JP2017501685A - 眼疾患に関連したアレルのマルチプレックス検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
疾患関連SNPの検出は、様々な医学的状態の診断及び予後のためにますます重要なツールとなっている。例えば、TGFβI遺伝子のエクソン4における単一ヌクレオチドの変化の存在が、アベリノ角膜ジストロフィーと強く関連している。このSNPのヘテロ接合の個体が、レーシック手術後の視力喪失のリスクが高いことが見出された。レーシックは多くの人々のクオリティオブライフを大きく向上させる医療処置であるが、G/A TGFβI SNPを保有する個体については、失明につながる可能性がある、4〜18月の期間にわたる段階的な視力障害の原因となる。視力障害は、より長い又はより短い期間で発生する可能性がある。幸いなことに、スクリーニングにより、レーシック処置を避けるべきである変異を有する個体を同定することができる。
本明細書中で使用される用語「発明」又は「本発明」は、本発明の特定の実施態様のいずれかに限定することを意図せず、特許請求の範囲及び明細書に記載したように、本発明の任意の及び全ての実施態様に一般に適用される。
いくつかの実施態様において、本開示は、リアルタイムPCRの一塩基多型検出アッセイで使用されるゲノムサンプルの改良された単離方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された方法100は、図1で説明されている工程の組み合わせを使用する。
様々な溶解液が記載されておりそして当業者に公知である。これらの周知の溶解液のうちのいくつかは、本方法に使用することができ、サンプルから核酸を単離する。典型的な溶解液は、市販されているもの、例えばINVITROGEN(登録商標)、QIAGEN(登録商標)、LIFE TECHNOLOGIES(登録商標)及び他の製造業者によって販売されているもの、並びに実験室の環境で当業者により生成することができるものが含まれる。溶解バッファもまた十分に記載されており、そして溶解バッファは記載された方法、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されたもの、を用いた使用を見出すことができ、これらの文献の両方は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施態様では、例えば、ゲノムDNAを含むがこれに限定されない核酸は、その後の分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。いくつかの実施態様では、核酸は、追加の分析例えばこれには限定されないがリアルタイムPCR分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。少量の核酸の単離に有用な様々な任意の方法が、開示された方法の様々な実施態様によって使用される。これらには、沈殿、ゲル濾過、密度勾配、及び固相結合が含まれるが、これらに限定されない。前記の方法は、例えば、全ての目的のために本明細書に参照として組み込まれる、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されている。
開示された方法は、核酸例えば、ゲノム分析を含む様々な核酸分析のためのゲノムDNA(gDNA)を単離するために使用される。いくつかの実施態様では、前記の分析は、様々な遺伝的変異の検出を含み、この遺伝的変異は、欠失、挿入、トランジション、及びトランスバージョンが含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、変異は一塩基多型(SNP)である。
リアルタイムPCRアッセイの設計のために、いくつかの部分は、多くの場合、アンプリコンと頻繁に呼ばれる、プライマーの2つによって挟まれその後増幅されるDNA断片を含み、プライマーの2つ及び検出プローブの1つ又は複数が使用されるべきである。
リアルタイムPCR法は、増幅のための方法の一部として、様々な工程又はサイクルを含む。これらのサイクルは、二本鎖核酸を変性させる工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムDNA配列の検出プローブをアニーリングする工程、そしてアニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖DNAを合成(すなわち、複製)する工程を含む。この3段階のプロセスは、本明細書ではサイクルと称する。
いくつかの実施態様において、プライマーは、実験室の設定において試験されそして設計される。いくつかの実施態様において、プライマーは、インシリコ方法(in silico methods)に基づいて、コンピュータによって設計される。プライマー配列は、アンプリコン又は増幅される標的核酸配列の配列に基づいている。より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンと比較して、より効率的に複製しそしてより効率的な増幅につながる。
様々な検出プローブが開示された発明と一緒の使用を見出すことができそしてジェノタイピング及び/又は定量化のために用いられる。当業者に一般的に採用される検出プロ―ブは、加水分解プローブ(TaqMan(登録商標)プローブ、5’ヌクレアーゼプローブ、又は二重標識プローブとしても公知である)、ハイブリダイゼーションプローブ、及びスコーピオンプライマー、(プライマーを組み合わせそして検出プローブは1つの分子内にある)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、検出プローブの設計は、プローブが用いられたPCRプライマーと互換性があるように、所望のプローブの標的に基づいて当業者によって決定される(例えば、プライマー及びプローブは、リアルタイムPCRアッセイにおいてお互いの機能を妨害してはならない)。いくつかの実施態様では、プローブは、効果的なシグナルの生成を促進するために、プライマーよりも高いTmを有するように設計される。Tmは、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを使用して計算され、当業者はTmを計算するための様々な方法を容易に理解するであろう;前記の方法には、オンラインツールで使用可能なもの例えば、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.でのワールドワイドウェブで使用可能な計算機が含まれる。いくつかの実施態様では、検出プローブの増加したTmは、プライマーがポリメラーゼによって伸長される前に検出プローブが結合していることを提供する。
いくつかの実施態様において、診断テストは、様々な変異の検出により遺伝的条件の1つ又はそれ以上を決定するために使用される。いくつかの実施態様において、診断テストは、特定の条件が、例えば物理的な症状、徴候及び/又は症状、並びに家族歴情報に基づいて疑われる場合に、診断を確定するために使用される。いくつかの実施態様では、診断テストの結果は、任意の患者に対する適切な治療計画の決定において医学分野の当業者を支援し、そしてより個人化されさらにより効果的な治療計画を可能にする。いくつかの実施態様において、治療計画は、当業者によって決定されるような、様々な薬剤治療、外科的治療、ライフスタイルの変化、又はそれらの組み合わせのいずれかを含む。
いくつかの実施態様では、上記の試薬のいずれか又は全ては、診断キットにパッケージされる。前記キットは、本明細書に記載される、プライマー、プローブ、バッファ、及び/又は他の試薬のいずれか及び/又は全てを任意の組み合わせで含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pの2、3、4、5、及び/又は6個の検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、及びR124Lの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555W及びR555Qの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Cの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Hの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Lの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Wの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Qの検出用の試薬を含む。
以下に記載するようにそして本明細書において提供される開示に従って、DNAを口腔上皮又は毛根又は全血から抽出した。
1 gcttgcccgt cggtcgctag ctcgctcggt gcgcgtcgtc ccgctccatg gcgctcttcg
61 tgcggctgct ggctctcgcc ctggctctgg ccctgggccc cgccgcgacc ctggcgggtc
121 ccgccaagtc gccctaccag ctggtgctgc agcacagcag gctccggggc cgccagcacg
181 ggtaagccga gccgcctggc caggggctgc ggaaggtcag gtagtcgggg ctcggagcgc
241 aagccgctgg gggcattgaa ctgggctggg ggcgcagggg acaaagcccg aactaaaaac
301 cttgcagcat ggagcgctcg gacaccagcc ctgcacgcgg tggaaggaga gagggaggga
361 ggtggaggac catggaggga aagcgggagg ccgccgcttt gtagaaggga gtggggaagt
421 ggaccagaga ctttcgacgc aggccaagag cctgagacgg acagcgcttt cagcttctcc
481 tcccagccac tgcagaaagg gggaaatggc aactctttgg ccataatcac cgtgggaggg
541 tgccaagggc aaagcccacc cagcagtaca cctattccaa cccagccagg cccccggcca
601 gcgactccag acaagaacct gggccacaca cggtggcagc atctaaggtg ccccaggctc
661 ctgtgctcct ggccaggccc tgcactcaga cactgctggc acccgacact gctctctggg
721 tacagcaagg gcaatgtggc acttcttgtc ctgcccgatg aagagcagga gaatgcactg
781 ggccctcaca cacactgttc aaatggggaa actgagtcct gagtggttcc actttcccac
841 agtcctgaag tgtgcactgg agccaggatt ggagtctgtc ttaaagtaat agctgggttt
901 gtaaatgtag gacactatca ttgcaggaat tcctttgaga ccctgaagat gtgttggctt
961 taggagacaa actcaagcag aaggtctggt ctgatagtgg ccctaatact gacccaggca
1021 gaggcaggca acatttctac ctcaaaaacc aggccatacc tgcgtcacaa atacccaggc
1081 tttgctgcag cttccagcct acctggttgc accaacttct ttttcataac taggtaaaac
1141 tatatatgag tagaatcttg tagtgactcc tcagaggaag cctaaatacc atcggggtct
1201 ggcgttcaca cccacaagca atgcccaaac ctccaagaga ctgggcagat ctgtgctcaa
1261 atcaaaactc attgttgggg gtgatagagt tgacttcaca ggccctgaaa gtcttggctc
1321 cttgcactag gagtgctctg ggtacgggta caggctgccc cttgtagggc atagttgctc
1381 ttgtttcctc tacttgtggc tttatggtct aggcctttca ggagtttggg gctctggcgg
1441 agagggcctg ctgggagcac atctggccac cctgcagagt gaaatcaaac caggcctggc
1501 tgcaacctca acaccctcct ggaaagagga gaatactggg gatatcctgg ggtctttctg
1561 gaagtgggag aatcagcttt gacttgggca gtgtgcagaa tagagtgagg ggggatgtca
1621 gaaagatgag agggatatga ggcctcaaca tcaaaatgca agcacctggc atttttatta
1681 tctctgccca cctctccgtt ggtctctctg cctttcctgc caatgaattg tgttatgttt
1741 gggtgcctca atttgcctag gagggttcta tttcttctgt atcttcgcca ctaagtcagg
1801 agaagatcct tatagcatgc cctgcaacag tgtcacctgt aagggcatct ctctgcacag
1861 ccacagtgaa ggatcctcaa aggtattgag ggctttccat caagagccat ctttacagca
1921 aacctctttc ccttcagagc ccagaagagt gctgaccagc tggaaaacag ggtttttttc
1981 ttaaatgcag atgctcttga ttatgagttc cagatattag atcaacttcc ccaccatacc
2041 cctgcaggca aagcctctta attagcttcc tgcagcacag ctggaaaggc ctattgtaat
2101 ctgtgatggg cagagtaatc taagaagtca caggagcacc cctgtcccag tagaatctgg
2161 atgcgcaggc acatgaacca tggcaaaatg gttgcaggca cagttgtatt tactctgatc
2221 taactgtccc tgttaatgcc acagggctgc ctggcctggc acacagggct gtggcgcctt
2281 gtgcaaatgg ataacgttgt tctagctcca gcctttcatt caaagtgaaa actgttagaa
2341 agggaaggaa aactttgcta ttttaaggaa ttgtagcgtg ctgcctgata tgaaggaaga
2401 aataacagct gtgccttgct tgtgcgcagc actcgattgc cgcttttgct ttcgacctca
2461 ccacaacaca gtgagatcta ctgttcatgt tcccatttta caggaggtga aactgcagct
2521 tagtgaggta gagagtgact tagttcagac acagaatgct gttgggagag taataactat
2581 gatatggtct cttgactccc agctatatct gtgttgctat agggaagggg aaaaataata
2641 ctgaaagaga agtaaaaata caatcacact tccaaacatc aaccaccaaa aactgaactg
2701 aatttcctga agcacttggt tttcaaatct aagctgaaca tcaatgctgt tattcttgag
2761 gcccagaagc aacttgctca tttcaattaa gcttcagcat gaacttccta tgtacacagc
2821 ccacccacac tccccgatgt gagaaggaga gggtcacagc cgcccccagc ctctgctgct
2881 gccacaagga cagcagcagt ggaaacattc agcaaaggaa tgttggagcc acatccacaa
2941 gagactcact gaagattcgc caaacgccta cggaaagtgg cagggaattc attgacagta
3001 attgtttcct gcttgatcag attgaagagc ttctgggatt ctgtaacaat aaataggacc
3061 gggggctgga gtatggccag caaggactct tcaggggtta ttcagggact gtctaacctg
3121 tgaatcctag gcagcaaaca gaaaccaggt attcagaaat ctggaggatt tggtcaggcc
3181 cagctaggac tagggaggca tgggcctctg ctggctgtgg tcccttctcc agccttcact
3241 tctcttgtcc ctagatcctt acatggattc attaatgctc attgtccctc ctgggcccac
3301 tcactttcac ctgttgaaca aaaaactggc caagaggtga cagtcatatc accgcagaag
3361 agacagggca gagaaatgaa ggggcagaat ggactcccac ccaaaagcct gactctgaat
3421 atttgagaat tgttcaagtt cctgcagagg aatcatgatg gggacagtag gtgtagtttt
3481 tactgcaata ttggtgtctt cttaacaaat acgctgcaca tcaagtgatg tctgtggatg
3541 gcattcttaa agtaacaggg aaattgatgt taaagaaata cttcatcctt tgggtgatac
3601 ctgaagttct ctgagcttgg aggtcttgtg aaagccctca gtattgtttg ttttatttgc
3661 tttcctctga cttgtgattc agtcagatgc atgcctgcct ctggctcagg aagatcaacc
3721 ctctcctgac tgaccacgcc tctcctgact gaccacgtag cacagcagct tcctttccct
3781 aggggctcct aatgaagctt tcacaatcac ctggcctgag cacagtttgg gtcaggactt
3841 ggtatacttg aaaaaaacat gcaaaaccaa aatcctgtgg ttctggaaaa ggcttcttag
3901 cagaaccccc agacatttac actctgcttt ttcacagggt ccctgaggat tctttggatc
3961 tgggtagttt ggggagcagt attttcaaca agttcatttc gtgctccttc tacaccctgc
4021 ctggatgcta ggccccatct agaatgtgaa caacagaaca aggcagaaca cttgtcctca
4081 aggttctgtt gagtgttaga tgcagagaag agacaccccc cacctccccg catcacttac
4141 aggaattctg tttggaaccc aacatcaaat aaggaccgta tccactgtca gaggatggga
4201 agcagcatgt catctgggac attggagaaa ggctcctggg ggaagtggga cttgagctgt
4261 gatctaagta atgaacaact gagagttaaa tgggagagca tcccctatca gggtcctgag
4321 agcaaccagc catggtttaa accagctata aagcctcggg tttataggat agacagtaac
4381 aatggcttgt ctttgggagc caagcagctg gtccaggcat gcagagcatg tctgtatgga
4441 gagctgcctg agagatgctt ttgtttacac ttatcaattg cccatgtcaa agaaggatat
4501 gtacatgaag ttacatcagt atgtaagaga gattttaaca atttttgcag gggaagcttt
4561 catgggggct gatgggaatc taggtaaaca gaaccaaagt ctaaacccaa gatatcccca
4621 gtaccaagac tgaaatgact ctctcctcta tctctagaaa gttccagtga cccaaggagg
4681 caaacacgat gggagtcatt aaagtggggt ggacgtgctg atcatcttcc taattctgct
4741 gcttttgttt tcagccccaa cgtgtgtgct gtgcagaagg ttattggcac taataggaag
4801 tacttcacca actgcaagca gtggtaccaa aggaaaatct gtggcaaatc aacgtgagta
4861 tctgtaacca gccaggagac caagctgtat gcacgctggc tgcagttccc cagggcctgg
4921 gccagccttc tagaaggtca ggttgcctaa aaagccatga agatgcatgt gcgaacatgt
4981 ctgggacctg cgtgctaggg agtggcattt ttaggaagct ggccaatttt gttttgcatt
5041 tttaaggctg ctgacaagac ttggagacat ttttcagggc tggtttgggt ttgcaagaaa
5101 catgaaacac tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttctc aatcctcata aaataataca
5161 gatatgcagt ggagaagcca ccagcatgtg actctggaaa agaaagccca ttggtgaatc
5221 tgtactaaag aatgccatcc ctatcttaca gtcctaaggt aaacacccca aaaagactta
5281 gagcactaaa catatgcaga ttatgagaca gcatagcata taatatttgc acagacttcc
5341 tcattcaaac cctagctcta cctgggccag tcgattcatc tttagaaccc tccattgctt
5401 tacctgaaaa gttcgtataa caaaaggacc caccttatgg ggttgttaca aggattgaat
5461 gaaataatgt acataagaga ctgaatatgg tgcccagcat atatcagtgc tcaataaatg
5521 ctagctacta ttattattat caccctagat ttgcaaatct agaccacaca agcagaagta
5581 agagtgccaa cggggtgtgg accagtgtgg ttacaatagg gcttgttgat gtctgtttca
5641 gcaaggaggg aggcagcttt taccccactg cccagctccc tggtggaatc aggtgcatgt
5701 tctaacaatt ctggggaaac ctaatctgtt ttggcactgt caacagatct caaagctggc
5761 tgtctcctat agctaggaag atgtgtatga caaatctcct gagccacttg tgaaggcctg
5821 accttcctcc tgtctccata cataatggga tgattaagaa actctaagcc actctcttaa
5881 gcacttttca atgttaggga tttttaagtt tattgttgtg acattgcttt tgagcagaca
5941 tctcctccaa tttaatagcc aactgaaaga agagaaaatg ctctttcctt aaactgtatg
6001 tggaaataaa tattccaatg tgtgaccctg attatgttag gcaattagca atcctaatat
6061 gaattgaggg aagttgggat tcatggcaca gctggggaga taccagcagt ccctgggagc
6121 ctgtccaggg caggtccatg gcagcttgct ccatgcctga ttgacagccc agcctgcaag
6181 ctaaaagttg agtgagctag gaggacacac tgccaagatt cagctaacag acacccagcg
6241 atattcttgc tgctatgaac aaaaggagac tatgcaaatt atacaccacc cattcttcca
6301 ggatgcctga cttaaaaaat aagaaaaaag atgggccggg cacagtggct cacgcctgta
6361 atcccaacac tttgggaggc cgaggtgggc ggatcacaag gtcaggagac agagaccatc
6421 ctggctaaca tggtgaaacc ccgtctctac taaaaaaata caaaaatatt agcgggcgtg
6481 gtggcgggca cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcgtgaacc
6541 tgggaggcgg agcttgcagt gagccaagat cgtgccactg cagtccagcc tgggtgacag
6601 agtgagacac cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaaa gaaaaccttt agtactgatt
6661 gattttttcc catgtgtgta tattatctac tcaaattaac aattaattac ttaattaaac
6721 acaaagccag gcctcaccta attgcttctt ggaaggtgac cagagtgcta gtgccaagca
6781 aacaactctt ctatatctca agagccctgg gcttcagagg gccatctttt ttgttaattc
6841 aagtttctct gaaaatggag acccgtttat gatgacaagc tggctacagg gtagcatctg
6901 ccacactgtt tcgggggtgc cgctgggctg aagcatttgc ccagctagtt aacaatagct
6961 cgataacatt ccctatcagt gtccaggctg agaatactgt cagtgatgag tcgccttggc
7021 tcttgtacct gtatctttgt gtgccaggac aaggcacaag caacagagct gtgtgttgcc
7081 aaaatgttcc tgatgagcag gtcaacccct cgggggcagg tttggatatg ataatgtggt
7141 gatgtggtgg cgcagctccc ttacccagtg agcacaaggg gagtcctcta ggaaaaggaa
7201 gaaatgtctg gatgaggtgg ggagatgggg ttcagagtgg actcaggcaa agcccgatgc
7261 ccagtcccag ctgttggcct agtctcacaa agccagaagg atatgacatt tacattcaac
7321 tcttgaattt gtggccactg ctttgggcaa cttcaaagag agaaaatgaa gatagaaaaa
7381 tattatttga tataaaactt ctaggacaag agaggccctt cctggaacat tacatgtagt
7441 attaggaagg tggagctgcc ctggaaaaga tccagagaac tcagagagag gaagaggtgg
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7621 catgggtggt caggtgggaa ggggagagga ctgtgctggc tggagttgat gttatcctgg
7681 ggaaagtagg tccctagatg cctttagttg agtgaggagc agactgggaa atgggagcac
7741 agtagtggtt ggggcaaaaa ggactgtctc tgcatgaggt ccataggcag ttggaatttt
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7861 aaagtatcat gggggaggag gcagctcagg ttgtcaaggg tcaagaaacc agaaggagaa
7921 tttcaccttg gaagcagaca acgggtacca agcatacagg ggaatacttt gtggtgagag
7981 gtcacacaga gatacaggag ccgacctggt gagacaggag cctggagcca cctgcctgct
8041 tttgtgaggc cccagactcc actgctatca tcaggtgaag ctctgttgcc tgcacacaaa
8101 agcttttctg catttacaaa gagagaaggg cctgagtttc tggtgcaatg cgtcaagctg
8161 acatatggac tttattacag gaagtggtta ccagtgggtc cctatttagt ggctgttatt
8221 gtgaatttta ttgttcggaa attcacttta gcatttattt cagatcctaa atagcaccgg
8281 agtgatacaa tggctaatca aacaaagagg gctgtgggga gcagacagtc agcatccccc
8341 tctgtgattt caggccctgg tttgattagt agccataaaa ttttttacgt gtggcacttt
8401 gagcaaaggt gcaggaaatt gtggtcagga agcctggctg cctctcgaca ggcttccttt
8461 gtgctagccc cagggagagg aggcctattt aacagccaag tccaagttga catcatggga
8521 ctggaatagt catagcagga gctcagacat cataaacgtg gcatagggag ggctggtgga
8581 ggagctagcg ggtatgggtg gcagctattc attccaaaag tcttgaaatt gtttcacgag
8641 caacacattt cacaagtgcg aagcccttct ctggagccaa gatgagctgg cagagcactc
8701 ctgtttctct agtagcaagt gttcctttgc ccaggggcaa aaatattaat actccttcag
8761 cactgcatta atgcttaaag atttaacttt taaagagatc agctggtgca tggtcgagct
8821 tttccatcag ctggcagggc tttttcagta ggtgtccttc tgggcagggc actggggaca
8881 gctgacgtga aggtgaagaa gagctgtcgt tttcctccct tatatcccac aaccttggtc
8941 ccaagaggaa aaaaaagaag atggtgagaa gtcatccaag cagaccccag acccatacta
9001 gtgcctcctt tcctgtttca tatccctgtg cagccagctg ggatctcttg aataatctgc
9061 tctgggggca ctgagattgg acatacacca aacagcggag atcgaccaaa cgcctctgtt
9121 gggcagtgtt tcctgagggt tctgtcccat tctgtaaact aggaggctga ctagctgaca
9181 aggaatttta ttctgttggg tatttacatg aacctatgtg ccacctgggg taagaccctg
9241 tggtaggtag aaacatgact tcccaaaaat gtccacatcc taatctctaa ttctgtaaat
9301 atattccctt actggaaaaa gagactttgc aggtgtgatt aaattaagga tcataagagg
9361 gagagattat ccaggattat ttgatgagtc taatataatc atcagggtac ttaaaagagg
9421 gaggcaggct gtgcctggtg gttcacgcct ttaatcccag cactttggga gactgaggcg
9481 agcgggtcac gaggacagga gttggagacc agcctgacca acatggtgaa actccccctc
9541 tagtaaaaaa aaaaatacaa aaattagcca ggcatggtgg tacacacctg taatcccagc
9601 tactcaggag gctgaggcgg gagaattgct tgaacccagg aggcagaggt tgtggtgagc
9661 tgagatcgca ccactgccct ccagcctggg caacagagca agactccatc tcaaaaaaaa
9721 aaaaagaggg aggcagtggg atcagagtca gagaaggcaa cgtgatgatg aaagctgaca
9781 tttgagtgat gcaaccacaa gccaaggaat gcaggcagct tctcaaagct ggaaaggacg
9841 agcaatggat tcttccctac agcctctgtg aggaatgcag cctttgattt taaccccata
9901 aggccgattt ctgactctag cctctggaat tgtaagataa tttgcatgat ctcaagccac
9961 taaatttgtg gtaatttgtc acagaaagca atgggaagcc aacacaggcc ttatttgttg
10021 acttatagat gcatttttct ttatttcaat gtacttttat caatggtctc atgtagggta
10081 ttgctttcaa tgaagatatt aacatagttt caactttaag gtttatatct ggagtttctt
10141 tagaagcttc acaactgacc acttagtaaa cagtaagcat ctgttaagtg cttctcatat
10201 gtaagttcat tcaattctca caatcacact ataagataaa tatgattatt agcccattta
10261 cagatgagga gacaggctca aaagactttt atgcaacctg gtcaaagtca ttcactggta
10321 agctgaggag gtctgtccac ttccttttgc tgcccccagg gggtatcaag cctggcagtt
10381 agtgtcagcg acttaggagg tgaacaagtg agcaggcctg taggacctgg ctaaactgcc
10441 ccaggtctct gtctacagcc tcaaacctgt ggctgtgggt cccagagaca aggcctcctc
10501 agcatcagag aaggatgcct ttgtctcagg gtcatcaacc ttctccaggt tgctcacccc
10561 ctgctgtaaa ggggatcccc aagaccgctc atcagacaag gagcttggga actgaggaga
10621 cacagtcagc ctccaggagt gcccaaaatg ccctcacatg ctgcatacag attgccacaa
10681 ataaagtaca tccacattct gaagactctg tcctcatcac caaccaggct ggcccctggt
10741 gagggctgta gtggttgagg cctttgttgg tagacagtag gttaaagcaa gccatgattt
10801 tctattggga ggcttcagaa tcagctcagc tgtgtttcca agaccaggag ggcagaaagc
10861 aaaccatccc aggcaagcag tccatgggcc atgtcagatg tctagacgtt atgggtctgt
10921 gtttgctctg ccattcctct cggaaactat gatgccctgt atggtttacc ttcagtcaca
10981 ggtgactggc ctacagggcc attccttgtt ccaacgactt ctcgagtata attaatcccc
11041 aggcatttac ggccagagca gccggccaaa tccgtgaagt gcagtggttg ttttaaatta
11101 tattaacttc ttggaaactt attttaggga gagaaaactc agtacttctc tctatccaat
11161 cttgagtaaa aatgttagaa gggactggtg gagagcctcc cagacatccc tacacataga
11221 ctttgggttg acattatctc tttgcacctt ccttgaaact ttcttctaaa ttaggtgcct
11281 tccctaattt aggcaccttc ccagtactag tctgtgacct gttaggaacc aggccacaca
11341 gcaggagttg agtggcaggg agtgagcatt attgcctgag ctccgcctcc tgtcagatca
11401 gcagtggcat tagattctca tagcagtccg aatactattg tgaactgtgc gtgtaaggga
11461 tctagcttgt gcattcctta tgagaatcta atgcccgatg gtctgagatg gaagagtttc
11521 ataccaaaac caccccttcc ccctgccacc atctggggaa atattgtcta ccacgaaact
11581 gatccctggt gccaaaaagg ttggggaccg ctgtcctaag ggatctgctt tttctgacct
11641 gaggtttttc tttattagac tgtatctggc tgaggagaag cctgaagcct ttaatcggaa
11701 cagctttggc tgatgagatt agattcagaa accaacagat tggtcttttc tatgcaggga
11761 agcctaggaa ctggggggct atggctggga agccccctat tgtttccatc ctttcctatg
11821 ttcatcctgg aggaatggca tcagacccat gcctctgtga ttgctcccag cccatccaac
11881 cacagcatct atgttctgcc tgggaccagg gccagggagc atggcacact gagctgagta
11941 taaggagagt ggagcaggcc actgccagcc cagaaaattt tggtcaaagt tgcctgaaat
12001 cttctcagcc ttcgattcac agctgctctc tgctgctctg gggccatgca gaccagttca
12061 gaaaagagtt aatttgttgg ggcagttgga ggcaggtgga ctgccagctt tgacaccttc
12121 ccagcccaca ggctgctgca ctggggctga aggcgtggct aacccctgca cacctagaga
12181 gtgacagaga tgccagactg ggcagcagga aggcaagagg attaagagag agcttcctgg
12241 ctgaaagcca cactcggtta accaggaaaa agcccttggc acgagaagac tcagtggcct
12301 gagggactga gccttggttg ttgggcatgt gctgcataag ccatccatgt gtgacagtag
12361 agtgtagtcc agccactgtg ggacatgggt gctgaaagac cacatggaga ggaacagtga
12421 gtgctgacaa gggctagcct tgatcacttt ggagacaccc cctgtgtctt ctagatgtca
12481 gactttccaa atctgtctgc tatcctccaa acgtgcattt tcaagagcaa tggaaaaagg
12541 attggacttg atggaatgca gcaagagtcc taggtctgtt actacctacc tatgacctta
12601 agaaactcct tcacccctca gaacccttac agctttcttt ctgattctat cctgagttac
12661 tctactccaa gctgagactt ttctgcttag atctatccct tcctcctaaa cccccaacct
12721 ccatttctcc tggtgtcttt ctttacacac ccctcagcat acacacacac ctagccacag
12781 gaaccaatga gttaatattt gaggagttgg ttttcttttg tcctcaatga gatcctggtg
12841 aggccacttg agctgttcag ctcccttgcg gtattttggg gatggaactc agaagccaac
12901 aatatagaaa aagagtcttt ggccagcttt cccaggggct ccatgccata gagagtactg
12961 cacccgtgtg cacagggggc cctgacatga ggactttgag gataacacta ttcctccaac
13021 tctgcttcag catctccatg gattttcaca cagacacttt aggaaagaaa ctaagtttgg
13081 ggggacttga cctaatccca catcacagcc ccagtaatac agccctggaa tttatcacag
13141 aaagcctaga atcccatgca tatcccatgc atatgcatcc ctagtcctat gggttcaagg
13201 cttggagctc tccctggatt tagctgggaa aagttggcag acagttcttc tctgtcttct
13261 agaaatatgg actagaatcg tgagtgtgag attgcaagta acttttaaaa tcatctagtt
13321 taacttcacc ccatttcata gaccaagaaa ctgagaccag agagagaaat ggactttcaa
13381 gttcaccctg ctagttactg atggatcaca agtcaaatct cctgattcta gcactgtttc
13441 tcttacacca caccaccttt gaaagtgtgt caatcaaatc ttactttagt tgcagaggat
13501 gactttagtt tctgaagata aaattgtgag tcaatcaaga tgagtcccaa gacaatagcc
13561 tgtttagccc ttataagttc agggatgaaa ggttagaaag aaacaggatg gaaggaggac
13621 tggagaaaaa aacaaaagag gaaggaagga ggaggaagca aacaggaaaa aaaaagaatg
13681 tgcatagctt gtcactcctc agtcatttcc tgggagccca tttctagcaa agtgacagct
13741 gcaactccct ggccacctga gcatcttagc tgatctgtct ctgaaacacc ccctggagaa
13801 cagatgaatc aggcttcatc ttcgcttaac taagtcttcc ctgagacgac tccatttaaa
13861 tgaacaagag caggatttcc tgggcacact gagagcacct tccagaggcc cctccagagc
13921 cctaaagcct gtatttcttc cagtcggcct gtttctttcc tggtgatgtc attaaacgcc
13981 ctttgagagt cccacagtga gcagttctgc ggtaaaaccc gctgcaatta aagtctgagt
14041 cctttcctgt ctcaaagggc atattcatat agaagaaagg aaaaggaagg actggctgtt
14101 tgcatttggt tccaggcctg ttgagtagag gtcgtgctca ctccaccgaa ggtacagggt
14161 agccttcagc agaacctggg gatttggttt taagcaagtc tttcttaggt gtgggctttc
14221 agaacacttc cttccttgca atattatttg aaattctcag tgttttagcc gtccccagaa
14281 tattggttcg ttaaagctgt gtatttcaga tctccagaca gtggtcactg tttgtatatt
14341 ttcaatttca aaccagaaaa caaaagttct tattgattac tttttttatt taaaaaataa
14401 aaagtaagta tcttcgtaag aggagctttg ttttaatttt aaagtttaaa atttgattgt
14461 gaagacagag aaaaacttga tgattgtaga tatattcccc tctttggcta ttcaatcaga
14521 gaactagaaa atcatgagag atttaatgac cactgcctga tacacatatg tgttttacag
14581 atgaggaaac tgagacccag agagatgatg aaattggctg aggatggccc agctggtcag
14641 tgaaagactc agagccagag ctggtgcagg gctctttcta ttccttcctg ttccctttca
14701 ggaacactca ccatcggctt tcctgtgaat aatgttgaga taaaatcctt ggtgcattat
14761 gttttctagt cacaacattg actaggctgc cagagtcctc tgttctccca gttggttggc
14821 tgtaggtgtt ggcagccgcc aggagcattc tacagaacag aggaggagtg agactctcct
14881 tgctcaggaa aggcagacct atgacttagc aaataactcc taagaggaga gtgtttcacc
14941 caccattcct cttccttggc tgtggaggca acttagtgga gaggggccag atgacctgtg
15001 aggaacagtg aagccctgcc taacacaatg tatggttgtc ttgttacaga gtcatcagct
15061 acgagtgctg tcctggatat gaaaaggtcc ctggggagaa gggctgtcca gcaggtgaat
15121 gaatcctccg ggccttgcct gttggtgtgg gtggaaggga atggtgggag agaggagtac
15181 ccacataaaa ggcagcagag tgtgaatggg ggcagtggca caaggacatg gcattctccc
15241 cacgtgccca ctggccccag gctctatgcg aggggctgag gaatggaagc tggaaacagc
15301 gcatttcctg agctgctcct cctggcctcc ttaccacact ggtggagtag actccaactg
15361 tggcctgtcc atgcccttcc cagcaggcac aggctcaggc tcaggctctt ggcctctgcc
15421 tctggctggg agtgattcta aacacatcca gcagggtcag cctgatagcc catcagtttc
15481 cgatcagctc tgctagagag ccgatgggat gtgggaggag ggggtcactg gtgggctggc
15541 aaccccaagc catccccatc tccctctgtg tctaaacttg gccctttgga gttcggtagg
15601 gagaagagcc ataggccagg tgggctcacc cagagtcagc agagagtccc acaaatggtt
15661 gcactgggcg aaagacagca tggcacctgt gaattttatt agagcttttc ttttagtgct
15721 acacacaagt gactgtacag gggagttagt attttgtttt aattttgaaa tagagtcatc
15781 ttttggtatc tgcgggggat tgattctagg acccattcta ggatgccata tcctcagatg
15841 ttcaagtccc tgatataaag tggtatagta tttgcatgta atctatgcat attcttccat
15901 gtactttaaa tcatctcaag attacttata ataccaaata taatgtaaat cctatgtaag
15961 tagttgttat accctctttt aaatttttgt attatctttt attgtatttc aaaaaatatt
16021 tttggtccat gtttagttga atctgtgggt gaagaaccca cagatacgaa gggccaactg
16081 tattggctat ttttttagtt aagaatgtga gactgaggcc aggcgcagtg gctcatgcct
16141 ttgattccag cactttggga ggccaagagg ggacgatcac ctgagccaag aattcgagac
16201 cagcagcccg tgcaacatag tgagaccttg tctcttaaag attgtgagac tgggctgggc
16261 acggtggctc acgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggcaggtg gatcaactga
16321 ggtcaggagt ttgagatcag cctggctaac atagtgaaac tctgtctcta ctaaaaatac
16381 aaaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctataatcc cagctactca ggaggctgag
16441 gcaggagaat cgcttgtatc caggaggcgg aggttgcagt gagctgagat agggccgttg
16501 cactccagcc tgggcaagaa gagcaaaact ccatctcaaa aataaataaa taaataaata
16561 aataaatcat gagactgaga cataacagga aggagggcaa tttggttggt tccaaggttc
16621 ctagagtatg tgatgggaga ggttggtgcg ggtggggcca tggaggtact gactcaagtg
16681 gagggacagg tggggaaatg ggatgggaaa agaagattga ccttagaagg ggagctcaac
16741 ctctgaaccc taatttcaga cccttcaaaa tgaatattaa gctcattttg gtctaagaaa
16801 caaaaaacaa atgaacatga aactcatttt ggtcttataa ggtctgagaa accccttcta
16861 aacttcaagc tgctttaaga aataacattt tattacctgc aaatacacac agtactttgg
16921 agatttataa tagtctctta ttctaataga agccattagg gaaccagttt caataaacag
16981 gtaaatctgt aagactagtt tgtaattagg atatctgttt ccagtgtcca ttcctgcctc
17041 tgttatctaa atgtctggga acaagagctg tgctctgctg tgtttaaaat gattaaaaat
17101 caccaattag ttgagttcac gtagacaggc atttgactta ttgagttgtt ttaagaagac
17161 tataacaagc cttaagcccc ccagaaacag cctgtctttg ggctttccca catgcctcct
17221 cgtcctctcc acctgtagat gtaccgtgct ctctgtcaga gaagggaggg tgtggttggg
17281 ctggaccccc agaggccatc cctccttctg tcttctgctc ctgcagccct accactctca
17341 aacctttacg agaccctggg agtcgttgga tccaccacca ctcagctgta cacggaccgc
17401 acggagaagc tgaggcctga gatggagggg cccggcagct tcaccatctt cgcccctagc
17461 aacgaggcct gggcctcctt gccagctgtg agatgacctc cgtctgcccg ggggactctt
17521 atggggaact gccttacttc cccgaggggt gggcatgatg aatgggagtc tgcagtcatt
17581 tcctactgtt tcaggaagct ttctccttaa ccccttagaa aaggctgtgg aacttgagct
17641 aaaatatgtc ttaccaggtt gcgtctaatg ccccccgttc cctactgggc agaaagactt
17701 gggtgcttcc tgaggaggga tccttggcag aagagaggcc tgggctcacg agggctgaga
17761 acatgtttcc cagagttgca aggacccatc tcttaaacac agagtctgca gcccctaact
17821 gacaccctgt ccttcctcct aggaagtgct ggactccctg gtcagcaatg tcaacattga
17881 gctgctcaat gccctccgct accatatggt gggcaggcga gtcctgactg atgagctgaa
17941 acacggcatg accctcacct ctatgtacca gaattccaac atccagatcc accactatcc
18001 taatggggta ggggatcccc agccatactg catggccctt ggtgcataat gaacccattt
18061 ctgttccatg tgtgggctgg tttctggggt ttaagctgta gacaacccac cctctttgtg
18121 cctgcttctc cttgggccct ctattccaca gcttgtggaa cccacatttt gctactgtgt
18181 ttgaaaacac tgttttctcc tcccggggct ttgggactat gcctctgttg tgttgactgc
18241 tcatccttgc tgcttctctg ggcagattgt aactgtgaac tgtgcccggc tgctgaaagc
18301 cgaccaccat gcaaccaacg gggtggtgca cctcatcgat aaggtcatct ccaccatcac
18361 caacaacatc cagcagatca ttgagatcga ggacaccttt gagacccttc gggtaaggga
18421 ctgccctggg tggaggccca ggcttgggac acattgcctc ccaagagggg cctagcagga
18481 actcttctgc aggagaggta gaggatggct cctgtagggg aacatagagc aggttcccct
18541 gaatgccctt gaacatggag aattcattga ccagacattc agcttgacct aacctgtgaa
18601 attctccatc ttctttataa agtgttccct tccttgcctc ccctggaaag gtcagtggtg
18661 tgtggctgca gcagcacagt gtcctctgag ccctggacct gcactgtggc ttccagaggt
18721 ggcagttccc acatggggta ctagaataaa tggcctatca ggctgtgtgt gctttgggat
18781 cacatgtccc caccctagga ccctggttcc aaccatacgc atgttctctt ggagcccaga
18841 acagcagaga agccaccagt gtggacacag aagtcaaggg tctgatttcc agcctggctt
18901 ctgactgctc tggggccgca ggaatacggt tccttccccc atgcccagca ggcatttgtc
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19021 caggctgccc tgtcagggtt tttgccttga ttcaaggaga acttcctaac cacaaaggat
19081 acaagtggga gtgaggcgga ccctccctag agatctccaa cacagagaga caaacacgct
19141 ggggctggct ggcactgaca ggcctcgcag gtgtggatgg ctgttagctg ggagcttcgc
19201 tgtctaagct cctctcccat gcttttcttc tgggttgctc gaaggacggg ggtctgcaag
19261 aaaatgatgt tcccacatag ttggcagcac gtgaacagca attgatccct ttgcatcacc
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19381 gccgatcttt ccttcttata acacatactt actaggtacc tgctacttcc cgggtgggcc
19441 tatgtgccag gagtatagag gtgaacaagg aaggcaaagt tctattctca gtagagctaa
19501 tactctatct ggagagagac aacaaacaaa tcaacaaggt agccaggggc tgtgataatt
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19681 ttatacaaaa tgctggggca agagcacacc cagtagaggg gagagtaata gcaaaggctc
19741 agggcaggaa gggcaaggga gaggccagtg ggtgaggtca catgtgaagg gcatacaatg
19801 ggcaaagaca aggccagagt ggccaggccc aatcctccag gacttgcaga cctgggaaag
19861 agtgcatctc catcctggga gcagcaggaa accactcagg cctttagaag atccttctgg
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19981 cagtaactgt cgagtgacag tgtgaggagg gctgcaagcc atgagtgtag gcacagcaga
20041 cagactcacc tttgtctggc ggtgagatgg ggtgggaagt gtgccaagtt gacctcccaa
20101 agaaatgata ttttagtgga agaatgaata gaatcagaga agcaaagtaa gagggaagag
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20221 tgaaagatgg ccaggctggc tggagctcag gcccagcaag gccccctggg ggccatggtc
20281 atgggtgagc ttgggtttgg cttctgtttt cgtcttgggc ttctgtgaaa gcctcgagcc
20341 cttgcgggga accagtgaag ctgtgtgtgc atcttctgtg gggagtgcca gagtcttcag
20401 ggagcactcc atcttctctc ctccccacag gctgctgtgg ctgcatcagg gctcaacacg
20461 atgcttgaag gtaacggcca gtacacgctt ttggccccga ccaatgaggc cttcgagaag
20521 atccctagtg agactttgaa ccgtatcctg ggcgacccag aagccctgag aggtgagcat
20581 cctttggctc ctgctgctgc ctcatttgtg cagctagatt gagcccaaga cctgctctgg
20641 tccaagatga acataccacc tgccatgagg tgaccctcag gatatccact gcagccatgg
20701 gctggggtca tcctgtcctg ttgcttcagc taaccgtgtc tctagcagcc acactactct
20761 gagggctgac tacagaatcc agcagctttt gtctgggaga gctggactga agagaggcat
20821 agctggagac ccatagctgg ccctggccag aaacagggag agtgaaaggc tggaatagcc
20881 aaggccagag caaggctaat aggtagagca acagcttaca ggtgtggggg tggcagatac
20941 tggcaccctt gaaatggatt cctcatgccc acgcttcact attcttctct gtggctaggg
21001 gatttatgga taaaccaaaa ttacagttaa aaaccagcca taggccaggc acagtgactc
21061 acgcctttaa tatcagcact ttgggaggac aaggtgggcg gatcacctga gatctggaat
21121 ttgagaccag cctggccaac atggcgaaac cccatctcta ctaaaaatac aaaaattagc
21181 tgggcatggt ggtgggcacc tgtaatccca gttactcagg ggctgaggca ggagaaccac
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21301 gtgacacagc gacactccgt ctcaagaaaa aaaaaaaaaa aaacagttat agtagtcaac
21361 ttttgactct ccatttcaga tttcgtcatg ccctcctcaa tgagctgcta agttaggcag
21421 tgcattgatt attgctgcag gagagggaag gaaggagcta acgtgttttc acatgttttc
21481 cttttggaga tgagaaagga ggactctgcc ttccccctac cctgcccctt tctactccag
21541 gacctctgaa aggccatgag cacaaagctg ctgcctgagt cccctgaaat gcagggtacg
21601 ccccaggtct ctgatgtacc ccaccacact tttcctctca aacatattcc aggatcactt
21661 gatttctttt gaatctattt aaacccaccg tgtcaatgtg ctatataaaa tgtctaatgc
21721 atttcagaca ccctatacat ctatacattt aaagtgttct ccttctatct gtgcagggat
21781 gggaaagggc atatttctga aagcacagat gggaagacgg gatttgttcc gtgtccaggt
21841 gattatggta cctctatgcg cctggccggc actggggaca gaggccatga aaatgaatac
21901 agcacagcct ttgcctccaa gaaacttaag acctagtaga aatggcaggc tttaaaacag
21961 gttgttggga tctgatttgg tgagtgcaat gacagagata ctcacagcac aaaatgggga
22021 atgagggcgg gcattgggac acacatagcc ttaaggggcc caaaggcttt tagaactgta
22081 ttccctatta aaacatgatt tgcacagagc acattctttg ctttggagac ctcagaactc
22141 cttactatag gccgggcatg gttataatcc cagcactttg ggaagccaag gcgggcagat
22201 cacttgaggc tgagagttca agaccagcct ggccaacatg gtaaaacccc gtctctacta
22261 aaaatacaaa aattagctgg gtgtggtggt ggccacctgt aatcccagct actcaggagg
22321 ctgaggtagg agaatcactt gaacctggga ggcagaagtt gcaataagcc cagatcatgc
22381 cactgcactc cagcctgggc aacaaagcta gactctctca aaagaaaaaa acaaaacaaa
22441 acaaaacaaa acaaaaaaaa ctccttatta taaactgtaa gaaaaaaaag gcccctactt
22501 cgtccctttt gcaaatctgc cttttcctac tcactaacca gctggttcag agcaaggaca
22561 ctctgtttgg tgccatcgct gcagactgga aggaagaggt ccttgcccca cacccaacag
22621 tctcctgctg ttaccggcag gttggcaggc aggcaggcga gaagcagcca gggctggtgg
22681 tgtgtccagt ttgaagacta gtttccagcc ctggccctgc tcaccctcca agtggccctg
22741 gcaggttcct ctaccacatc gtggacttca ccttccttct ctaagaagct caatccccaa
22801 ggcctcattc ccataggcct tctcaccctt tttctttccc tctggctgaa tgtggccagc
22861 acgggcttcc aaggccatca actcgtctgc agcagcccca tgccttgcag ggcctcagag
22921 cttcctcctg cctatgacag tgtggttttg gttcccacac ttgggatcag attgaaactc
22981 gcctccgtgg tgagaatatg ggacatagag cctcggtgac cttggtgagc agcagtccag
23041 gccacctgct cagcctgggg ttgggggggg ctcctcctcc ttgactggtc cttgcatttg
23101 cctccatcca gcctgtctgg gctctccgag gcaatggaga ccagcaggag tcacgatggg
23161 tcaggagccc cctttgggcc tcagccctgc cctgccccct aaagtagcac ttggataagc
23221 aaataaatta ttatacttac tatttatggg tgtggtgaat gggatggcaa aggccaagtc
23281 ttactgatca ccaaacctta agatatatcc tggcagctag tagacccttg ggctaaatga
23341 acagaaaact ggacaaataa agtgtacaca aataactcaa agctgtcatt tgtacacttt
23401 tcgtcttttc ctactacagt ttacattttt ataaaggtga gtagatttct aaaatcccgt
23461 ggtaggctct cttgagtttt tcttgtatcc ctgaagttca gctacaaata agctaatcac
23521 taacatttgt tgagcattta ctctgttgtc aggccccgtg ccgagtgctt taggttcaga
23581 atttcatgtc atccccacag cagccctagg agatgaatgc aattcttatg tccacttgac
23641 tgataaggaa gttgaggttc aaagaggcta aatgactctc ccagggtccc acagctggaa
23701 agtggccaca gggccccagc tggttttcta gggcagcagg cagaaggcga ggaggatctg
23761 ggccctgtgg tgccccagcc tcatctgagg gtcctcatct gagagaacag gatcctcaca
23821 gcatgggcag gctgcaagtg gtccctgagg ttatcgtgga gtggaccctg acttgacctg
23881 agtctgtttg gaccccagac ctgctgaaca accacatctt gaagtcagct atgtgtgctg
23941 aagccatcgt tgcggggctg tctgtagaga ccctggaggg cacgacactg gaggtgggct
24001 gcagcgggga catgctcact atcaacggga aggcgatcat ctccaataaa gacatcctag
24061 ccaccaacgg ggtgatccac tacattgatg agctactcat cccagactca ggtaggccag
24121 gcctccgggg gccttggccc tgcctggccc accatctctt ctgccatcct ttgtggcggg
24181 ggaggggaaa ttcagagatc tttgggcgac ttccctgcct ggacccagct cacagcttct
24241 cggccactgc aaatgtgtgg gttgtgacca gactgatgtg tcttgagctt caggcttgca
24301 agtgcagtgg agaggcagtg gggagctatt gaaggggtct ggggacagac tcaatcacag
24361 aggcctttca gaagatctgc ctgctgtgca tgggcaaaga gggccacttg ctgacctcag
24421 agcatgtgct ttctcagtag tgcccaagct gtcccatggt cactgaccca gttagaatga
24481 ctgaatggac tttggcttgt gtctcattag gaatcctagc cccattctag tcttccagtg
24541 agatctgtcc atgagtgaag gaatctcaca ggaaaaaaca aaatgcttct atgggtgtgg
24601 ttgctggcct tatctacacc acagaagcca tcacacagac tgtctttctt cccattgtta
24661 gaatgtgccc tgaccaagca gcccacaggg cctgggacag aggctgatct ctgcctaact
24721 gagctcacct ctcctccctc tcctcctgac tggttagatt ttctaggtga ctgttcccct
24781 gatgacacaa gcccgctggg ccccagcagt gtttagaggg gttgttgact cacgagatga
24841 cattcctgct gatgtgtgtc atgccctggg gtggatgaat gataaatgaa aacagcgctt
24901 ttaacttttg aacccacttt ctccttcctt gtagccaaga cactatttga attggctgca
24961 gagtctgatg tgtccacagc cattgacctt ttcagacaag ccggcctcgg caatcatctc
25021 tctggaagtg agcggttgac cctcctggct cccctgaatt ctgtattcaa aggtaacatg
25081 gggaaggcat ccctgttaga ttgtccctgg aggcagcttc cccacccctg tcacctccac
25141 aacactctcc gatttacagc accccatggg acattagaac ttccactcag ctcaaccaaa
25201 agcagatgtg acttcagcag aaacttcaga ggctctgttg tttcattagg cagtgcagag
25261 aatgcctttg gggagccgtt cctcagaact caagacttga catctgggag gcagccgttc
25321 ctcagaactc aagacttgac atctgggaga gcagagcatt cccttgcctt tctatttgca
25381 gggtcacttg ccaatgtata gtcaagaggt cagagtgagg gtacagctga gctgcagccc
25441 caggaaggca gagaaggggg ccaagttgtg tgcgtgcctg cccttccctc ttagggcaaa
25501 actccaaaca cccttgatta tctggatctt ctttaattct ccatagaaga taccagatgt
25561 taaggaatat tggcagcttc acttggtttc tcaatccctg tttccaaact caaggaggga
25621 tgggcttttt cactgtattt atctctcatc actctcttca ttgcaggagc acatctctct
25681 ggacctaacc atcacccttt cttgtagatg gaacccctcc aattgatgcc catacaagga
25741 atttgcttcg gaaccacata attaaagacc agctggcctc taagtatctg taccatggac
25801 agaccctgga aactctgggc ggcaaaaaac tgagagtttt tgtttatcgt aatgtaagtt
25861 ctgggtccta aatcatgctc ctgggaagct ccttactgtg ggacttgtat tagtgtaaaa
25921 aaaaatgtcc tcaataagca ggagtttgca tgagaactgg ttgctgacaa ggaaggaaat
25981 aatttctgga aaatatagat aacaaaatga gatcctgcag aaggattgga atctcttttt
26041 ctggaggcct ttgagaataa accacacaat tatccaacct gtattgtgaa ggaataagtc
26101 cttcttgaat tcaggaatta acacctggga ggagggatgg agttcagact ctttctgagc
26161 ttatgagaag agaagccccc taaactaaaa tacagccctc cttggtccaa aaggtgcctt
26221 ctctcttctg ctgtatcttc tttgttttca aacccaacag ttaccctgga aatcaaaaag
26281 gaagtacaac tcaacatagc tcttgcctgg gaccaaccag caccatttgg ctaaagatgg
26341 ttatcatctg ttaaacaaag aaataaataa atgggttcaa cgtatttatt tcaacattgt
26401 caatggacct catgtgtaac tgatattctc attatgggac ctctgtgtga ctttattggg
26461 gcctctctaa ccgttctttc cttaaggaag accatttatt gttttatttc ctggagaaaa
26521 tacatcattt tatcccagcc ttaataaccc atcccagtgt atactccttc atcttcatgg
26581 ataatgaccc tgctacatgc tctgaacaaa tcaggaggcc cctcgtggaa gtataaccag
26641 tcctttcttt ctctgtccct cttctgtgca gagcctctgc attgagaaca gctgcatcgc
26701 ggcccacgac aagaggggga ggtacgggac cctgttcacg atggaccggg tgctgacccc
26761 cccaatgggg actgtcatgg atgtcctgaa gggagacaat cgctttaggt aattagttcc
26821 atccccgggt ggagcttctg cccagtggtc atgctggagt gggatgtggg gccccagcta
26881 tttgtcaagc tttcttctac cttggggatt caattaacac tagcagtgca ctgctgcgac
26941 cttccagact tgggatgggg aaaaggcaag ggtcgccttg aaagcttaca ttgggaagaa
27001 gggttacttc taagagtgta atcttcacat gcatgggaag cagggagggg ggactacatt
27061 tttatgactg aagtgcaagg aaaacatcac cctctcattg taaagctcca agtgagccaa
27121 gagcacatag tttacagtgc acgatgagcc tctcactctc tgcgcagtat ctgtttattg
27181 caactgaagc acccttgtga gtttgttttc ttgcccggct atctccattt ctgacttgct
27241 cattcacctt ggggtgctgt catattgaat gtttccctgt cactgacttc agccacctgc
27301 acaagggctt ggagaccaca cccctctgcc ctcccagaat catatccctg gaggctcagc
27361 tagtctctgg gtcagccata cctctgccct ttcttttccc tcctttctcc tgtggcctct
27421 gacgtctggc catttaacag agcttagcat ttttgctggg tggagagagc tggagcctgg
27481 aatcactccc tctttgtgca tacggagggc atgaaaacca aggtgtgtgc attccagtgg
27541 cctggactct actatcctca gtggtgaggt atttaaggaa aatacctctc agcgtggtga
27601 ggtatttaag gaaaatacct gttgacaggt gacattttct gtgtgtgtat ctacagcatg
27661 ctggtagctg ccatccagtc tgcaggactg acggagaccc tcaaccggga aggagtctac
27721 acagtctttg ctcccacaaa tgaagccttc cgagccctgc caccaagaga acggagcaga
27781 ctcttgggta aagaccaact taagtacacg tctccatttt tctaaagtag tgatccctca
27841 gggccccagc agcaaacagt tggcacatca aggattgact tgaagggatt ttatgacaag
27901 actattagtg aaagagtggg cgggactaaa ggaactagca aaggatgagg ccaaccaggg
27961 actagcaacc ctgggaagcc tttactaccc ctaggcctgg gggaatggga ggatgagagc
28021 aggaaccagg gaggtcatga gccttggaca agggcacaga acagcagcca gagccatgtg
28081 cagccagcca ctgtcagaac catgcaaggg ggaccactca gcgccccagc ctccctctca
28141 gacagttgcc atctgggtct cttgttggct gatgcgagag caggagggag cccactgatg
28201 cagttcatag agctcagcct cctgggcagg aaaccgggca gagaggagta gaaaagaatt
28261 aagggtggct gcgaccagcc cagtcactga ggcacgtttc ccactggaga cctatgagca
28321 cagtgataat aaagccagtt acctgcactg actatccctc cagacaaaag ctttcccaag
28381 aagttagtca tggctctgag agatctagtt gaggatgttt ggcaggggat ctagtggtta
28441 cgggtggcta agaaaaatga ggaaggtaag agtatcttgc agcctgtgtt gggaggatta
28501 aataggatgc cacacacagg gccaggcaga cagcctggtc agtaatagcc atgacgatgg
28561 gggcgggggg agcaggaatg ggagttgcag tgtttagctc agatgcatgc ctgtgagaga
28621 tgcttccact ctcacagaaa gatgagacca aggaaaagga ggaggaagag gaaggacctt
28681 gacaaacctt ggggcccaca ttgtctacac ctcccttcct gctctagagc agaatagaaa
28741 gttcaggttg caggcagctc taagttgaat tcgtgtcctg tttaattttc tttattgcta
28801 aatgaatgcc tgtgtctgtg atgctgacgt atgttcctaa ggagagggga gaagttcatt
28861 ctgaacataa acttttcatc ctctctctgt ccagcaagaa tggaatattc cccaagtggc
28921 ctgagccagc ttggctttct ttttgttttc aattatgtgg gagttgagga gggggatggg
28981 aaaagcttcc caaacacacc ctcccccagg cctgaggcac ccctggggga cagagagtgt
29041 tagaggttgg tacaggtgtt agagatattg aaaggacatc ccatgcaccc caggggctgg
29101 tgtggctctg tacttccagg caatattttg tggaagggga accttgtcag ctccaggttg
29161 tggatgtttg aaaatcagtt ggtacccagt ggctccatcc tctggcaggc atgtggattt
29221 gtcaataacc aagtgaactc tccaaaataa gttaaaactt cctcccttct cagtttcaag
29281 atgctggaaa tagctgttca taagccctgg ggaaatttag ccctttggct ggtaatggga
29341 gtatccgaga tgagagggca gctggaaact ttcggaatga cctcccacac ttaatttggg
29401 aaatgcctct gcacctttat gggcaaccag atgcctgccc cagttgctgg agacactgat
29461 gtgggctgaa aggaatgctg agacgtgacg aggagagatg ctgcggaggg aatatccccc
29521 tcagccctga cctcatcggc tccatggctc ctccacagta cagctgtcta ctcttttaag
29581 ttctcccttc aggaaatagc catctcaaac agaatgtgca tttgagggca gaatgtgtaa
29641 atattgcact actgtgttat aaccgtcagg agccatgctg atgatgaaac gtcccagatg
29701 ccggtgctgg aaaggtccct ggctttccaa gcaaatattt atctcatgga aacatgagtc
29761 atactcacag aggagtatgg attaactcct tctcagcagc cagggagccc agcatcccag
29821 acagcatatt taacccagag gccaactgac tgctggggca gatttgtggt catgaacatg
29881 tgctttgtgt cctctgacca ttagacagat tgtgggtcac aacgttgagt atacagtggg
29941 agcttaataa gtgcttattc cctgggcagg gagttcttca tttcaggggt gaccacttac
30001 atcttctcct ctgggccctc cttgaccagg ctaattacca ttcttgggat taactctatc
30061 tccttttccc gcaacctgca ggagatgcca aggaacttgc caacatcctg aaataccaca
30121 ttggtgatga aatcctggtt agcggaggca tcggggccct ggtgcggcta aagtctctcc
30181 aaggtgacaa gctggaagtc agcttggtaa gtgtcctgca aatcaaaggc tggctaaatt
30241 tccccagggc agggctccag gacatatctc acccccagga tggaattata cacacacaac
30301 cttcaagttg cagcccgaat ctctgagtgt aattcgtcca aagaaaaaga gaaaagagaa
30361 gagggtcttc agggaaatca agtgagatca tagttagaca tgagtaagaa cttccagatt
30421 tacaagggaa tagagcatct gatttggcat ctgagagagg ctattagatc ttccttctct
30481 taaggaggtt gtaggcaact agttatgtga ctgaagagat cagtctgtac tcacaccatc
30541 ccacccccca aacccagggc ttcactgagt tgtaccatga accagaccat cccaagaggc
30601 tttttgagtt ctgacacttg ctctgtgagc cttcccttgc tctgcacatt gatgatataa
30661 ctttgtaact gcactaagag tgttcctaaa gcagatagcc agccgagctc cagaaatctc
30721 cctggctgca cctgcagagg ccactgaccc ctctgtggag ggaccgctct tcagtgtgtg
30781 gctggcttct actctctgct cctctctctt ggtcttcagc catccattgc tcaccagttt
30841 ctcacgagga gcataggaag atatgcatgt agggaggtag gcacggggat gacttgtttg
30901 actttagcag gtcattcaag aatctcctcg cacctggttt cagatgctgg ggtcctgtct
30961 gtcacaggct tctgtgcctc ctaccccctt gagtttgtca catggccctt caggaaggcc
31021 tgagatagat ttgccctggg tgggcctcct atgagaaaat cttaagtgag gcacccaggc
31081 aaaatggaaa gagccttttg cccagagcag gaagcctgtc ttccatttcc agctgttcca
31141 cctacttagc ttaaaagagg cacttcgcct gtcttcagtc tcagtctcag tctcctcttc
31201 tgtggaatgg gacaataata tctactctcc ttatcataca ctgctgtgag gactgagtgg
31261 atcacacaaa aaagcattat gtaaattgca aagtgctaaa tccacacagg agatttgaat
31321 taatccacca cactgaaggt ctgtcaaggg cagggactgt ttcattcacc agagtatccc
31381 cagtctaaca caggacttgg catatgaaaa gtgttcagta ggccgggtgc agtggctcat
31441 gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa agtgggcgga tcatctgagg tcaggagttc
31501 aagtccagcc tggccaacgt ggtgaaacca catctctact aaaaatacaa aattagctgg
31561 gcgtggtggc acatgcctgt aatcacagct actctggagg ctgaggcagg agaatcactt
31621 gaacccagga ggcggaggtt gcagtgagtc gagatcatgc cactgcactc cagcctgggc
31681 gacaagattg aaactccatc tcaaaaacaa agaacaagga aaaaaacgaa aactgttcag
31741 taaacacttg ctgaatgaat aaaataaata tataaatgta taaataaatg ctctactttc
31801 aaccactact ctgtttttct tttagaaaaa caatgtggtg agtgtcaaca aggagcctgt
31861 tgccgagcct gacatcatgg ccacaaatgg cgtggtccat gtcatcacca atgttctgca
31921 gcctccaggt aagtgtcgca tccccactga ctctgcagcc agtccttttc ttcatgtggc
31981 agttggtgga gagaagaaaa actgttctaa acaatgatga gaataacatg taattgtgat
32041 agttaaactg tgcctatgtg actgattgca gagtgaattg ggagctgttg gttttgaatg
32101 caccacacta aggaatgtga ggacacattg ctctttgcgg agttgcccag ctatattagc
32161 tcccctcgga cacagcccag ttttctgtat tcgcgtggat gctgtccgcg cgattcccag
32221 cactcctctt acagcatctc acctcagtgt atgttccttg cctccagtgc agttgaacct
32281 cagtcctgcc tctcctcatg tgtgcattca cctttcttgg tgctctctcc ccatgggcca
32341 agttctacca tgagttatga aacattatgg agaaaacatg tctttggaaa tgtgagccag
32401 aaagcccacc agtgcccctc agtcacggtt gttatgaatg acatgctaat ggtttcactc
32461 tggtcaaacc tgccttttct ttcctcttca gccaacagac ctcaggaaag aggggatgaa
32521 cttgcagact ctgcgcttga gatcttcaaa caagcatcag cgttttccag ggtaagatgc
32581 ctgctaggtt tgcgcctagc ctgagcagcc tcaggtcctc tgtttgggcc atagaggagc
32641 ctctccagcc cctgtcttcc ttggctgctc cccagggctc tcttaaaact tctccccact
32701 cccactgagg catcctcagc cccagcctgt gtcaaattca gagtaaagaa ccaaggcaac
32761 tccctggctt tcatgggcca aagcgcaggc tttcacaccg aggcctctga gcctcagatc
32821 atggggaagt cactgctgga gagaacagac atagctctgg aagccatctg cccaagaggg
32881 cagcccatcc caagttcatc ttacagtggc caggcctgcc ctgagccggg gcctctgggt
32941 cactcttctg ctgtccatgg cattgcccat cctgggtgag gctggggctc tcctgggcac
33001 tgtatgtatt ctggatacag ggatactggg ctcgctatgt gtgtggagcc atcccttcct
33061 tgccccagcc ccacctccct ctcaaaccct ctctggctct ttctgagctt cctttcctgc
33121 tccccagctt gcccagtgct cagtgcccca cttggctctt ttgctacttc gggtcaggtg
33181 gagcctcttg ggaatgtgaa gtgccttaca gaaagattgc acttcaagag gagaggctgc
33241 agggagccat cctaaaccca gaggcctgga gcttactgtg tcactttact tttgtacaca
33301 ggggtctcct tagtgccctc gagaaggatt cttggccctg agcttctact cctgaggcca
33361 cctctgtgca gccccagctc cctcaactct aggctgtagt ctcagtggga aagcctggct
33421 tgggggtctc ctaggaatgt ccacctgaag gcacacttga taggggcttg cacaacttat
33481 gtctgccaag gccacctgag gaactccctg gtgcctataa gttccacctt ccccttcctc
33541 ttcctcgccc cagcattttt tctgagtagg ggtggcaatg ggcaaagcca ttgtcataag
33601 cagttgcagg tataactttc actagaaaac ctgacacctt gtgttttctt tcaggcttcc
33661 cagaggtctg tgcgactagg tgagtctggt ctgggtttga agtcattgca gacctgttta
33721 ggccttaccc ccaagcaagc ccaagcctgc catctgctgt atatagataa gaacatcatg
33781 gtgcagtaaa agaagcctgg cctttggagt cagaacagca gggtgacttg gggtcagacc
33841 cagagcaccc catttccttc tctgtaagat gaggataata agagtaacaa ccttttaggg
33901 ttaaggtgag ttttcagctt aggaagtctg ggaatattgc aaagggcttg gcaggaaccc
33961 atggtgagga tctagttcca agttgatagg tacagaaaac cagaacatcg ggccttgagt
34021 aaagagtgaa gtttcacaaa ccacaaagca cctgctatgt gcaggagagc atggcagaag
34081 gaggctgctt ggccctggtc cttgagattc tgacagtgtc ctagacagac atggggagat
34141 ctgcacctat ttgacgttac caacttctct ttttcagccc ctgtctatca aaagttatta
34201 gagaggatga agcattagct tgaagcacta caggaggaat gcaccacggc agctctccgc
34261 caatttctct cagatttcca cagagactgt ttgaatgttt tcaaaaccaa gtatcacact
34321 ttaatgtaca tgggccgcac cataatgaga tgtgagcctt gtgcatgtgg gggaggaggg
34381 agagagatgt actttttaaa tcatgttccc cctaaacatg gctgttaacc cactgcatgc
34441 agaaacttgg atgtcactgc ctgacattca cttccagaga ggacctatcc caaatgtgga
34501 attgactgcc tatgccaagt ccctggaaaa ggagcttcag tattgtgggg ctcataaaac
34561 atgaatcaag caatccagcc tcatgggaag tcctggcaca gtttttgtaa agcccttgca
34621 cagctggaga aatggcatca ttataagcta tgagttgaaa tgttctgtca aatgtgtctc
34681 acatctacac gtggcttgga ggcttttatg gggccctgtc caggtagaaa agaaatggta
34741 tgtagagctt agatttccct attgtgacag agccatggtg tgtttgtaat aataaaacca
34801 aagaaacata
TGFβI gene protein product (βIG-H3 protein sequence; NCBI Reference number NG_012646.1):
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQH
GPNVCAVQKVIGTNRKYFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALP
LSNLYETLGVVGSTTTQLYTDRTEKLRPEMEGPGSFTIFAPSNEAWASLPAEVLDSLV
SNVNIELLNALRYHMVGRRVLTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIVTVNCARLL
KADHHATNGVVHLIDKVISTITNNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYT
LLAPTNEAFEKIPSETLNRILGDPEALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTT
LEVGCSGDMLTINGKAIISNKDILATNGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAI
DLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVFKDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLY
HGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIAAHDKRGRYGTLFTMDRVLTPPMGTVMDV
LKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVFAPTNEAFRALPPRERSRLLGDAKELA
NILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVSLKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGV
VHVITNVLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAFSRASQRSVRLAPVYQKLLERMK
H
Claims (76)
- (A)基材の先端に付着した対象の上皮細胞を提供することと;
(B)前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で、前記基材の前記先端を撹拌することと;
(C)前記撹拌すること(B)が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと;
(D)前記除去すること(C)の後に前記溶解液をインキュベートすることと;
(E)前記溶解液からゲノムDNAを単離してgDNA溶液を形成することと;
(F)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対及び前記gDNA溶液を使用して、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも2つのヌクレオチドの同一性を決定することと;
を含む、対象由来のサンプルにおける、角膜ジストロフィーに関連する少なくとも2つのゲノムのアレルの検出方法であって、
前記少なくとも2つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連するそれぞれの独立した一塩基多型(SNP)に相当するTGFβI遺伝子のそれぞれの独立した位置に位置している、前記方法。 - TGFβI遺伝子中に存在する前記少なくとも2つのヌクレオチドは、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対は、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対を含み、
前記第一増幅プライマー対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含み、そして、前記第二増幅プライマー対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 前記決定すること(F)が、
(i)配列番号25を含むヌクレオチド配列を有する第一野生型検出プローブ、及び配列番号26、配列番号48、又は配列番号49を含むヌクレオチド配列を有する第一変異型検出プローブと;
(ii)配列番号45又は配列番号47を含むヌクレオチド配列を有する第二野生型検出プローブ、及び配列番号46又は配列番号50を含むヌクレオチド配列を有する第二変異型検出プローブと;
を使用することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 - (A)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも1つの第二増幅プライマー対を含む反応混合液を使用して、ヒト対象由来の生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第一TGFβI遺伝子配列及び第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第二TGFβI遺伝子配列を含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列を増幅することと;
(B)第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第一検出プローブを前記第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;
(C)第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第二検出プローブを前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;
(D)前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対を含む少なくとも2つの検出プローブ対の使用に基づいて、前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の、1又はそれ以上の変異を検出することと;
を含む、角膜ジストロフィーの検出方法。 - 前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の前記1又はそれ以上の変異を検出することが、前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の2又はそれ以上の変異を検出することを含み、そして前記2又はそれ以上の変異は、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている、請求項7に記載の方法。
- 前記少なくとも第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記少なくとも第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列で表され、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列で表される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、
前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、
前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含み、
前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、
前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして
前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、
請求項7又は8に記載の方法。 - 前記1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの検出オリゴヌクレオチドプローブ対の各々が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項7〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一標識が、VICであり、そして前記第二標識が、FAMである、請求項22に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズすること(B)及び前記ハイブリダイズすること(C)が、同じ溶液中で同時に実行される、請求項7に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズすること(B)及び前記ハイブリダイズすること(C)が、同じ溶液中又は異なる溶液中で同時に又は異なる時間に実行される、請求項7に記載の方法。
- (A)(1)対象由来の生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第一TGFβI遺伝子配列を、及び(2)対象由来の生物学的サンプルから、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第二TGFβI遺伝子配列を、増幅しそして決定するための、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対の少なくとも1つと;
(B)少なくとも2つの検出プローブ対と;
を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも2つの検出プローブ対の各々における検出プローブが、前記少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の少なくとも1つとハイブリダイズする、前記反応混合物。 - 前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の反応混合物。
- 前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、請求項26又は27に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する変異を検出する、請求項26〜28のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する変異を検出する、請求項26〜29のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対のそれぞれの検出プローブ対が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜30のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜31のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜34のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜35のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項24〜36のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項24〜36のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも2つの検出プローブの第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記少なくとも2つの検出プローブの第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項26〜38のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第一標識が、VICであり、そして前記第二標識が、FAMである、請求項39に記載の反応混合物。
- (A)対象由来の生物学的サンプルから、TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも1つの第一増幅プライマー対と;
(B)少なくとも3つの検出プローブのセットと;
を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも3つの検出プローブのセットのうちの1つの検出プローブが、前記TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、前記TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする、前記反応混合物。 - 前記TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項41に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項41又は42に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜43のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜44のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25の第一検出プローブ及び配列番号26の第二検出プローブを含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第三検出プローブを含む、請求項46に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、第三検出プローブとは異なりそして配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第四検出プローブを含む、請求項47に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号26及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項41〜49のいずれか一項に記載の反応混合物。
- (C)前記生物学的サンプルから第二TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも1つの第二増幅プライマー対と;
(D)少なくとも3つの検出プローブの第二セットと;
をさらに含み、前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットのうちの1つの検出プローブが、前記第二TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項41〜50のいずれか一項に記載の反応混合物。 - 前記第二TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項51に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項51又は52に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項51〜53のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項51〜54のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む、請求項51〜55のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項41に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項41又は58に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41及び58〜59のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41及び58〜60のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む、請求項41及び58〜61のいずれか一項に記載の反応混合物。
- (A−1)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一TGFβI遺伝子配列を増幅することと;
(B−1)少なくとも3つの検出プローブのセットの第一検出プローブを前記第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;
(C−1)(i)前記少なくとも3つの検出プローブのセットの前記第一検出プローブの、前記第一TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも3つの検出プローブのセットの第二及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第一TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することと;
を含む、角膜ジストロフィー検出方法。 - 前記反応混合物が、請求項41〜50及び58〜62のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項63に記載の方法。
- (A−2)同じ反応混合物を使用して、前記生物学的サンプルから、第二TGFβI遺伝子配列を増幅することと、ここで、前記反応混合物は、少なくとも1つの第二増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブの第二セットを含ものとし;
(B−2)前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;
(C−2)(i)前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの前記第一検出プローブの、第二TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第二TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することと;
をさらに含む、請求項63又は64に記載の方法。 - 前記反応混合物が、請求項51〜57のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記増幅すること(A−1)、前記増幅すること(A−2)、前記ハイブリダイズすること(B−1)、前記ハイブリダイズすること(B−2)、前記検出すること(C−1)、及び前記検出すること(C−2)が、前記生物学的サンプルの同じアリコートを用いて実行される、請求項65又は66に記載の方法。
- 前記第一TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−1)及び前記第二TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−2)が、同時に実行される、請求項65〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズすること(B−1)及び前記ハイブリダイズすること(B−2)が、同時に実行される、請求項65〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出すること(C−1)及び前記検出すること(C−2)が、同時に実行される、請求項65〜69のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト対象におけるヘテロ接合性角膜ジストロフィーの検出を通して、前記対象におけるレーザー眼科手術後の合併症のリスクを予測するための、請求項7〜70のいずれかに記載の反応混合物の使用。
- 前記レーザー眼科手術が、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの1つを含む、請求項71に記載の使用。
- (A)基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと;
(B)前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で前記基材の前記先端を撹拌することと;
(C)前記撹拌すること(B)が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと;
(D)前記除去すること(C)の後に、前記溶解液をインキュベートすることと;
(E)前記溶解液からゲノムDNAを単離して、gDNA溶液を形成することと;
(F)少なくとも1つの第一プライマー対、少なくとも3つの検出プローブのセット、及び前記gDNA溶液を使用して、前記gDNA溶液を前記少なくとも3つの検出プローブに同時に曝露することにより、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つのヌクレオチドの同一性を決定することと;
を含む、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法であって、
前記少なくとも1つのヌクレオチドが、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型(SNP)に相当する前記TGFβI遺伝子の特定の位置に位置し、そして、
前記少なくとも3つの検出プローブのセットのうち少なくとも2つの検出プローブの各々が、前記TGFβI遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている、前記方法。 - (G)少なくとも1つの第二プライマー対、少なくとも3つの検出プローブの第二セット、及び前記gDNA溶液を使用して、前記gDNA溶液を前記少なくとも3つの検出プローブのセット及び前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、前記TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つの第二ヌクレオチドの同一性を決定すること
をさらに含み、
前記少なくとも1つの第二ヌクレオチドが、前記少なくとも1つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型(SNP)に相当するT前記GFβI遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、
前記少なくとも3つの検出プローブの前記第二セットのうちの少なくとも2つの検出プローブが、前記TGFβI遺伝子の前記第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている、請求項73に記載の方法。 - 前記決定すること(F)及び前記決定すること(G)が、同時に実行される、請求項75に記載の方法。
- 前記決定すること(F)及び前記決定すること(G)が、同じgDNA溶液を使用して実行される、請求項74又は75に記載の方法。
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