CN108699542A - 用于治疗角膜营养不良的方法 - Google Patents

用于治疗角膜营养不良的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108699542A
CN108699542A CN201680077123.2A CN201680077123A CN108699542A CN 108699542 A CN108699542 A CN 108699542A CN 201680077123 A CN201680077123 A CN 201680077123A CN 108699542 A CN108699542 A CN 108699542A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
lys
mutation
stem cell
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680077123.2A
Other languages
English (en)
Inventor
T.莫尔
A.内斯比特
G.李
S-Y.乔
L.德迪奥尼西奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Avellino Lab USA Inc
Original Assignee
Avellino Lab USA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Avellino Lab USA Inc filed Critical Avellino Lab USA Inc
Publication of CN108699542A publication Critical patent/CN108699542A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3666—Epithelial tissues other than skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3695—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the function or physical properties of the final product, where no specific conditions are defined to achieve this
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C12N2533/92—Amnion; Decellularised dermis or mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

提供了用于治疗有此需要的受试者中的角膜营养不良的方法和组合物。在一方面，方法包括以下步骤：从受试者获得包含角膜营养不良靶核酸中的核酸突变的多个干细胞，并且操作多个干细胞的一个或多个干细胞中的核酸突变以校正核酸突变，从而形成一个或多个经操作的干细胞。分离经操作的干细胞，然后移植到受试者中。在一些实施方案中，使用CRISPR系统操作核酸突变。

Description

用于治疗角膜营养不良的方法
发明领域
本公开一般涉及用于治疗角膜营养不良的方法。具体地，本公开涉及用于治疗与遗传突变有关的角膜营养不良的方法。
发明背景
角膜营养不良是眼外层(角膜)的一组遗传性病症。例如，角膜营养不良可以以角膜，即眼的透明前部中的物质的双侧异常沉积为特征。角膜营养不良包括但不限于角膜营养不良的以下四种IC3D类别(参见例如Weiss et al.,Cornea 34(2):117-59(2015))：上皮和上皮下营养不良、上皮-基质TGFβI营养不良、基质营养不良和内皮营养不良。角膜营养不良可以由位于转化生长因子、β诱导(TGFβI)、角蛋白3(KRT3)、角蛋白12(KRT12)、GSN或含有UbiA异戊烯转移酶域1(UbiA prenyltransferase domain containing 1,UBIAD1)中的突变引起。
例如，已知此类角膜营养不良的亚组，上皮-基质角膜营养不良，与转化生长因子β诱导(TGFβI)基因中的突变相关。TGFβI基因编码结合I型、II型和IV型胶原的含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)的蛋白质。RGD基序存在于许多调节细胞粘附的胞外基质蛋白中，并充当几种整联蛋白的配体识别序列。在一些情况下，上皮-基质角膜营养不良基于不透明度的临床表现、疾病的临床特征以及沉积物的组织病理学染色特性彼此区分，并且而分为亚型。不受任何特定操作理论的束缚，认为TGFβI基因中的特定突变导致与此类角膜营养不良相关的特定表型，并且导致不同表型的临床特征的角膜不透明度源自整个或部分的突变编码TGFβI蛋白的沉积。阿维利诺(Avellino)角膜营养不良，又称颗粒状角膜营养不良II型，是一种上皮-基质角膜营养不良形式，以表面中央角膜基质中的不规则形状、界限清楚的颗粒状沉积物和进行性视力损伤为特征。患有阿维利诺角膜营养不良的杂合患者随着年龄具有增加的视力丧失，在生命的晚年变得严重。与之相对的，纯合患者在6岁龄时有严重到完全的视力丧失。
圆锥角膜(KTCN)是最常见的角膜扩张性病症，约6-23.5％受试者携带阳性家族史(Wheeler,J.,Hauser,M.A.,Afshari,N.A.,Allingham,R.R.,Liu,Y.,Reproductive SysSexual Disord 2012；S:6)。报告的KTCN流行率的范围为每100,000之8.8至54.4。流行率的此种变化部分由于用于诊断该疾病的不同标准。(Wheeler,J.,Hauser,M.A.,Afshari,N.A.,Allingham,R.R.,Liu,Y.,Reproductive Sys Sexual Disord 2012；S:6；和Nowak,D.,Gajecka,M.,MiddleEast Afr J Ophthalmol 2011；18(1):2-6)。在文献内存在许多试图确限定KTCN遗传原因的研究。这些研究发现了许多可能的遗传变体或单核苷酸多态性(SNPs)，据信它们根据实验参数对疾病的病因起作用。在圆锥角膜过程中，中央或旁中央角膜经历逐渐变薄和变峭(steepening)，导致不规则散光。遗传模式既不突出也不可预测，但报告了阳性家族史。经常报告圆锥角膜的发病率为2000人之一。圆锥角膜可以显示以下病理学发现，包括鲍曼层的碎裂、基质变薄和上覆的上皮、德斯密(Descemet)氏膜中的折叠或断裂、以及可变量的弥漫性角膜瘢痕形成。
最初用高渗眼药水和软膏治疗角膜营养不良的早期阶段以减少角膜水肿，并且可以在手术干预之前提供症状改善。由角膜营养不良引起的次优视力通常需要角膜移植的形式的手术干预。然而，供体角膜组织可用性的短缺限制了外科手术的使用。另外，然而，供体移植物中的疾病复发可能在角膜移植后发生。角膜移植后可能出现的其它并发症包括例如瘢痕形成、白内障形成、从移植切口渗漏液体、感染和视力问题。因此，需要治疗角膜营养不良的替代方法。
发明概述
本文中提供了用于治疗有此需要的受试者中的角膜营养不良的组合物、方法和系统。在某些实施方案中，角膜营养不良是颗粒状角膜营养不良II型。在其它实施方案中，角膜营养不良是圆锥角膜。在一些实施方案中，角膜营养不良与单核苷酸多态性(SNP)相关，例如，在TGFBI、KRT3、KRT12、GSN、和/或UBIAD1基因中的单核苷酸多态性(SNP)。
在一方面，本文中提供了在有此需要的受试者中预防、改善或治疗角膜营养不良的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括操作来自所述受试者的干细胞中的角膜营养不良靶核酸中的核酸突变以校正所述核酸突变，从而形成经操作的干细胞；并将经操作的干细胞移植到受试者中。在另外的实施方案中，所述方法还包括在移植之前培养经操作的干细胞，从而形成多个经操作的干细胞，并且移植包括移植所述多个经操作的干细胞。在进一步的实施方案中，该方法包括操作来自受试者的多个干细胞中的核酸突变以校正核酸突变，从而形成一个或多个经操作的干细胞；分离一个或多个经操作的干细胞；并移植一个或多个经操作的干细胞。在又一个实施方案中，该方法包括在移植前培养一个或多个经操作的干细胞，从而形成多个经操作的干细胞，并且移植包括移植所述多个经操作的干细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得在角膜营养不良靶核酸中包括核酸突变的干细胞。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：a)从受试者获得包含角膜营养不良靶核酸中的核酸突变的多个干细胞；b)操作多个干细胞中的一个或多个干细胞中的核酸突变以校正核酸突变，从而形成一个或多个经操作的干细胞；c)分离一个或多个经操作的干细胞；并且d)将一个或多个经操作的干细胞移植入受试者中。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸是TGFβI靶核酸。在其它实施方案中，角膜营养不良靶核酸是COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1靶核酸。
在一些实施方案中，在操作后进行培养。
在一些实施方案中，通过如下操作核酸突变：将核酸操作试剂组导入分离的多个干细胞中，从而核酸操作试剂校正多个干细胞中的一个或多个中的核酸突变。在进一步的实施方案中，使用电穿孔、转染或病毒递送将核酸操作试剂导入到多个干细胞中。
在某些实施方案中并且根据任何上述内容，核酸突变编码TGFβI多肽中的精氨酸124、精氨酸555或组氨酸666的氨基酸取代。在一些实施方案中，核酸突变编码选自R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P的氨基酸取代。
在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A1中的氨基酸取代Q1334H。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A2中的氨基酸取代G683A。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A2中的氨基酸取代P718S。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A2中的氨基酸取代R517K。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A3中的氨基酸取代D326Y。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A3中的氨基酸取代H451R。在一些实施方案中，核酸突变编码COL4A4中的氨基酸取代V1327M。在一些实施方案中，核酸突变编码LOX中的氨基酸取代R158Q。在一些实施方案中，核酸突变编码AKAP13中的氨基酸取代A1046T。在一些实施方案中，核酸突变编码AKAP13中的氨基酸取代G624V。在一些实施方案中，核酸突变编码ZNF469中的氨基酸取代G2358R。在一些实施方案中，核酸突变编码SLC29A3中的氨基酸取代S158F。在一些实施方案中，核酸突变编码MUC5AC中的氨基酸取代P4493S。在一些实施方案中，核酸突变编码CROCC中的氨基酸取代P370S。
在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs3742207(例如国立生物技术信息中心的dbSNP数据库中由rs3742207鉴定的SNP)。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs3803230。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs9583500。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs7990383。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs55703767。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs11677877。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2229813。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs1800449。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs1053411。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2116780。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs3749350。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2286194。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs12536657。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2614668。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs745191。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs12598474。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs10932976。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs5908678。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs35803438。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs132728。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs132729。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs132730。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs859063。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2893276。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs6687749。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs13189855。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs6876514。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs6876515。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs13361701。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs883764。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs780667。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs780668。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs13166148。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs10941287。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs7907270。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs200922784。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs9435793。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs116300974。在一些实施方案中，核酸突变对应于参考SNP簇标识符rs2233696。
在一些实施方案中并且根据任何上述内容，干细胞从自体或同源供体获得。在一些实施方案中，该方法包括从受试者获得包含角膜营养不良靶核酸中的核酸突变的干细胞。
在某些实施方案中并且根据任何上述内容，多个干细胞是角膜缘上皮干细胞、口腔粘膜上皮干细胞、牙干细胞、毛囊干细胞、间充质干细胞、脐带衬干细胞或胚胎干细胞。在某些实施方案中，多个干细胞的细胞是角膜缘上皮干细胞。
在一些实施方案中，核酸操作试剂组包含锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、再工程化归巢核酸酶、RNA干扰(RNAi)试剂或成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/核酸酶系统试剂。
在具体的实施方案中，核酸操作试剂为成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/核酸酶系统试剂，其包括：a)与多个干细胞的DNA分子内角膜营养不良靶核酸杂交的引导RNA核酸；和b)编码核酸酶的核酸酶核酸。在此类实施方案中，引导RNA靶向(例如与之杂交)靶核酸并且核酸酶切割DNA分子。在一些实施方案中，CRISPR/核酸酶系统试剂还包括c)修复核酸，其包含野生型形式的角膜营养不良靶核酸或其片段。在此类实施方案中，引导RNA与靶核酸杂交并且核酸酶切割DNA分子，从而创建靶核酸切割位点，从而在创建靶核酸切割位点后修复核酸能够与角膜营养不良靶核酸同源重组。在一些实施方案中，引导RNA和/或修复核酸包含可检测标记物。在具体的实施方案中，可检测标记物是核酸条形码或荧光条形码标记物。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸是TGFβI靶核酸。在其它实施方案中，角膜营养不良靶核酸是COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1靶核酸。在一些实施方案中，操作COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1靶核酸中的两种或更多种。在一些实施方案中，操作TGFβI靶核酸和选自COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、和PLP1靶核酸的一种或多种靶核酸。
在一些实施方案中，CRISPR/核酸酶系统试剂还包含一种或多种试剂，所述试剂通过抑制参与非同源末端连接(NHEJ)途径的基因来增加多个干细胞中的同源重组频率。在某些实施方案中，核酸酶是Cas9核酸酶。
在示例性实施方案中并且根据任何上述内容，在激光眼部手术之后发生角膜营养不良。
在进一步的实施方案中并且根据任何上述内容，该方法进一步包括从分离的一个或多个经操作的干细胞建立稳定的细胞系。
在一些实施方案中，该方法进一步包括重复d)以一个或多个预定频率(例如，每周、每月、每季度、每半年、每年等)将一个或多个经操作的干细胞移植到受试者中。
在第二方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中治疗角膜营养不良的试剂盒。该试剂盒包括：与角膜营养不良靶核酸杂交的引导RNA核酸；和编码核酸酶的核酸酶核酸。在一些实施方案中，试剂盒还包括修复核酸，其包含野生型形式的角膜营养不良靶核酸或其片段。
附图简述
为了更好地理解本系统和方法的前述实施方式及其另外的实施方式，应当结合以下附图参考以下实施方式的描述，其中类似的参考数字在整个附图中指相应的部分。
图1是显示本文中描述的主题方法的一个具体实施方案的示意图的图。
图2是显示可以使用本文提供的主题方法修复的示例性突变的图。
图3显示了新型PAM的变体的位置。
图4显示了CRISPR/Cas9系统的示例性载体，包括使用酿脓链球菌Cas9核酸酶的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
图5显示了用于靶向野生型和突变体角蛋白12(K12)等位基因的sgRNA的示例性设计。设计了使用在K12-L132P等位基因上发现的SNP衍生的PAM的sgRNA(红色)。此PAM不存在于野生型等位基因中。还设计靶向野生型和突变体K12等位基因两者的第二种sgRNA(绿色)并用作阳性对照。
图6显示了使用外源表达构建体评估sgK12LP的等位基因特异性和效力。使用野生型和突变体K12的外源表达构建体来测试sgK12LP的等位基因特异性和效力。(a)双重萤光素酶测定法证明sgK12LP质粒的等位基因特异性，而显示效力与sgK12构建体的效力相当。(b)Western印迹法进一步证明这些属性，其中与经处理但表达K12野生型蛋白质的细胞相比，在用sgK12LP处理的细胞中K12-L132P蛋白显著减少。使用β-肌动蛋白作为加载对照。(c)对表达野生型和突变体等位基因两者的细胞中的总K12的定量逆转录酶-PCR证明mRNA表达的敲低。N＝4(d)然后通过焦磷酸测序量化此mRNA敲低的等位基因比例，证实在共表达这两种KRT12等位基因并用sgK12LP处理的细胞中突变体等位基因的等位基因敲低。N＝4，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7显示了体内sgK12LP诱导的NHEJ。在基质内注射后24小时在小鼠的角膜上皮中观察到GFP表达，证明用于转染角膜上皮的基质内质粒注射的功效(a；N＝2)。注射后48小时未观察到GFP表达。对来自用sgK12LP构建体注射的人K12-L132P杂合小鼠的gDNA的测序证明由于KRT12-L132P等位基因的切割引起的大缺失和NHEJ的诱导。在测序的13个克隆中，发现5个经历了NHEJ(b)。
图8显示使用为TGFBI突变R514P(A)、L518R(B)和L509R(C)设计的SNP衍生的PAM引导RNA的结果，并且使用萤光素酶表达来评估野生型和突变体等位基因表达。设计阳性对照(sgW或sgWT)引导以切割WT(蓝色柱形)和MUT(红色柱形)等位基因两者，并如上所示切割这两种等位基因，如预期。用于L518R的引导(sgM或sgMUT)显示最大的等位基因特异性，对突变体等位基因具有最小切割(红色柱形)。如预期的阴性对照引导(sgN或sgNSC)不切割WT或MUT DNA。
图9显示了使用针对R124设计的突变体等位基因特异性引导RNA的结果。使用TGFBI突变和萤光素酶表达来评估野生型和突变体等位基因表达。阳性对照sgWT引导设计为切割WT和MUT等位基因两者，并且如上所示切割这两种等位基因，如预期(每个图中的中间柱形蓝色和红色柱形)。具有20聚体长度的引导显示较多的WT等位基因DNA编辑。用缩短至18聚体的等位基因特异性RNA指导重复测定法。这减少WT DNA切割的数目(图的右手图和图上的右侧柱形(蓝色柱形))。
图10显示了用非特异性阴性对照sgRNA转染左眼，而用靶向Luc2的sgRNA转染右眼。
图11显示了来自酿脓链球菌(Spy)和金黄色葡萄球菌(Sau)的Cas9核酸酶的示例性sgRNA序列、核苷酸和氨基酸序列。
发明详述
I.导言
角膜营养不良是一组遗传性疾病，其特征在于角膜，即眼的透明前部中的物质的双侧异常沉积。已知此类角膜营养不良的亚组，上皮-基质角膜营养不良，与转化生长因子β诱导(TGFβI)基因中的突变相关。TGFβI基因编码结合I型、II型和IV型胶原的含有RGD的蛋白质。
在一些情况下，上皮-基质角膜营养不良基于不透明度的临床表现、疾病的临床特征以及沉积物的组织病理学染色特性彼此区分，并且分为亚型。不受任何特定操作理论的束缚，认为TGFβI基因中的特定突变导致与此类角膜营养不良相关的特定表型，并且导致不同表型的临床特征的角膜不透明度源自整个或部分的突变编码TGFβI蛋白的沉积。
用于组织修复和再生的基于干细胞的治疗为许多眼病症提供了有希望的治疗方法，包括角膜营养不良。干细胞能够自我更新和分化，以产生多种成熟细胞谱系。可以利用此类细胞的移植作为临床工具以重建靶组织(例如角膜组织)，从而恢复生理和解剖功能性。
在开发核酸操作试剂方面的进步已经允许干细胞中的核酸(例如DNA和RNA)的简单且有效的操作。CRISPR试剂的开发提供了DNA编码的、RNA介导的、DNA或RNA靶向的序列特异性靶向。例如，CRISPR系统可以用于将供体DNA精确插入靶细胞基因组中。此类核酸操作试剂使研究人员能够精确操作特定的基因组元件。
本公开至少部分基于使用基于干细胞的方法来治疗眼疾病的方法的发现。在具体的实施方案中，获得从经历眼营养不良的治疗的受试者分离的干细胞，并使用CRISPR系统试剂进行遗传修饰以校正与眼疾病相关的突变等位基因。
在一方面，本文中提供了用于治疗角膜营养不良的方法(例如，图1)。例如，方法包括操作来自受试者的干细胞中的角膜营养不良靶核酸中的核酸突变以校正核酸突变，从而形成经操作的干细胞；并将经操作的干细胞移植到受试者中。在一些实施方案中，方法可以包括以下步骤：从受试者获得多个干细胞，所述干细胞包含靶角膜营养不良核酸中的核酸突变；b)操作多个干细胞的一个或多个干细胞中的核酸突变以校正核酸突变，从而形成一个或多个经操作的干细胞；c)分离一个或多个经操作的干细胞；并且d)将一个或多个经操作的干细胞移植到受试者中。将在下面进一步详细讨论主题方法的特征。
II.角膜营养不良
本文中提供的方法用于治疗有此需要的受试者中的一种或多种角膜营养不良。
可以用方法治疗的受试者包括但不限于哺乳动物受试者，如小鼠、大鼠、狗、狒狒、猪或人。在一些实施方案中，受试者是人。可以使用方法治疗至少1岁、2岁、3岁、5岁、10岁、15岁、20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或100岁龄的受试者。
如本文所用，“角膜营养不良”是指眼外层(角膜)中的一组遗传性病症中的任何一种。例如，角膜营养不良可以以角膜中物质的双侧异常沉积为特征。角膜营养不良包括但不限于角膜营养不良的以下四种IC3D类别(参见例如Weiss et al.,Cornea 34(2):117-59(2015))：上皮和上皮下营养不良、上皮-基质TGFβI营养不良、基底营养不良和内皮营养不良。在一些实施方案中，角膜营养不良选自上皮基底膜营养不良(EBMD)、米斯曼角膜营养不良(Meesmann corneal dystrophy，MECD)，Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)、格子状角膜营养不良(LCD)、颗粒状角膜营养不良(GCD)和施奈德角膜营养不良(Schnyder cornealdystrophy，SCD)。在另外的实施方案中，本文的角膜营养不良排除MECD。
在另外的实施方案中，角膜营养不良是由一个或多个突变如SNP引起的，例如包括位于选自转化生长因子、β诱导(TGFBI)、角蛋白3(KRT3)、角蛋白12(KRT12)、GSN和含有UbiA异戊烯转移酶域1(UBIAD1)的基因中的那些SNP。在进一步的实施方案中，如本文所示，SNP位点导致编码突变体蛋白中的突变体氨基酸。在进一步的实施方案中，包含SNP位点的突变体序列编码选自下组的突变体蛋白：(i)突变体TGFBI蛋白，其包含对应于例如蛋白质登录号Q15582的TGFBI中的Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu、和/或Thr125_Glu126del的突变；(ii)突变体KRT3蛋白，其包含对应于例如蛋白质登录号P12035或NP_476429.2的角蛋白3蛋白中的Glu498Val、Arg503Pro、和/或Glu509Lys；(iii)具有例如蛋白质登录号Q99456.1或NP_000214.1的KRT12中的Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、Asn133Lys、Arg135Gly、Arg135Ile、Arg135Thr、Arg135Ser、Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、Lle391_Leu399dup、Ile426Val、Ile 426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro、和/或Leu433Arg的突变体KRT12蛋白；(iv)例如蛋白质登录号P06396的GSN中具有Asp214Tyr的突变体GSN蛋白；(v)突变体UBIAD1蛋白，其包含对应于蛋白质登录号Q9Y5Z9的UBIAD1中的Ala97Thr、Gly98Ser、Asn102Ser、Asp112Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、Leu121Phe、Val122Glu、Val122Gly、Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、Asp236Glu、和/或Asp240Asn的突变。例如，包含SNP位点的突变体序列编码通过在对应于蛋白质登录号Q15582的氨基酸位置509的氨基酸位置处用Arg替换Leu突变的突变体TGFBI蛋白的至少一部分。在此情况下，SNP位点处的突变可以导致编码对应于蛋白质登录号Q15582的氨基酸位置509的氨基酸位置处的突变体氨基酸。如本文所用，“对应于”人蛋白质中的特定突变的突变可以包括在人蛋白质的特定突变的相应位点处发生的不同物种中的突变。还如本文所用，当突变体蛋白描述为包含例如Leu509Arg的特定突变体时，此类突变体蛋白可以包含在与相关人蛋白质中，例如如本文所述的蛋白质登录号Q15582的TGFBI蛋白质中的特定突变体对应的突变体位点处发生的任何突变。
在一些实施方案中，本文所述的突变体排除KRT12蛋白中的任何突变体。在一些实施方案中，本文所述的突变体排除对应于例如蛋白质登录号Q99456.1的KRT12中的Leu132Pro的突变。在进一步的实施方案中，本文所述的SNP排除在KRT12基因中发生的任何SNP。在又一些实施方案中，本文所述的SNP排除导致KRT12蛋白质中的Leu132Pro突变的任何SNP。SNP可以进一步排除导致KRT12蛋白中的Leu132Pro突变的PAM位点处的SNP(AAG>AGG)。
上皮-基质角膜营养不良包括雷-布二氏角膜营养不良(Reis-Bucklers cornealdystrophy)、Thiel-Behnke角膜营养不良、格子状角膜营养不良1型、颗粒状角膜营养不良1型和颗粒状角膜营养不良2型。基质角膜营养不良包括斑点状角膜营养不良、施奈德角膜营养不良、先天性基质角膜营养不良、后无定形角膜营养不良、Francois中心云雾状营养不良(central cloudy dystrophy of Francois)、和德斯密前角膜营养不良(pre-Descemetcorneal dystrophy)。在一些实施方案中，方法用于治疗上皮-基质角膜营养不良。在一些实施方案中，角膜营养不良是雷-布二氏角膜营养不良。在某些实施方案中，角膜营养不良是Thiel-Behnke角膜营养不良。在某些实施方案中，角膜营养不良是格子状角膜营养不良1型。在某些实施方案中，角膜营养不良是颗粒状角膜营养不良1型。在某些实施方案中，角膜营养不良是颗粒状角膜营养不良2型。上皮-基质营养不良是由TGFβI突变引起的。如本文所用，“转化生长因子，β诱导”、“TGFBI”、“TGFβI”、“BIGH3”、“CDB1”、“CDG2”、“CDG1”、“CSD”、“CSD1”、“CSD2”、“CSD3”、“EBMD”和“LCD1”均指与I型、II型和IV型胶原(登录号：NM_00358和MP_000349(人)和NM_009369和MP_033395(小鼠))结合的含RGD的蛋白质。在人中，TGFβI由TGFBI基因，基因座5q31编码。RGD基序存在于许多调节细胞粘附的胞外基质蛋白中，并充当几种整联蛋白的配体识别序列。TGFβI由转化生长因子-β诱导并起到抑制细胞粘附的作用。在上皮-基质营养不良中，TGFBI基因突变，TGFβI结构异常，不溶性突变体TGFβI或其蛋白水解片段积累在角膜中发生。
在其它实施方案中，受试者具有颗粒状角膜营养不良II型。如本文所用，“颗粒状角膜营养不良II型”、“阿韦利诺角膜营养不良”、“颗粒状角膜营养不良2型”和“组合颗粒状-格子状角膜营养不良”都是指位于染色体5q31上的TGFBI基因突变引起的颗粒状角膜营养不良的常染色体显性形式。在某些情况下，颗粒状角膜营养不良II型的特征是表面中央角膜基质中的不规则形状的界限良好的颗粒状沉积物和进行性视力障碍。患有颗粒状角膜营养不良II型的杂合患者随年龄而具有逐渐增加的视力丧失，并在生命的后期中变得严重。损伤出现在生命的前十年内，并且到3岁龄可以是明显的。颗粒状角膜营养不良II型发作一般在纯合患者中较早，并可以伴有轻度角膜糜烂。视敏度通常保持良好，直到状况过程的晚期。不透明度最初是小的表面白色点。随后，形成环形或星状的基质不透明度。最后阶段的不透明度是更表面且半透明的，并且可以在前基质中合并。
在一些实施方案中，受试者具有圆锥角膜。圆锥角膜(KTCN)是最常见的角膜扩张性病症，约6-23.5％的受试者携带阳性家族史(Wheeler,J.,Hauser,M.A.,Afshari,N.A.,Allingham,R.R.,Liu,Y.,Reproductive Sys Sexual Disord2012；S:6)。报告的KTCN流行率的范围为每100,000之8.8至54.4。流行率的此种变异部分由于用于诊断该疾病的不同标准。(Wheeler,J.,Hauser,M.A.,Afshari,N.A.,Allingham,R.R.,Liu,Y.,ReproductiveSys Sexual Disord 2012；S:6；and Nowak,D.,Gajecka,M.,Middle East Afr JOphthalmol 2011；18(1):2-6)。在文献内存在许多试图确限定KTCN遗传原因的研究。这些研究发现了许多可能的遗传变体或单核苷酸多态性(SNP)，据信它们根据实验参数对疾病的病因起作用。
此前，发现杂合个体在LASIK激光眼部手术后对加速丧失视力高度易感。值得注意的是，手术后两年，在具有增加的侵入性的这些患者中观察到增加角膜的不透明性，最终导致完全丧失视力(Jun,R.M.et al.,Opthalmology,111:463,2004)。此前，已经进行眼部手术，预期LASIK或Excimer激光手术会消除患有角膜营养不良的患者的视力模糊。对于假设的三十万例LASIK手术病例，根据患有颗粒状角膜营养不良II型的杂合患者的最小估计的1/1000，300人将丧失视力。经历了LASIK手术的患者主要在进行生产活动的其20和30多岁中。另外，美国2000年批准LASIK手术后，发现经历LASIK手术的患有颗粒状角膜营养不良II型的非裔美国人患者丧失眼视力，这推断世界各地可以发生大量类似病例。
在一些实施方案中，具有颗粒状角膜营养不良II型的受试者对于TGFβI中的突变是纯合的。在其它实施方案中，具有颗粒状角膜营养不良II型的受试者对于TGFβI中的突变是杂合的。在一些实施方案中，受试者具有编码TGFβI多肽中精氨酸124、精氨酸555或组氨酸626的取代的突变。在具体的实施方案中，核酸突变编码选自R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P的氨基酸取代。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有颗粒状角膜营养不良I型，并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84,85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者具有颗粒状角膜营养不良I型，并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有颗粒状角膜营养不良II型，并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84,85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者具有颗粒状角膜营养不良II型并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有格子状角膜营养不良1型并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者具有格子状角膜营养不良1型并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有雷-布二氏角膜营养不良，并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84,85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者具有雷-布二氏角膜营养不良，并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有Thiel-Behnke角膜营养不良，并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者Thiel-Behnke角膜营养不良，并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在一些实施方案中，受试者具有圆锥角膜并且对于以下角膜靶核酸之一中的突变是纯合的：COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1。在其它实施方案中，受试者具有圆锥角膜并且对于以下角膜靶核酸之一中的突变是杂合的：COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1。
在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A1中的氨基酸取代Q1334H的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A2中的氨基酸取代G683A的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A2中的氨基酸取代P718S的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A2中的氨基酸取代R517K的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A3中的氨基酸取代D326Y的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A3中的氨基酸取代H451R的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码COL4A4中的氨基酸取代V1327M的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码LOX中氨基酸取代R158Q的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码AKAP13中的氨基酸取代A1046T的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码AKAP13中的氨基酸取代G624V的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码ZNF469中的氨基酸取代G2358R的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码SLC29A3中的氨基酸取代S158F的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码MUC5AC中的氨基酸取代P4493S的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有编码CROCC中的氨基酸取代P370S的核酸突变。
在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs3742207(例如，国立生物技术信息中心的dbSNP数据库中由rs3742207鉴定的SNP)的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有的核酸突变that对应于参考SNP簇标识符rs3803230。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs9583500的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs7990383的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs55703767的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs11677877的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2229813的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs1800449的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs1053411的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2116780的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs3749350的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2286194的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs12536657的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2614668的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs745191的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs12598474的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs10932976的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs5908678的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs35803438的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs132728的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs132729的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs132730的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs859063的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2893276的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs6687749的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs13189855的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs6876514的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs6876515的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs13361701的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs883764的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs780667的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs780668的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs13166148的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs10941287的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs7907270的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs200922784的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs9435793的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs116300974的核酸突变。在一些实施方案中，受试者具有对应于参考SNP簇标识符rs2233696的核酸突变。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有圆锥角膜并且是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84,85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100岁龄。在一些实施方案中，经历治疗的受试者具有圆锥角膜并且是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、或100岁龄。
在某些实施方案中，经历治疗的受试者具有颗粒状角膜营养不良II型并且还已经经历激光眼手术。在一些实施方案中，激光眼手术后6个月或更少、1年或更少、1.5年或更少、2年或更少、2.5年或更少、3年或更少、3.5年或更少、4年或更少、4.5年或更少、5年或更少、5.5年或更少、6年或更少、6.5年或更少、7年或更少、7.5年或更少、8年或更少、8.5年或更少、9年或更少、9.5年或更少、10年或更少、15年或更少、20年或更少、25年或更少、30年或更少、35年或更少、40年或更少、45年或更少、50年或更少、55年或更少、60年或更少、65年或更少、70年或更少、75年或更少、80年或更少、85年或更少、90年或更少、95年或更少、或100年或更少进行处理。
在本文提供的方法的一些实施方案中，使用治疗就疾病或状况(例如角膜营养不良)而言提供阳性治疗响应。“阳性治疗响应”意指疾病或状况的改善，和/或与疾病或状况相关的症状的改善。可以使用任何合适的方法评估主题治疗方法的治疗效果。在某些实施方案中，通过与对照(例如治疗前蛋白质沉积量)相比治疗后受治疗者的角膜上的蛋白质沉积减少来评估治疗。在一些实施方案中，与经历治疗前的角膜相比，主题方法将受试者中的角膜蛋白沉积量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。也可以使用角膜不透明性来评估使用主题方法的治疗效果。此外，在一些实施方案中，通过视觉功能来评估治疗。可以使用本领域已知的任何合适的测试进行受试者中的视觉功能的评估，所述测试包括但不限于未矫正视敏度(UCVA)、最佳矫正视敏度(BCVA)和亮度敏锐度测试(BAT)的评估。参见例如Awaadet al.,Am J Ophthalmol.145(4):656–661(2008)和Sharhan et al.,Br J Ophthalmol84:837-841(2000)，其通过引用完整并入用于所有目的，以及特别出于涉及评估视敏度的标准的所有教导。在某些实施方案中，与经历治疗前相比，受试者的视敏度改善至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
在一些实施方案中，对受试者测试一种或多种角膜营养不良。在一些实施方案中，对受试者测试与本文所述的角膜营养不良相关的核酸突变，如SNP。
例如，对受试者测试靶TGFβI核酸中的核酸突变。在某些实施方案中，对受试者测试编码TGFβI多肽中的精氨酸124、精氨酸555或组氨酸626的氨基酸取代的核酸突变。在一些实施方案中，核酸突变编码选自R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P的氨基酸取代。例如，使用颊拭子收集受试者的颊细胞。对收集的口腔细胞分析编码TGFβI多肽中的精氨酸124、精氨酸555或组氨酸626的氨基酸取代的一个或多个核酸突变的存在。在一些实施方案中，例如，通过检测阿维利诺角膜营养不良相关单核苷酸多态性(SNP)，诸如导致TGFβI基因中的R124突变的那些(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸418处的G至A转变引起的R124H突变，也称为C(G/A)CSNP)检测角膜营养不良。在一些实施方案中，角膜营养不良例如通过检测颗粒状角膜营养不良相关SNP，诸如导致TGFβI基因中的R555突变的那些SNP(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸1663处的C至T转变引起的R555W突变，也称为(C/T)GG SNP)检测角膜营养不良。在一些实施方案中，例如通过检测格子状营养不良相关的SNP，诸如导致TGFβI基因中的R124和/或626突变的那些SNP(包括例如但不限于由在TGFβI基因的核苷酸417处的C至T转变引起的R124C突变，也称为(C/T)GC SNP或由TGFβI基因的核苷酸1924处的A至C转变引起的H626P突变)检测角膜营养不良。在一些实施方案中，例如通过检测雷-布二氏角膜营养不良相关SNP，例如导致TGFβI基因中的R124突变的那些SNP(包括例如但不限于由TGFβI基因的核苷酸418处的G至T转变引起的R124L突变，也称为C(G/T)CSNP)检测角膜营养不良。在一些实施方案中，例如通过检测Thiel-Behnke角膜营养不良相关SNP，诸如导致TGFβI中的R555突变的SNP基因(包括例如但不限于在TGFβI基因的核苷酸1664处由G至A转变引起的R555Q突变，也称为C(G/A)G SNP)检测角膜营养不良。在一些实施方案中，对受试者测试在与圆锥角膜相关的角膜营养不良靶核酸中的核酸突变。在某些实施方案中，角膜营养不良靶核酸是COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1。
在一些实施方案中，在将一个或多个经操作的干细胞移植入受试者之前，测试受试者的一种或多种角膜营养不良。
III.干细胞
主题方法包括获得多个干细胞。任何合适的干细胞都可以用于主题方法，这取决于待治疗的角膜营养不良的类型。在某些实施方案中，干细胞获自自体、同源或异源供体。当从异源供体获得干细胞时，异源供体的干细胞和待治疗的受试者是供体-受体组织相容的。在某些实施方案中，从需要治疗角膜营养不良的受试者获得自体干细胞。获得的干细胞在与待治疗的特定角膜营养不良相关的基因中携带突变(例如，具有上皮-基质营养不良的受试者的TGFBI基因中具有突变的干细胞，如上文讨论)。合适的干细胞包括但不限于牙髓干细胞、毛囊干细胞、间充质干细胞、脐带衬干细胞、胚胎干细胞、口腔粘膜上皮干细胞和角膜缘上皮干细胞。
在一些实施方案中，多个干细胞包括角膜缘上皮干细胞。角膜缘上皮干细胞(LESC)位于角膜的角膜缘区域中，并且负责角膜表面的维持和修复。不受任何特定操作理论的束缚，认为LESC经历不对称细胞分裂，产生保留在干细胞小生境中以再增殖干细胞合并物和子代早期瞬时扩增细胞(daughter early transient amplifying cell，eTAC)的干细胞。此种较为分化的eTAC从干细胞小生境中取出并且能够分裂以进一步产生瞬时扩增细胞(TAC)，最终产生终末分化的细胞(DC)。例如，可以通过从受试者的眼进行活组织检查来获得LESC。参见例如Pellegrini et al.,Lancet 349:990-993(1997)。可以使用任何合适的技术(包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)和离心技术)分离和分选从角膜缘活组织检查获得的LESC以用于主题方法。可以利用干细胞相关标志物的阳性表达和分化标志物的阴性表达从活组织检查中分选LESC。阳性干细胞标志物包括但不限于转录因子p63、ABCG2、C/EBPδ和Bmi-1。阴性角膜特异性标志物包括但不限于细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)、连接蛋白43和外皮蛋白(involucrin)。在一些实施方案中，多个干细胞对p63、ABCG2或其组合的表达呈阳性。在某些实施方案中，多个干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、86％.88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞表达p63、ABCG2、C/EBPδ和Bmi-1或其组合。在一些实施方案中，多个干细胞对CK3、CK12、连接蛋白43、外皮蛋白或其组合的表达呈阴性。在某些实施方案中，多个干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、86％.88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％细胞不表达CK12、连接蛋白43、外皮蛋白或其组合。例如，在Takacs etal.,Cytometry A 75:54-66(2009)中描述了可用于LESC的其它标志物，其通过引用完整并入本文用于所有目的，特别是与LESC标志物相关的所有教导。干细胞特征如细胞大小和高核质比(nuclear to cytoplasmic ratio)可以用来帮助鉴定LESC。
除了LESC之外，从受试者的角膜分离的其它干细胞也可以在主题方法的情况下使用。示例性角膜干细胞包括但不限于基质干细胞、基质成纤维细胞样细胞、基质间充质细胞、神经嵴衍生的角膜干细胞和推定的内皮干细胞。
在一些实施方案中，与本文所述方法一起使用的细胞是从受试者的角膜获得的基质干细胞。例如，可以使用任何合适的方法分离基质干细胞，所述方法包括但不限于以下中描述的方法：Funderburgh et al.,FASEB J 19:1371-1373(2005)；Yoshida et al.,Invest Ophtalmol Vis Sci 46:1653-1658(2005)；Du et al.Stem Cells 1266-1275(2005)；Dravida et al.,Brain Res Dev Brain Res160:239-251(2005)；以及Polisettyet al.Mol Vis 14:431-442(2008)，其通过引用完整并入本文用于所有目的，特别是涉及分离和培养各种基质干细胞的所有教导。
这些基质干细胞特征性的标志物包括但不限于Bmi-1、Kit、Notch-1、Six2、Pax6、ABCG2、Spag10、和p62/OSIL。在一些实施方案中，多个干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、86％.88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞表达Bmi-1、Kit、Notch-1、Six2、Pax6、ABCG2、Spag10、或p62/OSIL或其组合。在某些实施方案中，基质干细胞对于CD31、SSEA-4、CD73、CD105呈阳性，且对于CD34、CD45、CD123、CD133、CD14、CD106和HLA-DR呈阴性。在某些实施方案中，多个干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、86％.88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞对于CD31、SSEA-4、CD73、CD105呈阳性且对于CD34、CD45、CD123、CD133、CD14、CD106和HLA-DR呈阴性。在其它实施方案中，基质细胞对CD105、CD106、CD54、CD166、CD90、CD29、CD71、Pax6呈阳性，且对于SSEA-1、Tra1-81、Tra1-61、CD31、CD45、CD11a、CD11c、CD14、CD138、Flk1、Flt1、和VE-钙粘蛋白呈阴性。在某些实施方案中，多个干细胞中的至少65％、70％、75％、80％.85％、86％.88％.89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％细胞对于CD105、CD106、CD54、CD166、CD90、CD29、CD71、Pax6呈阳性且对于SSEA-1、Tra1-81、Tra1-61、CD31、CD45、CD11a、CD11c、CD14、CD138、Flk1、Flt1、和VE-钙粘蛋白呈阴性。
在某些实施方案中，与主题方法一起使用的细胞是从受试者角膜分离的内皮干细胞。例如，在Engelmann et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci 29:1656-1662(1988)中描述了分离此类干细胞的方法，其通过引用完整并入本文用于所有目的，特别是涉及分离和培养角膜内皮干细胞的所有教导。
分离后，可以使用任何合适的方法培养多个干细胞(例如LESC)以产生稳定的细胞系。可以在操作本文所述的核酸突变之前和/或之后培养干细胞。例如，可以在存在或不存在作为饲养细胞的成纤维细胞(例如3T3)的情况下维持培养物。在其它情况下，将人羊膜上皮细胞或人胚胎成纤维细胞用作培养物的饲养层。Takacs et al.CytometryA 75:54-66(2009),Shortt et al.,Surv Opthalmol VisSci 52:483-502(2007)；和Cauchi et al.AmJ Ophthalmol 146:251-259(2008)中进一步描述了用于培养LESCs的合适技术，其通过引用完整并入本文用于所有目的，并且特别是涉及LESC培养的所有教导。
IV.核酸操作试剂
在一方面，操作干细胞中的核酸突变以校正角膜营养不良靶核酸中的核酸突变。如本文中所用，“角膜营养不良靶核酸”指包含与一种或多种角膜营养不良有关的突变的核酸。
在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸位于TGFBI、KRT3、KRT12、GSN、和UBIAD1基因中。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸与SNP位点有关，所述SNP位点导致编码如本文中所示的突变体蛋白质中的突变体氨基酸。在其它实施方案中，包含SNP位点的突变体序列编码选自下组的突变体蛋白质：(i)突变体TGFBI蛋白，其包含对应于例如蛋白质登录号Q15582的TGFBI中的Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu、和/或Thr125_Glu126del的突变；(ii)突变体KRT3蛋白，其包含对应于例如蛋白质登录号P12035或NP_476429.2的角蛋白3蛋白中的Glu498Val、Arg503Pro、和/或Glu509Lys的突变；(iii)突变体KRT12蛋白，其具有例如蛋白质登录号No.Q99456.1或NP_000214.1的KRT12中的Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、Asn133Lys、Arg135Gly、Arg135Ile、Arg135Thr、Arg135Ser、Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、Lle391_Leu399dup、Ile 426Val、Ile 426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro、和/或Leu433Arg；(iv)突变体GSN蛋白，其具有例如蛋白质登录号P06396的GSN中的Asp214Tyr；和(v)突变体UBIAD1蛋白，其包含对应于例如蛋白质登录号Q9Y5Z9的UBIAD1中的Ala97Thr、Gly98Ser、Asn102Ser、Asp112Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、Leu121Phe、Val122Glu、Val122Gly、Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、Asp236Glu、和/或Asp240Asn的突变。
在某些实施方案中，角膜营养不良靶核酸与颗粒状角膜营养不良II型相关(例如TGFβI)。在其它实施方案中，角膜营养不良靶核酸与圆锥角膜相关。不受任何特定的操作理论限制，认为图2中描绘的突变与圆锥角膜相关。在某些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包括图2中描述的一种或多种突变。
要操作的干细胞包括个别的分离的干细胞或来自由分离的干细胞建立的干细胞系的干细胞。可以使用任何合适的遗传操作方法来校正干细胞中的核酸突变。
在某些实施方案中，将核酸操作试剂导入干细胞中。此类核酸操作试剂随后校正干细胞中的核酸突变以形成经操作的干细胞。核酸操作试剂包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)系统试剂。参见例如Gaj et al.,Trends Biotechnol31(7):397-405(2013)，其通过引用完整并入本文用于所有目的，特别是涉及核酸操作试剂的所有教导。此类试剂通过诱导靶DNA双链断裂(DSB)来实现靶核酸的有效和精确修饰而起作用，所述靶DNA双链断裂刺激细胞DNA修复机制，包括易错非同源末端连接(NHEJ)和/或同源性定向修复(HDR)途径。在存在含有核酸突变的野生型等位基因(例如野生型TGFBI或其片段)的同源修复核酸的情况下，有切口的靶核酸经历同源重组，从而用野生型替换突变体等位基因并且校正经操作的干细胞中的核酸突变。
在一些情况下，与本文提供的主题方法一起使用的靶核酸操作试剂包括CRISPR系统试剂。与主题方法一起使用的CRISPR系统试剂包括例如编码II型核酸酶(例如Cas9核酸酶或CpfI核酸酶)的核酸、编码引导RNA(gRNA)的核酸和包含感兴趣基因的野生型等位基因或其片段的修复核酸。引导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的组合。在利用CRISPR系统试剂的一些实施方案中，包含crRNA和tracrRNA作为单独的试剂代替引导RNA。
在一些实施方案中，修复核酸能够在干细胞基因组中包含如本文中所述的与角膜营养不良相关的突变(即，“角膜营养不良靶核酸”)的区域处通过HDR途径进行同源重组。在某些实施方案中，修复核酸能够与TGFBI、KRT3、KRT12、GSN、和UBIAD1基因内的靶核酸同源重组。在具体的实施方案中，修复核苷酸分子能够与编码本文所述的突变体氨基酸(例如Leu132Pro)的TGFBI基因中的核酸同源重组。在一些实施方案中，至少一种载体包含多种修复核酸。修复核酸还可以包含用于鉴定和分选含有特定突变的本文所述的细胞的标记物。可以与修复核苷酸分子一起包含的示例性标记物包括荧光标记物和可通过长度或序列鉴定的核酸条形码。
编码II型核酸酶和引导RNA的核酸可以各自可操作地连接至调控元件，并且可以包含在单一载体上或不同载体上。在一些实施方案中，引导RNA和II型核酸酶包含在相同的载体上。在一些实施方案中，引导RNA和II型核酸酶包含在不同的载体上。
在一些示例性实施方案中，包含编码引导RNA和/或II型核酸酶的核酸的载体能够稳定整合到多个干细胞的一个或多个细胞的细胞基因组中。在一些例子中，II型核酸酶和引导RNA在自然界中不一起出现。用于本发明的示例性CRISPR系统试剂和方法更为详细记载于在例如Shalem et al.,Nature Reviews Genetics 16:299-311(2013)；Zhang etal.,Human Molecular Genetics23(R1):R40-6(2014)；Zetsche et al.dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038(2015)和Zhu et al.Cell 157:1262-1278(2014)，其通过引用整体并入本文用于所有目的，特别是关于涉及CRISPR系统试剂的所有教导。
在CRISPR系统中，通过gRNA序列和靶核酸的互补物之间的碱基配对将gRNA/II型核酸酶复合物募集至基因组靶序列。gRNA/II型核酸酶复合物的结合将II型核酸酶定位于基因组靶序列，从而II型核酸酶可以切割DNA的两条链，导致双链断裂(DSB)。
可以通过(1)非同源末端连接(NHEJ)DNA修复途径或(2)同源性定向修复(HDR)途径发生DSB的修复。NHEJ修复途径通常导致DSB位点处的插入/缺失(InDel)，其可导致移码和/或提前终止密码子，有效破坏靶核酸的可读框(ORF)，从而降低由靶核酸编码的基因产物的表达。HDR途径需要存在修复核酸，其用于修复DSB。可以通过在修复核酸的情况下使用HDR将特定的核苷酸变化(例如野生型等位基因)导入到靶向的突变体基因中。例如，可以使用HDR途径来校正干细胞中的突变，其中突变与本文所述的角膜病症相关(例如TGFBI基因)。
在一些实施方案中，核酸操作试剂包括修复核酸。修复核酸在经由HDR途径修复II型核酸酶诱导的DSB后将特定的等位基因(例如野生型等位基因)引入多个干细胞的一个或多个细胞的基因组中。在一些实施方案中，修复核酸是单链DNA(ssDNA)。在其它实施方案中，修复核酸作为质粒载体导入细胞中。在一些实施方案中，修复核酸的长度是20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、50至55、55至60、60至65、65至70、70至75、75至80、80至85、85至90、90至95、95至100、100至105、105至110、110至115、115至120、120至125、125至130、130至135、135至140、140至145、145至150、150至155、155至160、160至165、165至170、170至175、175至180、180至185、185至190、190至195、或195至200个核苷酸。在一些实施方案中，修复核酸的长度是200至300、300,至400、400至500、500至600、600至700、700至800、800至900、900至1,000个核苷酸。在其它实施方案中，修复核酸的长度是1,000至2,000、2,000至3,000、3,000至4,000、4,000至5,000、5,000至6,000、6,000至7,000、7,000至8,000、8,000至9,000、或9,000至10,000个核苷酸。在一些实施方案中，修复核酸能够在干细胞基因组中包含如本文中所述的与角膜营养不良有关的突变(即“角膜营养不良靶核酸”)的区域处经历通过HDR途径的同源重组。在某些实施方案中，修复核酸能够与TGFBI基因内的靶核酸同源重组。在具体的实施方案中，修复核酸能够与编码TGFβI多肽中精氨酸124、精氨酸555、或组氨酸626的TGFBI基因中的核酸同源重组。在某些实施方案中，修复核酸能够与编码选自R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P的氨基酸取代的TGFBI基因中的核酸同源重组。在一些实施方案中，修复核酸包含编码TGFβI多肽的精氨酸124的核酸。例如，使用修复核酸来插入TGFβI基因的核苷酸417处的胞嘧啶(例如校正TGFβI基因的核苷酸417处的C至T转变)、TGFβI基因的核苷酸418处的鸟嘌呤(例如以校正TGFβI基因的核苷酸418处的G至A或G至T转变)。在某些实施方案中，修复核酸包含编码TGFβI多肽的精氨酸555的核酸。例如，使用修复核酸以插入TGFβI基因的核苷酸1663处的胞嘧啶(例如以校正TGFβI基因的核苷酸1663处的C至T转变)并且插入TGFβI基因的核苷酸1664处的鸟嘌呤(例如以校正TGFβI基因的核苷酸1663处的G至A转变)。在某些实施方案中，修复核酸包含编码TGFβI多肽的组氨酸626的核酸。例如，使用修复核酸以插入TGFβI基因的核苷酸1924处的腺嘌呤(例如以校正TGFβI基因的核苷酸1924处的A至C转变)。在又一些实施方案中，修复核酸包含编码TGFβI多肽的精氨酸124、精氨酸555、和组氨酸626的核酸。
在其它实施方案中，修复核酸能够与同圆锥角膜有关的角膜营养不良靶核酸(例如包含图2中描述的一种或多种突变的靶核酸)同源重组。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含COL4A1-4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1中的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs3742207(例如国立生物技术信息中心的dbSNP数据库中由rs3742207鉴定的SNP)的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs3803230的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs9583500的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs7990383的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs55703767的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs11677877的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2229813的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs1800449的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs1053411的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2116780的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs3749350的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2286194的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs12536657的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2614668的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs745191的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs12598474的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs10932976的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs5908678的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs35803438的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs132728的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于的突变参考SNP簇标识符rs132729。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于的突变参考SNP簇标识符rs132730在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs859063的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2893276的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs6687749的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs13189855的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs6876514的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs6876515的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于的突变参考SNP簇标识符rs13361701。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs883764的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs780667的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs780668的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs13166148的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于的突变参考SNP簇标识符rs10941287。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs7907270的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs200922784的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs9435793的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs116300974的突变。在一些实施方案中，角膜营养不良靶核酸包含对应于参考SNP簇标识符rs2233696的突变。
在一些实施方案中，核酸操作试剂包括多种修复核酸。在某些实施方案中，修复核酸包含编码TGFβI多肽的精氨酸124的核酸和编码TGFβI多肽的精氨酸555的核酸。在一些实施方案中，修复核酸还包含编码TGFβI多肽的组氨酸626的核酸。在一些实施方案中，与主题方法一起使用的CRISPR系统试剂包括编码用于编码TGFβI多肽的精氨酸124的核酸的第一引导RNA的第一核酸和编码用于编码TGFβI多肽的精氨酸555的核酸的第二引导RNA的第二核酸。在一些实施方案中，CRISPR系统试剂还包括编码用于编码组氨酸626的核酸的第三引导RNA的第三核酸。在一些实施方案中，CRISPR系统试剂还包括第一核酸、第二核酸和第三核酸的任何组合(例如，第一核酸和第三核酸的组合，或第二核酸和第三核酸的组合)。在一些实施方案中，修复核酸能够修复角膜营养不良靶核酸，其编码一种或多种氨基酸取代，包括COL4A1中的Q1334H、COL4A2中的G683A、COL4A2中的P718S、COL4A2中的R517K、COL4A3中的D326Y、COL4A3中的H451R、COL4A4中的V1327M、LOX中的R158Q、AKAP13中的A1046T、AKAP13中的G624V、ZNF469中的G2358R、SLC29A3中的S158F、MUC5AC中的P4493S、CROCC中的P370S或其组合。
修复核酸还可以包含用于鉴定和分选含有特定突变的干细胞的标记物。可以与修复核酸一起包含的示例性标记物包括可通过长度或序列鉴定的荧光标记物和核酸条形码。
在进一步的实施方案中，核酸操作试剂还包括一种或多种相对于DSB的HNEJ修复促进HDR途径的试剂。此类试剂有利地允许通过HDR途径的修复核酸的同源重组。相对于DSB的HNEJ修复促进HDR途径的试剂包括但不限于抑制参与HNEJ修复的基因的试剂，例如DNA连接酶IV。参见例如Maruyana et al.NatBiotechnol.33(5):538-42(2015)，其通过引用完整并入本文用于所有目的，并且特别是涉及抑制参与DSB的HNEJ修复的基因的试剂的所有教导。
与本文提供的主题方法一起使用的II型核酸酶可以是针对以时间或细胞类型依赖性方式表达而优化的诱导型II型核酸酶。可以与II型核酸酶连接的诱导型启动子包括但不限于四环素诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、甲硫氨酸诱导型启动子(例如MET25，MET3启动子)；和半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL10启动子)。其它合适的启动子包括ADH1和ADH2醇脱氢酶启动子(在葡萄糖中受到抑制，当葡萄糖耗竭和生成乙醇时诱导)、CUP1金属硫蛋白启动子(在存在Cu2+,Zn2+的情况下诱导)、PHO5启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1启动子。
也可以使用表现出改善的特异性的突变体II型核酸酶(参见例如AnnRan etal.Cell 154(6)1380-89(2013)，其通过引用整体并入本文用于所有目的，并且特别是关于所有涉及对靶核酸具有改善的特异性的突变体Cas9核酸酶的教导)。核酸操作试剂还可以包括失活的II型核酸酶(例如，dCas9)。失活的Cas9与单独的核酸元件的结合可以通过空间阻碍RNA聚合酶机制来抑制转录。此外，失活的Cas可以用作其它蛋白质(例如，转录阻遏物、活化剂和募集域)的归巢装置，所述其它蛋白质影响靶位点处的基因表达而不将不可逆的突变导入靶核酸。例如，dCas9可以与转录阻遏物域例如KRAB或SID效应物融合以促进靶位点处的表遗传沉默。也可以通过与VP16/VP64或p64激活域融合将Cas9转化为合成的转录激活物。
可以使用任何合适的方法将核酸操作试剂导入干细胞中。用于导入核酸操作试剂的示例性方法包括但不限于转染、电穿孔和基于病毒的方法。
在一些情况下，一种或多种细胞摄取试剂是转染试剂。转染试剂包括例如基于聚合物的(例如DEAE葡聚糖)转染试剂和阳离子脂质体介导的转染试剂。电穿孔方法也可用于促进核酸操作试剂的摄取。通过施加外部场，诱导细胞中改变的跨膜电位，并且当跨膜电位净值(施加和静息电位差之和)大于阈值时，在膜中产生瞬时渗透结构，并且电穿孔得以实现。参见例如Gehl et al.,Acta Physiol.Scand.177:437–447(2003)。
也可以通过病毒转导将核酸操作试剂递送到干细胞中。合适的病毒递送系统包括但不限于腺伴随病毒(AAV)逆转录病毒和慢病毒递送系统。此类病毒递送系统在干细胞对转染有抗性的情况下特别有用。使用病毒介导的递送系统的方法可以进一步包括制备编码核酸操作试剂的病毒载体并将载体包装到病毒颗粒中的步骤。其它递送核酸试剂的方法包括但不限于脂转染、核转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体和试剂增强的核酸摄取。还可见Neiwoehner et al.,Nucleic Acids Res.42:1341–1353(2014)，其通过引用整体并入本文用于所有目的，并且特别是关于涉及试剂递送系统的所有教导。
在一方面，通过对干细胞导入工程化成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统来操作干细胞中的角膜营养不良靶核酸中的核酸突变，其中CRISPR/Cas9系统包含至少一种包含编码Cas9核酸酶的核苷酸分子和单一引导RNA(sgRNA)的载体，并且Cas9核酸酶和所述sgRNA不一起天然存在。
术语“非天然存在”或“工程化”可互换使用并且指示人工参与。当提及核酸分子或多肽时，术语意指核酸分子或多肽至少基本上不含至少一种与它们在自然界中天然相关并且如在自然界中找到的其它组分。在一些实施方案中，Cas9核酸酶和sgRNA不一起天然存在。
可以使用本领域已知的任何合适的方法和本文描述的方法将工程化的CRISPR/Cas9系统导入细胞中。在一些实施方案中，导入可以包括将本文所述的工程化CRISPR/Cas9系统施用到培养物中或在宿主生物体中的干细胞。如上文讨论，用于导入工程化CRISPR/Cas9系统的示例性方法包括但不限于转染、电穿孔和基于病毒的方法。在一些情况下，一种或多种细胞摄取试剂是转染试剂。转染试剂包括例如基于聚合物的(例如DEAE葡聚糖)转染试剂和阳离子脂质体介导的转染试剂。也可以使用电穿孔方法来促进核酸操作试剂的摄取。通过施加外部场，诱导细胞中改变的跨膜电位，并且当跨膜电位净值(施加和静息电位差之和)大于阈值时，在膜中产生瞬时渗透结构，并且电穿孔得以实现。参见例如Gehl etal.,Acta Physiol.Scand.177:437–447(2003)。也可通过病毒转导将工程化的CRISPR/Cas9系统递送到细胞。合适的病毒递送系统包括但不限于腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒和慢病毒递送系统。此类病毒递送系统在细胞对转染有抗性的情况下是有用的。使用病毒介导的递送系统的方法可以进一步包括制备编码核酸操作试剂的病毒载体并将载体包装到病毒颗粒中的步骤。递送核酸试剂的其它方法包括但不限于脂转染、核转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体和试剂增强的核酸摄取。还可见Neiwoehner et al.,Nucleic Acids Res.42:1341–1353(2014),和美国专利号5,049,386,4,946,787；和4,897,355，其通过引用整体并入本文用于所有目的，并且特别是涉及试剂递送系统的所有教导。在一些实施方案中，通过非病毒载体递送系统进行导入，所述非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如本文所述载体的转录物)、裸核酸、和与递送载体例如脂质体复合的核酸。可以递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
一般而言，“CRISPR系统”总体上指参与表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因的活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(在内源CRISPR系统的背景下包含“直接重复”和tracrRNA加工的部分直接重复)、引导序列(本文中也称为“crRNA”或在内源CRISPR系统的背景中“间隔物”)，和/或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。如上所述，sgRNA是至少tracrRNA和crRNA的组合。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件源自II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一种或多种元件源自包含内源CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。通常，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列位点(在内源CRISPR系统的情况下也称为原间隔物(protospacer))处形成CRISPR复合物的元件。在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”指引导序列设计为具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不一定是需要的，只要有足够的互补性来引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。在本公开中，“靶位点”指靶序列的位点，包括靶序列及其互补序列两者，例如在双链核苷酸中。在一些实施方案中，本文所述的靶位点可以指与CRISPR/Cas9系统的sgRNA或crRNA杂交的第一靶序列和/或与PAM的5’端相邻的第二靶序列。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的核或胞质中。在一些实施方案中，靶序列位于真核细胞的细胞器，例如线粒体或叶绿体内。
sgRNA可以是人工的、人为的、合成的和/或非天然存在的。在一些实施方案中，sgRNA包含(i)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其也可以称为“sgRNA支架”。在一些实施方案中，crRNA序列和tracrRNA序列不一起天然存在。如本文所用，术语“sgRNA”可以指含有(i)引导序列(crRNA序列)和(ii)Cas9核酸酶募集序列(tracrRNA)的单一引导RNA。crRNA序列可以是与感兴趣的基因中的区域同源，并且可以指导Cas9核酸酶活性的序列。crRNA序列和tracrRNA序列不一起天然存在。可以以RNA或通过具有启动子下的sgRNA编码序列(sgRNA基因)的质粒转化来递送sgRNA。
在一些实施方案中，sgRNA或crRNA与靶序列(例如靶基因组序列)的一部分杂交，并且crRNA可以具有与靶序列互补的序列。“互补性”指核酸通过传统沃森-克里克或其它非传统类型与另一个核酸序列形成氢键的能力。百分比互补性指示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10中的5、6、7、8、9、10为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补性)。“完全互补”指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键键合。如本文所用，“基本上互补”指8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、或更多个核苷酸的区域内至60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％.97％、98％、99％、或100％的互补性程度，或者指在严格条件下杂交的两个核酸。如本文所用，杂交的“严格条件”指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交，并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且随许多因素而变化。通常，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例详细描述于Tijssen(1993),LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With NucleicAcid Probes Part 1,第二章“Overview of principles of hybridization and thestrategy ofnucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y。“杂交”指一个或多个多核苷酸起反应以形成通过核苷酸残基碱基之间的氢键键合稳定的复合物的反应。氢键键合可以通过沃森克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式发生。复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一自我17杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的步骤，诸如PCR的启动或酶对多核苷酸的切割。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补物”。如本文所用，术语“约”可以指与所述参考值类似的数值范围。在某些实施方案中，术语“约”指落入所述参考数值的15、10、9、8,7、6、5、4、3、2、1％或更小内的数值范围。在另外的实施方案中，crRNA或引导序列长约17、18、19、20、21、或22个核苷酸。在进一步的实施方案中，crRNA包括TAGGAAGCTAATCTATCATT(SEQ ID NO:9)的核苷酸序列。在另外的实施方案中，crRNA排除具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的crRNA序列。在又一些实施方案中，crRNA排除与包含导致角蛋白(kratin)12蛋白中的L132P突变的SNP的核苷酸序列杂交的crRNA序列。在又一些实施方案中，crRNA排除与包含导致角蛋白12蛋白中的突变的SNP的核苷酸序列杂交的crRNA序列。
在一些实施方案中，tracrRNA提供发夹结构，其活化Cas9以打开dsDNA实现crRNA序列的结合。tracrRNA可以具有与回文重复互补的序列。当tracrRNA与短回文重复杂交时，它可以触发通过细菌双链RNA特异性核糖核酸酶RNA酶II的加工。在另外的实施方案中，tracrRNA可以具有SPIDR(间隔物间隔直接重复(SPacer Interspersed DirectRepeats))，构成通常对于特定的细菌物种特异性的DNA基因座家族。CRISPR基因座包含大肠杆菌中识别的间隔短序列重复(SSR)的独特类别(Ishino et al.,J.Bacteriol.,169:5429-5433[1987]；以及Nakata et al.,J.Bacteriol.,171:3553-3556[1989])以及相关基因。已经在地中海极嗜盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌、鱼腥藻属(Anabaena)、和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中鉴定出相似的间隔SSR(参见Groenen et al.,Mol.Microbiol.,10:1057-1065[1993]；Hoe et al.,Emerg.Infect.Dis.,5:254-263[1999]；Masepohl et al.,Biochim.Biophys.Acta1307:26-30[1996]；和Mojica et al.,Mol.Microbiol.,17:85-93[1995])。CRISPR基因座可以与其它SSR的不同之处在于重复的结构，其已经称作短规则间隔重复(SRSR)(Janssen etal.,OMICS J.Integ.Biol.,6:23-33[2002]；和Mojica etal.,Mol.Microbiol.,36:244-246[2000])。在某些实施方案中，重复是通过基本上恒定长度的独特居间序列规则间隔的簇中发生的短元件(Mojica et al.,[2000],见上文)。虽然重复序列在菌株间是高度保守的，但是间隔重复的数目和间隔物区域的序列通常在菌株间不同(van Embden et al.,J.Bacteriol.,182:2393-2401[2000])。tracrRNA序列可以是本领域中已知的CRISPR/Cas9系统的tracrRNA的任何序列。在另外的实施方案中，tracrRNA包含与SEQ ID NO:2和6的核苷酸序列具有至少约70、75、80、85、90、95或100％序列同一性的核苷酸序列。美国专利号8697359、美国专利申请公开号20150232882、20150203872、20150184139、20150079681、20150073041、20150056705、20150031134、20150020223、20140357530、20140335620、20140310830、20140273234、20140273232、20140273231、20140256046、20140248702、20140242700、20140242699、20140242664、20140234972、20140227787、20140189896、20140186958、20140186919、20140186843、20140179770、20140179006、20140170753、20140093913、20140080216、and WO2016049024中公开了示例性CRISPR/Cas9系统、sgRNA、crRNA和tracrRNA，以及其制备方法和用途，所有专利通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的Cas9核酸酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在登录号Q99ZW2下在SwissProt数据库中找到。Cas9核酸酶可以是Cas9同源物或直向同源物。也可以使用表现出改善的特异性的突变体Cas9核酸酶(参见例如AnnRan et al.Cell 154(6)1380-89(2013)，其通过引用整体并入本文用于所有目的，并且特别是关于所有涉及对靶核酸具有改善的特异性的突变体Cas9核酸酶的教导)。核酸操作试剂还可以包括失活的Cas9核酸酶(dCas9)。失活的Cas9与单独的核酸元件的结合可以通过空间阻碍RNA聚合酶机制来抑制转录。此外，失活的Cas可以用作其它蛋白质(例如，转录阻遏物、活化剂和募集域)的归巢装置，所述其它蛋白质影响靶位点处的基因表达而不将不可逆的突变导入靶核酸。例如，dCas9可以与转录阻遏物域例如KRAB或SID效应物融合以促进靶位点处的表遗传沉默。也可以通过与VP16/VP64或p64激活域融合将Cas9转化为合成的转录激活物。
在一些实施方案中，Cas9核酸酶在靶序列的位置处，诸如在靶序列内和/或在靶序列的互补物内指导一条或两条链的切割。在通过Cas9核酸酶进行定向DNA切割之后，有对细胞可用的两种DNA修复模式：同源性定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。虽然在突变位点附近的Cas9切割后通过HDR对突变的无缝校正是有吸引力的，但是此方法的效率意味着它仅可以用于在选择已经发生修复的那些细胞并且仅纯化那些经修饰的细胞的另外步骤的情况下对干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)的体外/离体修饰。HDR在细胞中不以高频率发生。NHEJ以高得多的效率发生并适合于对许多角膜营养不良所描述的显性阴性突变。在另外的实施方案中，Cas9核酸酶来自链球菌属。在另外的实施方案中，Cas9核酸酶来自酿脓链球菌、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、犬链球菌(Streptococcuscanis)、马链球菌(Streptococcus equi)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、海豹链球菌(Streptococcus phocae)、Streptococcus pseudoporcinus、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、Streptococcus pseudoporcinus、婴儿链球菌(Streptococcusinfantarius)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、Streptococcus caballi、马肠链球菌(Streptococcus equinus)，链球菌口腔分类群(Streptococcus sp.oral taxon)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)或巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)或其变体。这些变体可以包括D10A切口酶、SpyCas9-HF1，如Kleinstiver et al,2016Nature,529,490-495中描述。在另外的实施方案中，Cas9核酸酶来自葡萄球菌属(Staphylococcus)。在又一个实施方案中，Cas9核酸酶来自金黄色葡萄球菌、模仿葡萄球菌(S.simiae)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、S.condimenti、S.massiliensis、鱼发酵葡萄球菌(S.piscifermentans)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、头状葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、S.devriesei、出血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、S.agnetis、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、猫葡萄球菌(S.felis)、海豚葡萄球菌(S.delphini)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、S.lutrae、S.microti、S.muscae、S.pseudintermedius、S.rostri、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、阿尔莱特葡萄球菌(S.arlettae)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、S.leei、S.nepalensis、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、S.succinus、S.xylosus、S.fleurettii、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、S.stepanovicii、S.vitulinus、模仿葡萄球菌(S.simulans)、巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、或其变体。
在另外的实施方案中，Cas9核酸酶包含与选自SEQ ID NO:4或8的氨基酸序列具有至少约60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与选自SEQ ID NO:3或7具有至少约60、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas9系统和使用本文描述的CRISPR/Cas9系统的方法通过NHEJ改变DNA序列。在另外的实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas9系统或至少一种载体不包含修复核苷酸分子。在一些实施方案中，本文所述的方法通过本文所述的HDR改变DNA序列。在另外的实施方案中，此HDR方法可以用于MECD中基因疗法的离体方法。在进一步的实施方案中，此方法可以不是等位基因特异性的并且可以用于修复KRT12密码子129、130、132、133和135中的突变。
在一些实施方案中，工程化CRISPR/Cas9系统包含(a)与sgRNA可操作连接的第一调控元件，所述sgRNA与本文所述的靶序列杂交，和(b)与编码Cas9核酸酶的核苷酸分子可操作连接的第二调控元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同载体或不同载体上，sgRNA靶向靶序列(例如与靶序列杂交)，且Cas9核酸酶切割DNA分子。靶序列可以是与PAM 5’端相邻的16至25个核苷酸互补的核苷酸序列。在本文中“相邻”是指位于参照位点的2或3个核苷酸内，包括“紧邻”，这意味着在紧邻的核苷酸序列之间不存在居间核苷酸，并且紧邻的核苷酸序列在彼此的1个核苷酸之内。在另外的实施方案中，细胞是真核细胞或哺乳动物或人细胞，并且调控元件是真核生物调节剂。在进一步的实施方案中，细胞是本文所述的干细胞。在一些实施方案中，将Cas9核酸酶密码子优化用于在真核细胞中表达。
在一些实施方案中，第一调控元件是聚合酶III启动子。在一些实施方案中，第二调控元件是聚合酶II启动子。术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它表达控制元件(例如转录终止信号，如聚腺苷酸化信号和poly-U序列)。例如，在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,AcademicPress,San Diego,Calif.(1990)中描述了此类调节元件。调控元件包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成性表达的那些调控元件和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些调控元件(例如，组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可以主要在期望的感兴趣组织(诸如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏，胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞))中指导表达。调节元件还可以以时间依赖性方式指导表达，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，其也可以是或可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中，载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选与RSV增强子一起)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选与CMV增强子一起)[参见例如Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。术语“调控元件”还包括增强子元件，如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5’区段(Mol.Cell.Biol.,Vol.8(1),p.466-472,1988)；SV40增强子；和兔β-珠蛋白外显子2和3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.78(3),p.1527-31,1981)。
在一些实施方案中，本文提供的Cas9核酸酶是针对以时间或细胞类型依赖性方式进行表达优化的诱导型Cas9核酸酶。第一调控元件可以是可以与Cas9核酸酶连接的诱导型启动子，包括但不限于四环素诱导型启动子、金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、甲硫氨酸诱导型启动子(例如MET25，MET3启动子)；和半乳糖诱导型启动子(GAL1、GAL7和GAL10启动子)。其它合适的启动子包括ADH1和ADH2醇脱氢酶启动子(在葡萄糖中受到抑制，当葡萄糖耗竭和生成乙醇时诱导)、CUP1金属硫蛋白启动子(在存在Cu2+,Zn2+的情况下诱导)、PHO5启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1启动子。
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的表达水平等因素。可以将载体导入宿主细胞中，从而产生由如本文中所述的核酸编码的转录物、蛋白质或肽(包括融合蛋白或肽)(例如，成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白等)。
术语“载体”指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，不含游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；和本领域已知的其它多种多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其指其中可以插入额外DNA区段的环状双链DNA环，诸如通过标准分子克隆技术。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于载体中用于包装成病毒(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺伴随病毒)。病毒载体还包括由病毒携带的多核苷酸用于转染宿主细胞。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。在重组DNA技术中效用的常用表达载体通常为质粒的形式。重组表达载体可以以适合于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调控元件，其在某些情况下基于要用于表达的宿主细胞选择，其与待表达的核酸序列可操作连接。在重组表达载体内，“可操作连接”意图指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)的方式与调控元件连接。有利的载体包括慢病毒和腺伴随病毒，并且也可以选择此类载体的类型用于靶向特定类型的细胞。
可以使用任何合适的方法分离已经经历核酸操作事件的干细胞(即，“经操作的”干细胞)。在一些实施方案中，修复核酸还包含编码选择标志物的核酸。在这些实施方案中，修复核酸对宿主干细胞基因组的成功同源重组也伴随选择标志物的整合。因此，在此类实施方案中，使用阳性标志物来选择经操作的干细胞。在一些实施方案中，选择标志物允许经操作的干细胞在其它情况下会杀死细胞的药物存在下存活。此类选择标志物包括但不限于赋予对新霉素、嘌呤霉素或潮霉素B的抗性的阳性选择标志物。另外，选择标志物可以是允许经操作的干细胞在其中一些不含选择标志物的干细胞群体间视觉鉴定的产物。此类选择标志物的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，其可以通过其荧光而显现；萤光素酶基因，其当暴露于其底物萤光素时可以通过其发光而显现；和β-半乳糖苷酶(β-gal)，其当与其底物接触时产生特征性的颜色。此类选择标志物在本领域中是公知的，并且编码这些标志物的核酸序列是商品化的(参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)。可以使用荧光激活细胞分选(FACS)技术进一步分选采用可以通过荧光显现的选择标志物的方法。
在一些实施方案中，使用分离的经操作的干细胞来建立用于移植的细胞系。可以使用任何合适的方法培养分离的经操作的细胞以产生稳定的细胞系。例如，可以在存在或不存在作为饲养细胞的成纤维细胞(例如3T3)的情况下维持培养物。在其它情况下，将人羊膜上皮细胞或人胚胎成纤维细胞用作培养物的饲养层。在一些实施方案中，将经操作的干细胞在补充的激素上皮培养基(SHEM)中的成纤维细胞(例如3T3细胞)饲养层上培养。在某些实施方案中，适于培养主题经操作的干细胞的培养基包括一种或多种以下组分：胎牛血清、患者自体血清、EGF、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、霍乱毒素亚基A、DMSO、三碘甲状腺原氨酸、抗生素(如青霉素/链霉素和庆大霉素)和抗真菌药(如两性霉素B)。Takacs et al.CytometryA 75:54-66(2009),Shortt et al.,Surv Opthalmol VisSci52:483-502(2007)；以及Cauchi et al.Am J Ophthalmol 146:251-259(2008)中进一步描述了用于培养LESC的合适技术，其通过引用完整并入本文，并且特别是关于涉及LESC培养的所有教导。可以使用任何合适的技术来验证所建立的细胞系中期望的核酸操作，所述技术包括例如选择如本文讨论的选择标志物和核酸序列以确认期望的核酸操作的序列。
V.移植
在一方面，在分离经操作的干细胞和从经操作的干细胞任选建立或培养细胞系后，将经操作的干细胞移植到需要其治疗的受试者中。可以使用任何合适的方法在受试者中移植经操作的干细胞。
在一些实施方案中，从随后移植到受试者中的经操作的细胞形成用于移植的手术移植物。在某些实施方案中，将经操作的干细胞在羊膜上培养一段时间，其对于使经操作的干细胞扩增至大小对于移植合适的面积是足够的。可以通过各种方法完成生长确认，包括直接观察、整体染色制备(whole mount stained preparation)、组织病理学、免疫组织化学，胸苷掺入以及通过使用细胞周期标志物的流式细胞术进行。然后可以将培养的经操作的干细胞直接与羊膜一起移植。在其它实施方案中，将经操作的干细胞与羊膜分离并移植到非羊膜载体上以获得手术移植物。合适的载体包括但不限于石蜡纱布、隐形眼镜、胶原屏蔽(collage shield)、生物聚合物、纤维蛋白凝胶和晶状体前囊。
在移植之后，可以使用本领域已知的任何合适的测试来进行受试者中视觉功能的评估，所述测试包括但不限于未矫正视敏度(UCVA)、最佳矫正视敏度(BCVA)和亮度敏锐度测试(BAT)的评估。参见例如Awaad et al.,Am J Ophthalmol.145(4):656–661(2008)和Sharhan et al.,Br J Ophthalmol84:837-841(2000)，其通过引用完整并入本文用于所有目的，特别是关于涉及评估视敏度的标准的所有教导。在某些实施方案中，与经历治疗前相比，受试者的视敏度改善至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
在一些实施方案中，方法还包括以一个或多个预定频率(例如，每周、每月、每季度、每半年、每年等)重复移植一个或多个经操作的干细胞到受试者中。
VI.试剂盒
在另一方面，本文提供了包含用于治疗角膜营养不良的核酸操作试剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括CRISPR试剂，例如靶向感兴趣核酸的一种或多种引导RNA和核酸酶(例如II型核酸酶)。在另外的实施方案中，试剂盒还包括修复核酸，其包括如本文所述的待修复的突变的野生型等位基因。在一些实施方案中，试剂盒包括促进细胞摄取核酸操作的试剂，例如转染剂或电穿孔缓冲液。在一些实施方案中，本文提供的主题试剂盒包括用于检测或分离干细胞的一种或多种试剂，例如用于可与FACS结合使用的一种或多种阳性干细胞标志物的标记抗体。
实施例
呈现以下实施例以例示本发明的各种实施方案。应该理解的是，此类实施例不代表并且不旨在表示排他性的实施方案；此类实施例仅用来说明本发明的实践。
突变分析：分析与各种角膜营养不良相关的突变，以测定哪些是完全错义突变或框内插入/缺失。该分析指示对于大多数K12和TGFBI疾病，无义或移码插入/缺失突变与疾病无关。此外，对外显子组变体数据库的分析确认报告在这些基因中发现的任何天然存在的无意、移码插入/缺失或剪接位点突变与这些个体中的疾病无关。
突变分析揭示了以下角膜营养不良基因适合于靶向核酸酶基因疗法(表1)。
表1：适合于CRISPR/Cas9介导的方法的基因及其相关的角膜营养不良。
本报告进行合适的角膜营养不良基因的调查以测定通过PAM特异性方法或引导等位基因特异性方法可靶向的突变数目。PAM特异性方法需要致病性SNP以产生新的PAM，而等位基因特异性方法涉及设计含有致病性SNP的引导。
鉴定了TGFBI中产生具有次要等位基因频率(MAF)>10％的新PAM的所有非致病性SNP。具有MAF>10％的SNP的选择可以提供合理的机会，即导致新PAM的SNP将与致病性突变一起顺式发现。分析TGFBI内的所有变体以测定是否创建新的PAM(表2)。以前的报告证明使用此方法使突变体等位基因永久失活(Shin et al.,2016.Human Molecular Genetics)。
表2：TGFBI内的变体，其导致具有>10％的MAF的新PAM。显示了新的PAM，用下划线指示需要的变体。
在表2中，“b/w”指示变化(例如突变)位于两个外显子之间。例如，“b/w 1和2”表示变体位于外显子1和外显子2之间(例如，变体位于内含子中)，如图3所示。在图3中，编号框指示TGFBI内的外显子。红色框显示了TGFBI中发现多种致病性突变的热点。每个蓝色箭头指示产生新PAM的SNP的位置。每个箭头显示新PAM，其中以红色突出显示要求的变化。
构建体：在整个实验中使用三种表达Cas9和sgRNA的质粒。使用的非靶向质粒是pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)(Broad Institute，MIT；Addgene质粒48139；图4)。遵循公开的方案(Ran FA、et al.,Nat Protoc 2013；8:2281–2308)，通过退火并克隆以下2种引物到pSpCas9(BB)-2A-Puro中来设计含有对K12-L132P等位基因特异的sgRNA的质粒(LifeTechnologies,Paisley,UK)：5′-CACCGTAGGAAGCTAATCTATCATT-3′和5′-AAACAATGATAGATTAGCTTCCTAC-3′。此sgRNA对应于在K12-L132P等位基因(图5，红色)上发现的等位基因特异性PAM的直接3'的20个核苷酸，以下称为sgK12LP。构建靶向野生型和突变体K12序列两者的Cas9/sgRNA质粒(Sigma，Gillingham，UK)并用作阳性对照(图5，绿色)。
使用先前描述的另外的K12表达构建体来评估等位基因特异性和效力。使用具有3'插入终止密码子的K12-WT或K12-L132P的完整mRNA序列的萤火虫萤光素酶质粒，下文分别命名为K12WT-Luc和K12LP-Luc(Liao H.et al.PLoS One 2011；6:e28582.)和成熟血细胞凝集素(HA)标记的K12-WT和K12-L132P蛋白(Courtney DG,et al.Invest OphthalmolVis Sci 2014；55:3352–3360)的表达质粒，以下分别称为K12WT-HA和K12LP-HA的质粒。使用花虫型(Renilla)萤光素酶(pRL-CMV，Promega，Southampton，UK)的表达构建体进行双重萤光素酶测定法以标准化转染效率。
双重萤光素酶测定法：使用双重萤光素酶测定法来量化外源构建体中的三种测试sgRNA的效力和等位基因特异性，使用如先前所述调整的方法(Courtney DG,et al.InvestOphthalmol Vis Sci 2014；55:977–985；Allen EHA,et al.Invest Ophthalmol Vis Sci2013；54:494–502；Atkinson SD,et al.J InvestDermatol 2011；131:2079–2086)进行。简言之，使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)，用K12WT-Luc或K12LP-Luc表达构建体和sgNSC、sgK12或sgK12LP构建体以1:4的比率转染HEK AD293细胞(LifeTechnologies)。将细胞温育72小时，然后裂解并量化萤火虫和花虫型萤光素酶两者的活性。总之，对于每种转染条件进行8次重复。
Western印迹法：使用如先前描述(Courtney DG,et al.Invest OphthalmolVisSci 2014；55:977–985；Allen EHA,et al.Invest Ophthalmol Vis Sci 2013；54:494–502)的类似方法，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)一式两份以1:4的比率将HA标记的野生型(K12WT-HA)和突变体(K12LP-HA)表达构建体(Liao H,et al.PLoS One 2011；6:e28582.)与每个sgRNA瞬时共转染入HEK AD293细胞中。将经转染的细胞温育72小时。使用标准方法(Courtney DG,et al.InvestOphthalmol Vis Sci 2014；55:977–985；AllenEHA,et al.Invest Ophthalmol VisSci 2013；54:494–502)，使用针对HA的兔多克隆抗体(Abcam,Cambridge,UK；ab9110,1:2000)和针对人β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma，1:15 000)分析HA标记的K12和β-肌动蛋白的表达。将膜与缀合有辣根过氧化物的多克隆猪抗兔二抗(DakoCytomation，Ely，UK)或缀合有辣根过氧化物偶联的山羊抗小鼠抗体(DakoCytomation)一起温育。通过标准化学发光(Life Technologies)检测蛋白质结合。使用ImageJ(Schneider CA,Rasband WS,Eliceiri KW.NatMethods 2012；9:671–675)进行密度测定以量化经HA标记的K12(n＝4)的条带强度。将这相对于β-肌动蛋白的带强度标准化。
定量实时PCR：以与对western印迹法所述相同的方式进行转染；然而，将K12WT-HA和K12LP-HA同时转染到细胞中。一式三份进行所有转染。转染后，将细胞温育48小时，并使用RNAeasy Plus试剂盒(Qiagen,Venlo,TheNetherlands)提取RNA。在500ng RNA的cDNA转化(Life Technologies)后，进行定量实时PCR以量化KRT12mRNA的水平。在HPRT测定法(测定ID102079；Roche)和GAPDH测定法(测定ID141139；Roche)旁使用KRT12测定法(测定Id140679；Roche，West Sussex，UK)。对于每个测定法一式三份运行每个样品，并使用ΔΔCT方法(Livak KJ,Schmittgen TD.Methods 2001；25:402–408)计算相对基因表达。使用BestKeeper软件工具(Pfaffl MW,Tichopad A,Prgomet C,Neuvians TP.Biotechnol Lett2004；26:509–515)将KRT12表达水平相对于HPRT和GAPDH标准化，其中这两种参考基因的表达视为处理组间“稳定的”。
焦磷酸测序：使用通过定量逆转录酶-PCR评估的相同cDNA样品，进行焦磷酸测序以确定剩余的K12-L132P mRNA与K12-WT mRNA的比率，完全如先前所述(Courtney DG,etal.Invest Ophthalmol Vis Sci 2014；55:3352–3360)。
KRT12转基因小鼠：获得C57小鼠模型，敲入人K12-L132P等位基因以替换内源小鼠Krt12编码序列。这允许通过等位基因特异性sgRNA和Cas9体内靶向KRT12-L132P。使用24周龄的雌性杂合小鼠，其中存在人K12-L132P等位基因的一个拷贝和鼠Krt12的一个拷贝。使用标准PCR和Sanger双脱氧核苷酸测序对小鼠进行基因分型并确认K12-L132P等位基因的杂合性。因为本研究调查了处理对一个角膜的影响，而同一动物的另一个角膜用作阴性对照，所以不需要动物的随机化。调查人员在这项研究中不是盲的。所有实验都符合伦理规定，并得到当地伦理委员会的批准。
体内基质内眼注射：为了实现等位基因特异性sgRNA和Cas9的瞬时表达，遵循先前描述的方案(Moore JE,McMullen CBT,Mahon G,Adamis AP.DNA Cell Biol 21:443–451)，通过基质内眼注射将sgK12LP质粒导入杂合敲入小鼠的角膜基质中。为了评估此递送方法，首先对野生型小鼠注射4μg的Cas9-GFP质粒(pCas9D10A_GFP)(Addgene质粒44720)。在24、48和72小时时剔除小鼠，并将角膜固定在4％多聚甲醛中并使用标准组织学程序进行处理。切除5微米厚的切片，再水合，并通过荧光显微术成像。给小鼠施用全身麻醉剂，并且对角膜施用局部麻醉剂。合格的眼科医生分别将4μg在总共3μl磷酸盐缓冲盐水中稀释的sgK12LP或sgNSC质粒注射入四只小鼠的右眼和左眼的角膜中。处理后48小时剔除小鼠。
测序和NHEJ的测定：一旦剔除小鼠，摘出眼，并切出角膜。使用DNA提取试剂盒(Qiagen)提取gDNA，并将样品合并为两个处理组：sgK12LP和sgNSC。使用以下两种引物对样品进行PCR扩增以扩增K12-L132P突变周围的区域：5′-ACACCCATCTTGCAGCCTAT-3′和5′-AAAATTCCCAAAGCGCCTC-3′。将PCR产物进行凝胶纯化并连接到CloneJet克隆载体(LifeTechnologies)中并用于转化DH5α感受态细胞(LifeTechnologies)。选择总共13个克隆，并遵循制造商的程序使用微量制备试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。然后使用提供有CloneJet载体的测序引物对来自13个克隆的DNA进行测序(Department of Zoology,University ofOxford)。以相同的方式评估如Zhang实验室在线工具(crispr.mit.edu)所预测的小鼠基因组中sgK12LP的两个最可能的外显子脱靶位点，其中选择10个集落用于分析每个预测的脱靶。预测的脱靶位点是5′-TAAGTAGCTGATCTATCAGTGGG-3′(Gon4l)和5′-TGGGAAGCATATCTGTCATTTGG-3′(Asphd1)。仅选择这两个位点，因为它们是具有计算的脱靶得分>0.1的仅有的两个位点。
统计学：所有误差棒代表s.e.m.，除非另有说明。使用非配对t检验计算显著性，因为所有样品表明相同的分布。统计学显著性设定为0.05％。在各组之间计算方差，并认为是相似的。
构建KRT12特异性sgRNA：分析源自引起MECD的KRT12错义突变的序列变化揭示了引起MECD严重形式的L132P突变巧合导致新的PAM位点(AAG>AGG)的产生。设计与由KRT12L132P突变产生的新PAM位点的5'端相邻的序列20个核苷酸互补的sgRNA(sgK12LP)，并使用由Zhang实验室,MIT 2013在线提供的“优化的CRISPR设计工具”评估潜在的脱靶位点(图5，红色)。使用该系统将sgRNA计算为具有66％的得分，其中认为>50％的得分是高质量的，并且具有有限数目的预测可能的脱靶。
sgK12LP等位基因特异性和效力的体外评估：使用野生型和突变体K12的外源表达构建体，在HEK AD293细胞中体外评估sgK12LP的等位基因特异性和效力。首先使用双重萤光素酶报告物测定法测定等位基因特异性(图6项a)。发现萤火虫萤光素酶活性在表达K12WT-Luc或K12LP-Luc并用sgK12处理的细胞中显著降低。在用sgK12LP处理的细胞中观察到有力且等位基因特异性的萤火虫萤光素酶活性降低。在表达K12LP-Luc的细胞中，观察到73.4±2.7％的减少(P<0.001)(图6项a)。在表达K12WT-HA或K12LP-HA(图6项b；图像代表四个印迹)的细胞中，通过Western印迹法也观察到此等位基因特异性且有力的敲减，并且通过密度测定法的量化揭示与K12WT-HA蛋白相比通过sgK12LP对K12LP-HA蛋白的32％显著降低(P<0.05)。在用sgK12处理的细胞中，发现野生型和突变体K12蛋白两者均降低，而在用sgK12LP处理的细胞中，似乎对野生型蛋白的表达没有影响，但显著敲低突变体K12蛋白(图6项b)。
为了支持在蛋白质水平观察到的此数据，进行定量逆转录酶-PCR和焦磷酸测序以在mRNA水平测定等位基因特异性和效力。在同时表达野生型和突变体K12两者(以1:1的表达比)并用三种测试Cas9/sgRNA表达构建体(NSC、K12和K12LP)中的每一种处理的细胞中，使用定量逆转录酶-PCR来测定总K12mRNA的敲低(图6项c)。在经sgK12处理的细胞中观察到总K12mRNA的73.1±4.2％的有力减少(P<0.001)，在经sgK12LP处理的细胞中测量到较少的减少52.6±7.0％(P<0.01)(图6项c)。使用焦磷酸测序来测定用这些sgRNA处理后剩余的成熟mRNA种类的胞内比例(图6项d)。mRNA的比例计算为“K12-L132P的百分比”/“K12-WT的百分比”。假设突变体和野生型K12mRNA之间的比率1:1，将用sgNSC处理的细胞相对于1标准化。在用sgK12测试的细胞中，观察到K12突变体mRNA比例0.89±0.03，但与NSC对照的差异不显著(P<0.14)。在用sgK12LP处理的那些细胞中，检测到K12突变体mRNA比例0.28±0.02，并且与经sgNSC处理的细胞相比显著改变(P<0.001)(图6项d)。
sgRNA-K12LP体内功效的测定：注射后24小时，基质内注射Cas9-GFP构建体导致角膜上皮中存在绿色荧光蛋白(GFP)蛋白(图7项a)。在注射后达48小时发现GFP的瞬时表达。在将sgK12LP或sgNSC表达构建体基质内注射入K12-L132P人源化杂合小鼠和48小时的温育期之后，对小鼠实施安乐死并从角膜制备基因组DNA(gDNA)。合并来自4只经sgK12LP或sgNSC处理的动物的角膜的gDNA并对人源化K12-L132P基因的外显子1进行PCR扩增，进行克隆和测序。在从用sgNSC处理的眼的gDNA建立的10个克隆中，K12-L132P序列在全部10个中保持完整。对来自经sgK12LP处理的眼的13个单独克隆测序；发现8个含有未改变的KRT12L132P人序列，而5个克隆表明在Cas9/sgK12LP复合物的预测切割位点周围的NHEJ(图7项b)。在1个克隆(1)中，发现1个核苷酸的插入，缺失32个核苷酸。在体内观察到高达53个核苷酸的大缺失(克隆5)。在这5个克隆中，4个包含预测导致移码的缺失(克隆1和3-5)，其导致早期终止密码子的出现。还使用该方法评估小鼠中sgK12LP的前2个预测的外显子脱靶位点。对每个靶物测序10个克隆，发现无一经历了非特异性切割。
通过R514P、L518R和L509R中的突变创建的与PAM位点相关的TGFBI突变：设计单一引导RNA以靶向这些突变中的每个并克隆到sgRNA/Cas9表达质粒中。另外，针对每种突变设计利用天然存在的旁侧PAM的阳性对照引导RNA。将野生型和突变体靶序列克隆到萤光素酶报告物质粒中，以使我们监测基因编辑对WT和MUT表达的表达的影响。使用这两种质粒转染AD293细胞，并且在CRISPR Cas9处理后48小时使用我们的高通量报告物测定法来测量萤光素酶表达以给出细胞中存在的MUT和WT DNA的量。
图8显示对于使用SNP衍生的PAM方法评估的3个TGFBI突变(R514P、L518R和L509R)，实现了显著的等位基因特异性，其中突变体等位基因被CRISPR Cas9系统切割并且对于一些引导，WT DNA在一定程度上被切割。
与位于与PAM位点相邻的靶区域内的SNP突变相关的TGFBI突变：设计单一引导RNA以靶向这些突变并克隆到sgRNA/Cas9表达质粒中。将野生型和突变体靶序列克隆到萤光素酶报告物质粒中，并在我们的高通量报告物基因测定中评估。使用这两种质粒转染AD293细胞，并且两天后测量萤光素酶表达。首先，测试含有20bp靶物特异性序列的sgRNA。然而，这些未能提供足够的等位基因特异性。随后，设计截短的sgRNA(TRU-引导)，其将靶序列减少至18bp。注意到改善的等位基因特异性(图9项a-f)。
离体基因校正：证明在来自萤光素酶报告物小鼠的角膜中实现基因沉默的能力。将Luc2杂合的小鼠剔除，解剖其角膜，然后转移到细胞培养基中。使用Lipofectamine 2000将解剖角膜用非特异性对照sgRNA或靶向萤光素酶报告物基因的sgRNA转染。将角膜维持培养3天，并测量萤光素酶表达。
在用靶向Luc2的sgRNA转染的角膜中观察到萤光素酶报告物基因的有力沉默(图10)，这代表了离体靶向基因的成功CRISPR基因编辑。解剖来自Luc2杂合的小鼠的角膜并离体进行CRISPR基因编辑。小鼠角膜上皮干细胞并不局限于角膜缘区域，因此我们需要在整个上皮间显示基因编辑，如图10所示。治疗后右侧图像的深色表明完整的基因编辑和此整个小鼠角膜中的Luc基因的离体敲除。(Moore JE,McMullen CBT,Mahon G,Adamis AP(2002).The Corneal Epithelial Stem Cell.DNA&Cell Biology,21(5-6)pp.443-451.)。
手术移植物以治疗颗粒状角膜营养不良Ⅱ型
从经历用于颗粒状角膜营养不良Ⅱ型的治疗的患者获得的角膜缘活组织检查样品培养细胞。经历治疗的患者在编码下列氨基酸取代之一的TGFBI基因中携带突变：R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P。清洗细胞并且基于一种或多种以下标志物分选角膜缘上皮干细胞(LESC)：转录因子p63、ABCG2、C/EBPδ或Bmi-1。在3T3饲养细胞存在下从分离的LESC建立细胞系。然后，通过一种或多种以下阳性标志物：转录因子p63、ABCG2、C/EBPδ或Bmi-1的存在和一种或多种以下阴性标志物：细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)、连接蛋白43或外皮蛋白的不存在确认建立的LESC系。
根据Shalem et al.,Nature Reviews Genetics 16:299-311(2013)；Zhang etal.,Human Molecular Genetics 23(R1):R40-6(2014)；Zetsche et al.dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038(2015)和Zhu et al.Cell 157:1262-1278(2014)制备CRISPR系统试剂。CRISPR系统试剂包括一种或多种引导RNA(gRNA)和包含在相同载体上的II型核酸酶(例如Cas9或Cpf1)和长约150bp的修复核酸。修复核酸包括R124、R555或H626的野生型等位基因以及允许选择位置同源重组事件的选择GFP标志物。使用基于标准聚合物的(DEAE葡聚糖)转染技术将CRISPR系统试剂导入LESC细胞系中。允许LESC进行核酸操作事件，并且使用GFP标志物和FACS分离对此类事件呈阳性的细胞。通过FACS分选的LESC中感兴趣的TGFBI区域的测序来进一步证实期望的同源重组事件。
将含有期望的野生型TGFBI等位基因的经操作的LESC在羊膜上培养一段时间，其足以使经操作的LESC扩增至适合移植的区域大小。一旦达到期望的大小，可以使用羊膜作为载体移植经操作的LESC。
序列表
<110> 阿维利诺美国实验室股份有限公司
<120> 用于治疗角膜营养不良的方法
<130> 070335-5009
<150> PCT/US2016/061893
<151> 2016-11-14
<150> 62/255,310
<151> 2015-11-13
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> Spy Cas9 sgRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n是a, c, g, 或u
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 2
<211> 82
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> tracrRNA或sgRNA支架序列
<400> 2
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu uu 82
<210> 3
<211> 3974
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Spy Cas9核苷酸序列
<400> 3
atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60
gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1620
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960
ctggccgacg ctaa 3974
<210> 4
<211> 1423
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Spy Cas9氨基酸序列
<400> 4
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
35 40 45
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
50 55 60
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
65 70 75 80
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
100 105 110
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
115 120 125
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
130 135 140
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
165 170 175
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
195 200 205
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
210 215 220
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
225 230 235 240
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
260 265 270
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
275 280 285
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
290 295 300
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
325 330 335
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
340 345 350
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
370 375 380
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
405 410 415
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
420 425 430
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
435 440 445
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
450 455 460
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
485 490 495
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
515 520 525
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
530 535 540
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
565 570 575
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
580 585 590
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
595 600 605
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
610 615 620
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
625 630 635 640
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
645 650 655
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
660 665 670
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
675 680 685
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
690 695 700
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
705 710 715 720
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
725 730 735
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
740 745 750
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
755 760 765
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
770 775 780
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
785 790 795 800
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
805 810 815
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
820 825 830
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
835 840 845
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
850 855 860
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
865 870 875 880
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
885 890 895
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
900 905 910
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
915 920 925
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
930 935 940
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
945 950 955 960
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
965 970 975
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
980 985 990
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
995 1000 1005
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1010 1015 1020
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1025 1030 1035
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1040 1045 1050
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1055 1060 1065
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1070 1075 1080
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1100 1105 1110
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1115 1120 1125
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1130 1135 1140
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1145 1150 1155
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1160 1165 1170
Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1175 1180 1185
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1235 1240 1245
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1250 1255 1260
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1265 1270 1275
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1280 1285 1290
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1310 1315 1320
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1325 1330 1335
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1340 1345 1350
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1355 1360 1365
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1370 1375 1380
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1385 1390 1395
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr
1400 1405 1410
Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1415 1420
<210> 5
<211> 105
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> Sau Cas9 sgRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(22)
<223> n是a, c, g, 或u
<400> 5
gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnguuuuagu acucuggaaa cagaaucuac uaaaacaagg 60
caaaugccgu guuuaucucg ucaacuuguu ggcgaagauu uuuuu 105
<210> 6
<211> 83
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> tracrRNA或sgRNA支架序列
<400> 6
guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaugccgugu uuaucucguc 60
aacuuguugg cgaagauuuu uuu 83
<210> 7
<211> 3345
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Sau Cas9核苷酸序列
<400> 7
atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc caagcggaac 60
tacatcctgg gcctggacat cggcatcacc agcgtgggct acggcatcat cgactacgag 120
acacgggacg tgatcgatgc cggcgtgcgg ctgttcaaag aggccaacgt ggaaaacaac 180
gagggcaggc ggagcaagag aggcgccaga aggctgaagc ggcggaggcg gcatagaatc 240
cagagagtga agaagctgct gttcgactac aacctgctga ccgaccacag cgagctgagc 300
ggcatcaacc cctacgaggc cagagtgaag ggcctgagcc agaagctgag cgaggaagag 360
ttctctgccg ccctgctgca cctggccaag agaagaggcg tgcacaacgt gaacgaggtg 420
gaagaggaca ccggcaacga gctgtccacc aaagagcaga tcagccggaa cagcaaggcc 480
ctggaagaga aatacgtggc cgaactgcag ctggaacggc tgaagaaaga cggcgaagtg 540
cggggcagca tcaacagatt caagaccagc gactacgtga aagaagccaa acagctgctg 600
aaggtgcaga aggcctacca ccagctggac cagagcttca tcgacaccta catcgacctg 660
ctggaaaccc ggcggaccta ctatgaggga cctggcgagg gcagcccctt cggctggaag 720
gacatcaaag aatggtacga gatgctgatg ggccactgca cctacttccc cgaggaactg 780
cggagcgtga agtacgccta caacgccgac ctgtacaacg ccctgaacga cctgaacaat 840
ctcgtgatca ccagggacga gaacgagaag ctggaatatt acgagaagtt ccagatcatc 900
gagaacgtgt tcaagcagaa gaagaagccc accctgaagc agatcgccaa agaaatcctc 960
gtgaacgaag aggatattaa gggctacaga gtgaccagca ccggcaagcc cgagttcacc 1020
aacctgaagg tgtaccacga catcaaggac attaccgccc ggaaagagat tattgagaac 1080
gccgagctgc tggatcagat tgccaagatc ctgaccatct accagagcag cgaggacatc 1140
caggaagaac tgaccaatct gaactccgag ctgacccagg aagagatcga gcagatctct 1200
aatctgaagg gctataccgg cacccacaac ctgagcctga aggccatcaa cctgatcctg 1260
gacgagctgt ggcacaccaa cgacaaccag atcgctatct tcaaccggct gaagctggtg 1320
cccaagaagg tggacctgtc ccagcagaaa gagatcccca ccaccctggt ggacgacttc 1380
atcctgagcc ccgtcgtgaa gagaagcttc atccagagca tcaaagtgat caacgccatc 1440
atcaagaagt acggcctgcc caacgacatc attatcgagc tggcccgcga gaagaactcc 1500
aaggacgccc agaaaatgat caacgagatg cagaagcgga accggcagac caacgagcgg 1560
atcgaggaaa tcatccggac caccggcaaa gagaacgcca agtacctgat cgagaagatc 1620
aagctgcacg acatgcagga aggcaagtgc ctgtacagcc tggaagccat ccctctggaa 1680
gatctgctga acaacccctt caactatgag gtggaccaca tcatccccag aagcgtgtcc 1740
ttcgacaaca gcttcaacaa caaggtgctc gtgaagcagg aagaaaacag caagaagggc 1800
aaccggaccc cattccagta cctgagcagc agcgacagca agatcagcta cgaaaccttc 1860
aagaagcaca tcctgaatct ggccaagggc aagggcagaa tcagcaagac caagaaagag 1920
tatctgctgg aagaacggga catcaacagg ttctccgtgc agaaagactt catcaaccgg 1980
aacctggtgg ataccagata cgccaccaga ggcctgatga acctgctgcg gagctacttc 2040
agagtgaaca acctggacgt gaaagtgaag tccatcaatg gcggcttcac cagctttctg 2100
cggcggaagt ggaagtttaa gaaagagcgg aacaaggggt acaagcacca cgccgaggac 2160
gccctgatca ttgccaacgc cgatttcatc ttcaaagagt ggaagaaact ggacaaggcc 2220
aaaaaagtga tggaaaacca gatgttcgag gaaaagcagg ccgagagcat gcccgagatc 2280
gaaaccgagc aggagtacaa agagatcttc atcacccccc accagatcaa gcacattaag 2340
gacttcaagg actacaagta cagccaccgg gtggacaaga agcctaatag agagctgatt 2400
aacgacaccc tgtactccac ccggaaggac gacaagggca acaccctgat cgtgaacaat 2460
ctgaacggcc tgtacgacaa ggacaatgac aagctgaaaa agctgatcaa caagagcccc 2520
gaaaagctgc tgatgtacca ccacgacccc cagacctacc agaaactgaa gctgattatg 2580
gaacagtacg gcgacgagaa gaatcccctg tacaagtact acgaggaaac cgggaactac 2640
ctgaccaagt actccaaaaa ggacaacggc cccgtgatca agaagattaa gtattacggc 2700
aacaaactga acgcccatct ggacatcacc gacgactacc ccaacagcag aaacaaggtc 2760
gtgaagctgt ccctgaagcc ctacagattc gacgtgtacc tggacaatgg cgtgtacaag 2820
ttcgtgaccg tgaagaatct ggatgtgatc aaaaaagaaa actactacga agtgaatagc 2880
aagtgctatg aggaagctaa gaagctgaag aagatcagca accaggccga gtttatcgcc 2940
tccttctaca acaacgatct gatcaagatc aacggcgagc tgtatagagt gatcggcgtg 3000
aacaacgacc tgctgaaccg gatcgaagtg aacatgatcg acatcaccta ccgcgagtac 3060
ctggaaaaca tgaacgacaa gaggcccccc aggatcatta agacaatcgc ctccaagacc 3120
cagagcatta agaagtacag cacagacatt ctgggcaacc tgtatgaagt gaaatctaag 3180
aagcaccctc agatcatcaa aaagggcaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 3240
gcaaaaaaga aaaagggatc ctacccatac gatgttccag attacgctta cccatacgat 3300
gttccagatt acgcttaccc atacgatgtt ccagattacg cttaa 3345
<210> 8
<211> 1114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Sau Cas9氨基酸序列
<400> 8
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
20 25 30
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
35 40 45
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
50 55 60
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
65 70 75 80
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
85 90 95
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
100 105 110
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
115 120 125
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
130 135 140
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
145 150 155 160
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
165 170 175
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
195 200 205
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
210 215 220
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
225 230 235 240
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
245 250 255
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
260 265 270
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
275 280 285
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
290 295 300
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
305 310 315 320
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
325 330 335
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
340 345 350
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
355 360 365
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
370 375 380
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
385 390 395 400
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
420 425 430
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
450 455 460
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
465 470 475 480
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
485 490 495
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
500 505 510
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
515 520 525
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
530 535 540
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
545 550 555 560
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
565 570 575
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
580 585 590
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
595 600 605
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
610 615 620
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
625 630 635 640
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
645 650 655
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
660 665 670
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
675 680 685
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
690 695 700
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
705 710 715 720
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
725 730 735
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
740 745 750
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
755 760 765
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
770 775 780
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
805 810 815
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
820 825 830
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
835 840 845
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
850 855 860
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
865 870 875 880
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
885 890 895
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
900 905 910
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
915 920 925
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
930 935 940
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
945 950 955 960
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
965 970 975
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
980 985 990
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
995 1000 1005
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn
1010 1015 1020
Met Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser
1025 1030 1035
Lys Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn
1040 1045 1050
Leu Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys
1055 1060 1065
Gly Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys
1070 1075 1080
Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro
1085 1090 1095
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1100 1105 1110
Ala
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> crRNA
<400> 9
taggaagcta atctatcatt 20

Claims (40)

1.在有此需要的受试者中预防、改善或治疗角膜营养不良的方法，所述方法包括：
操作干细胞中角膜营养不良靶核酸中的核酸突变以校正所述核酸突变，从而形成经操作的干细胞；并且
将所述经操作的干细胞移植到所述受试者中。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
操作多个干细胞中的所述核酸突变以校正所述核酸突变，从而形成一个或多个经操作的干细胞；
分离所述一个或多个经操作的干细胞；并且
将所述一个或多个经操作的干细胞移植到所述受试者中。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括在移植前培养所述一个或多个经操作的干细胞，从而形成多个经操作的干细胞，
其中所述移植包括移植所述多个经操作的干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在移植前培养所述经操作的干细胞，从而形成多个经操作的干细胞，
其中所述移植包括移植所述多个经操作的干细胞。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述培养是在操作后进行。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述培养包括建立稳定的细胞系。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中从自体或同源供体获得所述干细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述受试者获得在角膜营养不良靶核酸中包括所述核酸突变的干细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良靶核酸是TGFβI靶核酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸突变编码TGFβI多肽中的精氨酸124、精氨酸555或组氨酸626的氨基酸取代。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸突变编码选自R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、和H626P的氨基酸取代。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良靶核酸是COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、LOX、SPARC、LRRN1、HGF、AKAP13、ZNF469、ATG12P2、GS1-256O22.5、PLEKHA6、APOL4、SLC44A3、SLC6A18、SLC29A3、RANBP3L、KCNMA1、MUC5AC、CROCC、ATHL1、或PLP1靶核酸.。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸突变编码选自以下的氨基酸取代：COL4A1中的Q1334H、COL4A2中的G683A、COL4A2中的P718S、COL4A2中的R517K、COL4A3中的D326Y、COL4A3中的H451R、COL4A4中的V1327M、LOX中的R158Q、AKAP13中的A1046T、AKAP13中的G624V、ZNF469中的G2358R、SLC29A3中的S158F、MUC5AC中的P4493S、CROCC中的P370S或其任何组合。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述核酸突变对应于rs3742207、rs3803230、rs9583500、rs7990383、rs55703767、rs11677877、rs2229813、rs1800449、rs1053411、rs2116780、rs3749350、rs2286194、rs12536657、rs2614668、rs745191、rs12598474、rs10932976、rs5908678、rs35803438、rs132728、rs132729、rs132730、rs859063、rs2893276、rs6687749、rs13189855、rs6876514、rs6876515、rs13361701、rs883764、rs780667、rs780668、rs13166148、rs10941287、rs7907270、rs200922784、rs9435793、rs116300974、或rs2233696。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述角膜营养不良靶核酸是TGFβI、KRT3、KRT12、GSN或UBIAD1靶核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸突变编码选自下组的氨基酸取代：
(i)TGFβI靶核酸中的Leu509Arg、Arg666Ser、Gly623Asp、Arg555Gln、Arg124Cys、Val505Asp、Ile522Asn、Leu569Arg、His572Arg、Arg496Trp、Pro501Thr、Arg514Pro、Phe515Leu、Leu518Pro、Leu518Arg、Leu527Arg、Thr538Pro、Thr538Arg、Val539Asp、Phe540del、Phe540Ser、Asn544Ser、Ala546Thr、Ala546Asp、Phe547Ser、Pro551Gln、Leu558Pro、His572del、Gly594Val、Val613del、Val613Gly、Met619Lys、Ala620Asp、Asn622His、Asn622Lys、Asn622Lys、Gly623Arg、Gly623Asp、Val624_Val625del、Val624Met、Val625Asp、His626Arg、His626Pro、Val627SerfsX44、Thr629_Asn630insAsnValPro、Val631Asp、Arg666Ser、Arg555Trp、Arg124Ser、Asp123delins、Arg124His、Arg124Leu、Leu509Pro、Leu103_Ser104del、Val113Ile、Asp123His、Arg124Leu、和/或Thr125_Glu126del；
(ii)KRT3靶核酸中的Glu498Val、Arg503Pro、和/或Glu509Lys；
(iii)KRT12靶核酸中的Met129Thr、Met129Val、Gln130Pro、Leu132Pro、Leu132Va、Leu132His、Asn133Lys、Arg135Gly、Arg135Ile、Arg135Thr、Arg135Ser、Ala137Pro、Leu140Arg、Val143Leu、Val143Leu、Lle391_Leu399dup、Ile 426Val、Ile 426Ser、Tyr429Asp、Tyr429Cys、Arg430Pro、和/或Leu433Arg；
(iv)GSN靶核酸中的Asp214Tyr；和
(v)UBIAD1靶核酸中的Ala97Thr、Gly98Ser、Asn102Ser、Asp112Asn、Asp112Gly、Asp118Gly、Arg119Gly、Leu121Val、Leu121Phe、Val122Glu、Val122Gly、Ser171Pro、Tyr174Cys、Thr175Ile、Gly177Arg、Lys181Arg、Gly186Arg、Leu188His、Asn232Ser、Asn233His、Asp236Glu、和/或Asp240Asn。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述多个干细胞是角膜缘上皮干细胞、口腔粘膜上皮干细胞、牙干细胞、毛囊干细胞、间充质干细胞、脐带衬干细胞或胚胎干细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个干细胞是角膜缘上皮干细胞。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在激光眼部手术后发生所述角膜营养不良。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，所述方法还包括以一个或多个预定频率重复所述移植。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中通过如下操作所述核酸突变：将核酸操作试剂组导入所述分离的多个干细胞中，从而所述核酸操作试剂校正所述多个干细胞中的一个或多个中的所述核酸突变。
22.根据权利要求21所述的方法，其中使用电穿孔、转染或病毒递送将所述核酸操作试剂导入到所述多个干细胞中。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述核酸操作试剂组包含锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、再工程化归巢核酸酶、RNA干扰(RNAi)试剂或成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/核酸酶系统试剂。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述核酸操作试剂是成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/核酸酶系统试剂，其包含：
与所述多个干细胞内的角膜营养不良靶核酸杂交的引导RNA核酸；和
编码核酸酶的核酸酶核酸；
从而所述引导RNA靶向所述靶核酸并且所述核酸酶切割所述靶核酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述引导RNA包含可检测标记物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述引导RNA的可检测标记物是核酸条形码或荧光条形码标记物。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述核酸操作试剂还包含：
包含野生型形式的所述角膜营养不良靶核酸或其片段的修复核酸，
从而所述引导RNA靶向所述靶核酸并且所述核酸酶切割所述靶核酸，从而创建靶核酸切割位点，并且从而在创建所述靶核酸切割位点后所述修复核酸能够与所述角膜营养不良靶核酸同源重组。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述修复核酸包含可检测标记物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述修复核酸的可检测标记物是核酸条形码或荧光条形码标记物。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中CRISPR/核酸酶系统试剂还包含一种或多种试剂，所述试剂通过抑制参与非同源末端连接(NHEJ)途径的基因来增加所述多个干细胞中的同源重组频率。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶。
32.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述操作包括将工程化成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统导入所述干细胞中，其中所述CRISPR/Cas9系统包含至少一种载体，所述载体包含编码Cas9核酸酶和单一引导RNA(sgRNA)的核苷酸分子，并且所述Cas9核酸酶和所述sgRNA不一起天然存在。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述sgRNA包含(i)CRISPR靶向RNA(crRNA)序列，和(ii)反式激活crRNA(tracrRNA)序列，其中所述crRNA序列和tracrRNA序列不一起天然存在。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述tracrRNA包含与SEQ ID NO:2或6的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述Cas9核酸酶来自链球菌属、葡萄球菌属或其变体。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述Cas9核酸酶包含与选自SEQ IDNO:4或8的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中编码Cas9核酸酶的核苷酸分子包含与选自SEQ ID NO:3或7的核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中所述sgRNA和所述Cas9核酸酶包含在同一载体上。
39.用于在有此需要的受试者中治疗角膜营养不良的试剂盒，所述试剂盒包含：
与角膜营养不良靶核酸杂交的引导RNA核酸；和
编码核酸酶的核酸酶核酸。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其还包含：
修复核酸，其包含野生型形式的所述角膜营养不良靶核酸或其片段。
CN201680077123.2A 2015-11-13 2016-11-14 用于治疗角膜营养不良的方法 Pending CN108699542A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562255310P 2015-11-13 2015-11-13
US62/255,310 2015-11-13
PCT/US2016/061893 WO2017083852A1 (en) 2015-11-13 2016-11-14 Methods for the treatment of corneal dystrophies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108699542A true CN108699542A (zh) 2018-10-23

Family

ID=58696178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680077123.2A Pending CN108699542A (zh) 2015-11-13 2016-11-14 用于治疗角膜营养不良的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11987809B2 (zh)
EP (2) EP4036228A1 (zh)
JP (2) JP6929865B2 (zh)
KR (1) KR20180120670A (zh)
CN (1) CN108699542A (zh)
ES (1) ES2905558T3 (zh)
WO (1) WO2017083852A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114245741A (zh) * 2019-03-28 2022-03-25 儿童医学中心公司 高功能性的制造的abcb5+间充质干细胞

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3065946A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Enhanced modified viral capsid proteins
EP3636754A4 (en) * 2017-06-07 2021-03-17 The University Of Tokyo GENE THERAPY FOR GRANULAR CORNEAL DYSTROPHY
US20190218532A1 (en) * 2017-09-19 2019-07-18 Massachusetts Institute Of Technology Streptococcus Canis Cas9 as a Genome Engineering Platform with Novel PAM Specificity
US11572574B2 (en) 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
RU2767201C2 (ru) * 2017-09-28 2022-03-16 Тулджен Инкорпорейтед Искусственная модификация генома для регуляции экспрессии гена
AU2018386301A1 (en) 2017-12-14 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Novel RNA-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications
KR20210106527A (ko) * 2018-12-20 2021-08-30 페킹 유니버시티 바코드화 가이드 rna 구축물을 사용한 고효율의 유전자 스크리닝을 위한 조성물 및 방법
RU2730975C1 (ru) * 2020-02-18 2020-08-26 Ирина Викторовна Булыгина Способ лечения эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы
WO2023004189A1 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 Avellino Lab Usa, Inc. Method for detecting alleles associated with keratoconus

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015089462A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
DE69733282T2 (de) 1996-06-04 2006-01-19 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Überwachung der Hybridisierung während PCR
US6117635A (en) 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US6018713A (en) 1997-04-09 2000-01-25 Coli; Robert D. Integrated system and method for ordering and cumulative results reporting of medical tests
JP3380744B2 (ja) 1998-05-19 2003-02-24 株式会社日立製作所 センサおよびこれを利用した測定装置
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6171112B1 (en) 1998-09-18 2001-01-09 Wyngate, Inc. Methods and apparatus for authenticating informed consent
AU4135600A (en) 1999-03-29 2000-10-16 Genset Prostate cancer associated human fibronectin gene and biallelic markers
US6270970B1 (en) 1999-05-14 2001-08-07 Promega Corporation Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids
ATE381626T1 (de) 2000-04-13 2008-01-15 Univ Georgetown Genetische diagnose zur feststellung von qt- verlängerungen als unerwünschte reaktion auf arzneimittel
US8438042B2 (en) 2002-04-25 2013-05-07 National Biomedical Research Foundation Instruments and methods for obtaining informed consent to genetic tests
CA2451919A1 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Curagen Corporation Nucleic acids, polypeptides, single nucleotide polymorphisms and methods of use thereof
AU2002352069A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Graffinity Pharmaceuticals Ag Surface plasmon resonance (spr) sensor surface support
US6943417B2 (en) 2003-05-01 2005-09-13 Clemson University DNA-based memory device and method of reading and writing same
US20050019757A1 (en) 2003-06-12 2005-01-27 Stolarchuk Danylo J. Contaminant detection apparatus
JP4229394B2 (ja) 2003-08-06 2009-02-25 日本電信電話株式会社 多孔質材料を用いた分子の検出方法ならびに該多孔質材料及び該多孔質材料の製造方法
WO2005040756A2 (en) 2003-10-22 2005-05-06 The Regents Of The University Of California Methods for preparing and functionalizing nanoparticles
JP2007512807A (ja) 2003-10-28 2007-05-24 バイエル ヘルスケア アーゲー 悪性腫瘍の処置に対する応答予測のための方法および組成物
EP1541528A1 (en) 2003-12-08 2005-06-15 Institut Jozef Stefan Quasi-one-dimensional polymers based on the metal-chalcogen-halogen system
US20060057604A1 (en) 2004-03-15 2006-03-16 Thinkfar Nanotechnology Corporation Method for electrically detecting oligo-nucleotides with nano-particles
CN1957245B (zh) 2004-05-19 2010-12-08 Vp控股有限公司 通过sers增强化学基团检测的具有层化等离子体结构的光学传感器
US7713849B2 (en) 2004-08-20 2010-05-11 Illuminex Corporation Metallic nanowire arrays and methods for making and using same
US7332329B2 (en) 2004-09-24 2008-02-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Versatile substrate for SPR detection
JP2008533000A (ja) 2005-03-08 2008-08-21 メディジーンズ カンパニー リミテッド ＴＧＦ−βに対する抗体を含むアベリノ角膜ジストロフィー治療用医薬組成物
JP2006250668A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Tatsuro Endo 非標識バイオチップ
EP1715326A1 (en) 2005-04-22 2006-10-25 Universität Heidelberg Sensor chip with connected non-metallic particles comprising a metallic coating
WO2007002567A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Nanosphere, Inc. Selective isolation and concentration of nucleic acids from complex samples
KR20070076532A (ko) 2006-01-18 2007-07-24 메디제네스(주) 각막이영양증 진단용 ｄｎａ 칩
CN101374850A (zh) 2006-01-18 2009-02-25 株式会社美迪基尼斯 用于角膜营养不良诊断的dna芯片
MX2008012026A (es) 2006-03-21 2008-11-04 Univ Washington Polimorfismos geneticos en el gen de hormona que libera corticotropina (crh) como marcadores para mejorar el registro de marmoleo de carne de res y/o profundidad de grasa subcutanea.
EP1932922A1 (de) 2006-12-13 2008-06-18 Desitin Arzneimittel GmbH Schnelltest zum Nachweis von DNA-Sequenzen
EP2115123A4 (en) 2007-01-16 2010-07-07 Applied Biosystems Llc SELECTIVE LYSE OF SPERM CELLS
US7898658B2 (en) 2007-01-23 2011-03-01 The Regents Of The University Of California Platform for chemical and biological sensing by surface-enhanced Raman spectroscopy
KR100891096B1 (ko) 2007-02-13 2009-03-31 삼성전자주식회사 올리고머 프로브 어레이 및 이의 제조 방법
JP5222599B2 (ja) 2007-07-20 2013-06-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析デバイス及びそれを用いた核酸分析装置
CN101144812B (zh) 2007-10-17 2012-02-22 中国科学院光电技术研究所 一种局域表面等离子体生化传感器的制作方法
US20120231537A1 (en) 2008-04-30 2012-09-13 Gradalis, Inc. Highly Pure Plasmid DNA Preparations
KR101251538B1 (ko) 2009-04-17 2013-04-08 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
US8865402B2 (en) 2009-08-26 2014-10-21 Clemson University Research Foundation Nanostructured substrates for surface enhanced raman spectroscopy (SERS) and detection of biological and chemical analytes by electrical double layer (EDL) capacitance
KR101125212B1 (ko) 2010-10-01 2012-03-21 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템
KR20130027281A (ko) 2011-09-07 2013-03-15 (주)에스엘에스 원추각막 검사 방법 및 키트
US9895451B2 (en) 2011-12-02 2018-02-20 Yale University Formulations for targeted release of agents to low pH tissue environments or cellular compartments and methods of use thereof
KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2022-12-12 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
CN105121648B (zh) 2012-12-12 2021-05-07 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
DK2921557T3 (en) 2012-12-12 2016-11-07 Broad Inst Inc Design of systems, methods and optimized sequence manipulation guide compositions
SG10201801969TA (en) 2012-12-12 2018-04-27 Broad Inst Inc Engineering and Optimization of Improved Systems, Methods and Enzyme Compositions for Sequence Manipulation
CN105164264B (zh) 2012-12-12 2021-05-07 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵和治疗应用的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3865573A1 (en) * 2013-02-19 2021-08-18 Children's Medical Center Corporation Abcb5(+) stem cells for treating ocular disease
US10335439B2 (en) * 2013-03-11 2019-07-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing human corneal epithelium sheet
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
SG11201600059QA (en) 2013-07-09 2016-02-26 Harvard College Multiplex rna-guided genome engineering
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
TWI755350B (zh) * 2013-11-15 2022-02-21 美商阿韋利諾美國實驗有限公司 用於多工偵測與眼科病況有關的對偶基因之方法
US20150225801A1 (en) * 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
CN107075469A (zh) * 2014-06-27 2017-08-18 加利福尼亚大学董事会 培养的哺乳动物角膜缘干细胞、其产生方法和其用途
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
GB2531454A (en) 2016-01-10 2016-04-20 Snipr Technologies Ltd Recombinogenic nucleic acid strands in situ
JP2018520149A (ja) * 2015-07-02 2018-07-26 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９をベースとした治療
US11473084B2 (en) 2015-10-09 2022-10-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating Huntington's disease and related disorders
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US20220056440A1 (en) 2016-08-20 2022-02-24 Tara Moore Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
US20190185850A1 (en) 2016-08-20 2019-06-20 Avellino Lab Usa, Inc. Single guide rna/crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
US20210222171A1 (en) 2016-08-20 2021-07-22 Avellino Lab Usa, Inc. Crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2020046861A1 (en) 2018-08-27 2020-03-05 Avellino Lab Usa, Inc. Crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
CN106282383B (zh) 2016-10-08 2019-05-31 山东省眼科研究所 Krt12基因在检测圆锥角膜中的应用
EP3545090A1 (en) 2016-11-28 2019-10-02 The Board of Regents of The University of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cpf1-mediated gene editing
CN110997940A (zh) 2017-04-28 2020-04-10 阿维利诺美国实验室股份有限公司 用于检测与圆锥角膜相关的等位基因的方法
EP3676378A4 (en) 2017-08-31 2021-06-09 The New York Genome Center PROCEDURES AND COMPOSITIONS USING CRIMP-CPF1 AND PAIRED GUIDE-CRISPR-RNA FOR PROGRAMMABLE GENOMIC DELETIONS
US20210032612A1 (en) 2018-02-22 2021-02-04 Avellino Lab Usa, Inc. CRISPR/Cas9 Systems, and Methods of Use Thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015089462A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYRNE,SM等: "Genome Editing in Human stem cells", 《METHODS IN ENZYMOLOGY》 *
COURTNEY, DG等: "A review of personalised molecular medicine for the treatment of comeal disorders", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY AND EYE DISEASE》 *
COURTNEY,DG等: "CRISPR/Cas9 DNAcleavage at SNP-Derived PAM Enables both in vitro and in vivo KRT12 mutation-specific targeting", 《GENE THERAPY》 *
ZHANG，K等: "Isolation and Transplantation of Comeal Endothelial Cell-Like cells derived from in-vitro-differentiated Human Embryonic stem cells", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114245741A (zh) * 2019-03-28 2022-03-25 儿童医学中心公司 高功能性的制造的abcb5+间充质干细胞

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017083852A1 (en) 2017-05-18
WO2017083852A8 (en) 2018-05-31
EP3374502A4 (en) 2019-07-10
JP7239649B2 (ja) 2023-03-14
EP4036228A1 (en) 2022-08-03
US11987809B2 (en) 2024-05-21
JP2021183626A (ja) 2021-12-02
US20190085288A1 (en) 2019-03-21
EP3374502A1 (en) 2018-09-19
JP6929865B2 (ja) 2021-09-01
JP2018534114A (ja) 2018-11-22
EP3374502B1 (en) 2021-10-27
KR20180120670A (ko) 2018-11-06
ES2905558T3 (es) 2022-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108699542A (zh) 用于治疗角膜营养不良的方法
JP2022046694A (ja) 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
JP7301332B2 (ja) Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット
Oldenburg et al. Changes in the structure of DNA molecules and the amount of DNA per plastid during chloroplast development in maize
US20230149439A1 (en) Rho-adrp gene editing-based methods and compositions
WO2022072458A1 (en) Crispr/cas9 targeted excision of the intronic ctg18.1 trinucleotide repeat expansion of tcf4 as a therapy in fuchs&#39; endothelial corneal dystrophy
KR101658135B1 (ko) 혈액 응고인자 ⅷ 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이의 용도
EP3636754A1 (en) Gene therapy for granular corneal dystrophy
WO2022137760A1 (ja) ゲノムｄｎａに大規模な欠失を生じさせる方法およびゲノムｄｎａの分析方法
JP2018042503A (ja) 標的遺伝子の標識方法、ベクターシステム、細胞、及び遺伝子活性維持標的遺伝子編集キット
US20230407279A1 (en) Crispr/cas9 targeted excision of the intronic ctg18.1 trinucleotide repeat expansion of tcf4 as a therapy in fuchs&#39; endothelial corneal dystrophy
Craig-Müller Modeling MyD88 deficiency
WO2021190226A1 (zh) 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
WO2021171688A1 (ja) 遺伝子ノックイン方法、遺伝子ノックイン細胞作製方法、遺伝子ノックイン細胞、がん化リスク評価方法、がん細胞製造方法、及びこれらに用いるためのキット
Christensen et al. The role of stem cell antigen-1/Lymphocyte antigen 6A-2/6E-1 knock out in murine epidermis
Hernández Morán In vitro analysis of early eye development to understand the molecular basis of mammalian eye malformations
CN117363649A (zh) 基因整合方法及应用
KR20230051688A (ko) 뉴클레아제 매개 핵산 변형
Lemanski et al. Cellular, molecular, and developmental studies on heart development in normal and cardiac mutant axolotls, Ambystoma mexicanum
CN115960957A (zh) 一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法、应用及治疗血栓的药物
Messineo Development of a gene targeting strategy (Recombinase-Mediated CAssette Exchange) to generate cellular models of MYH9-related disease
JP2012080808A (ja) Ｅｓ細胞における相同組換え効率を改善する方法
JP2005034008A (ja) 新規遺伝子発現抑制法およびその利用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1259885

Country of ref document: HK