160
          ttatgagaag agaagccccc taaactaaaa tacagccctc cttggtccaa aaggtgcctt    26220
          ctctcttctg ctgtatcttc tttgttttca aacccaacag ttaccctgga aatcaaaaag    26280
          gaagtacaac tcaacatagc tcttgcctgg gaccaaccag caccatttgg ctaaagatgg    26340
          ttatcatctg ttaaacaaag aaataaataa atgggttcaa cgtatttatt tcaacattgt    26400
          caatggacct catgtgtaac tgatattctc attatgggac ctctgtgtga ctttattggg    26460
          gcctctctaa ccgttctttc cttaaggaag accatttatt gttttatttc ctggagaaaa    26520
          tacatcattt tatcccagcc ttaataaccc atcccagtgt atactccttc atcttcatgg    26580
          ataatgaccc tgctacatgc tctgaacaaa tcaggaggcc cctcgtggaa gtataaccag    26640
          tcctttcttt ctctgtccct cttctgtgca gagcctctgc attgagaaca gctgcatcgc    26700
          ggcccacgac aagaggggga ggtacgggac cctgttcacg atggaccggg tgctgacccc    26760
          cccaatgggg actgtcatgg atgtcctgaa gggagacaat cgctttaggt aattagttcc    26820
          atccccgggt ggagcttctg cccagtggtc atgctggagt gggatgtggg gccccagcta    26880
          tttgtcaagc tttcttctac cttggggatt caattaacac tagcagtgca ctgctgcgac    26940
          cttccagact tgggatgggg aaaaggcaag ggtcgccttg aaagcttaca ttgggaagaa    27000
          gggttacttc taagagtgta atcttcacat gcatgggaag cagggagggg ggactacatt    27060
          tttatgactg aagtgcaagg aaaacatcac cctctcattg taaagctcca agtgagccaa    27120
          gagcacatag tttacagtgc acgatgagcc tctcactctc tgcgcagtat ctgtttattg    27180
          caactgaagc acccttgtga gtttgttttc ttgcccggct atctccattt ctgacttgct    27240
          cattcacctt ggggtgctgt catattgaat gtttccctgt cactgacttc agccacctgc    27300
          acaagggctt ggagaccaca cccctctgcc ctcccagaat catatccctg gaggctcagc    27360
          tagtctctgg gtcagccata cctctgccct ttcttttccc tcctttctcc tgtggcctct    27420
          gacgtctggc catttaacag agcttagcat ttttgctggg tggagagagc tggagcctgg    27480
          aatcactccc tctttgtgca tacggagggc atgaaaacca aggtgtgtgc attccagtgg    27540
          cctggactct actatcctca gtggtgaggt atttaaggaa aatacctctc agcgtggtga    27600
          ggtatttaag gaaaatacct gttgacaggt gacattttct gtgtgtgtat ctacagcatg    27660
          ctggtagctg ccatccagtc tgcaggactg acggagaccc tcaaccggga aggagtctac    27720
          acagtctttg ctcccacaaa tgaagccttc cgagccctgc caccaagaga acggagcaga    27780
          ctcttgggta aagaccaact taagtacacg tctccatttt tctaaagtag tgatccctca    27840
          gggccccagc agcaaacagt tggcacatca aggattgact tgaagggatt ttatgacaag    27900
          actattagtg aaagagtggg cgggactaaa ggaactagca aaggatgagg ccaaccaggg    27960
          actagcaacc ctgggaagcc tttactaccc ctaggcctgg gggaatggga ggatgagagc    28020
          aggaaccagg gaggtcatga gccttggaca agggcacaga acagcagcca gagccatgtg    28080
          cagccagcca ctgtcagaac catgcaaggg ggaccactca gcgccccagc ctccctctca    28140
          gacagttgcc atctgggtct cttgttggct gatgcgagag caggagggag cccactgatg    28200
          cagttcatag agctcagcct cctgggcagg aaaccgggca gagaggagta gaaaagaatt    28260
          aagggtggct gcgaccagcc cagtcactga ggcacgtttc ccactggaga cctatgagca    28320
          cagtgataat aaagccagtt acctgcactg actatccctc cagacaaaag ctttcccaag    28380
          aagttagtca tggctctgag agatctagtt gaggatgttt ggcaggggat ctagtggtta    28440
          cgggtggcta agaaaaatga ggaaggtaag agtatcttgc agcctgtgtt gggaggatta    28500
          aataggatgc cacacacagg gccaggcaga cagcctggtc agtaatagcc atgacgatgg    28560
          gggcgggggg agcaggaatg ggagttgcag tgtttagctc agatgcatgc ctgtgagaga    28620
          tgcttccact ctcacagaaa gatgagacca aggaaaagga ggaggaagag gaaggacctt    28680
          gacaaacctt ggggcccaca ttgtctacac ctcccttcct gctctagagc agaatagaaa    28740
          gttcaggttg caggcagctc taagttgaat tcgtgtcctg tttaattttc tttattgcta    28800
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          ctgaacataa acttttcatc ctctctctgt ccagcaagaa tggaatattc cccaagtggc    28920
          ctgagccagc ttggctttct ttttgttttc aattatgtgg gagttgagga gggggatggg    28980
          aaaagcttcc caaacacacc ctcccccagg cctgaggcac ccctggggga cagagagtgt    29040
          tagaggttgg tacaggtgtt agagatattg aaaggacatc ccatgcaccc caggggctgg    29100
          tgtggctctg tacttccagg caatattttg tggaagggga accttgtcag ctccaggttg    29160
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          cagtctaaca caggacttgg catatgaaaa gtgttcagta ggccgggtgc agtggctcat    31440
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          gaacccagga ggcggaggtt gcagtgagtc gagatcatgc cactgcactc cagcctgggc    31680
          gacaagattg aaactccatc tcaaaaacaa agaacaagga aaaaaacgaa aactgttcag    31740
          taaacacttg ctgaatgaat aaaataaata tataaatgta taaataaatg ctctactttc    31800
          aaccactact ctgtttttct tttagaaaaa caatgtggtg agtgtcaaca aggagcctgt    31860
          tgccgagcct gacatcatgg ccacaaatgg cgtggtccat gtcatcacca atgttctgca    31920
          gcctccaggt aagtgtcgca tccccactga ctctgcagcc agtccttttc ttcatgtggc    31980
          agttggtgga gagaagaaaa actgttctaa acaatgatga gaataacatg taattgtgat    32040
          agttaaactg tgcctatgtg actgattgca gagtgaattg ggagctgttg gttttgaatg    32100
          caccacacta aggaatgtga ggacacattg ctctttgcgg agttgcccag ctatattagc    32160
          tcccctcgga cacagcccag ttttctgtat tcgcgtggat gctgtccgcg cgattcccag    32220
          cactcctctt acagcatctc acctcagtgt atgttccttg cctccagtgc agttgaacct    32280
          cagtcctgcc tctcctcatg tgtgcattca cctttcttgg tgctctctcc ccatgggcca    32340
          agttctacca tgagttatga aacattatgg agaaaacatg tctttggaaa tgtgagccag    32400
          aaagcccacc agtgcccctc agtcacggtt gttatgaatg acatgctaat ggtttcactc    32460
          tggtcaaacc tgccttttct ttcctcttca gccaacagac ctcaggaaag aggggatgaa    32520
          cttgcagact ctgcgcttga gatcttcaaa caagcatcag cgttttccag ggtaagatgc    32580
          ctgctaggtt tgcgcctagc ctgagcagcc tcaggtcctc tgtttgggcc atagaggagc    32640
          ctctccagcc cctgtcttcc ttggctgctc cccagggctc tcttaaaact tctccccact    32700
          cccactgagg catcctcagc cccagcctgt gtcaaattca gagtaaagaa ccaaggcaac    32760
          tccctggctt tcatgggcca aagcgcaggc tttcacaccg aggcctctga gcctcagatc    32820
          atggggaagt cactgctgga gagaacagac atagctctgg aagccatctg cccaagaggg    32880
          cagcccatcc caagttcatc ttacagtggc caggcctgcc ctgagccggg gcctctgggt    32940
          cactcttctg ctgtccatgg cattgcccat cctgggtgag gctggggctc tcctgggcac    33000
          tgtatgtatt ctggatacag ggatactggg ctcgctatgt gtgtggagcc atcccttcct    33060
          tgccccagcc ccacctccct ctcaaaccct ctctggctct ttctgagctt cctttcctgc    33120
          tccccagctt gcccagtgct cagtgcccca cttggctctt ttgctacttc gggtcaggtg    33180
          gagcctcttg ggaatgtgaa gtgccttaca gaaagattgc acttcaagag gagaggctgc    33240
          agggagccat cctaaaccca gaggcctgga gcttactgtg tcactttact tttgtacaca    33300
          ggggtctcct tagtgccctc gagaaggatt cttggccctg agcttctact cctgaggcca    33360
          cctctgtgca gccccagctc cctcaactct aggctgtagt ctcagtggga aagcctggct    33420
          tgggggtctc ctaggaatgt ccacctgaag gcacacttga taggggcttg cacaacttat    33480
          gtctgccaag gccacctgag gaactccctg gtgcctataa gttccacctt ccccttcctc    33540
          ttcctcgccc cagcattttt tctgagtagg ggtggcaatg ggcaaagcca ttgtcataag    33600
          cagttgcagg tataactttc actagaaaac ctgacacctt gtgttttctt tcaggcttcc    33660
          cagaggtctg tgcgactagg tgagtctggt ctgggtttga agtcattgca gacctgttta    33720
          ggccttaccc ccaagcaagc ccaagcctgc catctgctgt atatagataa gaacatcatg    33780
          gtgcagtaaa agaagcctgg cctttggagt cagaacagca gggtgacttg gggtcagacc    33840
          cagagcaccc catttccttc tctgtaagat gaggataata agagtaacaa ccttttaggg    33900
          ttaaggtgag ttttcagctt aggaagtctg ggaatattgc aaagggcttg gcaggaaccc    33960
          atggtgagga tctagttcca agttgatagg tacagaaaac cagaacatcg ggccttgagt    34020
          aaagagtgaa gtttcacaaa ccacaaagca cctgctatgt gcaggagagc atggcagaag    34080
          gaggctgctt ggccctggtc cttgagattc tgacagtgtc ctagacagac atggggagat    34140
          ctgcacctat ttgacgttac caacttctct ttttcagccc ctgtctatca aaagttatta    34200
          gagaggatga agcattagct tgaagcacta caggaggaat gcaccacggc agctctccgc    34260
          caatttctct cagatttcca cagagactgt ttgaatgttt tcaaaaccaa gtatcacact    34320
          ttaatgtaca tgggccgcac cataatgaga tgtgagcctt gtgcatgtgg gggaggaggg    34380
          agagagatgt actttttaaa tcatgttccc cctaaacatg gctgttaacc cactgcatgc    34440
          agaaacttgg atgtcactgc ctgacattca cttccagaga ggacctatcc caaatgtgga    34500
          attgactgcc tatgccaagt ccctggaaaa ggagcttcag tattgtgggg ctcataaaac    34560
          atgaatcaag caatccagcc tcatgggaag tcctggcaca gtttttgtaa agcccttgca    34620
          cagctggaga aatggcatca ttataagcta tgagttgaaa tgttctgtca aatgtgtctc    34680
          acatctacac gtggcttgga ggcttttatg gggccctgtc caggtagaaa agaaatggta    34740
          tgtagagctt agatttccct attgtgacag agccatggtg tgtttgtaat aataaaacca    34800
          aagaaacata                                                           34810
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  683]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基因蛋白質產物]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 
              50                  55                  60                  
          Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 
                          85                  90                  95      
          Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 
                      100                 105                 110         
          Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 
              130                 135                 140                 
          Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 
                          165                 170                 175     
          Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 
                      180                 185                 190         
          Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 
              210                 215                 220                 
          Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 
              290                 295                 300                 
          Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 
                          325                 330                 335     
          Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 
                      340                 345                 350         
          Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 
                          405                 410                 415     
          Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 
                      420                 425                 430         
          Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 
                  435                 440                 445             
          Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 
              450                 455                 460                 
          Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 
                          485                 490                 495     
          Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 
                      500                 505                 510         
          Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr 
                  515                 520                 525             
          Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 
              530                 535                 540                 
          Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly 
          545                 550                 555                 560 
          Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 
                          565                 570                 575     
          Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 
                      580                 585                 590         
          Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val 
                  595                 600                 605             
          Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 
              610                 615                 620                 
          Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 
                          645                 650                 655     
          Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 
                      660                 665                 670         
          Val Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His 
                  675                 680
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039

Claims (10)

  1. 一種用於偵測人類個體之角膜營養不良的反應混合物，該反應混合物包含： (A)至少第一對擴增引子，其用於擴增及測定來自該個體之生物檢體的第一TGFβI基因序列；及 (B)至少三個偵測探針之第一組偵測探針，其含有： 第一偵測探針，其包含SEQ ID NO:45或47之序列； 第二偵測探針，其包含SEQ ID NO:46之序列；及 第三偵測探針，其包含SEQ ID NO:50之序列。
  2. 如請求項1之反應混合物，其進一步包含第二組偵測探針，其含有： 第四偵測探針，其包含SEQ ID NO:25之序列，及 一或二個選自由以下組成之群之偵測探針： 第五偵測探針，其包含SEQ ID NO:26之序列； 第六偵測探針，其包含SEQ ID NO:48之序列；及 第七偵測探針，其包含SEQ ID NO:49之序列；及 至少第二對擴增引子，其用於擴增及測定來自該個體之生物檢體的第二TGFβI基因序列。
  3. 如請求項1之反應混合物，其中： 該第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，該第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且該第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。
  4. 如請求項1之反應混合物，其中： 該第一TGFβI基因序列包含來自該個體之該生物檢體的編碼胺基酸殘基555的核苷酸。
  5. 如請求項2之反應混合物，其中： 該第一TGFβI基因序列包含來自該個體之該生物檢體的編碼胺基酸殘基555的核苷酸，且 該第二TGFβI基因序列包含來自該個體之該生物檢體的編碼胺基酸殘基124的核苷酸。
  6. 如請求項5之反應混合物，其中： 該第一對擴增引子包含第一擴增引子及第二擴增引子，該第一擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:43，且該第二擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:44；且 該第二對擴增引子包含第三擴增引子及第四擴增引子，該第三擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，且該第四擴增引子包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。
  7. 一種用於偵測角膜營養不良的方法，其包含： (A)使用反應混合物擴增來自人類個體之生物檢體的第一TGFβI基因序列，該反應混合物包含： 至少第一對擴增引子，其用於擴增TGFβI基因序列；及 一組至少三個偵測探針，其含有： 第一偵測探針，其包含SEQ ID NO:45或47之序列； 第二偵測探針，其包含SEQ ID NO:46之序列；及 第三偵測探針，其包含SEQ ID NO:50之序列； (B)使該一組至少三個偵測探針中的一個偵測探針與該第一TGFβI基因序列雜交；及 (C)依據以下(i)及(ii)來偵測該第一TGFβI基因序列中之突變： (i)在步驟(B)中用於雜交之該一組至少三個偵測探針中的一個偵測探針與第一TGFβI基因序列之雜交；及 (ii)該一組至少三個偵測探針中的其他二個偵測探針與第一TGFβI基因序列之雜交失敗。
  8. 如請求項7之方法，其中該反應混合物包含如請求項1至6中任一項之反應混合物。
  9. 一種偵測來自人類個體之檢體中與角膜營養不良有關之基因組突變的方法，該方法包含： (A)使用黏著於基材頂端之人類個體之上皮細胞； (B)在裂解溶液中攪拌該基材之該頂端，該裂解溶液溶解黏著於該基材之細胞； (C)在該攪拌(B)完成後，自該裂溶液中移除該基材； (D)在該移除(C)後，培育該裂解溶液； (E)自該裂解溶液分離基因組DNA，形成gDNA溶液；及 (F)使用用於擴增TGFβI基因之至少第一對引子、第一組至少三個偵測探針及該gDNA溶液，藉由同時暴露該gDNA溶液於該第一組至少三個偵測探針來測定TGFβI基因中所存在之至少一個核苷酸的特性，該第一組至少三個偵測探針含有： 第一偵測探針，其包含SEQ ID NO:45或47之序列； 第二偵測探針，其包含SEQ ID NO:46之序列；及 第三偵測探針，其包含SEQ ID NO:50之序列； 其中： 該至少一個核苷酸位於該TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之單核苷酸多形現象(SNP)之特定位置。
  10. 如請求項9之方法，其進一步包含： (G)使用至少第二對引子、第二組偵測探針及該gDNA溶液，藉由同時暴露該gDNA溶液於該二組偵測探針來測定該TGFβI基因中所存在之至少一個第二核苷酸的特性，該第二組偵測探針含有： 第四偵測探針，其包含SEQ ID NO:25之序列，及 一或二個選自由以下組成之群之偵測探針： 第五偵測探針，其包含SEQ ID NO:26之序列； 第六偵測探針，其包含SEQ ID NO:48之序列；及 第七偵測探針，其包含SEQ ID NO:49之序列； 其中： 該至少一個第二核苷酸位於TGFβI基因中對應於與角膜營養不良有關之第二單核苷酸多形現象(SNP)之第二特定位置，其獨立於該至少一個核苷酸之位置。
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