CN115960957A - 一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法、应用及治疗血栓的药物 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了smarca5突变体红细胞异常聚集的表型，研究了smarca5突变体中相应的红系细胞和髓系细胞的发育情况、细胞形态和数目等特征。部分解析了smarca5调控红细胞聚集表型的机制，由此构建了一种荧光血栓斑马鱼模型，建立了静脉血栓疾病模型，并提供了一种防止红细胞聚集的或抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的方法、用途及药物，以期作为血栓疾病模型用于药物筛选，具有临床指导意义。

Description

一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法、应用及治疗血栓的药物

技术领域

本申请涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法及治疗血栓的药物

背景技术

成熟的红细胞富含血红蛋白，具有携带氧气的功能。因其具有细胞形变能力，红细胞可以在所有血管中流动，对维持机体的稳态至关重要(Rodriguez-Garcia et al.,2016)。此外，红细胞参与血栓和止血的维持(Weisel&Litvinov,2019)。红细胞发生缺陷会导致多种疾病的发生，包括血红蛋白异常性贫血、红细胞溶解性贫血以及血栓(Kato etal.,2018；Roumenina,Rayes,Lacroix-Desmazes,&Dimitrov,2016；Weisel&Litvinov,2019)。其中，血栓的发生严重危害了人类的健康(Wendelboe&Raskob,2016)。通过动物疾病模型研究血栓的发生，为探究血栓发生的机制和寻找治疗手段提供了帮助。现如今，结扎下腔静脉模型、自由基血栓形成模型和基因敲除模型被广泛应用于小鼠静脉血栓形成的研究(Diaz et al.,2019；Grover&Mackman,2019)。这些模型主要通过改变血流、损伤内皮以及调节凝集因子引发血栓的形成。此外，苯肼处理可以通过损伤红细胞，导致红细胞的磷脂酰丝氨酸外翻以及自由基的产生，进而导致血栓的发生(Zhu et al.,2016)。然而，目前的研究仍缺乏对血栓形成的动态观察以及深入的机制研究。

发明内容

本发明从突变体红细胞异常聚集的表型出发，进行血栓疾病模型的研究，以期作为血栓疾病模型用于药物筛选，探究其临床指导意义。

本发明具体涉及以下技术方案：

1.一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法，其特征在于，包括：

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼。

2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述smarca5突变的斑马鱼杂合体是通过CRISPR/Cas9方法对斑马鱼的染色体进行编辑而获得。

3.根据项1或2所述的方法，其特征在于，所述带有荧光的转基因斑马鱼为具有不同荧光标记的转基因斑马鱼，优选利用不同荧光标记分别标记红细胞和血管内皮细胞。

4.根据项1～3任一项所述的方法，其特征在于，

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体并确定具有smarca5突变的斑马鱼杂合体F0；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼的步骤包括：

将smarca5突变体杂合体F0与带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，得到同时带有荧光的smarca5突变体F1代；

F1代突变体中挑选smarca5突变的杂合子进行雌雄交配，得到F2代突变体胚胎；

基因鉴定F2代突变体中smarca5突变的纯合子即为荧光血栓斑马鱼模型。

5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，所述荧光血栓斑马鱼模型是荧光血栓斑马鱼胚胎。

6.一种抗血栓或促进血栓溶解的方法，其包括针对由此需要的受试者进行基因治疗以修复smarca5突变。

7.荧光血栓斑马鱼在筛选用于促进血栓溶解或降低受试者血栓形成或抗血栓的药物中的用途。

8.一种防止红细胞聚集的方法，包括在体外或体内过表达keap1a或敲降hmox1a。

9.促进keapla的过表达或降低hmox1a的激活的物质用于制备抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物中的用途。

10.一种抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的方法，包括：通过基因操作的方法使得在由此需要的受试者中过表达keap1a或使受试者的hmox1a被敲降。

11.根据项10的方法，其中，所述基因操作包括利用基因编辑或基因表达。

12.一种用于抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物，其包括：抑制smarca5发生突变的物质或促进keapla的过表达的物质或降低hmox1a的激活的物质。

发明效果

1.本发明鉴定了smarca5突变体红细胞异常聚集的表型。

2.本发明部分解析了smarca5调控红细胞聚集表型的机制。

3.本发明建立了静脉血栓疾病模型，以期作为血栓疾病模型用于药物筛选，具有临床指导意义。

附图说明

图1A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红细胞聚集情况对比。虚线标记的区域为尾静脉的血凝块。

图1B为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红细胞初级红细胞标记基因scl的表达情况对比。黑色矩形框中标记的区域为scl在尾静脉的血凝块(箭头所示)。

图1C为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红细胞在尾部血管内聚集情况对比。箭头所示为血管腔内的gata1:dsRed细胞。

图1D为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红系细胞标记基因gata1,ikaros和scl的表达情况对比。

图1E为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红系细胞标记基因gata1,ikaros,hbae1和hbbe1的表达水平。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图2A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎髓系细胞分布情况对比。绿色荧光标记区域为圆圈内区域。

图2B为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎髓系细胞标记基因pu.1和lyz的表达情况对比。

图2C为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中髓系细胞标记基因pu.1,mfap4和lyz的表达水平。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图3A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的聚集过程。

图3B为smarca5突变体和对照组连体共生胚胎中的血细胞聚集表型。

图3C为smarca5突变体来源的红细胞(gata1:GFP⁺标记)和照组胚胎来源的红细胞(gata1:dsRed⁺标记)在连体共生胚胎中的分布情况。绿色荧光标记(gata1:GFP⁺标记)区域为圆圈内区域。

图3D为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中巨核前体细胞(CD41:GFP^high)的分布情况。

图3E为药物处理对红细胞聚集表型的缓解效果。

图3F为药物Argatroban处理后，对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞聚集表型。

图3G为药物Argatroban处理后，对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞聚集表型统计结果。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(**p<0.01)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图4A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中造血干祖细胞的分布情况。绿色荧光标记区域为圆圈内区域。

图4B对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中造血干祖细胞在尾部造血组织的数目统计结果。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图5A为透射电子显微镜观察对照组胚胎中尾部动脉和静脉丛的纵切面图。

图5B为对照组胚胎中红细胞的亚细胞结构图。箭头指示结构正常的线粒体。

图5C为透射电子显微镜观察smarca5纯合突变体胚胎中尾部动脉和静脉丛的纵切面图。

图5D为突变体尾部静脉区的红细胞聚集情况。

图5E为突变体组红细胞的亚细胞结构。箭头指示结构异常的线粒体。Ery，红细胞；EC，内皮细胞；Mito，线粒体；Nuc，细胞核；Cyto，细胞质。

图6A为流式分析对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞(gata1:dsRed⁺)的比例。

图6B为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞(gata1:dsRed⁺)的比例的流式统计结果。

图6C为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎的血涂片和吉姆萨染色。

图6D为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中的红细胞核质比分析。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图7A为RNA-seq测序实验流程图。

图7B为smarca5敲除后，红细胞中基因表达变化的火山图。

图7C为基因集变异分析(GSVA)分析照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的差异通路。x轴表示GSVA评分的t值。

图7D为“红细胞稳态”和“炎性反应”信号通路在smarca5纯合突变体胚胎红细胞中的富集变化。

图8A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的RNA-seq样本主成分分析图。

图8B为hbae1.1,hbae1.2,hbae1.3,hbae3,hbbe1.3,hbbe2,hbbe3,hbaa1,hbba1和hbba2在照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中的表达情况。

图8C为hbae1,hbae3,hbbe1,hbbe2,hbbe3,hbaa1,hbba1和hbba2在照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中表达的原位杂交展示图。

图8D为照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中的联甲氧基苯胺染色图。黑色箭头指示突变体中的血凝块。

图8E为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎髓系细胞标记基因spi1a,spi1b,mfap4和lyz的表达水平。

图8F为注射pu.1MO后smarca5纯合突变体和对照组胚胎中红细胞的聚集表型。

图8G为注射pu.1MO后smarca5纯合突变体和对照组胚胎中红细胞的聚集表型统计结果。数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图9A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体中启动子区和远端调控区分别开放的基因数的韦恩图。

图9B为对缺失smarca5后染色质开放性下降的区域进行Motif筛选。

图9C为对照组胚胎和smarca5纯合突变体中启动子区染色质开放性和转录水平同时上调和下调基因数的韦恩图。

图9D为对照组胚胎和smarca5纯合突变体中分别高表达同时伴随染色质开放的基因。

图10A ATAC-seq峰在转录起始位点(TSS)上游和下游1kb区间的分布热图。左侧热图为无核小体(小于100bp)分布，右侧为单核小体(180～247bp)分布。

图10B为图10A中TSS附近ATAC-seq峰的分布图。

图10C为主成分分析smarca5纯合突变体及其对照组中红细胞的ATAC-seq样本的结果。

图10D为突变体及其对照组ATAC-seq峰在整个基因组中的分布特征。

图10E为突变体组中远端调控区染色质开放性和转录水平同时上调和下调的基因数的韦恩图。

图11A为对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中keap1启动子区域的ATAC-seq峰值。黑色箭头标记预测的Gata1结合位点。

图11B为keap1a对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红细胞中的表达水平。

图11C为hmox1a，gclc，ggt1b，gsr，gstp1，gstk1，fbp1a，gsto2，prdx1，pgd和g6pd在对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎红细胞中的表达情况。

图11D为热激处理后EGFP在受精后2天发育时期的转基因鱼Tg(hsp70:keap1a-EGFP)的表达荧光图(上)，以及热激处理后smarca5纯合突变体和对照组胚胎中红细胞的聚集表型图(下)。

图11E为图11D中红细胞聚集表型的统计结果。

图11F为注射hmox1a MO后对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的聚集表型。

图11G为图11F中红细胞聚集表型统计结果。

数据是平均值±SD(B，C，E，G)。星号表示差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.无显著性差异)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

图11H为Smarca5通过调控keap1a启动子区的染色质开放性,影响Keap1-Nrf2信号通路以及下游靶基因hmox1a的表达的模式图。

图12A为显微观察在对照处理以及谷胱甘肽处理后，对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中尾部静脉红细胞聚集的表型。

图12B为12A中红细胞聚集表型的统计结果。

数据是平均值±SD。星号表示差异的显著性(*p<0.05，**p<0.01)。P值由学生t检验，双尾计算得出。

具体实施方式

以下通过具体实施例来详细阐述和说明本申请的实施方式，但以下内容不应理解为对本申请作任何限制。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。

定义

在以下描述的实例中，使用多个术语。为了提供说明书和权利要求的清楚的和一致的理解，提供以下定义。除非本文另有定义，所使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的公开内容全部引入本文以作参考。

如本文所使用的，除非另有定义，术语“普通科学术语”指的是具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义的技术和科学术语。本领域技术人员将认识到可用于本发明实施的与本文所述的那些相似或等同的很多方法和材料。的确，本发明决不限于所述的方法和材料，并且分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域内的常规技术的实施是本领域技术人员公知的。

如本文所使用的，术语基因的“表达水平”指的是由基因转录的RNA转录物的量和/或可从RNA转录物例如mRNA翻译的蛋白质的量。例如，对于编码miRNA的基因，可通过例如使用标准方法如成熟miRNA的定量PCR、微阵列(microarray)、或RNA印迹量化表达的RNA转录物的量来测定表达水平。可选地，表达水平还可通过测量miRNA对靶mRNA的作用来测定。

如本文所使用的，术语“基因的表达”指的是将可操作地连接至合适的调节区域特别是启动子的DNA区域转录为具有生物活性的，即可翻译为生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)的、或(例如在转录后基因沉默(gene silencing)或RNAi中)本身具有活性的RNA的过程。

如本文所用，术语“基因”泛指与生物学功能相关的任何DNA片段。基因涵盖序列，包括但不限于编码序列、启动子区、顺式调节序列、调节蛋白的特异性识别序列的非表达的DNA片段、有助于基因表达的非表达的DNA片段、设计为具有期望参数的DNA片段，或者它们的组合。

如本文所用，术语“基因表达”是指从DNA序列产生生物活性多肽的细胞过程。

如本文所使用的，术语“表型”指的是有机体或有机体的细胞的至少一种可观察特征(characterstic)或性状，例如其形态、发育、生物化学或生理特性、物候学、行为、和行为的产物。表型起因于基因的表达以及环境因子的影响，和两者之间的相互作用。虽然表型是有机体所展示的可观察特征的集合，但表型组(phenome)一词有时用来指性状的集合，并且它们的同时研究称为表型组学(phenomics)。

如本文所使用的，术语“高通量测序”和“下一代测序”和“深度测序(deepsequencing)”指的是可生成通常是数千(即几万或几十万)或数百万数量级的序列读序(read)而不是一次几百的大量读序的测序技术。高通量测序区别和不同于常规桑格(Sanger)或毛细管测序(capillary sequencing)。

如本文所使用的，术语“启动子”指的是功能为控制一个或多个基因的转录的核酸片段，其相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游，并且通过下列物质的存在而在结构上识别：DNA依赖性RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase)的结合位点，转录起始位点，和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻抑物和激活物蛋白结合位点、和本领域技术人员公知的直接或间接作用来调节从启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。

在本文中使用的术语“杂合子”是指同源染色体同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体。杂合子间交配所生后代会出现性状的分离。

在本文中使用的术语“纯合子”又称纯合体，同型结合体，其是指二倍体中同源染色体上相同位点等位基因相同的基因型个体。

在本文中使用的术语“位点”是指基因在染色体上占有的特定位置。

如本文所使用的，术语“测序”指的是测定核酸样品例如DNA或RNA中的核苷酸(碱基序列)的顺序。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，种类包括犬、猫、马、牛、羊等以及灵长类动物，具体是人。

如本文所用，术语“CRISPR/Cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。以CRISPR/Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

如本文所用，术语“Cas9”是指可以表现出由CRISPR RNA(crRNA)引导的最小内切核酸酶活性(例如切割多核苷酸内的磷酸二酯键)的酶(野生型或重组的)，所述CRISPR RNA携带靶多核苷酸的互补序列。Cas9多肽是本领域已知的，并且包括来自各种生物来源中任一种的Cas9多肽，包括例如原核生物来源，如细菌和古细菌。细菌Cas9包括放线菌(例如，内氏放线菌)Cas9、产水菌(Aquificae)Cas9、拟杆菌Cas9、衣原体Cas9、绿弯菌Cas9、蓝细菌(Cyanobacteria)Cas9、Elusimicrobia Cas9、纤维杆菌Cas9、厚壁菌Cas9(例如，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9、无害李斯特菌Cas9、无乳链球菌Cas9、变形链球菌Cas9和屎肠球菌Cas9)、梭杆菌Cas9、变形菌(例如，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、空肠弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌)Cas9、螺旋体(例如，齿垢密螺旋体)Cas9等。古细菌Cas9包括广古菌(Euryarchaeota)Cas9(例如，海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)Cas9)等。各种Cas9和相关多肽是已知的，并且在例如Makarova et al.(2011)Nature ReviewsMicrobiology 9:467-477,Makarova etal.(201 1)Biology Direct 6:38,Haft et al.(2005)PLOS Computational Biology I:e60和Chylinski et al.(2013)RNA Biology10:726-737；K.Makarova et al.,An updatedevolutionary classification of CRISPR-Cas systems.(2015)Nat.Rev.Microbio.13:722-736；以及B.Zetsche et al.Cpf1 is asingle RNA-guided endonuclease of aclass 2CRISPR-Cas system.(2015)Cell.163(3):759-771中进行了综述。

如本文所用，术语“过表达”在本发明中指基因过渡表达，即基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平。让基因过表达的方式主要有三种，构建外源基因过表达，CRISPR SAM，saRNA。

如本文所用，当用来指RNAi对基因表达的影响时，术语“敲降”表示基因表达水平被抑制，或者降低至低于在基本上相同的条件但不存在RNAi下检查时通常观察到的水平。

如本文所用，术语“敲除”是指部分或完全抑制内源基因的表达。这一般是通过缺失一部分基因或通过用第二序列替代一部分来完成的，但是还可以由对基因的其他修饰引起，如引入终止密码子、关键氨基酸的突变、去除内含子连接点(junction)等。因此，“敲除”构建体是核酸序列，如DNA构建体，当引入细胞时，其导致细胞中内源DNA编码的多肽或蛋白的表达的抑制(部分或完全)。在一些实施方案中，“敲除”包括突变如点突变、插入、缺失、移码或错义突变。

如本文所用，术语“突变的”是指序列的变化，如核苷酸或氨基酸序列，从各自序列的天然、野生型、标准或参考版本，即非突变的序列发生变化。突变的基因可以导致突变的基因产物。突变的基因产物与非突变的基因产物的不同之处在于一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，导致突变的基因产物的突变的基因可以与相应的非突变的核苷酸序列具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更大的序列相同性。

如本文所用，术语“组成性表达”是指某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，被称为管家基因。管家基因较少受环境因素影响，在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达被视为组成性基因表达。含义包括A.在大多数细胞中持续恒定表达，B.受多种机制调节的基因表达，C.可诱导基因表达，D.空间特异性基因表达。

如本文所用，术语“诱导表达”是指在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导表达。

如本文所用，术语“阻遏表达”是指在特定环境信号刺激下，如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏表达。

如本文所用，关于特定疾病状况，术语“治疗”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。在完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响方面，效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者，特别是人的疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生疾病或病症；(b)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；以及(c)缓解或减轻疾病或病症，即，引起疾病或病症的消退和/或缓解一种或多种疾病或病症症状。“治疗”还可以涵盖药剂的递送或治疗的给药以提供药理效应，甚至在不存在疾病、病症或疾病状况的情况下。在一些实施方案中，术语“治疗”用来指给药本公开的化合物以减轻宿主，优选哺乳动物受试者，更优选人的疾病或病症。因此，术语“治疗”可以包括：预防宿主中发生病症，特别是当宿主易患疾病但尚未诊断患有该疾病时；抑制病症；和/或缓解或逆转病症。就本公开的方法涉及预防病症而言，应当理解术语“预防”不要求完全阻止疾病状态。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员鉴定易患病症的群体的能力，从而本公开的化合物的给药可以在疾病发作之前发生。该术语并不表示必须完全避免疾病状态。

如本文所用，术语“载体”是指能够介导另一核酸分子进入(例如，转移、转运等)细胞的核酸分子。转移的核酸一般连接至(例如，插入)载体核酸分子。载体可以包括指导自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。对本领域普通技术人员来说显而易见的是，除了介导转移的核酸进入的核酸之外，病毒载体可以包括各种病毒组分。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒以及病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)等。

一方面，本发明提供了一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法，其特征在于，包括：

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼。

斑马鱼是常见的热带鱼类，与人类基因同源性高达87％，与人具有高度的生物相似性，繁殖周期短，交配无季节性，产卵多，胚胎发育迅速，受精后24小时即可完成身体内部器官的构建，且胚胎透明易于观察。目前，斑马鱼已经成为国际上疾病研究最重要的脊椎模式动物之一，并成功应用于新药筛选中。

本发明是通过基因编辑方法获得斑马鱼smarca5突变体即斑马鱼smarca5^zko1049a突变体，是由中国科学院动物研究所刘峰团队研发的。

所述smarca5，是ISWI家族的关键亚基成员。该蛋白可以调控核小体间距进而影响基因的表达。所述smarca5突变会抑制斑马鱼造血祖细胞在尾部造血组织的存活和向各系血液前体细胞的分化。此外，在小鼠红细胞中特异敲除Smarca5导致胎肝中红细胞成熟发育受阻，突变体表现为未成熟红细胞增多并伴随细胞的增殖减少和凋亡增加。

在本发明中，申请人在上述smarca5突变体中，观察到红细胞行为的异常，即在smarca5突变体中红细胞发生异常聚集。基于此，本发明针对该突变体构建了荧光血栓斑马鱼模型。

带有荧光的转基因斑马鱼是将荧光蛋白导入到斑马鱼体内，在特定的组织器官中表达，实现在荧光显微镜下观察到特定器官的发育与生理变化，动态追踪其胚胎发育全程以及外源性物质或基因突变对器官发育的影响。

本发明所使用的smarca5突变的斑马鱼杂合体是通过CRISPR/Cas9方法对斑马鱼的染色体进行编辑而获得。

CRISPR/Cas9方法是一种基因编辑方法，其可以通过核酸之间的相互识别，防止DNA甲基化对基因编辑的干扰，编辑效率更高。

本发明所述带有荧光的转基因斑马鱼为具有不同荧光标记的转基因斑马鱼，包括但不限于如下品系Tg(flila:EGFP)^y1、Tg(fliila:nEGFP)^y7、Tg(fliila:EGFP-cdc42wt)^y48、Tg(mTie2:GFP)、Tg(kdrl:G-RCFP)、Tg(kdrl:G-memCherry)^s896、Tg(kdrl:EGFP)^s843、Tg(flila:DsRed)、Tg(flila:EGFP；kdrl:ras-cherry)、Tg(fltl:YFP,kdrl:mCherryRed)、Tg(stabilin:YFP)^hu4453、Tg(gatal:DsRed)^sd2、、Tg(zp3:fsta,myl7:EGFP)、Tg(fli1a:EGFP)、Tg(myl7:GFP)、Tg(kdrl:EGFP)、Tg(kdrl:mCherry)、Tg(kdrl:RFP)、Tg(fli1a.ep:DsRedEx)、Tg(hsp:vegf165)；Tg(kdrl:GFP)、Tg(zp3b:zar1,myl7:EGFP)、Tg2(fli1a:mCherry)、Tg(-5.1myl7:DsRed2-NLS)、TgBAC(-36nkx2.5:ZsYellow)、Tg(kdrl:GFP；gata1:dsRed)等。

在某些具体的实施方式中，所述带有荧光的转基因斑马鱼是利用不同荧光标记分别标记红细胞和血管内皮细胞的斑马鱼。

在某些具体的实施方式中，所述带有荧光的转基因斑马鱼品为Tg(kdrl:GFP；gata1:dsRed)。

如前所述的构建荧光血栓斑马鱼模型的方法，具体步骤如下：

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体并确定具有smarca5突变的斑马鱼杂合体F0；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼的步骤包括：

将smarca5突变体杂合体F0与带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，得到同时带有荧光的smarca5突变体F1代；

F1代突变体中挑选smarca5突变的杂合子进行雌雄交配，得到F2代突变体胚胎；

基因鉴定F2代突变体中smarca5突变的纯合子即为荧光血栓斑马鱼模型。

所述基因编辑的方法包括但不限于，同源重组(Homologous Recombination,HR)技术、锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶TALEN(Transcription Activation Like Effector Nuclease)技术、规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins,CRISPR)技术，在某些具体的实施方式中，本发明所使用的基因编辑的方法为规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins,CRISPR)技术，优选的，所使用的基因编辑的方法为采用CRISPR/Cas9系统的方法。在某些具体的实施方式中，所述构建荧光血栓斑马鱼模型的方法具体为：

取由CRISPR/Cas9方法构建的斑马鱼smarca5突变体(smarca5^zko1049a)(Ding etal.,2021)成鱼F0，与荧光标记转基因鱼系Tg(kdrl:GFP；gata1:dsRed)(该转基因品系由Steve Wilson(King’s College London,London,United Kingdom)实验室提供)进行交配。收集F1代胚胎，在荧光显微镜下挑选同时带有kdrl:GFP(血管内皮细胞)和gata1:dsRed(红细胞)荧光的受精卵，培养至成鱼进行剪尾鉴定，鉴定方法为利用DNA提取方法提取基因组DNA，然后通过PCR的方法，将靶点附近的DNA片段克隆出来，之后通过测序鉴定基因突变类型。

所述DNA提取方法包括但不限于CTAB方法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、异硫氰酸胍法、碱裂解法、酶法等，在某些具体的实施方式中，所述DNA提取方法为碱裂解法。

确定同时带有kdrl:GFP和gata1:deRed荧光的smarca5突变体成鱼为F1代突变体，F1代突变体中挑选smarca5突变的杂合子进行自交配，得到F2代突变体胚胎，收集胚胎中，四分之一为纯合子突变体，即荧光血栓斑马鱼模型，其余四分之三为对照组胚胎。F2代smarca5纯合子突变体在受精后36小时出现头部凋亡，可在明场显微镜下被识别。

gata1:dsRed可以标记红细胞，用来指示红细胞的相对位置，kdrl:GFP可以标记血管内皮细胞，用来指示红细胞相对血管的位置。

所述斑马鱼成鱼饲养于斑马鱼鱼房中，其中斑马鱼鱼房的系统水的温度为25～37℃之间，例如，可以是25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃、28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。

在某些具体的实施方式中，斑马鱼鱼房的系统水的温度为28.5℃。

所述斑马鱼的胚胎培养于培养液中，所述培养液可以是能使斑马鱼胚胎正常生长的任何培养液，在某些具体的实施方式中，所述培养液配置方式为：70g NaCl,0.5gNaHCO3,2g CaCl₂,2g KCl溶于20L ddH₂O。

在某些具体的实施方式中，所述含有胚胎的培养液放置在培养箱中，在某些具体的实施方式中，所述培养箱的温度在25～37℃之间，例如，可以是25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃、28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。

在某些具体的实施方式中，所述培养箱的温度为28.5℃。在某些具体的实施方式中，所述斑马鱼和斑马鱼胚胎的培养条件为：斑马鱼成鱼饲养于斑马鱼鱼房28.5℃的系统水中，胚胎培养于培养液中(70g NaCl,0.5g NaHCO3,2g CaCl₂,2g KCl溶于20L ddH₂O中)，放置于28.5℃的培养箱。

在某些具体的实施方式中，所述荧光血栓斑马鱼模型是荧光血栓斑马鱼胚胎。

在本发明的另一个方面，提供了一种抗血栓或促进血栓溶解的方法，其包括针对由此需要的受试者进行靶向基因治疗以修复smarca5突变。

在某些具体的实施方式中，本发明的荧光血栓斑马鱼模型可用于评估潜在基因治疗策略的功效。也就是说，可修饰疾病相关基因或多核苷酸，从而抑制或减少疾病的发展和/或进展。特别地，所述方法包括修饰疾病相关基因或多核苷酸，从而产生改变的蛋白质，结果，动物或细胞具有改变的反应。因此，在一些方法中，可将遗传修饰的动物与易于疾病发展的动物进行比较，从而可评估基因治疗事件的效果。

对本发明而言，“血栓”包括在动脉和静脉血管系统中发生并可用本发明的方法治疗的疾病，特别是在心脏的冠状动脉中的疾病，如急性冠脉综合征(ACS)、存在ST段抬高(STEMI)和无ST段抬高(非STEMI)的心肌梗死、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、在冠状动脉介入术如血管成形术、支架植入或主动脉冠状动脉搭桥术后的再闭塞和再狭窄，以及导致外周动脉闭塞性疾病、肺栓塞、静脉血栓栓塞、静脉血栓形成，特别是在下肢深静脉和肾静脉中，短暂性脑缺血发作以及血栓性中风和血栓栓塞性中风的其它脉管中的血栓性或血栓栓塞性疾病。

在某些实施方案中，受试者是动物。这种动物可能是任何性别的，且可能处于任何发育阶段。在某些实施方案中，本文描述的受试者是人。在某些实施方案中，受试者是非人动物。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是驯养的动物，例如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，受试者是狗。在某些实施方案中，受试者是伴侣动物，例如狗或猫。在某些实施方案中，受试者是家畜动物，例如奶牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，受试者是动物园动物。在另一个实施方案中，受试者是研究动物，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、狗、猪或非人灵长类动物。在某些实施方案中，所述动物是基因工程动物。在某些实施方案中，所述动物是转基因动物(例如，转基因小鼠，转基因猪)。在某些实施方案中，受试者是鱼或爬行动物。

所述修复smarca5突变的基因治疗方法可以是任意的能够对smarca5突变进行修复的方法，包括但不限于基因的原位修复、基因定点整合和RNA干扰技术定点整合等。

在本发明的另一个方面，还提供了荧光血栓斑马鱼在筛选用于促进血栓溶解或降低受试者血栓形成或抗血栓的药物中的用途。

在某些具体的实施方式中，本发明的荧光血栓斑马鱼模型可用于使用疾病研究中常用的措施来研究突变对动物或细胞的影响以及疾病的发展和/或进展。或者，本发明的荧光血栓斑马鱼模型可用于研究药物活性化合物对疾病的影响。

在本发明的一个方面，提供了一种防止红细胞聚集的方法，包括在体外或体内过表达keap1a或敲降hmox1a。

本发明通过ATAC-seq和RNA-seq联合分析，发现smarca5的缺失会降低红细胞中keap1a启动子区的染色质开放性以及该基因的转录表达水平。keap1a-nrf2下游靶基因，包括hmox1a，出现过度激活。在突变体中过表达keap1a或敲降hmox1a可部分回救红细胞聚集表型。

在某些具体的实施方式中，本发明提供了开发调节与疾病基因相关的细胞信号事件的生物活性剂的方法。所述方法包括将测试化合物与包含一种或多种驱动系统的一种或多种组分表达的载体的细胞接触；以及检测读出的变化，所述读出变化指示与例如细胞中所含的疾病基因的突变相关的细胞信号事件的减少或增加。

所述过表达keap1a的防止红细胞聚集方法可以是使keap1a过度表达的任何方式，可以是基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平即可。方法包括但不限于构建外源基因过表达，CRISPR SAM，saRNA等。

在某些实施方式中，过表达keap1a是在受试者的体内进行，在某些实施方式中，过表达keap1a是在受试者的体外或离体进行。

所述敲降hmox1a的防止红细胞聚集方法可以是使hmox1a表达水平被抑制的任何方式，或者降低至低于在基本上相同的条件但不存在RNAi下检查时通常观察到的水平的任何方式，包括但不限于RNA干扰(RNAi)技术、CRISPR技术、TALEN技术、T-DNA插入技术等。

在某些实施方式中，敲降hmox1a是在受试者的体内进行，在某些实施方式中，敲降hmox1a是在受试者的体外或离体进行。

本发明进一步提供了一种促进keapla的过表达或降低hmox1a的激活的物质用于制备抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物中的用途。

另一个方面，本发明提供了一种抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的方法，包括：通过基因操作的方法使得在由此需要的受试者中过表达keap1a或使受试者的hmox1a被敲降。

在某些具体的实施方式中，所述基因操作包括利用基因编辑或基因表达。

所述基因编辑的方法包括但不限于，同源重组(Homologous Recombination,HR)技术、锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶TALEN(Transcription Activation Like Effector Nuclease)技术、规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins,CRISPR)技术，在某些具体的实施方式中，本发明所使用的基因编辑的方法为规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins,CRISPR)技术，优选的，所使用的基因编辑的方法为采用CRISPR/Cas9系统的方法。

所述基因表达的方式包括但不限于：组成性表达、诱导表达和阻遏表达等。

所述基因表达调控的水平包括但不限于：DNA和染色体水平，包括但不限于基因丢失、基因修饰、基因重排、基因扩增、染色体结构变化；转录水平调控(主要调控方式)，包括但不限于转录起始、延伸、终止均有影响。原核生物借助于操纵子，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用进行调控；转录后水平调控：主要指真核生物原初转录产物经过加工成为成熟的mRNA，包括但不限于加帽、加尾、甲基化修饰等；翻译水平调控：对mRNA稳定性的调控、反义RNA对翻译水平的调控；翻译后水平调控：包括但不限于蛋白质的剪切、化学修饰(磷酸化、乙酰化、糖基化等)、转运等；mRNA降解的调控等。

本发明进一步提供了一种用于抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物，其包括：抑制smarca5发生突变的物质或促进keapla的过表达的物质或降低hmox1a的激活的物质。

在某些实施方式中，所述抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物是抑制smarca5发生突变的物质。

在某些实施方式中，所述抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物是促进keapla的过表达的物质。

在某些实施方式中，所述抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物是降低hmox1a的激活的物质。

实施例

实施例1 smarca5突变体红细胞异常聚集表型的鉴定

取由CRISPR/Cas9方法构建的斑马鱼smarca5突变体(smarca5^zko1049a)(Ding etal.,2021)杂合子成鱼，自交配后得到四分之一为smarca5纯合突变体胚胎，其余四分之三为对照组胚胎，用显微镜观察两组胚胎的发育过程，结果如图1A所示，图中显示了两组斑马鱼的尾部图像，可以看出，在smarca5纯合突变体胚胎发育至受精后第2天时，血细胞发生异常聚集并沉积在尾部静脉，虚线标记的区域为尾静脉的血凝块；而对照组胚胎中没有血细胞聚集的现象。

使用初级红细胞标记基因scl标记smarca5纯合突变体胚胎和对照组胚胎，采用胚胎原位杂交技术(Whole mount in situ hybridization，WISH)检测两组胚胎中初级红细胞的表达，通过尼康显微镜(SMZ1500)采集图片，结果如图1B所示，对照组中没有发现血凝块，突变体中出现了标记基因scl在尾静脉的血凝块中富集的表达，即黑色矩形框中显示(放大图中箭头所示位置)。说明在smarca5纯合突变体的该区域存在初级红细胞。

为了更好地观察血块，本发明构建了荧光血栓斑马鱼模型，具体方法如下：

取由CRISPR/Cas9方法构建的斑马鱼smarca5突变体(smarca5^zko1049a)(Ding etal.,2021)成鱼F0，与荧光标记转基因鱼系Tg(kdrl:GFP；gata1:dsRed)(该转基因品系由Steve Wilson(King’s College London,London,United Kingdom)实验室提供)进行交配。收集F1代胚胎，在荧光显微镜下挑选同时带有kdrl:GFP(血管内皮细胞)和gata1:dsRed(红细胞)荧光的受精卵，培养至成鱼进行剪尾鉴定，鉴定方法为利用碱裂解法提取基因组DNA，然后通过PCR的方法，克隆靶点附近的DNA片段，之后通过测序鉴定基因突变类型。

确定同时带有kdrl:GFP和gata1:deRed荧光的smarca5突变体成鱼为F1代突变体，F1代突变体中挑选smarca5突变的杂合子进行自交配，得到F2代突变体胚胎，收集胚胎中，四分之一为纯合子突变体，即荧光血栓斑马鱼模型，其余四分之三为对照组胚胎。F2代smarca5纯合子突变体在受精后36小时出现头部凋亡，可在明场显微镜下被识别。

gata1:dsRed可以标记红细胞，用来指示红细胞的相对位置，kdrl:GFP可以标记血管内皮细胞，用来指示红细胞相对血管的位置。

培养条件：斑马鱼成鱼饲养于斑马鱼鱼房28.5℃的系统水中，胚胎培养于培养液中(70g NaCl,0.5g NaHCO3,2g CaCl₂,2g KCl溶于20L ddH₂O中)，放置于28.5℃的培养箱。

本发明中涉及的纯合突变体胚胎和对照组胚胎均按照此方法分辨和获得。

通过荧光显微镜观察gata1:dsRed标记的红细胞在纯合突变体和对照组胚胎中的聚集表型。通过激光共聚焦显微镜拍摄，如图1C所示，发现红细胞(gata1:dsRed)(箭头所示)在纯合突变体尾部血管(kdrl:GFP)内发生聚集，而对照组胚胎中没有发生这种聚集。

使用红系细胞标记基因gata1,ikaros和scl对smarca5纯合突变体和对照组胚胎进行标记，采用原位杂交技术检测两组胚胎中红系细胞的表达，结果如图1D所示，通过与对照组胚胎相比，可以看出红系细胞标记基因gata1,ikaros和scl在smarca5纯合突变体中的整体表达正常。

使用红系细胞标记基因gata1,ikaros,hbae1和hbbe1对smarca5纯合突变体和对照组胚胎进行标记，采用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)技术检测两组胚胎中红系细胞的表达，结果如图1E所示，红系细胞标记基因gata1,ikaros,hbae1和hbbe1在smarca5纯合突变体和对照组胚胎中的表达水平相近。

以上结果说明，在smarca5纯合突变体中，红系细胞的发育相关基因没有受到明显影响。

实施例2 smarca5敲除对初级髓系细胞发育的影响

将smarca5^zko1049a杂合突变体成鱼与髓系和红系细胞荧光标记的转基因鱼系Tg(mpo:GFP；gata1:dsRed)或Tg(coro1a:GFP；gata1:dsRed)(Li,Yan,Shi,Zhang,&Wen,2012；Renshaw et al.,2006)进行交配。按照上述方法得到含有髓系和红系细胞荧光标记的smarca5纯合突变体和对照组胚胎。

通过荧光显微镜观察mpo:GFP和coro1a:GFP标记的髓系细胞在纯合突变体和对照组胚胎中的聚集表型。通过激光共聚焦显微镜拍摄，如图2A所示，smarca5纯合突变体中髓系细胞分布正常，没有在红细胞血块中聚集。绿色荧光标记区域为圆圈内区域。

使用髓系细胞标记基因pu.1和lyz对smarca5纯合突变体和对照组胚胎进行标记，采用原位杂交技术检测两组胚胎中红系细胞的表达，结果如图2B所示，通过与对照组胚胎相比，可以看出髓系细胞标记基因pu.1和lyz在smarca5突变体纯合体中表达正常。

使用髓系细胞标记基因pu.1,mfap4和lyz对smarca5纯合突变体和对照组胚胎进行标记，采用实时荧光定量PCR技术检测两组胚胎中红系细胞的表达，结果如图2C所示，髓系细胞标记基因pu.1,mfap4和lyz在smarca5纯合突变体和对照组胚胎中的表达水平相近。

以上结果说明，在smarca5纯合突变体中，髓系细胞的发育没有受到明显影响。

实施例3红细胞异常聚集的表型模拟静脉血栓

为了观察红细胞聚集的发生过程，我们利用荧光显微镜长时间观察红细胞(gata1:dsRed⁺)在smarca5纯合突变体和对照组胚胎中的聚集过程。拍摄起始时间为胚胎受精后36小时，拍摄时长为12个小时。结果如图3A所示，在smarca5纯合突变体中，红细胞在胚胎受精后40小时出现聚集，随着聚集块的增大最终沉积在尾部静脉，对照组胚胎中没有发生聚集。

为了进一步探究红细胞的聚集是否受内皮等微环境的影响，我们进行了胚胎连体共生实验。将去除绒毛膜的发育至128细胞囊胚期至30％外包期的胚胎置于甲基纤维素中，用玻璃管尖头剥离两个胚胎接触面的细胞。随后将胚胎接触，静止放置于培养箱，至胚胎融合。融合后的两个胚胎可以进行血流交换，因此，通过检测流动的红细胞的表型可以判断红细胞的聚集是否受到血管内皮等微环境的影响。用显微镜观察两组胚胎的发育过程，结果如图3B所示，突变体胚胎和对照组胚胎连体共生后，血块在两枚胚胎中均形成，暗示红细胞的聚集很大程度上不依赖于微环境。

为了更好地区分突变体胚胎和对照组胚胎中的红细胞，我们利用gata1:GFP⁺标记smarca5纯合突变体来源的红细胞，同时用gata1:dsRed⁺标记对照组胚胎来源的红细胞。采用荧光显微镜观察两组胚胎中红细胞的分布情况，结果如图3C所示，smarca5纯合突变体来源的红细胞在突变体和对照组胚胎中均出现。绿色荧光标记(gata1:GFP⁺标记)区域为圆圈内区域。而对照组胚胎来源的红细胞除了少数被滞留在血块处，大部分在突变体和对照组胚胎中正常流动。该结果说明，缺失smarca5的红细胞可自主性地发生聚集。

为了探究血块中是否存在巨核前体细胞，我们将smarca5^zko1049a杂合突变体成鱼与巨核细胞荧光标记的转基因鱼系Tg(CD41:GFP)(Lin et al.,2005)进行交配。按照上述方法得到含有巨核前体细胞(CD41:GFP^high)荧光标记的smarca5纯合突变体和对照组胚胎。

通过荧光显微镜观察巨核前体细胞(CD41:GFP^high)在纯合突变体和对照组胚胎中的分布。结果如图3D所示，发现巨核前体细胞并没有出现在血块中。

接下来，我们用血栓治疗药物Argatroban(Sigma,A0487)、Aspirn(Sigma,A2093)、Heparin(Sigma,H3393)处理smarca5纯合突变体，结果如图3E所示，此图说明Argatroban处理可以部分缓解血块的产生。

继续使用Argatroban处理的smarca5纯合突变体和对照组胚胎，显微镜观察药物Argatroban处理后，smarca5纯合突变体和对照组胚胎中的红细胞聚集表型，结果如图3F所示，发现Argatroban可以部分缓解血块的产生。统计结果如图3G所示，突变体中红细胞聚集表型可以部分被回救，说明该突变体可以部分模拟血栓疾病，作为血栓疾病模型。

抗血栓药物给药方法：将Argatroban按照2mg/ml溶于DMSO，在胚胎发育至受精后36小时，按照每枚胚胎4nl的剂量，将药物注射进胚胎卵黄囊上方的静脉丛。胚胎给药后放置于28.5℃的培养箱。给药12小时后，通过显微镜观察红细胞聚集表型。

实施例4红细胞聚集不影响造血干祖细胞在尾部造血组织中的数目

将smarca5^zko1049a杂合突变体成鱼与内皮细胞及造血干祖细胞荧光标记的转基因鱼系Tg(kdrl:mCherry)(Bertrand et al.,2010)和Tg(cmyb:GFP)(North et al.,2007)进行交配。按照上述方法得到含有内皮细胞及造血干祖细胞的smarca5纯合突变体和对照组胚胎。

通过荧光显微镜观察cmyb:GFP⁺标记的造血干祖细胞在纯合突变体和对照组胚胎中的分布。通过激光共聚焦显微镜拍摄，结果如图4A所示，血块的产生并不影响造血干祖细胞(cmyb:GFP⁺)在突变体尾部造血组织中的分布。绿色荧光(cmyb:GFP⁺)标记区域为圆圈内区域。

其统计结果如图4B所示，血块的产生并不影响造血干祖细胞(cmyb:GFP⁺)在突变体尾部造血组织中的数目。

实施例5透射电子显微镜观察smarca5缺陷的红细胞的亚细胞形态

采用透射电子显微镜观察对照组胚胎中尾部动脉和静脉丛的纵切面图，如图5A所示，图中可以看出尾部动脉和静脉丛以及流动的血细胞。

采用透射电子显微镜观察对照组胚胎中红细胞的亚细胞结构图，如图5B所示，图中可以看出对照组胚胎中红细胞内正常的线粒体。

采用透射电子显微镜观察smarca5纯合突变体胚胎中尾部动脉和静脉丛的纵切面图，如图5C所示，图中可以看出尾部动脉和静脉丛以及流动的血细胞。

采用透射电子显微镜观察smarca5纯合突变体胚胎中突变体尾部静脉区，如图5D所示，图中可以看出smarca5纯合突变体中的红细胞聚集。

为了进一步观察smarca5缺陷是否会影响红细胞的亚细胞结构，我们进行了透射电子显微镜观察。结果如图5E所示，突变体组红细胞线粒体脊发生形态异常。箭头指示结构异常的线粒体。

Ery,红细胞；EC,内皮细胞；Mito,线粒体；Nuc,细胞核；Cyto,细胞质。

实施例6 smarca5突变体中红细胞的形态和数目变化情况

接下来，我们探究突变体中红细胞数目是否发生变化。

采用流式细胞技术分析对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的数目，结果如图6A所示，统计结果如图6B所示，红细胞(gata1:dsRed⁺)在对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中的比例相近，说明smarca5的敲除不影响红细胞在胚胎中的数目比例。

我们采用血涂片和吉姆萨染色技术观察对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的形态，如图6C所示，发现红细胞的形态在缺失smarca5后正常。

我们将对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞进行核质比分析，即量取细胞核最大直径除以细胞的最大直径，结果如图6D所示，此图说明红细胞的核质比在缺失smarca5后正常。

以上结果说明，smarca5缺失不影响红细胞的数目和整体形态。

实施例7 smarca5突变体中红细胞的转录表达分析

为了探究smarca5缺失对红细胞转录组的影响，我们采用RNA-seq即转录组测序技术对对照组胚胎和smarca5纯合突变体红细胞进行分析。

具体步骤为：将待分选的smarca5纯合突变体及其对照组胚胎收集到离心管中，并向样本中加入提前放入斑马鱼培养箱预热的0.5％胰酶(PBS缓冲液稀释)。用移液器吹打，并将样本放入斑马鱼培养箱消化，期间吹打2-3次，直至消化成单细胞悬液。向样本中加入CaCl₂至终浓度为1M以及胎牛血清(FBS)至终浓度为10％，终止胰酶消化。离心之后，向细胞沉淀中加入适量的含有1％FBS的PBS缓冲液重悬细胞，将细胞悬液过300目的滤网，获取单细胞悬液。流式细胞仪MoFlo XDP(Beckman Coulter)分选红细胞(gata1:dsRed⁺)。每个样品分选50000个细胞，收集到含有1％FBS的PBS缓冲液中，置于冰上。随后用QIAGEN RNeasyMini Kit(Cat.No.74104)提取RNA，之后进行RNA-seq建库测序，实验流程如图7A所示。

采用DESeq2差异表达分析(Love,Huber，&Anders,2014)，对smarca5纯合突变体胚胎中红细胞中基因表达的变化进行分析，结果如图7B所示，smarca5敲除后，红细胞中基因表达发生变化，黑色点状代表基因表达发生显著性变化的基因(Log2(fold change)>1,adjusted P-value<0.05)。此图说明，smarca5敲除后，红细胞中有1506个基因显著性上调，633个基因表达显著性下调。

采用基因集变异分析(GSVA)技术对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的差异通路进行分析，结果如图7C所示，发现smarca5敲除后，转录下降的基因主要与“Gata1下游靶点”，“红细胞携氧”等通路相关。如图7D所示，“红细胞稳态”和“炎性反应”信号通路在突变体组红细胞中分别下降和上调。以上结果说明，smarca5缺失影响红细胞整体的转录组变化。

实施例8 smarca5突变体及其对照组胚胎中红细胞的RNA-seq分析

采用主成分分析方法(Principal-component analysis，PCA)分析对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的RNA-seq样本，结果如图8A所示，此图说明突变体样本和对照组样本可以被明显地区分，即smarca5缺失导致了整体的转录组变化。

红细胞是一类富含血红蛋白的细胞，接下来，我们特异性分析了血红蛋白编码基因在突变组和对照组中的变化。

接着采用RNA-seq分析和原位杂交技术分析对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎的红细胞，结果分别如图8B和8C所示，胚胎期血红蛋白编码基因和成体期血红蛋白编码基因在突变组和对照组中表达无明显差异，说明smarca5缺失不影响红细胞血红蛋白编码基因的表达，红细胞的分化发育不受影响。

使用联甲氧基苯胺对对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎染色分析。结果如图8D所示，发现突变组和对照组中血红蛋白含量相近，黑色箭头指示突变体中的血凝块。

采用RNA-seq分析两组胚胎中髓系细胞的表达，结果如图8E所示，我们观察到髓系细胞标记基因spi1a,spi1b,mfap4和lyz在smarca5纯合突变体红细胞中出现上调。

接下来我们尝试利用吗啉基寡核苷酸Morpholino(MO)敲低smarca5突变体中髓系发育关键因子pu.1的表达。MO是一段可以靶向目的基因的反义寡核苷酸，主要通过阻止蛋白的翻译起始和影响RNA的正确剪切来抑制基因的表达。将待注射的试剂吸入毛细玻璃管中，调节显微注射仪。通过调节气压，根据打出的液滴大小判断注射剂量。注射MO时，将MO注射到一到四细胞发育期胚胎的卵黄囊。显微镜观察注射1ng pu.1MO后，如图8F所示，我们发现，smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的聚集表型没有得到明显回救，其统计结果如图8G所示，说明红细胞聚集的表型不是髓系基因高表达导致的。

实施例9 smarca5突变影响红细胞中染色质的开放性变化

为了进一步探究smarca5缺失对红细胞染色质可接近性的影响，采用ATAC-seq(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing)染色质开放测序技术对smarca5纯合突变体和对照组胚胎中的红细胞进行测序。ATAC-seq技术利用了改造后的Tn5转座酶，来特异性识别并标记染色质开放区域。将转座DNA设计为接头序列，使Tn5在识别开放的染色质区域的同时将测序接头插入到开放染色质区域中。后续通过高通量测序，可以捕获染色质开放区的基因组序列信息。

在smarca5纯合突变体和对照组胚胎中，由gata1:dsRed标记的红细胞经流式细胞仪分选后，进行ATAC-seq建库测序。每个样品细胞数为50000。分析结果如图9A所示，结果表明，突变体红细胞中启动子和远端调控区特异性开放的基因分别有439个和40个，而对照组胚胎红细胞中启动子和远端调控区特异性开放的基因分别有256个和20个。说明smarca5敲除会影响启动子区和远端调控区染色质的开放性。

同时我们对缺失smarca5后染色质开放性下降的区域进行Motif筛选，结果如图9B所示，结果显示，在富集列表中，包含调控红细胞发育的关键转录因子Gata1，暗示缺失smarca5可能会影响Gata1在染色质上的结合。

图9C展示的是突变体组中启动子区染色质开放性和转录水平同时上调和下调的基因数，发现突变组相比对照组有84个基因启动子区染色质开放性和基因转录表达均上升，36个基因启动子区染色质开放性和基因转录表达均下降，说明smarca5的缺失对启动子区染色质开放性和基因转录表达均有影响。

接下来我们着重分析了突变体组中染色质开放性和转录水平同时上调和下调的基因，结果如图9D所示，基因il34,cox4i2,skap2,vclb和acbd7在突变组中的染色质开放性和转录水平均上调，而基因trim2a,keap1a,skap2,acox3,igfbp1a和ada在突变组中的染色质开放性和转录水平均下调。

实施例10 smarca5突变体及其对照组胚胎中红细胞的ATAC-seq分析

利用R package ATACseqQC(Ou et al.,2018)(v 1.6.4)分析ATAC-seq数据，热图展示ATAC-seq峰在转录起始位点(TSS)上游和下游1kb区间的分布。如图10A所示，左侧热图为无核小体(小于100bp)分布，右侧为单核小体(180～247bp)分布。说明ATAC-seq峰分布正常，文库的质量评估正常。

利用R package ATACseqQC分析图A中TSS附近ATAC-seq峰的分布。结果如图10B所示，说明TSS附近ATAC-seq峰分布正常。

主成分分析smarca5纯合突变体及其对照组中红细胞的ATAC-seq样本。结果如图10C所示，突变体样本和对照组样本可以被明显地区分，即smarca5缺失导致了整体的染色质开放性变化。

利用ChIPseeker绘制的条形图展示的是突变体及其对照组ATAC-seq峰在整个基因组中的分布特征。结果如图10D所示，smarca5缺失对ATAC-seq峰在整个基因组中的分布特征没有明显影响。

图10E中的韦恩图展示了突变体组中远端调控区染色质开放性和转录水平同时上调和下调的基因数，发现突变组相比对照组有181个基因远端调控区染色质开放性和基因转录表达均上升，55个基因远端调控区染色质开放性和基因转录表达均下降，说明smarca5的缺失对远端调控区染色质开放性和基因转录表达均有影响。

实施例11 smarca5通过Keap1-Nrf2信号通路调节红细胞异常聚集的表型

在上述检测的smarca5的缺失后，染色质开放性和转录水平发生改变的基因中，如图11A所示，我们发现，keap1a启动子区的染色质开放性以及出现下降，黑色箭头标记预测的Gata1结合位点。采用荧光定量PCR技术检测对照组胚胎和smarca5纯合突变体中的keap1a的表达水平，结果如图11B所示，说明了smarca5纯合突变体中的keap1a的表达水平下降。

采用实时荧光定量PCR技术检测两组胚胎中keap1a-nrf2下游靶基因，包括hmox1a，gclc，ggt1b，gsr，gstp1，gstk1，fbp1a，gsto2，prdx1，pgd和g6pd的表达，结果如图11C所示，keap1a-nrf2大部分下游靶基因，包括hmox1a，出现过度激活。

接下来，我们尝试在smarca5纯合突变体胚胎中过表达keap1a然后检测聚集表型是否可以被回救。

keap1a的CDS全长通过DNA重组试剂盒(NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix，E2621S)克隆到含有hsp70启动子和EGFP报告系统的pDestTol2pA2载体上。构建成功的过表达质粒(50ng/μl)与tol2 mRNA(50ng/μl)等体积混合，注射1nl到smarca5突变体斑马鱼一细胞期的细胞中。将注射的胚胎养至成鱼，交配后收集胚胎，将胚胎热激处理(42℃处理40分钟到1小时)后筛选有绿色荧光表达的胚胎，即获得稳定遗传的转基因品系：Tg(hsp70:keap1a-EGFP)。该热激处理可同时激活keap1a基因的表达。将转基因成鱼雌雄交配，收集胚胎。图11D(上)为荧光拍照EGFP在受精后2天发育时期的转基因鱼Tg(hsp70:keap1a-EGFP)的表达图(胚胎受精后36小时进行热激处理)。

胚胎受精后36小时进行热激处理，12小时后用显微镜观察红细胞的聚集表型。结果如图11D(下)所示，统计结果如图11E所示，显示在smarca5纯合突变体胚胎中过表达keap1a可部分减少红细胞的聚集。

此外，我们向对照组胚胎和照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中注射hmox1a MO(步骤同注射pu.1MO)，来观察对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中红细胞的聚集表型，结果如图11F所示，统计结果如图11G所示，发现敲降hmox1a可部分回救红细胞聚集表型。

我们将smarca5通过调控keap1a启动子区的染色质开放性,影响Keap1-Nrf2信号通路以及下游靶基因hmox1a的表达通过图11H模式图进行展示。

以上结果说明smarca5部分通过Keap1-Nrf2信号通路调节红细胞异常聚集的表型。

实施例12自由基的产生在红细胞聚集中可能起重要作用

用还原剂谷胱甘肽(Sigma,PHR1359)处理smarca5纯合突变体及其对照组胚胎。谷胱甘肽溶于斑马鱼培养液，浓度为0.5mg/ml。对照处理为不加药物的斑马鱼培养液。处理时间为胚胎受精后36小时，处理12小时后用显微镜观察红细胞的聚集表型。在对照处理以及谷胱甘肽处理对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎后，采用显微观察对照组胚胎和smarca5纯合突变体胚胎中尾部静脉红细胞聚集的表型，结果如图12A所示，检测时间为胚胎发育至受精后第2天。箭头指示尾静脉的血凝块。此图说明了谷胱甘肽处理可部分缓解红细胞聚集的表型。

其红细胞聚集表型的统计结果如图12B，此图说明了谷胱甘肽处理可部分缓解红细胞聚集的表型。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (12)

1.一种构建荧光血栓斑马鱼模型的方法，其特征在于，包括：

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述smarca5突变的斑马鱼杂合体是通过CRISPR/Cas9方法对斑马鱼的染色体进行编辑而获得。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述带有荧光的转基因斑马鱼为具有不同荧光标记的转基因斑马鱼，优选利用不同荧光标记分别标记红细胞和血管内皮细胞。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，

通过基因编辑方法获得具有smarca5突变的斑马鱼杂合体并确定具有smarca5突变的斑马鱼杂合体F0；

将所述smarca5突变的斑马鱼杂合体和带有荧光的转基因斑马鱼进行交配并从后代中筛选出具有smarca5突变表型且具有荧光的荧光血栓斑马鱼的步骤包括：

将smarca5突变体杂合体F0与带有荧光的转基因斑马鱼进行交配，得到同时带有荧光的smarca5突变体F1代；

F1代突变体中挑选smarca5突变的杂合子进行雌雄交配，得到F2代突变体胚胎；

基因鉴定F2代突变体中带有荧光的smarca5突变的纯合子即为荧光血栓斑马鱼模型。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述荧光血栓斑马鱼模型是荧光血栓斑马鱼胚胎。

6.一种抗血栓或促进血栓溶解的方法，其包括针对由此需要的受试者进行基因治疗以修复smarca5突变。

7.荧光血栓斑马鱼在筛选用于促进血栓溶解或降低受试者血栓形成或抗血栓的药物中的用途。

8.一种防止红细胞聚集的方法，包括在体外或体内过表达keap1a或敲降hmox1a。

9.促进keapla的过表达或降低hmox1a的激活的物质用于制备抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物中的用途。

10.一种抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的方法，包括：通过基因操作的方法使得在由此需要的受试者中过表达keap1a或使受试者的hmox1a被敲降。

11.根据权利要求10的方法，其中，所述基因操作包括利用基因编辑或基因表达。

12.一种用于抗血栓或促进血栓溶解或降低受试者血栓形成的药物，其包括：抑制smarca5发生突变的物质或促进keapla的过表达的物质或降低hmox1a的激活的物质。

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