JP7055469B2 - ホモ接合型細胞の作製方法 - Google Patents
ホモ接合型細胞の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7055469B2 JP7055469B2 JP2020518315A JP2020518315A JP7055469B2 JP 7055469 B2 JP7055469 B2 JP 7055469B2 JP 2020518315 A JP2020518315 A JP 2020518315A JP 2020518315 A JP2020518315 A JP 2020518315A JP 7055469 B2 JP7055469 B2 JP 7055469B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- homozygous
- chromosome
- drug
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
項1. 以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法:
(A)標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断の導入を行いブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
(B)前記ホモ接合型細胞を選別する工程。
項2. 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、1-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレア及び/又は1-(4-(1H-ピラゾリル)-3-シアノフェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレアである、項1に記載の方法。
項3. 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を3.0~50.0μMの濃度で用いる、項1又は2に記載の方法。
項4. 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記(A)工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、項1~3のいずれかに記載の方法。
項5. 前記(A)工程において、前記DNA二重鎖切断を、クリスパー(CRISPR)/クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)法から選択されるDNA二重鎖切断法によって行う、項1~4のいずれかに記載の方法。
項6. 前記(A)工程において、前記染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断の導入を、前記DNA二重鎖切断における標的配列のうち片アレルに多型が存在する標的配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、項1~5のいずれかに記載の方法。
項7. 前記(A)工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記(B)工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、項1~6のいずれかに記載の方法。
項8.前記(A)工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記(B)工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、項7に記載の方法。
項9. 前記(A)工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、項7または8に記載の方法。
項10. 前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、項1~9のいずれかに記載の方法。
項11. 前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、項1~10のいずれかに記載の方法。
項12. 前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、項11に記載の方法。
本発明のホモ接合型細胞の作製方法は、(A)標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞に対し、相同染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断を導入しブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程と、(B)前記ホモ接合型細胞を選別する工程とを含む。
図1及び図2に、(A)工程の例を模式的に示す。(A)工程では、生体外で、標的部位にヘテロ接合変異(図1及び図2中、Xで示される。)を有する細胞(図1及び図2中、(i)で示される。)に対し、相同染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断(DSB)を導入しブルーム症候群(BLM)タンパク質阻害剤の存在下で交差を生じさせることで、ヘテロ性喪失(LOH;Loss Of Heterozygosity)により標的部位のホモ接合型細胞(図1及び図2中、(ii)及び(iii)で示される。)を得る。
本発明において標的部位とは、ヘテロ接合変異を含む部位であり、染色体上の交差によりホモ接合を生じさせるべき部位である。ヘテロ接合変異としては、例えば疾患を引き起こす可能性のある変異、免疫反応性の個人差を生じさせる変異等が挙げられる。当該変異としては特に限定されず、塩基多型(SNP)、挿入欠失(インデル)、コピー数多型(CNV)等が挙げられる。標的部位中に、変異は1個のみ含んでいてもよいし、複数含んでいてもよい。標的部位の長さとしては特に限定されず、染色体上の狭い領域から短腕全体又は長腕全体といった広い領域を含む、例えば1~200Mbpが挙げられる。
標的部位にヘテロ接合変異を含む細胞の種類としては特に限定されない。本発明は交差効率を高めることができるため、ヘテロ接合型細胞が、本来(BLMを抑制しない条件下で)交差が起こりにくい二倍体細胞である場合に特に有用である。二倍体細胞としては、多能性幹細胞、体性幹細胞、芽細胞、体細胞等が挙げられる。多能性幹細胞としては、ES細胞、EG細胞、mGS細胞、iPS細胞等が挙げられ;体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞(骨髄細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞等)、血管幹細胞(血管前駆細胞、血管内皮前駆細胞等)、神経幹細胞等が挙げられ;芽細胞としては、線維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞等が挙げられ;体細胞としては、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、血液細胞(単核球、樹状細胞等)等が挙げられる。また、体性幹細胞は、人工的復帰変異モザイクを生じさせる場合に特に有用であり、多能性幹細胞は、HLAをホモ化し移植の汎用性を高める場合に特に有用である。
ブルーム症候群は、ブルーム遺伝子に劣性変異のある疾患として知られており、顔面の毛細血管拡張、日光過敏、小人症、免疫不全、高頻度の発がん等の症状が報告されている。ブルーム症候群タンパク質(BLMタンパク質)は、ブルーム症候群に関連するタンパク質であり、本発明におけるブルーム症候群タンパク質阻害剤としては、BLMタンパク質のヘリカーゼ活性を阻害する物質が用いられる。具体的には、5-(ピリジン-4-イル)-1,3,4-チアジアゾール-2-アミン誘導体が挙げられる。5-(ピリジン-4-イル)-1,3,4-チアジアゾール-2-アミン誘導体としては、1-フェニル-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレア誘導体が挙げられ、より具体的には、1-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレア(ML216;下記式化合物(1))及び1-(4-(1H-ピラゾリル)-3-シアノフェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレア(下記式化合物(2))が挙げられる。これらのBLMタンパク質阻害剤は、1種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
ヘテロ接合型細胞に導入する核酸構築物は、相同染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断導入を作動させるターゲティングベクターに組み込まれて構築される。
(B)工程では、ホモ接合型細胞を選別する。交差によって相同組換え体として生じる2種類のホモ接合型細胞のいずれを選別してもよい。選別には、(A)工程で用いた選択カセットの内容に応じた選択マーカーを含む培養液(選択培養液)中で細胞を培養すればよい。薬剤耐性遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は対応する薬剤を含む培養液中で樹立した細胞(ポジティブクローン)を選別することができ、蛍光タンパク質遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は蛍光顕微鏡で観察することによって選別することができ、レポーター遺伝子を含む選択カセットを用いた場合は対応する基質を加えることによって選別することができ、フランキングプローブ遺伝子を含む選択カセットを用いた場合はサザンブロット法により選別することができる。
(B)工程で選別されたホモ接合型細胞は、その応用目的に応じた工程に供されることができる。例えば、選別されたホモ接合型細胞が治療に応用される場合等のゲノムに修飾が無い状態が要求される場合は、(A)工程でゲノムに組み込まれた選択カセットを除去する。具体的には、選別されたホモ接合型細胞に再切り出し用トランスポゼース発現ベクターを導入することによって、細胞内でトランスポゼースが発現し、組み込まれた選択カセットを痕跡を残すことなく除去することができる。
本発明によって得られるホモ接合型細胞は、ホモ化した標的部位に応じて様々な用途に応用することができる。ホモ接合型細胞を、疾患を引き起こす変異のホモ接合体(図1中(ii)で示される細胞)として得た場合は、当該変異と疾患との関連を技術的に解析するために応用することができる。この細胞は、特に、多因子疾患における遺伝子間領域での原因因子探索を行う場合に有用である。また、ホモ接合型細胞を、変異がなくなり正常の表現型のもの(図1中(iii)で示される細胞)として得た場合は、再生医療に応用することができる。さらに、ホモ接合型細胞を、復帰細胞(Revertant細胞)(図2(iii)に示される細胞)として得た場合は、治療、疾患発生機構の解析、異なる細胞系列での遺伝子変異回復時における生体への影響の解析等に応用することができる。
まず、参考例として、ブルーム症候群タンパク質阻害剤ML216を用いず、テトラサイクリン遺伝子発現調節システム(Tet-off)を用い、BLMタンパク質の遺伝子発現抑制と片アレル特異的にDNA二重鎖切断(DSB)を導入するように設計したCRISPR/Cas9の導入とを組み合わせることで、ホモ接合型細胞を作製した。さらに、実施例として、Tet-offを用いず、ブルーム症候群タンパク質阻害剤ML216存在下で、片アレル特異的にDSBを導入するように設計したCRISPR/Cas9を細胞に導入することで、ホモ接合型細胞を作製した。
ML216を用いず、ブルーム遺伝子の発現を一過性にシャットダウンにするTet-offシステムと片アレル特異的にDNA二重鎖切断(DSB)を導入するように設計したCRISPR/Cas9の導入とを組み合わせ、neomycinとpuromycinとのダブル薬剤選択を行うことで、19番染色体AAVS1領域(セントロメアからの9Mb(35M領域)、セントロメアからの14Mb(40M領域)、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1領域、45M-2領域)を標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株を獲得した。なお、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1領域、45M-2領域)は、45M領域における異なる領域である。この実験では、テトラサイクリン誘導体(ドキシサイクリン:Dox)を添加した時だけブルーム遺伝子の発現が低下するように設計した。また、ダブル薬剤選択カセットとして図4に示すものを用いた。ダブル薬剤選択カセット内には薬剤選択可能な2種類の遺伝子(neomycin及びpuromycin)が逆向きに配置されており、当該2種類の遺伝子の外側には逆向きloxPが存在する。このダブル薬剤選択カセットは、部位特異的ホモ接合体に変化することで2コピーとなり、Creリコンビナーゼの作用により2種類の薬剤に対して耐性となる。実験デザインを図6~図8に示す。図6は、TALENによるBLM遺伝子座の両アレルに対するTetカセットのターゲティングを示す。ターゲティング後のpuromycin選択カセットはフリッパーゼリコンビナーゼによって除去された。図7は、AAVS1遺伝子座への二重選択カセットのターゲティングを示す。図8は、4N期における有糸分裂交差の模式図を示す。なお、片アレル特異的DSB導入用CRISPR/Cas9システム構築、細胞培養、RNA抽出およびcDNA合成、DNA抽出、ホモ接合型細胞のスクリーニング、交差部位の決定、フローサイトメトリーの手法の詳細については、後述の実施例に記載の手法と同様である。
ヒトBLM-ターゲティングベクターを調製するために、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)プロモーターをhEF1αプロモーターに変更し、マウスBlmターゲティングベクター(Yusa K, Horie K, Kondoh G, Kouno M, Maeda Y, Kinoshita T, Takeda J. Genome-wide phenotype analysis in ES cells by regulated disruption of Bloom's syndrome gene. Nature. 2004 Jun 24;429(6994):896-9.)において、tTA翻訳のためのコザック配列をAGGATTからGCCACCへ改変した。さらに、マウスBlm-ターゲティングベクターから人工イントロン配列を除去した。ターゲティングベクターの左右のアームは、下記表に示すプライマーをそれぞれ用いてPCRによって調製した。
選択カセット(cNPカセット)は、マウスESC(Horie, K., Kokubu, C., Yoshida, J., Akagi, K., Isotani, A., Oshitani, A., Yusa, K., Ikeda, R., Huang, Y., Bradley, A., et al. (2011). A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature methods 8, 1071-1077.)で使用されたcNPカセットに、3つの改変(PgkプロモーターをhEF1αプロモーターに変更、Thymidine kinase 遺伝子を除去、及びlox2272をloxPに置き換え)を加えたものとして作製した。
まず、発現のために必要なbGH (bovine growth hormone) polyA配列を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型:
PGK-L21-NPT-L21-pA (A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature Methods 8, 1071-1077 (2011))
プライマー:
*KpnI-bGHpA-puro-up-up:TAGTGGGCGCGCCGGTACCTTATCGAGTCC
*Gly -puro- low:GGCTTGTACTCGGTCATGGT GGATCCAATAACTTCGTATAATGT
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1分)×35サイクル、及び68℃7分
鋳型:
pPGKpuro-F2F
プライマー:
*Gly -puro- up:GACCGAGTACAAGCC CACGGTGCGCCTCGC
*puro-up:TAA CTCGAGTCATTA GGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCAC
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1分)x35サイクル、及び68℃7分
鋳型:
pMulti-hEF1a-LP1-NPT-LP1-SLRarm
プライマー:
neo-low:TAATGACTCGAGTTAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG
XhoI-tTA-up:TCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGT
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1.5分)x35サイクル、及び68℃7分
8μgのDNA(TALEN左2μg、TALEN右2μg、及びBLMターゲティングベクター4μg)を用い、100μlのチップ内の100万個のヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞(hiPSCs);後述実施例の細胞培養の欄参照)に対し、1300V、30ミリ秒、1パルスの条件でエレクトロポレーション(Neon transfection platform; Invitrogen)によってトランスフェクトした。TALEN配列は下記のとおりである。トランスフェクションを行った細胞を、Synthemax(R)II-SC被覆組織培養皿上の10mMのY-27632を含有しピューロマイシンを含有しないhESC培地中にプレーティングした。トランスフェクションの2日後、ピューロマイシン0.5μg/mlで選択を開始した。標的クローンを下記表に示すプライマーhBLM-3およびプライマーtTA2を用いたPCRによって最初に選択し、次に両アレル標的クローン(hiPSC-BLMtet/tet)をプライマーhBLM-1、プライマーhBLM-2およびプライマーtTA-1を用いたPCRによって選択した。
基本ベクターに、19番染色体AAVS1領域のアームを挿入することで、19番染色体AAVS1のターゲティング用ベクターとして構築した。また、8μgのDNA(AAVS1-ZFN左2μg、AAVS1-ZFN右2μg、及びAAVS1用ターゲティングベクター4μg)を用い、100μlのチップ内の100万個のBLMtet/tet hiPSCに対し、1100V、30ミリ秒、1パルスの条件でエレクトロポレーション(Neon transfection platform; Invitrogen)によってトランスフェクトした。AAVS1-ZFNの配列としては、Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, Dekelver RC, Jaenisch R, et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 2009;27(9):851-857.で報告されたものを用いた。
CRISPR/Cas9(種々のgRNA配列を含むpX330)6.5~8.0μgを、iCreリコンビナーゼプラスミド3μgとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、1300V、20ミリ秒、1パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、100万個のBLMtet/tetAAVS1cNP/+ hiPSC細胞にトランスフェクトした。gRNA配列は、後述表12に示したものを用いた。
Tet-offを用いず、BLMタンパク質阻害剤ML216(10.0μM、12.5μM、及び14.0μM)存在下で12時間培養した100万個の細胞に、片アレル特異的にDSBを導入するように設計したCRISPR/Cas9を導入し、neomycinとpuromycinとのダブル薬剤選択を行うことで、19番染色体AAVS1領域(セントロメアからの9Mb(35M領域)、セントロメアからの14Mb(40M領域)、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1領域、45M-2領域)をそれぞれ標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株を獲得した。なお、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1領域、45M-2領域)は、45M領域における異なる領域である。さらに、実施例では、6番染色体HLA領域をそれぞれ標的部位とする部位特異的ホモ接合体の細胞株も獲得した。ダブル薬剤選択カセット内には薬剤選択可能な2種類の遺伝子(neomycin及びpuromycin)が逆向きに配置されており、当該2種類の遺伝子の外側には逆向きloxPが存在する。このダブル薬剤選択カセットは、部位特異的ホモ接合体に変化することで2コピーとなり、Creリコンビナーゼの作用により2種類の薬剤に対して耐性となる。
参考例と同様、以下のようにして、選択用プラスミドを作製した。
まず、発現のために必要なbGH (bovine growth hormone) polyA配列を、以下の鋳型及びプライマーを用い、以下の条件で増幅した。
鋳型:
PGK-L21-NPT-L21-pA (A homozygous mutant embryonic stem cell bank applicable for phenotype-driven genetic screening. Nature Methods 8, 1071-1077 (2011))
プライマー:
*KpnI-bGHpA-puro-up-up:TAGTGGGCGCGCCGGTACCTTATCGAGTCC
*Gly -puro- low:GGCTTGTACTCGGTCATGGT GGATCCAATAACTTCGTATAATGT
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1分)×35サイクル、及び68℃7分
鋳型:
pPGKpuro-F2F
プライマー:
*Gly -puro- up:GACCGAGTACAAGCC CACGGTGCGCCTCGC
*puro-up:TAA CTCGAGTCATTA GGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCAC
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1分)x35サイクル、及び68℃7分
鋳型:
pMulti-hEF1a-LP1-NPT-LP1-SLRarm
プライマー:
neo-low:TAATGACTCGAGTTAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG
XhoI-tTA-up:TCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGT
PCR条件:
94℃2分、(98℃10秒、68℃1.5分)x35サイクル、及び68℃7分
(2-1.19番染色体AAVS1領域への選択カセットのターゲティング)
基本ベクターに、19番染色体AAVS1領域のアームを挿入することで、19番染色体AAVS1のターゲティング用ベクターとして構築した。また、8μgのDNA(AAVS1-ZFN 左 2μg、AAVS1-ZFN 右 2μg、及びAAVS1用ターゲティングベクター 4μg)を用い、Neon(R) Transfection Systemを用いて、1100V、30ミリ秒、1パルスの条件で、100万個のヒトiPS細胞にトランスフェクションを行った。AAVS1-ZFNの配列としては、Hockemeyer D, Soldner F, Beard C, Gao Q, Mitalipova M, Dekelver RC, Jaenisch R, et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 2009;27(9):851-857.で報告されたものを用いた。
トランスポゾンの認識配列を有したベクター(PiggyBacトランスポゾンベクター)に選択カセットと、挿入された外来DNA(選択カセット)をメチル化などの不活性化から守るためのインシュレーター配列とを、選択カセットの両方に組み込んだ。選択カセット及びインシュレーター配列を組み込んだベクターのターゲティングアーム・クローニングサイトに、6番染色体HLA領域のテロメア側の配列PCRによって増幅し組み込んだものをターゲティングベクターとした。
インシュレーター配列(tgcttgtccttccttcctgtaacacagccattaaaccaggagcatcgcccttccccggccctcaggtaagaggaccaaataccgtagccgtttccaatttcagtcctttagcgccacctggtgctaactactctatcacgcttttatccaataactacctttgtaaatttcctttcaaaagttctggccgggcgcggtggctcacgcttgtaatcccagcactttgtgaggggtcaggagttc; 7番染色体 +39519983-39520225)を、5’側をプライマーPB5'-HindIII-ins及びプライマーins-HindIII-PB5'で、3’側をプライマーbghpA-ins及びプライマーins-SpeI-PB3'でPCRによって増幅し、PiggyBacトランスポゾンベクターに組み込んだ(#28 pPB-hEF1-puro-bghpA-h5F-insurator-2)。
AscIサイトには、下記のプライマーchr6-Asc1-up及びプライマーchr6-Asc1-lowで増幅したアームを挿入した。また、PacIサイトには下記のプライマーchr6-Pac1-up及びプライマーchr6-Pac1-lowで増幅したアームを挿入した。PCR条件は、94℃2分(98℃10秒、68℃1分)x35サイクル、及び68℃7分であった。
19番染色体AAVS1領域(セントロメアからの9Mb(35M領域)、セントロメアからの14Mb(40M領域)、セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1領域、45M-2領域)、及び6番染色体HLA領域(29M領域)を標的部位としたCRISPR/Cas9システムによるDNA二重鎖切断(DSB)を行うために、標的部位の3’側に位置するPAM(NGG)にSNPがあるgRNAを用意し、片アレルだけ選択的にDSBを導入するようにCRISPR/Cas9システムを構築した。SNP情報(SNPタイプは、PAM配列NGGの「G」におけるSNPタイプを示す。いずれのGにおけるSNPタイプかについては、表12のSNP_IDにより明らかにされている。)標的部位の染色体上の位置、及びgRNA標的配列を下記表に示す。
・19番染色体35M領域用オリゴDNA:
CACCGCCTGGTGTGGGGGCCCTGCG
AACCGCAGGGCCCCCACACCAGGC
・19番染色体40M領域用オリゴDNA:
CACCGGTCAGGGATGGGATTAGGGA
AAACTCCCTAATCCCATCCCTGACC
・19番染色体45M-1領域用オリゴDNA:
CACCGCCCAGAAGCCTCCGCGGCGC
AAACGCGCCGCGGAGGCTTCTGGGC
・19番染色体45M-2領域用オリゴDNA:
CACCGATTGTTATATTGGTGAGGGG
AAACCCCCTCACCAATATAACAATC
・6番染色体HLA領域用オリゴDNA:
CACCGATTGCTTTGATGCTGGGTCA
AAACTGACCCAGCATCAAAGCAATC
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)系統(Igawa K, Kokubu C, Yusa K, Horie K, Yoshimura Y, Yamauchi K, Suemori H, Yokozeki H, Toyoda M, Kiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H, Umezawa A, Katayama I, Takeda J. Removal of reprogramming transgenes improves the tissue reconstitution potential of keratinocytes generated from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2014 Sep; 3(9): 992-1001.)を、Synthemax(R) II-SC(Corning)被覆組織培養皿上のhESC培地で培養し、Accutase(R)を用いて継代し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632(10μM、LCラボラトリーズ)を用いてプレーティングした。
10.0μM、12.5μM、又は14.0μMのML216を、交差を誘発するCRISPR/Cas9と選択カセットを作動させるCreリコンビナーゼとを細胞に導入(トランスフェクション)する12時間前から導入後の48時間の間、細胞に作用させた。具体的には、上述の細胞培養において、DMSOに溶解させたML216を、hESC培地中上記濃度となるように含ませた。
(6-1.19番染色体での片アレル特異的DSBの導入及びホモ接合型細胞の選択)
CRISPR/Cas9(表12に基づくgRNA配列を含むpX330)8μgを、iCreリコンビナーゼプラスミド3μgとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、1300V、20ミリ秒、1パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、100万個のヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞(hiPSCs))にトランスフェクトした。
CRISPR/Cas9(表12に基づくgRNA配列を含むpX330)8μgを、iCreリコンビナーゼプラスミド3μgとともに、Neon(R) Transfection Systemを用いて、1300V、20ミリ秒、1パルスの条件で、エレクトロポレーションにより、100万個のヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞(hiPSCs))にトランスフェクトした。
(1.ホモ接合型細胞の処理)
以下のように、参考例及び実施例で得られたホモ接合型細胞(参考例で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、並びに、実施例で得られたhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+))について、RNA抽出及びcDNA合成、DNA抽出、ホモ接合型細胞のスクリーニング(ジェノタイピング)、交差部位の決定、HLA遺伝子型反対(実施例の場合)、並びにフローサイトメトリーを行った。
総RNAサンプルは、RNeasy Plus Micfro Kit(QIAGEN)を用いて細胞から調製した。 SuperScriptIII(Invitrogen)を用い、50℃で60分間、ランダムヘキサマープライマーを用いて800ngの全RNAから一本鎖cDNAを合成した。
細胞を溶解緩衝液(10mMTrisHCl、pH8.0、1mMEDTA、X1SSC、1%SDS、及び200μg/mlプロテイナーゼK)中、55℃で一晩インキュベートした。DNA抽出キットDNeasy(R)(Qiagen)を用いてhiPSCからDNAを抽出した。
(1-3-1.19番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニング)
選択後のhiPSCコロニーから抽出したDNAについて、以下のプライマー(AAVS1-C-F、AAVS1-C-R、及びPuro-L2)を用いて競合的PCRを行った。PCR条件は、94℃2分(98℃10秒、68℃1.5分)x35サイクル、及び72℃7分であった。
選択後のhiPSCコロニーから抽出したDNAについて、以下のプライマー(chr6-TG-check-up-outside、chr6-TG-check-low-outside、及びPuro-L2)を用いて競合的PCRを行った。PCR条件は、94℃2分(98℃10秒、68℃2分10秒)x35サイクル、及び72℃7分であった。
まず、染色体交差を起す前の細胞からゲノムDNAを抽出し、2本の染色体で配列が異なっている(ヘテロ状態)SNPを同定した。また、交差反応が起きた後に、競合的PCRによって同定された陽性クローンからゲノムDNAを抽出し、当該SNP部位を解析し、配列が一種類(ホモ状態)へ変化しているかどうかを解析した。解析の結果、ヘテロ状態のSNP部位とホモ状態のSNP部位との中間位置を交差部位(CO)として決定した。
まず、グループ特異的プライマー(LABType SSO HLA A Locus、LABType SSO HLA B Locus、LABType SSO HLA C Locus、及びLABType SSO HLA DRB1)を用いて標的DNAをPCR増幅した。R-フィコエリトリン結合ストレプトアビジンを用いた検出のため、PCR産物をビオチン化した。PCR産物を変性させ、蛍光ビーズ(One Lamda)と結合したcDNAプローブに再ハイブリダイズさせた。LABScan 100(Luminex(R) 100)フロー分析器によって、各ビーズ上のフィコエリトリンの蛍光強度を同定した。陽性および陰性ビーズIDのパターンをLABTypeSSOワークシートまたはHLA Fusion 4.1 HotFix 2の情報と照合することにより、試料中のHLA対立遺伝子または対立遺伝子群を決定した。
hiPSC懸濁液を、1%(wt/vol)のウシ血清アルブミン及び0.05%(v/v)アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで氷上で30分間、適切な抗体と共にインキュベートした。試料は、BD FACSCanto II(BD Biosciences)を用いて分析した。データは、FlowJoソフトウェア(Tomy Digital Biology)を用いて分析した。フローサイトメトリーに使用した抗体は、FITC結合抗HLA-A2抗体(BioLegend、343303)、抗HLA-A32/25モノクローナルIgM抗体(One Lamda、0136HA)、およびAlexa Fluor 647結合ヤギ抗マウスIgM(Abcam ab150123)であった。
(2-1.ホモ接合型細胞のスクリーニング結果(ジェノタイピング結果))
Tet offを用いた参考例において、19番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合PCRの結果を図9に示す。野生型対立遺伝子は275bpで検出され、ネオマイシン選択性対立遺伝子は407bpで検出され、ピューロマイシン選択性対立遺伝子は1435bpで検出された。野生型バンドが検出されず、ネオマイシン選択性及びピューロマイシン選択性の両方について陽性を示す407bpと1435bpとの両バンドのみが検出されたクローン(posi)を、目的のホモ接合型細胞として獲得した。なお、407bpと1435bpと共に275bpも併せて検出されたクローンは、本来2本の染色体を4本にしたり、同じ染色体上で選択カセットを複数に増幅させたりすることで生き残ったバックグラウンドクローンである。ML216を用いた実施例において、19番染色体におけるホモ接合型細胞のスクリーニングのために行った競合PCRの結果を図10に示す。図10の結果も図9と同様であり、野生型バンドが検出されず、ネオマイシン選択性及びピューロマイシン選択性の両方について陽性を示す両バンドのみが検出されたクローンを、目的のホモ接合型細胞として獲得した。
(2-2-1.19番染色体における交差部位の解析結果)
図14は、19番染色体における交差部位の分布を示す(参考例)。図14において、×で示されるポイントは、それぞれ、19番染色体セントロメアからの9Mb(35M領域)においてDSBを生じたクローンを示し;▲で示されるポイントは、それぞれ、セントロメアからの14Mb(40M領域)においてDSBを生じたクローンを示し;○で示されるポイントは、それぞれセントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1、45M-2領域)においてDSBを生じたクローンを示す。図15は、19番染色体セントロメアからの9Mb(35M領域)における交差部位の分布を示す(参考例)。図16は、19番染色体セントロメアからの14Mb(40M領域)における交差部位の分布を示す(参考例)。図17は、19番染色体セントロメアからの19Mb-I, 19Mb-II(45M-1、45M-2)における交差部位の分布を示す(参考例)。図18は、ML216によるBLMタンパク質の抑制下における19番染色体セントロメアからの9Mb(35M領域)における交差部位の分布を示す(実施例)。
図19に、6番染色体の短腕の交差前の模式図を示す。二重選択カセットの標的化後、片アレル特異的DSBがHLAクラスIとIIIとの間に導入された。親細胞のHLA遺伝子型は右パネルに示されている。図20に、6番染色体の短腕の交差後の模式図を示す。交差後のHLA遺伝子型が右パネルに示されている。6番染色体においても、DSBを導入した近傍で交差が起きたことが確認された。
図21に、hiPSCにおけるHLA-Aハプロタイプのフローサイトメトリープロファイルを示す(実施例)。図21に示すように、交差を生じさせる前のParental human iPS cellsのハプロタイプはHLA-A領域においてA2とA32のヘテロであったことに対し、ブルーム症候群タンパク質阻害剤(ML216)を用いて交差を起こさせ、この領域にLOHが生じたHLA-homozygouse human iPS cellsのハプロタイプは、HLA-A2のみのホモとなっていることがフローサイトメトリーにより示された。
ジェノタイピングおよびフローサイトメトリーの結果から、染色体交差に関連するLOHがホモ接合型細胞の予想される位置に生じることを実証した。
(1.細胞の処理)
SNPコピー数を分析するために、ゲノムDNAを、親線維芽細胞(parental fibroblast cells;hiPSCsの由来元となる細胞)、hiPSCs、参考例の項目(4)で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+、並びに、参考例及び実施例で得られたホモ接合型細胞(参考例で得られたhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、並びに、実施例で得られたhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+))から単離し、Infinium Omni5-4 v1.2 BeadChip(Illumina)にハイブリダイズさせた。GenomeStudio(Illumina)を用い、一塩基多型(SNP)アレイ分析を行った。
親線維芽細胞(parental fibroblast cells)、hiPSCs、hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+、hiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)、hiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)、及びhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+))についての6番染色体及び19番染色体におけるSNPアレイ分析結果を、それぞれ、図22A~図22Fに示す。図22A~図22Eから明らかなように、DSBが第19染色体の9Mbの位置に導入された場合、親線維芽細胞(parental fibroblast cells)、hiPSCs、及びhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+(図22A~図22C)と対比したhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+Dox(+)9M-CRISPR(+)(図22D)及びhiPSC-AAVS1cNP/+ML216(+)9M-CRISPR(+)(図22E)の結果から、ホモ接合SNPパターンが第19染色体上のDSBに対してテロメア的に観察された。また、図22A~図22C及び図22Fから明らかなように、DSBが第6染色体のHLAの位置に導入された場合、親線維芽細胞(parental fibroblast cells)、hiPSCs、及びhiPSC-BLMtet/tetAAVS1cNP/+(図22A~図22C)と対比したhiPSC-telHLAcNP/+ML216(+)HLA I-III-CRISPR(+)(図22F)の結果から、ホモ接合SNPパターンが第6染色体上のDSBに対してテロメア的に観察された。
配列番号2は、19番染色体40498170-40498189に対するgRNA標的配列である。
配列番号3は、19番染色体44500571-44500590に対するgRNA標的配列である。
配列番号4は、19番染色体44536861-44536880に対するgRNA標的配列である。
配列番号5は、6番染色体2810497-2810516に対するgRNA標的配列である。
Claims (13)
- 以下の工程を含む、ホモ接合型細胞の作製方法:
(A)標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞(但し、ヒト生体内の細胞を除く。)に対し、ブルーム症候群タンパク質阻害剤の存在下で相同染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断の導入を行うことで染色体上の前記標的部位を狙って交差を生じさせることにより、前記標的部位のホモ接合型細胞を得る工程、及び
(B)前記ホモ接合型細胞を選別する工程。 - 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤が、1-(4-フルオロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレア及び/又は1-(4-(1H-ピラゾリル)-3-シアノフェニル)-3-(5-(ピリジン-4-イル)1,3,4-チアジアゾール-2-イル)ウレアである、請求項1に記載の方法。
- 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を3.0~50.0μMの濃度で用いる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を、前記(A)工程の前に、前記ヘテロ接合変異を有する細胞と共存させておく、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記DNA二重鎖切断を、クリスパー(CRISPR)/クリスパー関連ヌクレアーゼ法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)法、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)法から選択されるDNA二重鎖切断法によって行う、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記染色体の片アレル特異的なDNA二重鎖切断の導入を、前記DNA二重鎖切断における認識配列のうち片アレルに多型が存在する認識配列を選択して設計されたベクターを、前記ヘテロ接合変異を有する細胞に導入することによって行う、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(A)工程において、前記相同染色体のアレルの一方又は他方に、一の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子と他の薬剤に対する薬剤耐性遺伝子とを互いに逆方向に配置した配列を有する選択カセットの導入と前記配列の反転とを行い、
前記(B)工程において、前記一の薬剤及び前記他の薬剤の両方に耐性である細胞を、前記標的部位のホモ接合型細胞として選別する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記(A)工程において、前記選択カセットをトランスポゾンベクターに組み込んで導入し、
前記(B)工程の後に、再切り出し用トランスポゼースによって前記選択カセットを除去する、請求項7に記載の方法。 - 前記(A)工程において、前記選択カセットの両方又は片方にインシュレーター配列を導入する、請求項7または8に記載の方法。
- 前記標的部位が主要組織適合抗原の遺伝子座である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的部位にヘテロ接合変異を有する細胞が二倍体細胞である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二倍体細胞がヒト由来細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記ブルーム症候群タンパク質阻害剤を12.0~13.0μMの濃度で用いる、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018089779 | 2018-05-08 | ||
JP2018089779 | 2018-05-08 | ||
PCT/JP2019/018379 WO2019216338A1 (ja) | 2018-05-08 | 2019-05-08 | ホモ接合型細胞の作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019216338A1 JPWO2019216338A1 (ja) | 2021-07-15 |
JP7055469B2 true JP7055469B2 (ja) | 2022-04-18 |
Family
ID=68467469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020518315A Active JP7055469B2 (ja) | 2018-05-08 | 2019-05-08 | ホモ接合型細胞の作製方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210230637A1 (ja) |
EP (1) | EP3792347A4 (ja) |
JP (1) | JP7055469B2 (ja) |
CN (1) | CN112218945A (ja) |
WO (1) | WO2019216338A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021206054A1 (ja) * | 2020-04-06 | 2021-10-14 | 株式会社Logomix | ゲノム改変方法及びゲノム改変キット |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040033596A1 (en) | 2002-05-02 | 2004-02-19 | Threadgill David W. | In vitro mutagenesis, phenotyping, and gene mapping |
WO2004022741A1 (ja) | 2002-09-03 | 2004-03-18 | Japan Science And Technology Agency | 哺乳類人工染色体 |
JP2015523098A (ja) | 2012-07-31 | 2015-08-13 | リコンビネティクス・インコーポレイテッドRecombinetics,Inc. | 対立遺伝子置換によるfmdv抵抗性家畜の産生 |
JP2017535292A (ja) | 2014-11-17 | 2017-11-30 | アディセット バイオ, インコーポレイテッド | 改変γδT細胞 |
US20180016601A1 (en) | 2015-01-15 | 2018-01-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for Modulating Genome Editing |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080318804A1 (en) * | 2004-06-08 | 2008-12-25 | Osaka University | Es Cell Mutation Method and System |
US20150376707A1 (en) * | 2007-05-18 | 2015-12-31 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods of diagnosing and treating inflammatory bowel disease |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
BR112017010547A2 (pt) * | 2014-11-21 | 2018-02-27 | Regeneron Pharma | métodos para produção de uma modificação bialélica, modificação de um genoma dentro de uma célula, produção de uma geração f0 de um animal não humano e identificação de uma inserção de um inserto de ácido nucleico. |
US11905521B2 (en) * | 2015-11-17 | 2024-02-20 | The Chinese University Of Hong Kong | Methods and systems for targeted gene manipulation |
-
2019
- 2019-05-08 WO PCT/JP2019/018379 patent/WO2019216338A1/ja active Search and Examination
- 2019-05-08 CN CN201980029832.7A patent/CN112218945A/zh active Pending
- 2019-05-08 EP EP19799779.4A patent/EP3792347A4/en not_active Withdrawn
- 2019-05-08 JP JP2020518315A patent/JP7055469B2/ja active Active
- 2019-05-08 US US17/053,530 patent/US20210230637A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040033596A1 (en) | 2002-05-02 | 2004-02-19 | Threadgill David W. | In vitro mutagenesis, phenotyping, and gene mapping |
WO2004022741A1 (ja) | 2002-09-03 | 2004-03-18 | Japan Science And Technology Agency | 哺乳類人工染色体 |
JP2015523098A (ja) | 2012-07-31 | 2015-08-13 | リコンビネティクス・インコーポレイテッドRecombinetics,Inc. | 対立遺伝子置換によるfmdv抵抗性家畜の産生 |
JP2017535292A (ja) | 2014-11-17 | 2017-11-30 | アディセット バイオ, インコーポレイテッド | 改変γδT細胞 |
US20180016601A1 (en) | 2015-01-15 | 2018-01-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for Modulating Genome Editing |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2013) Vol.23, pp.5660-5666 |
Guide-it Genotype Confirmation Kit, タカラバイオ株式会社 [online], pp.1-2, 2015.03 [検索日 2020.02.04],URL: http://www.takara-bio.co.jp/goods/catalog/pdf/guide-it_genotype_confirmation_kit.pdf |
Nature (2004) Vol.429, pp.896-899 |
Nature Biotechnology (2015) Vol.33, No.2, pp.198-203, ONLINE METHODS |
Nature Genetics (2000) Vol.26, pp.424-429 |
Nature Methods (2011) Vol.8, No.12, pp.1071-1077 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019216338A1 (ja) | 2019-11-14 |
EP3792347A4 (en) | 2021-11-10 |
CN112218945A (zh) | 2021-01-12 |
JPWO2019216338A1 (ja) | 2021-07-15 |
US20210230637A1 (en) | 2021-07-29 |
EP3792347A1 (en) | 2021-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sakurai et al. | A single blastocyst assay optimized for detecting CRISPR/Cas9 system-induced indel mutations in mice | |
JP6948718B2 (ja) | ゲノム編集方法 | |
MX2014015204A (es) | Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional. | |
WO2018227755A1 (zh) | 用于特异性修复人hbb基因突变的碱基编辑系统、方法、试剂盒及其应用 | |
JP2011045380A (ja) | トラップベクター及びこれを用いた遺伝子トラップ法 | |
EP1642970A1 (en) | Method of preparing transgenic organism with use of methylation and system therefor | |
Isiaku et al. | Transient, flexible gene editing in zebrafish neutrophils and macrophages for determination of cell-autonomous functions | |
Boyd et al. | Molecular biology of transgenic animals | |
Kannan et al. | Dynamic silencing of somatic L1 retrotransposon insertions reflects the developmental and cellular contexts of their genomic integration | |
JP2019507610A (ja) | CRISPR−Casゲノム編集に基づく、Fel d1ノックアウト並びに関連組成物及び方法 | |
Keng et al. | Efficient transposition of Tol2 in the mouse germline | |
JP7055469B2 (ja) | ホモ接合型細胞の作製方法 | |
Ma et al. | Building Cre knockin rat lines using CRISPR/Cas9 | |
JP7426101B2 (ja) | ゲノム編集された細胞を製造する方法 | |
KR20220033468A (ko) | 강화된 이종이식편 생존 및/또는 내성을 위한 하나 이상의 변형된 유전자를 갖는 세포, 조직, 장기 및/또는 동물 | |
JP2004530429A (ja) | 転写活性な座を標的化する方法 | |
Zeidler et al. | Transgene recombineering in bacterial artificial chromosomes | |
US20080104723A1 (en) | Development of Mammalian Genome Modification Technique Using Retrotransposon | |
Michalski et al. | Generation of a new frizzled 2 flox mouse model to clarify its role in development | |
Pravtcheva et al. | Timing of paternal Pgk-1 expression in embryos of transgenic mice | |
Suzuki et al. | Seamless Gene Correction in the Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Locus by Vector Replacement and Vector Insertion Events | |
TW201840849A (zh) | 編輯核酸序列之組成物及方法 | |
Dicke et al. | A protocol for locating and counting transgenic sequences from laboratory animals using a map-then-capture (MapCap) sequencing workflow: procedure and application of results | |
WO2023191063A1 (ja) | 遺伝子工学、細胞工学、および細胞医薬に適した細胞およびその製造方法 | |
US20230039930A1 (en) | Methods and compositions for binding immunoglobulin protein targeting |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20201020 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201020 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210928 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211125 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220315 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220330 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7055469 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |