WO2017170771A1 - Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入する方法 - Google Patents

Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入する方法 Download PDF

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msec
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grna
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橋本　昌和
龍也 竹本
威重 音井
史倫 谷原
俊幸 森泉
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国立大学法人徳島大学
国立大学法人大阪大学
株式会社ベックス
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present application relates to a method for introducing Cas9 protein into a fertilized egg of a mammal.
  • the present application also uses the above method to produce a mammalian fertilized egg containing the Cas9 protein, to perform genome editing with the mammalian fertilized egg, and to produce a genome-edited mammalian fertilized egg Or producing a genetically modified animal.
  • ZFN Zinc-Finger Nucleases
  • TALEN Transcription Activator-Like Effector Nucleases
  • CRISPR / Cas system grouping etc.
  • systems using artificial restriction enzymes such as the short interval palindromic system (ClusteredClusterRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System) have attracted attention.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Gene-modified animals by genome editing are usually produced by microinjecting artificial restriction enzyme genes into pronuclear embryos.
  • Mouse genome editing has also been carried out by microinjecting Cas9 mRNA and gRNA (guide RNA) or plasmids expressing these RNAs one by one into the cytoplasm or pronucleus of fertilized eggs (Non-patent Document 1). ).
  • this method is the mainstream, but skilled techniques are required to prevent cell damage.
  • Somatic cell nuclear transfer (SCNT) using genetically modified donor cells is the most widely used for genetic modification of large animals such as pigs, cattle, and sheep, but initialization of epigenetic modifications is incomplete. Therefore, pups may die before or after giving birth, and the success rate is low.
  • Cas9 protein can be introduced into a fertilized egg of a mammal by electroporation.
  • FIG. 5 shows genomic editing of the porcine Fgf10 gene by electroporation of Cas9 mRNA.
  • FIG. 6 shows the blastocyst formation rate of porcine fertilized eggs electroporated at various times after fertilization.
  • FIG. 7 shows the results of genome editing when Cas9 protein was introduced into pig fertilized eggs by electroporation under various electrical conditions.
  • FIG. 8 shows the genome editing efficiency and blastocyst formation rate of pig fertilized eggs by electroporation of Cas9 mRNA or Cas9 protein.
  • FIG. 9 shows the genomic structure of the porcine myostatin (MSTN) locus and a list of gRNA target sequences of the first exon of the MSTN gene.
  • FIG. 1 porcine myostatin
  • the solution containing Cas9 protein is obtained by dissolving Cas9 protein in an arbitrary solution that can be used for electroporation.
  • the solution that can be used for electroporation may be a medium or buffer that allows a fertilized egg to survive during electroporation.
  • a medium such as Opti-MEM-I, PBS, HBS, HBSS, Hanks, HCMF, or the like Contains a buffer.
  • the solution does not contain serum.
  • the Cas9 protein comprises about 80% or more, such as about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-4.
  • Amino acid sequence identity refers to the percentage of amino acid residues that are identical in the two sequences when the sequences are optimally aligned.
  • 90% amino acid sequence identity means that 90% of the amino acids are identical in two optimally aligned amino acid sequences.
  • Methods for calculating alignment and identity of amino acid sequences are well known to those skilled in the art. For example, a program such as BLAST can be used.
  • Cas9 protein can be prepared by any peptide synthesis technique known in the art and, in particular, can be prepared using chemical synthesis or genetic recombination techniques.
  • One skilled in the art can prepare Cas9 protein based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, for example.
  • a commercially available Cas9 protein may be used.
  • the Cas9 protein can be purchased from, for example, Takara Bio Inc., New England BioLabs, thermofisher, ToolGen, PNA bio, and the like.
  • the concentration of gRNA in solution can be from about 10 to about 1000 ng / ⁇ l, from about 50 to about 500 ng / ⁇ l, or from about 100 to about 300 ng / ⁇ l, such as about 200 ng / ⁇ l.
  • the concentration of crRNA and tracrRNA in solution can be from about 10 to about 1000 ng / ⁇ l, from about 50 to about 500 ng / ⁇ l, or from about 100 to about 300 ng / ⁇ l, for example, about 200 ng / ⁇ l, respectively.
  • the fertilized egg is in the 1 cell stage to the morula stage, preferably in the 1 cell stage to 8 cell stage, more preferably in the 1 cell stage to 4 cell stage, more preferably in the 1 cell stage to 2 cell stage, For example, the one-cell stage.
  • electroporation is performed after about 6 hours, preferably after about 9 hours, more preferably after about 12 hours after fertilization.
  • electroporation is performed about 6 hours to about 20 hours after fertilization, preferably about 9 hours to about 16 hours, more preferably about 11 hours to 14 hours, such as about 12 hours to 13 hours. carry out.
  • a fertilized egg usually has a protective film called a zona pellucida.
  • Cas9 protein can be introduced into a fertilized egg of a mammal by electroporation.
  • the advantages of electroporation are high embryo viability and a time consuming technique that does not require special procedures.
  • electroporation can be accomplished in a few minutes with a simple operation. it can.
  • commercially available electroporation systems are generally cheaper than microinjection systems.
  • electroporation of Cas9 protein is more efficient for genome editing than electroporation of Cas9 mRNA. This allows for the selection of mild electroporation conditions and can further increase embryo viability. Therefore, the method disclosed in the present application can contribute to increasing the efficiency, speeding up, and reducing the cost of genome editing by the CRISPR / Cas system and the production of genetically modified animals using the genome editing.
  • the precipitated gRNA was dissolved in Opti-MEM I at a concentration of 2-4 ⁇ g / ⁇ l and stored at ⁇ 20 ° C. until use. gRNA was quantified with an absorptiometer and agarose gel electrophoresis.
  • 2d is a microscopic image of a fertilized egg placed in the gap between the electrodes.
  • Fertilized eggs cultured in KSOM medium were washed three times with Opti-MEM I (Life technologies), and the serum-containing medium was removed.
  • fertilized eggs are arranged in the gap of a platinum block electrode filled with Opti-MEM I solution (5 ⁇ l) containing Cas9 protein (100 ng / ⁇ l) and gRNA (200 ng / ⁇ l), and electroporation is performed under various conditions. It was.
  • Opti-MEM I solution 5 ⁇ l
  • Cas9 protein 100 ng / ⁇ l
  • gRNA 200 ng / ⁇ l
  • the signal intensity of mCherry fluorescence was measured.
  • the fluorescence signal was detected with an A1 confocal microscope (Nikon, Japan).
  • hCas9 plasmid (pX330) was purchased from Addgene (Cambridge, Massachusetts, USA). hCas9 excised from pX330 was ligated downstream of the SP6 promoter of pSP64 vector (Promega) (pSP64-hCas9) and used for mRNA synthesis. pSP64-hCas9 was linearized with XbaI. HCas9 mRNA was synthesized using an in vitro RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, Austin, TX, USA) using the linear plasmid as a template.
  • mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion, Austin, TX, USA
  • Cas9 protein 100 ng / ⁇ l
  • Cas9 mRNA 400 ng / ⁇ l
  • gRNA targeting the mCherry gene 200 ng / ⁇ l
  • the electroporation condition was 30 V (3 msec pulse + 97 msec interval) ⁇ 7 times.
  • Fertilized eggs were cultured in vitro to the blastocyst stage (E4.5), and the sequence of the mCherry gene was determined by the direct sequencing method. Sequencing was performed using BigDye TM Terminator TM Cycle TM Sequencing Kit TM ver. 3.1 TM and ABI TM 3500 Genetic TM Analyser TM (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA).
  • Example 2 Genome editing of pig fertilized eggs
  • Example 2-1 Ovary was collected from pigs (ternary hybrids; Landrace ⁇ Large Yorkshire ⁇ Duroc) slaughtered in a genome editing slaughterhouse by electroporation of Cas9 mRNA into pig fertilized eggs, Stored in saline (0.9% NaCl) and brought back to the laboratory within 1 hour. Cumulus cell-oocyte complexes (COCs) were collected from 2-6 mm diameter follicles and matured for 44 hours at 39 ° C., 5% CO 2 , 5% O 2 .
  • COCs Cumulus cell-oocyte complexes
  • the cells were cultured in a maturation medium supplemented with 10 IU / ml equine chorionic gonadotropin (eCG) and 10 IU / ml human chorionic gonadotropin (hCG), and then COCs were added to the maturation medium without eCG and hCG. Transfer and culture for 22 hours.
  • eCG equine chorionic gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the mature egg was washed with an in vitro fertilization medium (PFM; Functional Peptide Institute, Yamagata) and then subjected to in vitro fertilization.
  • PFM Functional Peptide Institute
  • the frozen semen was thawed, washed with 6 ml of PFM, and the sperm concentration was adjusted to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Mature eggs were transferred into diluted semen, and sperm was performed under conditions of 39 ° C., 5% CO 2 , 5% O 2 for 12 hours. After completion of the nymph, cumulus cells and sperm around the egg were removed by pipetting to obtain a fertilized egg. The fertilized egg was immediately used for electroporation.
  • FIG. 5a shows the genomic structure of the porcine FGF10 locus, including the gRNA target sequence (uppercase) and the PAM sequence (CTT, uppercase, underline) in the third exon of the FGF10 gene.
  • An oligonucleotide pair (FIG. 13) containing the target sequence in FGF10 (5′-GGAAAAGGAGCTCCCCAGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and its complementary sequence) was annealed and inserted into the BsaI restriction enzyme site of the pDR274 vector (addgene). .
  • Example 2 Using the same electroporation system as in Example 1, the voltage was maintained at 30 V, the pulse interval was 97 msec at various electroporation pulse times (1-3 ms) and the number of pulses (3-7 times).
  • 400 ng / ⁇ l of Cas9m RNA (see Example 1) and 200 ng / ⁇ l of gRNA targeting FGF10 were introduced into pig fertilized eggs 13 hours after the start of in vitro fertilization. After electroporation, fertilized eggs were cultured for 3 days in PZM-5 medium (Functional Peptide Institute, Yamagata). Subsequently, developmental culture was performed for 4 days in PBM medium (Functional Peptide Institute, Yamagata) to obtain blastocysts.
  • the blastocyst was boiled in a 50 mM NaOH solution to prepare a genome. After neutralization, adjacent to the gRNA target using porcine FGF10Fwd (5′-CCATCCCATTGATCTGCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 8)) and Rev (5′-CTTCAACTGGCAGCCACAATG-3 ′ (SEQ ID NO: 9)) as specific primers
  • the genomic region was amplified by PCR.
  • the PCR product was cloned into the pMD20 (Takara Bio) plasmid. More than 12 plasmids were isolated and the target genomic region was sequenced.
  • FIG. 5b shows the frequency of the mutated sequence in the FGF10 target region detected in the PCR amplification product.
  • FIG. 5c shows the blastocyst formation rate of embryos electroporated at each condition (* P ⁇ 0.05 using unilateral ANOVA, error bars indicate mean ⁇ standard error).
  • Electroporation was performed at 11, 13, 19, 21 and 23 hours after the start of in vitro fertilization.
  • the efficiency of genome editing was the same, but the blastocyst formation rate was relatively good after 13 hours (FIG. 6, * P ⁇ 0.05 using unilateral ANOVA, error bars mean ⁇ standard error is shown). Therefore, in subsequent experiments, electroporation was performed 13 hours after the start of in vitro fertilization.
  • o indicates that a mutation was observed in the target genome sequence
  • x indicates that no mutation was observed
  • x * indicates that a blastocyst was not formed. This result indicates that the genome of the porcine fertilized egg gene can be edited by electroporation of Cas9 protein.
  • Example 2-3 Comparison of genome editing by electroporation of Cas9 protein and Cas9 mRNA
  • the electroporation conditions were set to 30 V (1 msec pulse + 97 msec interval) ⁇ 5 times.
  • FIG. 8a shows the frequency of indels in the FGF10 target region
  • Example 9 shows the genomic structure of the MSTN locus and a list of gRNA target sequences of the MSTN gene first exon.
  • 50 ng / ⁇ l of Cas9 protein and 200 ng / ⁇ l of gRNA were electroporated into a pig fertilized egg under conditions of 30 V (1 msec pulse + 97 msec interval) ⁇ 5 times, Cultured to the end of the phase.
  • Table 7 Sequence analysis of MSTN variants In the table,-(n) bp indicates deletion of n bases, + (n) bp indicates insertion of n bases, and m (n) indicates replacement of n bases.
  • Example 2-5 Production of Mutant from Pig Fertilized Egg Introduced with Cas9 Protein by Electroporation It was examined whether a mutant individual could be produced from a pig fertilized egg into which Cas9 protein was introduced by electroporation.
  • Cas9 protein and either gRNA1, 6 or 7 were introduced into pig fertilized eggs by electroporation.
  • Two heifers (recipients) synchronized in estrus were prepared for embryo transfer as described in Onishi, A. et al., Science 289, 1188-1190 (2000).
  • 1-cell to 2-cell stage embryos were transferred into recipient oviducts. The number of embryos transferred was 100 (about 200 / animal) in one oviduct.
  • One of the two became pregnant and gave birth to 10 piglets 111 days after fertilized egg transplantation.
  • Figure 12a shows the expression of MSTN protein in the long breast muscle of MSTN mutant pigs.
  • MSTN protein expression was not detected in both allelic mutants (# 4), whereas strong expression was detected in wild-type piglets of the same age. This indicates that the indel introduced into MSTN exon 1 caused a frameshift and made functional MSTN protein synthesis impossible.
  • the 40-day-old allele mutant (# 4) and the longest breast muscle isolated from the wild type were subjected to histochemical analysis.
  • the muscle sample was fixed in 10% neutral buffered formalin solution (Wako Pure Chemical Industries) and embedded in paraffin. Paraffin sections (10 ⁇ m) were prepared and stained with hematoxylin and eosin. The results are shown in FIG. 12c (scale bar is 200 ⁇ m). Piglet # 4 had more muscle mass than the wild type. This is a trait commonly found in MSTN mutant animals.
  • the type of muscle fiber of skeletal muscle was examined by immunohistochemical analysis of myosin.
  • the longest breast muscle obtained from a 40-day-old piglet was frozen in dry ice acetone ( ⁇ 78 ° C.).
  • cryosections were cut using a cryostat microtome (Sakura Finetech, Tokyo, Japan) and subjected to immunohistochemistry.
  • mutant animals can be produced by introducing Cas9 protein and gRNA into fertilized eggs by electroporation.

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Abstract

本願は、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入する方法であって、（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、（ｂ）電極間に電圧をかけること、の各段階を含む方法を提供する。また、当該方法を使用して、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、遺伝子改変動物を作製することができる。

Description

Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入する方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１６－０７４６４５号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入する方法に関する。本願は、また、上記方法を利用して、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することに関する。
　遺伝子改変動物は、現在、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-Finger Nucleases））、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases））およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System））などの人工制限酵素を利用する系が、近年注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。
　ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製は、通常、前核期胚に人工制限酵素の遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行われる。マウスのゲノム編集も、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、または、これらのＲＮＡを発現するプラスミドを受精卵の細胞質または前核に１つずつマイクロインジェクションすることにより実施されてきた（非特許文献１）。現在はこの方法が主流であるが、細胞の損傷を防ぐには、熟練された手技を要する。さらに、マイクロインジェクションでは、専用の機械を使用して前核期胚に１つずつ遺伝子を注入しなければならず、かなりの時間を必要とする。ブタ、ウシ、ヒツジ等の大型動物の遺伝子改変には、遺伝子改変されたドナー細胞を使用する体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が現在最も広範に使用されているが、エピジェネティック修飾の初期化が不完全であるために出産前または後に仔が死亡することがあり、成功率は低い。
　エレクトロポレーションは、目的の遺伝子またはタンパク質を、細胞または組織に導入するのに有用な手段であり、多くの生物種で幅広く用いられてきた。マウスでは、この技法は、胎児および出生後の個体の脳、精巣および筋肉を含む様々な組織に使用されてきた。エレクトロポレーションにより哺乳動物の受精卵に遺伝子を導入したことが数例報告されており、最近、ラットまたはマウス受精卵へのエレクトロポレーションによるＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの導入が報告された（特許文献２、非特許文献２および３）。
米国特許第８６９７３５９号 国際公開第２０１５／０４９８９７号
Wang, H. et al., Cell 153, 910-918 (2013) Kaneko, T. et al., Scientific Reports 4, 6382 (2014) Hashimoto, M. & Takemoto, T. Scientific Reports 5, 11315 (2015)
　本願の目的は、ゲノム編集に必要な分子の受精卵への導入方法を改善することである。
　本発明者らは、エレクトロポレーションにより、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入できることを見出した。
　従って、本願は、ある態様では、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
　本願は、ある態様では、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵の製造方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
　本願は、ある態様では、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、核酸分子は、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）の組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
　本願は、ある態様では、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、核酸分子は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せまたはｇＲＮＡである、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む方法を提供する。
　本願は、ある態様では、上記の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、遺伝子改変動物の作製方法を提供する。
　本願に開示される方法は、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入することを容易にし、それにより、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することを容易にし得る。
図１Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を示す。 図１Ｂは、配列番号２のアミノ酸配列を示す。 図１Ｃは、配列番号３のアミノ酸配列を示す。 図１Ｄは、配列番号４のアミノ酸配列を示す。 図１Ｅは、配列番号５のアミノ酸配列を示す。Ｃ末端の下線は、核移行シグナルおよびＨＡエピトープタグを示す。 図２は、エレクトロポレーション装置を示す。 図３は、Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるマウスのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノム編集を示す。 図４は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるマウスのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノム編集の結果を示す。 図５は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるブタのＦｇｆ１０遺伝子のゲノム編集を示す。 図６は、受精後の様々な時期にエレクトロポレーションされたブタ受精卵の胚盤胞形成率を示す。 図７は、様々な電気的条件でＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションによりブタ受精卵に導入した場合の、ゲノム編集の結果を示す。 図８は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるブタ受精卵のゲノム編集の効率および胚盤胞形成率を示す。 図９は、ブタミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子座のゲノム構造およびＭＳＴＮ遺伝子第１エキソンのｇＲＮＡ標的配列のリストを示す。 図１０は、ＭＳＴＮを標的とする様々なｇＲＮＡと共にＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションによりブタ受精卵に導入した場合の、ゲノム編集の効率を示す。 図１１は、ＭＳＴＮを標的とする様々なｇＲＮＡと共にＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションによりブタ受精卵に導入した場合の、胚盤胞形成率を示す。 図１２Ａは、ＭＳＴＮ変異ブタの特徴解析の結果ａを示す。 図１２Ｂは、ＭＳＴＮ変異ブタの特徴解析の結果ｂ～ｅを示す。 図１２Ｃは、ＭＳＴＮ変異ブタの特徴解析の結果ｆを示す。 図１３は、実施例においてｇＲＮＡの調製に使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、発生生物学、細胞生物学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般的に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「２０±１０％～３０±１０％」を含むものとする。
エレクトロポレーション
　上記の方法で使用するエレクトロポレーターは、電気パルスの発生装置を意味し、段階（ａ）および（ｂ）を実施できるものであればどのようなものでもよい。エレクトロポレーターは、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
　「エレクトロポレーション用電極」は、従来のエレクトロポレーション法において使用されるあらゆる電極を含む。例えば、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。通常、２本の電極が約０.２５ｍｍないし約１０ｍｍ、例えば約０.５ｍｍないし約４ｍｍまたは約１ｍｍないし約２ｍｍのギャップをあけて配置され、そのギャップにＣａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くことができる。電極は、混合物を入れるための容器と組み合わせたキュベット電極であってもよい。エレクトロポレーション用電極は、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
　段階（ａ）において、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液は、Ｃａｓ９タンパク質を、例えば、約３ｎｇ／μｌ以上、約５ｎｇ／μｌ以上、約１０ｎｇ／μｌ以上、約２０ｎｇ／μｌ以上、約３０ｎｇ／μｌ以上、約４０ｎｇ／μｌ以上、約５０ｎｇ／μｌ以上、約７０ｎｇ／μｌ以上または約１００ｎｇ／μｌ以上、かつ、約５０００ｎｇ／μｌ以下の濃度で、例えば、約３ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌ、約５ｎｇ／μｌないし約２０００ｎｇ／μｌ、約１０ｎｇ／μｌないし約１０００ｎｇ／μｌ、約２０ｎｇ／μｌないし約５００ｎｇ／μｌ、約３０ｎｇ／μｌないし約２００ｎｇ／μｌ、約４０ｎｇ／μｌないし約１５０ｎｇ／μｌまたは約５０ｎｇ／μｌないし約１００ｎｇ／μｌの濃度で含む。ある実施態様では、溶液は約５０ｎｇ／μｌまたは約１００ｎｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質を含む。一定の電気条件下では、一般的に、溶液中のＣａｓ９タンパク質の濃度が高いほど、タンパク質導入量は多くなる。
　段階（ａ）において、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液は、エレクトロポレーションに使用できる任意の溶液にＣａｓ９タンパク質を溶解したものである。エレクトロポレーションに使用できる溶液は、エレクトロポレーションを実施する間に受精卵が生存できる培地またはバッファーであればよく、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ、ＰＢＳ、ＨＢＳ、ＨＢＳＳ、Ｈａｎｋｓ、ＨＣＭＦなどの培地またはバッファーが含まれる。好ましくは、溶液は血清を含まない。
　段階（ａ）において、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物をエレクトロポレーション用電極の間に置く。Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵を予め混合したものを電極間に添加しても、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵を別々に電極間に添加してもよい。混合物は、上記電極のギャップを満たす体積で、例えば、約１μｌないし約５０μｌ、好ましくは約１.５μｌないし約１５μｌ、より好ましくは、約２μｌないし約１０μｌの体積で使用する。ある実施態様では、混合物の体積は約５μｌである。
　受精卵に導入されるＣａｓ９タンパク質の量はエレクトロポレーションの電圧および通電時間に伴って増加するが、電圧が高すぎると、あるいは、通電時間が長すぎると、受精卵の生存率が低下する傾向がある。電圧と通電時間は、哺乳動物の種とＣａｓ９タンパク質の濃度に応じて、適宜調整され得る。段階（ｂ）において、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり、例えば、約１５Ｖないし約５５Ｖ、約１５Ｖないし約５０Ｖ、約２０Ｖないし約５０Ｖまたは約２５Ｖないし約４０Ｖ、例えば、約１５Ｖ、約２０Ｖ、約２５Ｖ、約３０Ｖ、約３５Ｖ、約４０Ｖ、約４５Ｖまたは約５０Ｖである。段階（ｂ）において、通電時間は、例えば、約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃないし約２５ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃないし約２２ｍｓｅｃ、約２.５ｍｓｅｃないし約１８ｍｓｅｃ、または約２ｍｓｅｃないし約１５ｍｓｅｃ、例えば、約２．５ｍｓｅｃ、約３ｍｓｅｃ、約３．５ｍｓｅｃ、約４．５ｍｓｅｃ、約５ｍｓｅｃ、約５．５ｍｓｅｃ、約６ｍｓｅｃ、約７ｍｓｅｃ、約８ｍｓｅｃ、約９ｍｓｅｃ、約１０ｍｓｅｃ、約１１ｍｓｅｃ、約１２ｍｓｅｃ、約１３ｍｓｅｃ、約１４ｍｓｅｃ、約１６ｍｓｅｃまたは約１８ｍｓｅｃである。
　ある実施態様では、電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９９０Ｖｍｓｅｃ以下、さらに好ましくは約６３０Ｖｍｓｅｃ以下、より好ましくは約３３０Ｖｍｓｅｃ以下であるように電圧と通電時間を設定する。電圧と通電時間の積の値は、Ｃａｓ９タンパク質濃度が高いほど低くすることができる。ある実施態様では、電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約０.９Ｖｍｓｅｃ以上、好ましくは約１２Ｖｍｓｅｃ以上であるように電圧と通電時間を設定する。例えば、タンパク質濃度が約５０μｇ／ｍｌの場合、電圧と通電時間の積の値は、約９０Ｖｍｓｅｃ以上、好ましくは約１２０Ｖｍｓｅｃ以上である。
　例えば、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖであり、通電時間は約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃであり、電圧と通電時間の積の値は、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約９９０Ｖｍｓｅｃである。別の例では、電圧は電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖであり、通電時間は約２ｍｓｅｃないし約２２ｍｓｅｃであり、電圧と通電時間の積の値は、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約３３０Ｖｍｓｅｃである。これらの例において、溶液中のＣａｓ９タンパク質濃度は約５０ｎｇ／μｌ以上であり得る。
　段階（ｂ）における電圧は一定であっても、変動してもよい。ある実施態様では、段階（ｂ）における電圧は一定である。その場合、エレクトロポレーターとして、従来のスクエアパルス式エレクトロポレーターを使用できる。
　ある実施態様では、電圧を複数のパルスに分けてかける。電圧を複数のパルスに分けてかける場合、通電時間は、各パルスの時間の合計である。例えば、電圧を２回ないし１５回または３回ないし１１回のパルスに分けてかける。ある実施態様では、電圧を３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または１１回のパルスに分けてかける。各パルスの時間は、例えば、約０.０１ｍｓｅｃ～約３３ｍｓｅｃ、約０.０５ｍｓｅｃ～約１２ｍｓｅｃ、約０.１ｍｓｅｃ～約１０ｍｓｅｃ、約０.３ｍｓｅｃ～約７ｍｓｅｃ、約０.４ｍｓｅｃないし約５ｍｓｅｃ、約０.５ｍｓｅｃないし約３ｍｓｅｃ、例えば、約０.５ｍｓｅｃ、約１ｍｓｅｃ、約２ｍｓｅｃまたは約３ｍｓｅｃである。各パルス間の間隔は、例えば、約０.５ないし約５００ｍｓｅｃ、好ましくは約５ないし約２５０ｍｓｅｃ、より好ましくは約１０ないし約１５０ｍｓｅｃ、さらに好ましくは約８０ないし約１２０ｍｓｅｃである。ある実施態様では、パルス間の間隔は約９７ｍｓｅｃである。
　電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの大きさは同じであっても、異なっていてもよい。
　電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの方向は同じであってもよく、少なくとも１つのパルスの方向が他のパルスと逆であってもよい。また、両方向のパルスを用いる場合、各方向のパルスはいかなる順序であってもよい。例えば、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい。「逆方向のパルス」は、２本のエレクトロポレーション用電極の一方を陽極とし、他方を陰極とするパルスに対して、陽極と陰極を入れ替えた場合のパルスを意味する。
ゲノム編集
　「ゲノム編集」は、人工制限酵素を使用して哺乳動物細胞の１つまたはそれ以上の遺伝子を改変することを意味する。ゲノム編集により、対立遺伝子の一方または両方が改変される。上記の方法では、細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム編集を行う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第８６９７３５９号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
　一般的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集には、エンドヌクレアーゼのＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡが必要である。ｇＲＮＡは、細菌のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて１つのキメラＲＮＡにしたものである。従って、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的配列特異性と、Ｃａｓ９タンパク質の足場となるｔｒａｃｒＲＮＡの特性を併せ持つ。ｇＲＮＡとＣａｓ９が細胞内に存在すると、ゲノム内の標的配列が永続的に改変され得る。
　ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体は、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ内の標的配列との相補的塩基結合により、標的配列にリクルートされる。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が標的配列に結合するためには、ゲノム内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（Protospacer Adjacent Motif））配列を含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体の標的配列への結合は、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の標的配列に局在化させ、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの両方の鎖を切断し、ＤＳＢ（二本鎖切断（Double Strand Break））を引き起こす。ＤＳＢは、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（Non-Homologous End Joining））ＤＮＡ修復経路、または、ＨＤＲ（相同組換え修復）経路により修復され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、ＤＳＢの部位にしばしば塩基の挿入／欠損を与え、それはフレームシフトおよび／または停止コドンをもたらし、標的遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊し得る。ＨＤＲ経路は、ＤＳＢを修復するために、修復鋳型の存在を必要とする。ＨＤＲでは、修復鋳型の配列が、切断された標的配列に忠実に複写される。修復鋳型とＨＤＲを利用して、標的遺伝子に所望の変異を導入できる。
Ｃａｓ９タンパク質
　野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨの２つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、ＤＮＡの二本鎖の異なる鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９タンパク質はゲノムＤＮＡにＤＳＢ（二本鎖切断）を引き起こす。ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかの触媒活性のみを有するＣａｓ９タンパク質も開発されている。この場合、Ｃａｓ９タンパク質は標的ＤＮＡのいずれかの鎖のみを切断する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ変異により不活性化され、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ変異により不活性化される。
　Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性は、そのヌクレアーゼ活性から独立している。ヌクレアーゼ活性を担うＲｕｖＣおよびＨＮＨが不活性であり、Ｃａｓ９タンパク質がヌクレアーゼ活性を全く持たない場合でも、Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を保持する。従って、ヌクレアーゼとして不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９タンパク質）を、分子生物学的ツールとして利用することができる。例えば、ｇＲＮＡを利用してｄＣａｓ９タンパク質を既知の転写調節ドメインに結合させることにより、遺伝子の発現を活性化または抑制する転写レギュレーターとして利用することができる。例えば、転写活性化因子と融合させたｄＣａｓ９タンパク質は、標的配列の転写を活性化できる。逆に、ｄＣａｓ９タンパク質のみが標的配列に結合すると、転写を抑制し得る。遺伝子のプロモーターに近い領域にあるｇＲＮＡ標的配列を選択することにより、様々な遺伝子の転写を調節することができる。あるいは、クロマチン免疫沈降などにおいて、エピトープタグに融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと共に使用することにより、ゲノムＤＮＡを精製できる。ＧＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質マーカーと融合させたｄＣａｓ９タンパク質を、任意のゲノムＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わせて、生きている細胞で検出可能なＤＮＡ標識として使用することもできる。
　「Ｃａｓ９タンパク質」は、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合する能力を有するタンパク質を意味し、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性の両方を有するものも、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有さないものも含まれる。Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合活性およびヌクレアーゼ活性は、例えば、引用により本明細書の一部とするSamuel H. Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014) に記載の方法により測定できる。
　ある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌に由来するものである。ＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌には、アエロピュルム属（Aeropyrum）、ピュロバクルム属（Pyrobaculum）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、ハロアーキュラ属（Halocarcula）、メタノバクテリウム属（Methanobacteriumn）、メタノコックス属（Methanococcus）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノピュルス属（Methanopyrus）、ピュロコックス属（Pyrococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクウィフェクス属（Aquifex）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、クロロビウム属（Chlorobium）、サーマス属（Thermus）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、アゾアルカス属（Azoarcus）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ナイセリア属（Neisseria）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、デスルフォビブリオ属（Desulfovibrio）、ジオバクター属（Geobacter）、マイクロコッカス属（Micrococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ウォリネラ属（Wolinella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エスケリキア属（Escherichia）、レジオネラ属（Legionella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、パスツレラ属（Pasteurella）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、ザントモナス属（Xanthomonas）、エルシニア属（Yersinia）、トレポネーマ属（Treponema）およびテルモトガ属（Thermotoga）などに属する細菌が含まれる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）などの細菌に由来するものである。
　ある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、他のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質であり得る。他のタンパク質またはペプチドには、例えば、蛍光タンパク質、転写調節因子、エピトープタグ、タンパク質精製用タグ、核移行シグナルペプチドなどが含まれる。
　ある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、図１に示す配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣヌクレアーゼ活性およびＨＮＨヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列からなる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列に約８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｃａｓ９タンパク質のｇＲＮＡ依存的ＤＮＡ結合活性を有し、場合によりＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１のアミノ酸配列からなる。配列番号１ないし４は、各々、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラ由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列である。
　ある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１ないし４のいずれかのアミノ酸配列に、約８０％以上、例えば約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以上、より好ましくは約９９.５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、配列を最適にアライメントした場合に、２つの配列において同一であるアミノ酸残基の割合を意味する。従って、例えば、９０％アミノ酸配列同一性とは、最適にアライメントされた２つのアミノ酸配列において９０％のアミノ酸が同一であることを意味する。アミノ酸配列のアライメントおよび同一性の計算の方法は当業者に周知であり、例えば、BLAST等のプログラムを利用することができる。
　Ｃａｓ９タンパク質は、当分野で公知のいかなるペプチド合成の技法によっても調製でき、特に、化学合成または遺伝子組換え技法を利用して調製できる。当業者は、例えば、配列番号１ないし４のアミノ酸配列に基づいてＣａｓ９タンパク質を調製できる。あるいは、購入できるＣａｓ９タンパク質を使用してもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、タカラバイオ社、New England BioLabs、thermofisher、ToolGen、PNA bio等から購入し得る。
　ある実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液は、１種またはそれ以上の核酸分子を含み、当該核酸分子がＣａｓ９タンパク質と共に受精卵に導入される。核酸分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｓＯＤＮであり得、ｇＲＮＡ単独、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せ、ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せ、または、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの組合せを使用できる。
　ある実施態様では、溶液中のｇＲＮＡの濃度は、約１０～約１０００ｎｇ／μｌ、約５０～約５００ｎｇ／μｌまたは約１００～約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。ある実施態様では、溶液中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの濃度は、各々、約１０～約１０００ｎｇ／μｌ、約５０～約５００ｎｇ／μｌまたは約１００～約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。溶液中のｓｓＯＤＮの濃度は、約１０～約１０００ｎｇ／μｌ、約５０～約５００ｎｇ／μｌまたは約１００～約３００ｎｇ／μｌ、例えば約２００ｎｇ／μｌであり得る。
ｇＲＮＡ
　ゲノム編集には、標的特異的なｇＲＮＡが必要である。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが融合した人工１本鎖ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間にリンカー配列が存在してもよい。Ｃａｓ９タンパク質はｇＲＮＡの存在下で標的特異的にゲノムＤＮＡに結合できる。
　ｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、ｇＲＮＡの配列特異性を担う。ｃｒＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内の標的配列またはそれに相補的な配列を含む。標的配列としては、ゲノムＤＮＡ内で、その直後にＰＡＭ配列を有するヌクレオチド配列を選択する。標的配列は、ゲノムＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい。標的配列の選択および／またはｇＲＮＡの設計に利用できる数々のツール、および、バイオインフォマティックスにより予想された様々な種の様々な遺伝子についての標的配列のリストを利用することができ、例えば、引用により本明細書の一部とするFeng Zhang lab's Target Finder、Michael Boutros lab's Target Finder (E-CRISP)、RGEN Tools: Cas-OFFinder、CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes、CRISPR Optimal Target Finder などが挙げられる。
　Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡに結合するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有する必要がある。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列の直後に存在するが、ｇＲＮＡ内の標的配列の直後には存在しない。Ｃａｓ９タンパク質は、標的配列の直後にＰＡＭ配列を有するいかなるＤＮＡ配列にも結合できる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌の種により異なる。最も広く使用されているＣａｓ９タンパク質はスタフィロコッカス・ピオゲニスに由来し、対応するＰＡＭ配列は、標的配列の３’末端の直後に位置するＮＧＧの配列である。様々な細菌の種とＰＡＭ配列の組合せが知られており、例えば、ナイセリア・メニンギティディス：ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ストレプトコッカス・サーモフィラス：ＮＮＡＧＡＡ、トレポネーマ・デンティコラ：ＮＡＡＡＡＣなどが挙げられる。これらの配列において、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのいずれかの塩基を示す。
　ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部と相補的に結合し、ヘアピン構造を形成する。この構造がＣａｓ９に認識され、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９の複合体が形成される。従って、ｔｒａｃｒＲＮＡはｇＲＮＡのＣａｓ９タンパク質結合能力を担う。ｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌の内在性ＲＮＡに由来し、細菌の種によって異なる配列を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、上記のＣＲＩＳＰＲ系を有することが知られている細菌のものであり得、好ましくは、ゲノム編集に使用するｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９タンパク質は、同じ細菌の種に由来する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・サーモフィラス、トレポネーマ・デンティコラのｔｒａｃｒＲＮＡを使用できる。
　所望のｇＲＮＡ配列を有するＤＮＡをインビトロ転写用ベクターにクローニングし、インビトロで転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。適するインビトロ転写用ベクターは、当業者に公知である。また、ｇＲＮＡの標的配列以外の配列を含むインビトロ転写用ベクターが当分野で公知である。標的配列のオリゴヌクレオチドを合成し、そのようなベクターに挿入し、インビトロ転写することにより、ｇＲＮＡを得ることができる。そのようなベクターには、例えば、addgene から購入できる、pUC57-sgRNA expression vector、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs、pRB17、pMB60、DR274、SP6-sgRNA-scaffold、pT7-gRNA、DR274、pUC57-Simple-gRNA backbone、並びに、Origene社から購入できるpT7-Guide-IVTが含まれる。インビトロ転写の方法は、当業者に公知である。
　ｇＲＮＡの代わりに、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用してもよい。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せを使用する場合、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは各々分離したＲＮＡ分子であり、これらの重量比は１：１０～１０：１、例えば１：１であり得る。
ＨＤＲ（相同組換え修復）
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、また、ＨＤＲを利用して、標的配列の特定のヌクレオチドを改変することもできる。ＨＤＲによりゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオチドを改変するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。ある実施態様では、ＤＮＡ修復鋳型として、ｓｓＯＤＮ（一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド）を用いることができる。ｓｓＯＤＮは、ＤＳＢの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、ＨＤＲは、Ｃａｓ９タンパク質によるＤＳＢの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ｓｓＯＤＮを設計する際には、修復された遺伝子がＣａｓ９タンパク質により切断されないように、ｓｓＯＤＮが、直後にＰＡＭ配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、ＰＡＭ配列に対応する配列をｓｓＯＤＮ中では別の配列にすることにより、ｓｓＯＤＮがＣａｓ９タンパク質により切断されないようにできる。ｓｓＯＤＮの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ｓｓＯＤＮは、通常、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９遺伝子またはタンパク質と共に細胞に導入される。
　エレクトロポレーションされた受精卵、または、当該受精卵に由来する細胞の少なくとも１個において、ｇＲＮＡの存在下でゲノム中の少なくとも１つの標的遺伝子のゲノム編集が起こり得る。ある実施態様では、上記の方法は、ゲノム編集が起こったことを確認する段階をさらに含む。ゲノム編集が起こったことは、当分野で知られている様々な方法により確認できる。例えば、標的遺伝子の表現型が知られている場合に、その表現型の変化を検出することにより、あるいは、受精卵または受精卵から発生した胚の細胞において、標的配列を含むゲノムＤＮＡの配列を解読することにより確認できる。ＨＤＲの場合は、ｓｓＯＤＮに制限酵素切断部位を組み込むことにより、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）で評価することも可能である。これらの方法は、当分野で周知である。
　「哺乳動物」は、哺乳綱に分類されるあらゆる生物を含む。哺乳動物は、例えば、霊長目（例えば、サル、ヒトなど）、齧歯目（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、鯨偶蹄目（例えば、ブタ、イノシシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどを含む。ある実施態様では、哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。ある実施態様では、哺乳動物は齧歯目、特にマウスである。ある実施態様では、哺乳動物は鯨偶蹄目、特にブタである。
　「受精卵」は、受精後の卵または胚を意味し、受精卵（１細胞期）および２細胞期から胚盤胞期までの発生初期胚を含む。受精卵は、体内または体外で受精した受精卵であり得、卵子または受精卵として冷凍保存されたものであってもよい。受精卵の調製、培養および保存の方法は、当分野で公知である。好ましくは、エレクトロポレーションに使用する前に、エレクトロポレーション用の溶液で受精卵を洗浄し、培養培地を除去する。ある実施態様では、受精卵は、１細胞期ないし桑実胚期、好ましくは１細胞期ないし８細胞期、より好ましくは１細胞期ないし４細胞期、より好ましくは１細胞期ないし２細胞期、例えば１細胞期のものである。ある実施態様では、受精の約６時間後以降、好ましくは約９時間後以降、より好ましくは約１２時間後以降にエレクトロポレーションを実施する。ある実施態様では、受精の約６時間～約２０時間後、好ましくは約９時間～約１６時間後、より好ましくは約１１時間～１４時間後、例えば約１２時間～１３時間後にエレクトロポレーションを実施する。受精卵は、通常、透明帯と呼ばれる保護膜を有する。透明帯は、酸性タイロード液、グルタチオン等の薬剤による処理により除去または薄化できるが、上記の方法においては、透明帯は除去または薄化しても、しなくてもよい。好ましくは、薬剤処理により透明帯を除去または薄化していない受精卵を使用する。「透明帯を除去または薄化していない受精卵」は、透明帯を除去または薄化するための薬剤による処理を受けていない受精卵を意味する。透明帯を除去または薄化するための薬剤には、酸性タイロードおよびグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。
　ある実施態様は、エレクトロポレーションされた受精卵を培養し、受精卵の生存を確認する段階を含む。受精卵の培養方法は、当業者に周知である。受精卵の生存は、エレクトロポレーション後に受精卵の少なくとも１回の細胞分裂が起こったことを観察することにより確認できる。
　ある実施態様では、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を得ることができる。ある実施態様は、また、上記の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む遺伝子改変動物の作製方法を提供する。レシピエント動物は、通常、受精卵と同じ動物種の偽妊娠状態のメスであり、その卵管に受精卵を移植する。受精卵（胚）の発生段階によっては、子宮に移植する場合もあり得る。受精卵を移植されたレシピエント動物は、遺伝子改変動物を出産することができる。遺伝子改変動物の作製方法は当業者に公知であり、例えば、引用により本明細書の一部とするManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Press) に記載の方法を用いる。
　本願に開示される方法により、エレクトロポレーションで、Ｃａｓ９タンパク質を哺乳動物の受精卵に導入することができる。エレクトロポレーションの利点は、胚の生存率が高いこと、および、特別な手技を必要とせず、時間のかからない技術であることである。１００個の受精卵の細胞質または前核にｍＲＮＡまたはタンパク質をマイクロインジェクションする場合、熟練者であっても１時間以上を要するが、エレクトロポレーションは、これを数分で、単純な作業で、達成できる。加えて、市販のエレクトロポレーションシステムの価格は、マイクロインジェクションシステムよりも一般的に安い。さらに、Ｃａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションすると、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションするよりもゲノム編集の効率がよい。このことは、穏やかなエレクトロポレーション条件の選択を可能にし、胚の生存率をさらに高めることができる。従って、本願に開示される方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるゲノム編集およびこれを利用した遺伝子改変動物の作製の効率を高め、迅速化し、コストを低減することに貢献し得る。
　以下に、本願に開示される方法の実施態様を例示する。
［１］
　哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入する方法であって、
（ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
（ｂ）電極間に電圧をかけること、
の各段階を含む、方法。
［２］
　溶液中のＣａｓ９タンパク質濃度が約３ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌである、第１項に記載の方法。
［３］
　溶液中のＣａｓ９タンパク質濃度が約５０ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］
　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖである、第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
［５］
　通電時間が約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃである、第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
［６］
　通電時間が約２.５ｍｓｅｃないし約１８ｍｓｅｃである、第１項ないし第５項のいずれかに記載の方法。
［７］
　電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約９９０Ｖｍｓｅｃである、第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。
［８］
　電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約３３０Ｖｍｓｅｃである、第１項ないし第７項のいずれかに記載の方法。
［９］
　電圧を３回ないし１１回のパルスに分けてかける、第１項ないし第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］
　各パルスの時間が約０.０５ｍｓｅｃ～約１２ｍｓｅｃである、第９項に記載の方法。
［１１］
　各パルスの時間が約０.５ｍｓｅｃないし約３ｍｓｅｃである、第９項または第１０項に記載の方法。
［１２］
　各パルス間の間隔が約０.５ないし約５００ｍｓｅｃである、第９項ないし第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］
　各パルス間の間隔が約８０ないし約１２０ｍｓｅｃである、第９項ないし第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］
　Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質である、第１項ないし第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］
　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１項ないし第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］
　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１項ないし第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］
　哺乳動物が齧歯目である、第１項ないし第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］
　哺乳動物がマウスである、第１項ないし第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］
　哺乳動物が鯨偶蹄目である、第１項ないし第１６項のいずれかに記載の方法。
［２０］
　哺乳動物がブタである、第１項ないし第１６項および第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］
　受精卵が、透明帯を除去または薄化していない受精卵である、第１項ないし第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］
　溶液が１種またはそれ以上の核酸分子を含み、核酸分子がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せまたはｇＲＮＡであり、核酸分子がＣａｓ９タンパク質と共に受精卵に導入される、第１項ないし第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］
　核酸分子がｇＲＮＡである、第２２項に記載の方法。
［２４］
　第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入することを含む、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵の製造方法。
［２５］
　第２２項または第２３項に記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質および核酸分子を導入することを含む、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法。
［２６］
　第２２項または第２３項に記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質および核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法。
［２７］
　遺伝子改変動物の作製方法であって、第２６項に記載の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、方法。
　以下、実施例により本願の開示をさらに説明するが、本願に開示される方法はこれらに限定されるものではない。
実施例１　マウス受精卵のゲノム編集
実施例１－１　Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノム編集
Ｃａｓ９タンパク質
　タカラバイオ Guide-it（商標）sgRNA Screening Kit（631440）に含まれるＣａｓ９タンパク質を使用した（配列番号５）。これは、Streptococcus pyogenesに由来するＣａｓ９タンパク質と核移行シグナルおよびＨＡタグの融合タンパク質であり、Nature Biotechnology, vol.31, (3) 230-232 に記載の方法により製造されたものである（Supplementary Methods / Supplementary Figure 1 参照）。
ｇＲＮＡの調製
　ｍＣｈｅｒｒｙ中の標的配列（５’－ＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧ－３’（配列番号６）およびその相補的配列）を含むオリゴヌクレオチド対をアニーリングし、ｐＤＲ２７４ベクター（addgene）のＢｓａＩ制限酵素部位に挿入した。ＤｒａＩによる切断後、MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）を使用してｇＲＮＡを合成した。合成したｇＲＮＡは、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。沈殿したｇＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉに２～４μｇ／μｌの濃度で溶解し、使用するまで－２０℃で保存した。ｇＲＮＡを吸光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量した。
受精卵
　Ｒｏｓａ２６遺伝子座にＨｉｓｔｏｎ２ｂ（Ｈ２ｂ）－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する受精卵（引用により本明細書の一部とするAbe et al., Genesis 49, 579-590 (2011)）を使用した。この受精卵から発生した胚では、Ｒｏｓａ２６プロモーターの制御下でＨ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙが遍在性に発現され、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が観察される。Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを標的とするゲノム編集が起こり、遺伝子が破壊されると、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は消失する。
　ＩＣＲ（日本ＳＬＣ）のメスを、Ｒ２６－Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙのオス（RIKEN CDB、日本）と交配させ、卵管からＥ０.５で受精卵を回収した（Ｅの後の数字は、受精後の日数を示す。Ｅ０.５は、腟栓を確認した日の暗期の中間点から１２時間後である。）。１％ヒアルロニダーゼ／Ｍ２培地（Sigma）でインキュベートすることにより、受精卵を覆っている卵丘細胞を除去した。回収した受精卵を、エレクトロポレーションに使用するまで、ＫＳＯＭ培地（アーク・リソース、日本）中で培養した。
エレクトロポレーション
　白金ブロック電極（長さ：１０ｍｍ、幅：３ｍｍ、高さ：０.５ｍｍ、ギャップ：１ｍｍ）（株式会社ベックス（以下、BEXと称する）、東京、日本）を外注して使用した（図２ａ）。CUY21EDIT II（BEX）（図２ａ右）に接続した白金ブロック電極（図２ｃ）を、実体顕微鏡（図２ａ左）にセットした。図２ｂは、図２ａの四角で囲んだ部分の拡大図である。このシステムを使用して、約４０個～５０個の受精卵を同時に処理できる。エレクトロポレーションに先立ち、マウスの受精卵を手技により一列に並べた。図２ｄは、電極間のギャップに置かれた受精卵の顕微鏡像である。ＫＳＯＭ培地中で培養されている受精卵をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Life technologies）で３回洗浄し、血清含有培地を除去した。次いで、Ｃａｓ９タンパク質（１００ｎｇ／μｌ）およびｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）を含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ溶液（５μｌ）を満たした白金ブロック電極のギャップに受精卵を並べ、様々な条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、Ｍ２培地で４回、ＫＳＯＭ培地で２回洗浄した。次いで、受精卵を、ＫＳＯＭ培地中、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内で、胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養した。
蛍光シグナルの検出
　ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のシグナル強度を測定した。蛍光シグナルは、Ａ１共焦点顕微鏡（ニコン、日本）により検出した。
　結果を図３に示す。図３左はＤＡＰＩ染色を、図３右は同一視野のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示す。１０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（±３は、両方向からのパルスを交互に３回ずつ与えたことを示す）のエレクトロポレーション条件では、全ての割球で蛍光が観察された（各パネル左上）。１５Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３では、一部の割球で蛍光が消失した（各パネル右上）。２０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（各パネル左下）および２５Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×±３（各パネル右下）では、全ての割球で蛍光が消失した。Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによりゲノム編集を実施でき、エレクトロポレーションの電圧が高いほど、Ｃａｓ９タンパク質の導入効率は高いことが示された。
実施例１－２　Ｃａｓ９タンパク質とＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集の比較
　Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるマウス受精卵のゲノム編集を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの場合と比較した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの調製
　ｈＣａｓ９プラスミド（ｐＸ３３０）は、Addgene（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。ｐＸ３３０から切り出したｈＣａｓ９を、ｐＳＰ６４ベクター（Promega）のＳＰ６プロモーターの下流につなぎ（ｐＳＰ６４－ｈＣａｓ９）、ｍＲＮＡ合成に使用した。ｐＳＰ６４－ｈＣａｓ９を、ＸｂａＩにより直鎖状にした。直鎖状プラスミドを鋳型として、インビトロＲＮＡ転写キット（mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, オースティン、テキサス州、米国）を使用して、ｈＣａｓ９のｍＲＮＡを合成した。
　実施例１－１と同様に、Ｃａｓ９タンパク質（１００ｎｇ／μｌ）またはＣａｓ９ ｍＲＮＡ（４００ｎｇ／μｌ）およびｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（２００ｎｇ／μｌ）を、Ｈ２ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有するＥ０.５のマウス受精卵に、エレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション条件は、３０Ｖ（３ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×７回であった。受精卵をインビトロで胚盤胞期（Ｅ４.５）まで培養し、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の配列をダイレクトシーケンス法により決定した。配列解読は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver. 3.1 および ABI 3500 Genetic Analyser （Applied Biosystems, フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を使用して行った。
　結果を図４に示す。Ｃａｓ９タンパク質を導入した胚では、配列解読の結果は単一の波形で得られた（図４上）。このことは、胚のすべての割球においてｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が同じ配列を有することを示し、１細胞期にゲノム編集が起こったことを示唆する。一方、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを導入した胚では、配列解読の結果は複数の波形を含むモザイク状であった（図４下）。このことは、配列が異なるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有する割球が胚盤胞に存在することを示し、２細胞期以降にゲノム編集が起こったことを示唆する。これらの結果は、エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を受精卵に導入すると、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを導入するよりも早い発生段階でゲノム編集が起こることを示す。
実施例２　ブタ受精卵のゲノム編集
実施例２－１　ブタ受精卵へのＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集
　屠畜場にて屠殺されたブタ（三元交雑種；ランドレース×大ヨークシャー×デュロック）より卵巣を採取し、３０℃の生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）中に保存し１時間以内に実験室に持ち帰った。直径２－６ｍｍの卵胞より卵丘細胞－卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を採取し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で４４時間成熟培養を行った。成熟培養には Earle's 塩含有 tissue culture medium 199 (TCM 199; Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) に１０％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液、０.６ｍＭシステイン、５０μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌ Ｄ－ソルビトール、５０μＭ β－メルカプトエタノール、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した成熟培地を用いた。成熟培養開始２２時間は１０ＩＵ／ｍｌウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）および１０ＩＵ／ｍｌヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を添加した成熟培地にて培養し、その後ＣＯＣｓをｅＣＧおよびｈＣＧ非添加の成熟培地中に移し、２２時間培養を行った。
　成熟培養後、成熟卵を体外受精培地（ＰＦＭ；機能性ペプチド研究所，山形）で洗浄後、体外受精に供した。凍結精液を融解後、６ｍｌのＰＦＭで洗浄し、精子濃度を５×１０６個／ｍｌに調節した。希釈精液中に成熟卵を移し、３９℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で１２時間媒精を行った。媒精終了後、卵周囲の卵丘細胞と精子をピペッティング操作により除去し、受精卵を得た。受精卵は直ちにエレクトロポレーションに使用した。
　肢の発生に必須であるＦＧＦ１０遺伝子を標的とした（引用により本明細書の一部とするSekine, K. et al., Nature Genetics 21, 138-141(1999)）。図５ａは、ＦＧＦ１０遺伝子第３エキソンにあるｇＲＮＡ標的配列（大文字）およびＰＡＭ配列（ＣＴＴ、大文字、下線）を含む、ブタＦＧＦ１０遺伝子座のゲノム構造を示す。ＦＧＦ１０中の標的配列（５’－ＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧ－３’（配列番号７）およびその相補的配列）を含むオリゴヌクレオチド対（図１３）をアニーリングし、ｐＤＲ２７４ベクター（addgene）のＢｓａＩ制限酵素部位に挿入した。ＤｒａＩによる切断後、MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）を使用してｇＲＮＡを合成した。ｇＲＮＡを、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿により精製した。沈殿したｇＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉに溶解した。ｇＲＮＡを吸光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量し、使用するまで－３０℃で保存した。
　実施例１と同様のエレクトロポレーションシステムを用いて、電圧を３０Ｖに維持し、様々なエレクトロポレーションのパルス時間（１－３ｍｓ）およびパルスの回数（３－７回）で、パルス間隔を９７ｍｓｅｃとして、ブタの受精卵に、４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍ ＲＮＡ（実施例１参照）および２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０を標的とするｇＲＮＡを、体外受精開始の１３時間後に導入した。エレクトロポレーション後、受精卵をＰＺＭ－５培地（機能性ペプチド研究所、山形）にて３日間発生培養を行った。続いて、ＰＢＭ培地（機能性ペプチド研究所、山形）にて４日間の発生培養を行い、胚盤胞を得た。
　胚盤胞を５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液中でボイルし、ゲノムを調製した。中和後、ブタＦＧＦ１０Ｆｗｄ（５’－ＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＣＴＴ－３’（配列番号８））およびＲｅｖ（５’－ＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧ－３’（配列番号９））を特異的プライマーとして使用して、ｇＲＮＡ標的に隣接するゲノム領域をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＭＤ２０（Takara Bio）プラスミドにクローニングした。１２種以上のプラスミドを単離し、標的ゲノム領域を配列解読した。図５ｂは、ＰＣＲ増幅産物中に検出されるＦＧＦ１０標的領域における変異配列の頻度を示す。インデルの頻度は、パルス時間と回数の増加に伴って増加した。図５ｃは、各条件でエレクトロポレーションされた胚の胚盤胞形成率を示す（片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。３ｍｓｅｃのパルス×５回を超えると胚盤胞形成率の低下が顕著であった。
　同様にして、エレクトロポレーションに適する時期を調べた。体外受精開始の１１、１３、１９、２１および２３時間後にエレクトロポレーションした。ゲノム編集の効率はいずれも同等であったが、胚盤胞形成率は１３時間後が比較的良好であった（図６、片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。従って、以後の実験では、体外受精開始の１３時間後にエレクトロポレーションを行った。
実施例２－２　ブタ受精卵へのＣａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるゲノム編集
　Ｃａｓ９タンパク質のブタ受精卵へのエレクトロポレーションにより、ゲノム編集を実施できるか否かを調べた。実施例１と同様に、タカラバイオ Guide-it（商標）sgRNA Screening Kit（631440）に含まれるＣａｓ９タンパク質を使用した（配列番号５）。実施例２－１と同様に、ただし、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの代わりにＣａｓ９タンパク質（５０ｎｇ／μｌ）を、２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０遺伝子を標的とするｇＲＮＡと共に、様々な電気的条件でのエレクトロポレーションによりブタ体外受精卵に導入し、胚盤胞まで培養し、ゲノム編集の効率を調べた。結果を図７に示す。図中、○は標的ゲノムの配列に変異が観察されたことを示し、×は、変異が観察されなかったことを示し、×＊は、胚盤胞が形成されなかったことを示す。この結果は、Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションにより、ブタ受精卵の遺伝子をゲノム編集できることを示す。
実施例２－３　Ｃａｓ９タンパク質とＣａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによるゲノム編集の比較
　実施例２－１および２－２と同様に、エレクトロポレーション条件を３０Ｖ（１ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×５回に固定し、４００ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡまたは５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質を、２００ｎｇ／μｌのＦＧＦ１０遺伝子を標的とするｇＲＮＡと共にブタ体外受精卵に導入し、ゲノム編集の効率および胚盤胞形成率を比較した。図８ａは、ＦＧＦ１０標的領域におけるインデルの頻度を示し、図８ｂは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質をエレクトロポレーションされたブタ受精卵の胚盤胞形成率を示す（片側ＡＮＯＶＡを使用して＊Ｐ＜０.０５、エラーバーは平均±標準誤差を示す）。胚盤胞形成率は両者で同等であったが、ゲノム編集の効率はタンパク質の方が高かった。
実施例２－４　Ｃａｓ９タンパク質のエレクトロポレーションによるＭＳＴＮ遺伝子のゲノム編集
　ミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子を標的としてゲノム編集を行った。これは、筋形成の負の制御因子をコードし、その破壊は、ブタ、ウシおよびヒツジにおいて、骨格筋の肥大という単純な形質を示す（Qian, L. et al., Sci Rep 5, 14435, doi:10.1038/srep14435 (2015) および Rao, S. et al., Mol Reprod Dev, doi:10.1002/mrd.22591 (2015)）。実施例２－１と同様に、ＭＳＴＮ第１エキソンの様々な部位を標的とするｇＲＮＡを調製した。図９は、ＭＳＴＮ遺伝子座のゲノム構造およびＭＳＴＮ遺伝子第１エキソンのｇＲＮＡ標的配列のリストを示す。実施例２－２と同様に、５０ｎｇ／μｌのＣａｓ９タンパク質および２００ｎｇ／μｌのｇＲＮＡを、３０Ｖ（１ｍｓｅｃのパルス＋９７ｍｓｅｃの間隔）×５回の条件でブタ受精卵にエレクトロポレーションし、胚盤胞期まで培養した。
　４～５個の胚盤胞を５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液中でボイルし、ゲノムを調製した。中和後、ｇＲＮＡ標的に隣接するゲノム領域をＰＣＲにより増幅させた。以下の特異的プライマーを使用した：ブタＭＳＴＮ Ｆｗｄ（５’－ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＡＴＧ－３’（配列番号１０））およびＲｅｖ（５’－ＴＧＴＡＧＧＣＡＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＣＧ－３’（配列番号１１））。ＰＣＲ産物をｐＭＤ２０（TakaraBio）プラスミドにクローニングした。１２種以上のプラスミドを単離し、標的ゲノム領域の配列を決定した。
　図１０は、各標的領域のＰＣＲ増幅産物中の変異の頻度を示す。７種の試験したｇＲＮＡのうち、２種（ｇＲＮＡ６および７）を用いた場合にゲノム編集効率が高く、１種（ｇＲＮＡ１）で中程度であった（図１０ａ）。残りの４種のｇＲＮＡを用いると、ゲノム編集効率は低かった（図１０ｂ）。図１１は、エレクトロポレーションされた胚の胚盤胞形成率を示す（エラーバーは平均±標準誤差を示す）。胚盤胞形成率は、ｇＲＮＡ間で同等であった。
　同様に、１個の胚盤胞からゲノムを調製し、各胚盤胞の配列を分析した。２－４種の変異配列を有し、野生型配列を有さない胚盤胞と、変異型と野生型の両方の配列を様々な割合で有する胚盤胞が見られた（表７）。この結果は、エレクトロポレーションによるＣａｓ９タンパク質の導入によりブタの各種遺伝子のゲノム編集が可能であることを示唆する。
表７：ＭＳＴＮ変異体の配列分析
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表中、－（ｎ）ｂｐはｎ塩基の欠損を、＋（ｎ）ｂｐはｎ塩基の挿入を、ｍ（ｎ）はｎ塩基の置換を示す。
実施例２－５　エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を導入したブタ受精卵からの変異個体の作製
　エレクトロポレーションによりＣａｓ９タンパク質を導入したブタ受精卵から、変異個体を作製できるか否かを調べた。実施例２－４と同様に、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ１、６または７のいずれかをブタ受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。発情期を同調させた２匹の未経産雌豚（レシピエント）を、Onishi, A. et al., Science 289, 1188-1190 (2000) に記載の通りに、胚移植用に調製した。エレクトロポレーションの約１２時間後に、１細胞期ないし２細胞期の胚をレシピエントの卵管に移植した。移植した胚の数は、片側の卵管に１００個（約２００個／匹）であった。２匹のうち１匹が妊娠し、受精卵移植の１１１日後に１０匹の子ブタを出産した。１匹（１０％）は出生後すぐに死亡した。
　実施例２－４と同様に、耳生検からゲノムＤＮＡを調製し、ＭＳＴＮ遺伝子に変異が導入されたか否かを分析した。標的部位に隣接するＭＳＴＮゲノム領域の配列解読により、１０匹のうち９匹（９０％）がＭＳＴＮ遺伝子に変異を有することが判明した（表８）。それらのうち２匹には野生型配列が検出されなかった（子ブタ＃３および＃４）。これは、それらが両アレルのＭＳＴＮ遺伝子に変異を有することを示す。他の子ブタは、ゲノムの７－７９％に変異を有した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 表中、－（ｎ）ｂｐはｎ塩基の欠損を、＋（ｎ）ｂｐはｎ塩基の挿入を、ｍ（ｎ）ｂｐはｎ塩基の置換を示す。
　子ブタ＃４（両アレル変異体）をさらに分析した。麻酔下で胸最長筋から筋肉生検を単離した。M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Life Technologies）を使用して総タンパク質を抽出し、ＢＣＡタンパク質定量用試薬（Thermo Scientific）を使用して定量した。全てのタンパク質抽出物を同じ濃度（２.２ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。酵素結合免疫吸着測定キット（R&D Systems, Minneapolis, MN）で、製造業者のプロトコールに従ってＭＳＴＮタンパク質の量を測定した。プロペプチドＭＳＴＮ（Prospec, East Brunswick, NJ）およびＭＳＴＮタンパク質（和光純薬工業、大阪、日本）を各々負および正の対照として使用した。図１２ａは、ＭＳＴＮ変異ブタの胸最長筋におけるＭＳＴＮタンパク質の発現を示す。ＭＳＴＮタンパク質発現は両アレル変異体では検出されず（＃４）、一方、同月齢の野生型子ブタでは、強い発現が検出された。これは、ＭＳＴＮエキソン１に導入されたインデルがフレームシフトを引き起こし、機能的ＭＳＴＮタンパク質の合成を不可能にしたことを示す。
　外見の分析では、両アレル変異体の子ブタ（＃４）は、野生型対照（ＷＴ）と比較して臀部が太っており、筋肉量が多かった（図１２ｂ）。
　４０日齢の両アレル変異体（＃４）および野生型から単離された胸最長筋を組織化学的分析に付した。筋肉サンプルを１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業）中で固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片（１０μｍ）を調製し、ヘマトキシリン・エオシン染色した。結果を図１２ｃに示す（スケールバーは２００μｍである）。子ブタ＃４の筋肉量は野生型よりも多かった。これは、ＭＳＴＮ変異動物に一般的に見られる形質である。
　ミオシンの免疫組織化学的分析により、骨格筋の筋繊維のタイプを調べた。４０日齢の子ブタから得られた胸最長筋をドライアイスアセトン（－７８℃）で凍結させた。骨格筋の筋繊維のタイプを判定するために、クリオスタットミクロトーム（サクラファインテック、東京、日本）を使用して凍結切片を切り、免疫組織化学に付した。それぞれＩ型およびＩＩ型筋繊維の特異的マーカーである抗遅筋型（cloneM8421, 1:400, Sigma）および抗速筋型（clone M4276, 1:200, Sigma）ミオシン重鎖モノクローナル抗体で切片を免疫染色した。ヒストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｍ）（ニチレイ、東京、日本）を二次抗体として使用した。各筋肉タイプの割合を、胸最長筋の各切片でデジタル顕微鏡（ＶＨＸ－５０００、キーエンス、大阪、日本）で測定した。結果を図１２ｄ－ｆに示す。両アレル変異体（＃４）では遅筋の数が少なく、過去の報告と一致した（Girgenrath, S., Song, K. & Whittemore, L. A., Muscle Nerve 31, 34-40 (2005)）。
　これらの結果は、受精卵にＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡをエレクトロポレーションで導入することにより、変異動物を作製できることを示す。

Claims (25)

  1. 　哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入する方法であって、
    （ａ）エレクトロポレーション用電極の間に、Ｃａｓ９タンパク質を含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
    （ｂ）電極間に電圧をかけること、
    の各段階を含む、方法。
  2. 　溶液中のＣａｓ９タンパク質濃度が約３ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌである、請求項１に記載の方法。
  3. 　溶液中のＣａｓ９タンパク質濃度が約５０ｎｇ／μｌないし約５０００ｎｇ／μｌである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 　電圧が電極間距離１ｍｍ当たり約１５Ｖないし約５０Ｖである、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
  5. 　通電時間が約２ｍｓｅｃないし約３５ｍｓｅｃである、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
  6. 　通電時間が約２.５ｍｓｅｃないし約１８ｍｓｅｃである、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
  7. 　電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約９９０Ｖｍｓｅｃである、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
  8. 　電圧と通電時間の積の値が、電極間距離１ｍｍ当たり約９０Ｖｍｓｅｃないし約３３０Ｖｍｓｅｃである、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
  9. 　電圧を３回ないし１１回のパルスに分けてかける、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
  10. 　各パルスの時間が約０.０５ｍｓｅｃ～約１２ｍｓｅｃである、請求項９に記載の方法。
  11. 　各パルスの時間が約０.５ｍｓｅｃないし約３ｍｓｅｃである、請求項９または請求項１０に記載の方法。
  12. 　各パルス間の間隔が約０.５ないし約５００ｍｓｅｃである、請求項９ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　各パルス間の間隔が約８０ないし約１２０ｍｓｅｃである、請求項９ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ｇＲＮＡ依存的にＤＮＡに結合するタンパク質である、請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１ないし配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　Ｃａｓ９タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし請求項１５のいずれかに記載の方法。
  17. 　哺乳動物が齧歯目である、請求項１ないし請求項１６のいずれかに記載の方法。
  18. 　哺乳動物が鯨偶蹄目である、請求項１ないし請求項１６のいずれかに記載の方法。
  19. 　受精卵が、透明帯を除去または薄化していない受精卵である、請求項１ないし請求項１８のいずれかに記載の方法。
  20. 　溶液が１種またはそれ以上の核酸分子を含み、核酸分子がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの組合せまたはｇＲＮＡであり、核酸分子がＣａｓ９タンパク質と共に受精卵に導入される、請求項１ないし請求項１９のいずれかに記載の方法。
  21. 　核酸分子がｇＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
  22. 　請求項１ないし請求項２１のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質を導入することを含む、Ｃａｓ９タンパク質を含む哺乳動物の受精卵の製造方法。
  23. 　請求項２０または請求項２１に記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質および核酸分子を導入することを含む、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法。
  24. 　請求項２０または請求項２１に記載の方法により、哺乳動物の受精卵にＣａｓ９タンパク質および核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法。
  25. 　遺伝子改変動物の作製方法であって、請求項２４に記載の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、方法。
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