MX2014015204A - Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional. - Google Patents
Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.Info
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Abstract
La invención proporciona métodos y composiciones para generar alelos de inhibición (knock-out) condicionales que utilizan nucleasas específicas de secuencia.
Description
MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA GENERAR ALELOS CON INACTIVACIÓN
CONDICIONAL
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense N.° 61/658,670, presentada el 12 de junio de 2012, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se presentó en formato ASCII a través de la EFS-Web y se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Dicha copia de ASCII, creada el 12 de junio de 2013, se denomina P4905RlWO_PCTSequenceListing.txt y tiene un tamaño de 49214 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos nuevos para producir alelos con inactivación condicional genéticamente modificados.
ANTECEDENTES
La inhibición selectiva o mejora de la expresión génica individual ha colaborado enormemente con el estudio de la función génica in vitro e in vivo. El direccionamiento génico de células madre embriónicas murinas usando la recombinación homologa es un método bien asentado para la manipulación de genomas murinos y ha permitido la creación de ratones mutantes o "con inactivación" con respecto a un gen en investigación. Más recientemente, la teenología con inactivación inducible o condicional ha avanzado en el estudio de genes que, cuando se eliminan sistemáticamente, dan lugar a la mortalidad perinatal o embriónica ((por ejemplo, Lakso, M. et ál . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 89:6232-36 (1992); Jacks, T. et ál . , Nature 359:295-300 (1992)). También se pueden utilizar ratones con inactivación condicional para estudiar los efectos de la eliminación de un gen en forma selectiva en un tejido particular, mientras deja su función intacta en otros tejidos. Sin embargo, los métodos convencionales para crear animales con inactivación condicional son trabajosos, ineficaces y necesitan la disponibilidad de células madre embriónicas.
Se han utilizado nucleasas específicas para secuencias modificadas para crear alelos con inactivación. Los ejemplos de dichas endonucleasas específicas para secuencias incluyen nucleasas con dedos de zinc (ZFN), que se componen de dominios de unión al ADN específicos para secuencias fusionadas con el dominio efector de endonucleasas (Porteus, M.H. and Caroll, D., Nat . Biotechnol . 23, 967-973 (2005).
Otro ejemplo de nucleasas específicas para secuencias son las nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN), que se componen de un dominio de nucleasa fusionado con proteínas efectoras TAL (Miller, J.C. et ál . , Nat . Biotechnol . 29, 143-148 (2011); Cermak, T. et ál . , Nucleic Acid Res. 39, e82 (2011)). Las endonucleasas específicas para secuencias son modulares por naturaleza y la especificidad de unión al ADN se obtiene al arreglar uno o más módulos. Por ejemplo, los dominios con dedos de zinc en ZFN reconocen cada uno tres pares de bases (Bibikova, M. et ál . , Mol . Cell . Biol . 21, 289-297 (2001)), mientras que los dominios TAL individuales en TALEN reconocen cada uno un par de base mediante un código único (Boch, J. et ál . , Science 326, 1509-1512 (2009).) Otro ejemplo de nucleasas específicas para secuencias incluye nucleasa de ADN guidas por ARN, por ejemplo, el sistema CRISPR/Cas.
Se ha utilizado la edición de ZFN, TALEN y más recientemente, el gen mediado por CRISPR/Cas para generar alelos con inactivación génica en forma eficiente y directa (Geurts, A. M. et ál . , Science 325, 433 (2009); Mashimo, T. et ál., PLoS ONE 5, e8870 (2010); Carbery, I. D. et ál . , Genetics 186, 451-459 (2010); Tesson, L., et ál . , Nat . Biotech. 29, 695-696 (2011). Se cree que los alelos con inactivación producen una unión de extremos no homólogos (NHEJ) propensos a errores del daño de cadena doble (DSB, por sus siglas en inglés) mediada por endonucleasas.
Recientemente, las ZFN se utilizaron en forma exitosa para la inserción dirigida (activación) de un gen reportero mediante la recombinación homologa del locus cromosómico dirigido con un ADN donante tanto en ratones como en ratas (Mcyer, M., et ál . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 107, 15022-15026 (2010); Cui, X. et ál . , Nat . Biotechnol . 29(1), 64-67 (2010)). Se ha propuesto que la inserción específica para secuencias de la secuencia donante se produzca mediante un modelo de hibridación de cadenas dependientes de síntesis (SDSA por sus siglas en inglés) de reparación del daño de cadena doble mediante recombinación homologa entre el donante y el locus en el que se produce el daño de cadena doble (Moehle, E. A. et ál., Proc Nati Acad Sci EUA 104, 3055-3060 (2007)). De
acuerdo a este modelo, luego del daño de cadena doble mediada por endonucleasas y la resección de cadenas, los extremos del cromosoma de cadena simple se híbrida a las regiones de homología presentes en el ADN donante seguido de la síntesis usando la inserción donante como base.
Pese a estos avances, siguen siendo necesarios en la téenica nuevos métodos para crear alelos con inactivación condicional y para extender esta tecnología a otras especies. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios.
COMPENDIO
La presente invención se refiere a métodos y composiciones nuevas para generar alelos con inactivación condicional. Específicamente, la presente invención se refiere al uso específico de construcciones donantes junto con nucleasas específicas para secuencias con el fin de generar alelos con inactivación condicional.
En un aspecto, se proporciona un método para generar un alelo con inactivación condicional en una célula que comprende un gen diana. El método comprende las etapas de
1.introducción en la célula de una construcción donante, donde la construcción donante comprende una región 5' de homología, un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región 3' de homología, donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral; y
2.introducción en la célula de una nucleasa específica para una secuencia que híbrida una secuencia dentro del gen diana, lo que produce de este modo un alelo con inactivación condicional en la célula.
En determinadas modalidades, la nucleasa específica para secuencias es una nuclease con dedos de zinc (ZFN), un dímero ZFN, una nuclease efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa de ADN guiada por ARN. En determinadas modalidades, la nucleasa específica de secuencias escinde el gen diana una sola vez. En determinadas modalidades, se introduce la nucleasa específica para secuencias en la célula como una proteína, ARNm o ADNc.
En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio loxP, un sitio rox o un sitio frt .
En determinadas modalidades, la secuencia donante comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
diez, once o doce mutaciones neutrales. En determinadas modalidades, la homología entre la secuencia donante y la secuencia diana es de 51-99 %. En determinadas modalidades, la homología entre la secuencia donante y la secuencia diana es de 78 %. En determinadas modalidades, la construcción donante comprende la secuencia que se muestra en la FIG.4A-1 y 4A-2 o la FIG.4B-1 y 4B-2. En determinadas modalidades, la región de homología 5' comprende al menos 1,1 kb y donde la región de homología 3' comprende al menos 1 kb . En determinadas modalidades, el gen diana es Lrp5.
En una modalidad adicional, la célula es una célula de mamífero. En determinadas modalidades, la célula de mamífero es una célula de ratón, rata, conejo, hámster, gato, perro, oveja, caballo, vaca, mono o célula humana. En determinadas modalidades, la célula es de un animal no humano. En determinadas modalidades, la célula es una célula somática, un cigoto o una célula madre pluripotente.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para generar un animal con inactivación condicional, el método comprende las etapas de:
1.introducción de una construcción donante en una célula que comprende un gen diana, donde la construcción donante comprende una región de homología 5', un sitio
de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3', donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral;
2.introducción de una nucleasa específica de secuencias en una célula, donde la nucleasa escinde al gen diana; e
3.introducción de la célula en un animal portador para producir el animal con inactivación condicional desde la célula.
En algunas modalidades, el animal es un ratón, rata, conejo, hámster, cobayo, perro, oveja, cerdo, caballo, vaca o mono. En determinadas modalidades, la célula es de un animal no humano. En algunas modalidades, la célula es un cigoto o una célula madre pluripotente.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para generar un animal con inactivación, el método que comprende las etapas de:
1.introducción de una construcción donante en un cigoto que comprende un gen diana, donde la construcción donante comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y
una región de homología 3', donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral;
2.introducción de una nucleasa específica de secuencias en el cigoto donde la nucleasa escinde al gen diana;
3.introducción del cigoto en un animal portador para producir un animal con inactivación condicional desde el cigoto; y
4. reproducción del animal con inactivación condicional con un animal transgenico que tenga un transgén que codifique una recombinasa que catalice la recombinación en los sitios de reconocimiento de recombinasas 5' y 3', produciendo así el animal con inactivación.
En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio loxP y la recombinasa es recombinasa Cre. En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio frt y la recombinasa es flipasa. En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio rox y la recombinasa es recombinasa Dre. En determinadas modalidades, el transgén que codifica la recombinasa está bajo el control de un promotor específico para un te j ido .
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición para generar un alelo con inactivación condicional de un gen diana, que comprende:
1.una construcción donante que comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3', donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral; y
2.una nucleasa específica para una secuencia que reconoce el gen diana.
En determinadas modalidades, la nucleasa específica para secuencias es una ZFN, un dímero ZFN, una ZFNickasa, una TALEN o una endonucleasa de ADN guiada por ARN. En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio loxP, un sitio frt o un sitio rox.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una construcción donante que comprende la secuencia que se muestra en la FIG.4A-1 y 4A-2 (SEQ ID NO: 30), la FIG.4B-1 y 4B-2 (SEQ ID NO: 31) O la FIG.14C (SEQ ID NOS: 44-46).
En un aspecto adicional de la invención, una célula que comprende la construcción donante que comprende la secuencia se muestra en la FIG.4A-1 y 4A-2 (SEQ ID NO: 30), la FIG.4B
o la FIG. 14C (SEQ ID NOS: 44-46). En determinadas modalidades, la célula es una célula de mamífero. En determinadas modalidades, la célula de mamífero es una célula de ratón, rata, conejo, hámster, gato, perro, oveja, caballo, vaca, mono o célula humana. En determinadas modalidades, la célula es de un animal no humano. En determinadas modalidades, la célula es una célula somática, un cigoto o una célula madre pluripotente.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un animal con inactivación condicional no humano preparado de acuerdo con el método descrito en la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG.1 muestra la distribución de los alelos Lrp5 mutantes mediados por ZFN en ratones nacidos vivos. El tamaño de las eliminaciones e inserciones se indican en pares de base en el eje x. Compuesto KO: animales con dos alelos independientes del mismo gen y sin alelos de tipo salvaje detectables del gen; múltiples alelos: animales quiméricos que llevan más de dos alelos; SKG->WTD: eliminación de TCCAAGGGT (el sitio de corte de ZFN se encuentra subrayado).
Las FIGS.2A-2E muestran fenotipos vasculares de ratones de 2 meses de edad con eliminaciones compuestas dentro del marco y
fuera del marco en Lrp5. 542: ratón heterocigoto funcional quimérico (control) que portaba un alelo con una eliminación de 3 bp dentro del marco que parecía ser silencioso y un alelo con una eliminación de 1 bp fuera del marco; 495: ratón que portaba un alelo de eliminación de 4 bp fuera del marco y un alelo de eliminación de lbp fuera del marco; 519: ratón que portaba un alelo de eliminación de 29 bp fuera del marco y un alelo de eliminación de 17 bp fuera del marco; 555: ratón heterocigoto funcional que portaba un alelo de eliminación de 3 bp dentro del marco y un alelo de eliminación de 1 bp fuera del marco que es un heterocigoto funcional; FA: angiografía fluorescente; IB4: isolectina B4;
NFL: capa de fibras nerviosas; IPL: capa plexiforme interna; OPL: capa plexiforme externa.
Las FIGS.3A-3B muestran alelos con inactivación condicional a partir de la comicroinyección o coelectroporación de los ZFN del exón 2 Lrp5 y el plásmido donante. La FIG.3A muestra una reparación del daño de cadena doble esquemático mediante la hibridación de cadenas dependiente de la síntesis. Las puntas de las flechas representan los sitio de reconocimiento de recombinasas; la flecha grande en la Etapa 1 representa la secuencia diana; la flecha grande con asteriscos representa la secuencia donante; los asteriscos representan las
mutaciones neutrales; las flechas por la mitad indican las posiciones del cebador. La FIG.3B muestra los resultados de un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN aislado a partir de las muestras de colas de las crías (panel izquierdo) o celulas ES (panel derecho). Los pares de cebadores respectivos utilizados para el análisis se indican a la izquierda (las posiciones de los cebadores son como se muestran en la FIG.3A).
Las Figuras 4A-1-4C-1 muestran las secuencias donantes (SEQ ID NOS: 30-32, respectivamente, en orden de aparición) que se utilizaron en los plásmidos en la orientación correcta y con secuencias que flanquean las inserciones.
Las Figuras 5A-5B muestran una alineación de secuencia de los tres donantes de ADN Lrp5 CKO de los sitios loxP 5' a 3' (SEQ ID NOS 33-35, respectivamente, en orden de aparición). Las letras mayúsculas en negrita indican sitios loxP; las letras minúsculas indican secuencias de intrones; las letras mayúsculas indican secuencias de exones 2 (de tipo salvaje o modificados); las líneas punteadas indican los sitios de unión de ZFN; las líneas punteadas sólidas indican mutaciones silenciosas; las letras subrayadas indican la secuencia en la que se escinde el exón 2 de tipo salvaje mediante ZFN.
Las Figuras 6A-6E muestran los fenotipos retínales normales de los ratones que llevan un alelo con inactivación condicional Lrp5 modificado por codones. Las Figuras 6A-6D muestran proyecciones confocales de preparación completa de retinas teñidas con isolectina B4 (barras a escala: 50 mm). La Figura 6E muestra cortes transversales de retina de los ojos opuestos con respecto a los representados en la Figuras 6A-6D, teñidos con IB4, MECA32 y DAPI. Las flechas señalan el ejemplo que tiñe tal como se indica. +/+: control de tipo salvaje; KO/KO: inactivación homocigota Lrp5,- KO/+: inactivación heterocigota Lrp5; CKO/KO: inactivación condicional Lrp5 /inactivación de compuesto heterocigoto Lrp5; IB4: isolectina B4; NFL; capa de fibras nerviosas; IPL: capa plexiforme interna; OPL: capa plexiforme externa.
Las Figuras 7A-7D muestran una representación gráfica del posible mecanismo que produjo cado uno de los alelos Lrp5 derivados de donantes observados. Se indican los cebadores que se unen a los alelos resultantes. Las mutaciones neutrales se indican por medio de asteriscos.
La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo SURVEYOR seguido de la introducción de pares con dedos de zinc (pZFNl+pZFN2) o Cas9 (+pRK5-hCas9) junto con un ARN guía que dirige al exón 2 Lrp5 (p_ARNg T2, p_ARNg T5 o p_ARNg T7) o un
plásmido de control (PMAXGFP) en las células N1H/3T3 o células Hepal-6.
Las Figuras 9A-9B ilustran un resumen de tasas de las mutaciones ARNg/Cas9 (figura 9A) y tamaños de las eliminaciones (figura 9B) en el locus genómico del exón 2 Lrp5 en las células hepatomas murinas Hepal-6. Las células recibieron un ARNg que dirige Lrp5 junto con un ARNm (ARNm Cas9 + ARNg T2, barras oscuras) o un plásmido (plásmido Cas9 + ARNg T2, barras claras) o dos plásmidos que codifican pares con dedos de zinc que dirigen el exón 2 de Lrp5 (plásmido ZFN, barras grises).
La Figura 10 muestra el resultado del análisis de PCR usando un cebador directo específico de secuencias C0exon2 y un cebador inverso fuera del brazo de homología en el locus genómico para identificar la integración del exón donante en el locus Lrp5. Las células murinas Hepal-6 recibieron plásmido (pRK5-hCas9) o ARNm (ARNm hCas9) que codifica Cas9 junto con un ARN guía solo (p_ARNg T2), el ARN guía y el plásmido donante (p_ARNg T2+ p_donantel) o un plásmido de control (PMAXGFP). Algunas células recibieron el donante junto con el par con dedos de zinc Lrp5
(pZFNl+pZFN2+p_donantel).
La Figura 11 muestra el resultado del análisis PCR usando cebadores que detectan la integración del sitio loxP 5' (superior, cebadores P9 y PIO) y 3' (inferior, por codones, cebadores Pll y P12) en el locus genómico Lrp5. Los grupos de tratamiento son como se describen en la FIG.10. Se utilizó el ADN de una inactivación condicional Lrp5 heterocigota (ratón CKO/en peso) como control positivo.
La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo SURVEYOR que sigue la introducción de Cas9 (p_hCas9) junto con un ARN guía y correspondiente construcción donante que direcciona Lrp5 ( Lrp5 exón 2; p_ARNg T7 + p_Lrp5_donantel), UsplO ( UsplO exóx3; p_ARNg TI + p_UsplO_donantel) o Notch3 (Notch3 exón3; p_ARNg TI + p_Notch3_donantel) en las células Hepal-6.
La Figura 13 muestra el resultado del análisis PCR usando cebadores que detectan la integración del sitio loxP 5' en el locus genómico exón2 Nnmt (panel izquierdo), cebadores P26 y P27) o integración del sitio loxP 3' en el locus genómico exón3 Notch3 (panel derecho, cebadores P25 y P28) siguiendo Cas9/ARNg y la administración del donante.
Las Figuras 14A-14D muestran las secuencias (SEQ ID NOS: 36-46, respectivamente, en orden de aparición) para el direccionamiento Cas9/CRISPR del ratón Lrp5, UsplO, Nnmt , y loci genómicos Notch3. Se muestran secuencias para secuencias
específicas de ARN guía (ARNg) para Lrp5 , UsplO, Nnmt , y Notch3 y secuencias de plásmido donante para UsplO, Nnmt , y Notch3. Además, se muestra una secuencia de Cas9 ADNc para la expresión mamífera y la transcripción (ARNm) in vitro.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES DE LA INVENCIÓN
I. DEFINICIONES
A los efectos de interpretar la presente memoria descriptiva, aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea necesario, un término utilizado en singular también incluirá el plural y viceversa. En el caso que cualquier definición establecida a continuación dé lugar a conflictos con cualquier documento que se incorpora en la presente mediante esta referencia, prevalecerá la definición establecida a continuación.
El término "construcción donante", tal como se utiliza en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un polinucleótido que comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3'. La construcción donante puede incluir también secuencias adicionales, tales como las secuencias que
soportan la propagación de la construcción donante o selección de células que albergan la construcción.
El término "secuencia donante", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un ácido nucleico que tiene una secuencia que comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral en comparación con una parte de la secuencia del gen diana. Como tal, la secuencia donante comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que es básica y funcionalmente similar o indistinguible del que codifica la parte del gen diana. Por consiguiente, la secuencia donante puede reemplazar la parte similar del gen diana en su posición en el gen diana sin cambiar sustancialmente las propiedades funcionales de la proteína codificada por el gen diana. La secuencia donante puede comprender determinadas secuencias no codificadoras, tales como las secuencias intrónicas o reguladoras.
El término "región de homología", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un ácido nucleico en la construcción donante que es homologa a un ácido nucleico que flanquea una secuencia diana.
El término "sitio de reconocimiento de recombinasas " tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un ácido nucleico en una construcción donante que tiene una secuencia que la recombinasa reconoce.
El término "recombinasa", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una enzima que reconoce secuencias de polinucleótidos específicas (sitio de reconocimiento de recombinasas) que flanquea un polinucleótido interferente y cataliza un intercambio de cadenas recíproco, lo que da lugar a la inversión o escisión del polinucleótido interferente.
El término "gen diana", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un ácido nucleico que codifica un polipéptido dentro de una célula.
La frase "secuencia diana", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una parte del gen diana, por ejemplo, una o más secuencia de exones del gen diana, secuencias intrónicas o secuencias reguladoras del gen diana o una combinación de secuencias de exones e intrones, secuencias reguladoras y de
intrones, secuencias reguladoras y de exones o secuencias reguladoras, de exones e intrones del gen diana.
La frase "endonucleasa específica de secuencias" o "nucleasa específica de secuencias", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una proteína que reconoce y se une a un polinucleótido, por ejemplo, un gen diana en una secuencia de nucleótidos específica y cataliza un daño de cadena doble y simple en el polinucleótido.
La frase "nucleasa de ADN guiada por ARN" o "nucleasa de ADN guiada por ARN" o "endonucleasa guiada por ARN", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una proteína que reconoce y se une a un ARN guía y un polinucleótido, por ejemplo, un gen diana en una secuencia de nucleótidos específica y cataliza un daño de cadena doble y simple en el polinucleótido.
La frase "alelo con inactivación condicional" tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un alelo que comprende una secuencia de polinucleótidos que está flanqueada por los sitios de reconocimiento de recombinasas pero produce un fenotipo que es indistinguible del que produce el alelo de tipo salvaje similar.
El término "mutación neutral", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una mutación en una secuencia donante que reduce la homología general entre la secuencia donante y la secuencia diana pero permite que la secuencia donante sea capaz de codificar un polipéptido funcional. Los ejemplos de mutaciones neutrales incluyen mutaciones silenciosas, es decir, mutaciones que alteran la secuencia de nucleótidos pero no la secuencia de polipéptidos codificados. Los ejemplos de mutaciones neutrales también incluyen mutaciones conservadoras, tales como las mutaciones puntuales (por ejemplo, sustituciones), inserciones y eliminaciones, es decir, mutaciones que alteran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de polipéptidos codificados pero no alteran sustancialmente la función del polipéptido resultante. Los ejemplos de mutaciones de sustitución conservadoras se muestran en la Tabla 8. Las mutaciones neutrales pueden incluir también combinaciones de mutaciones silenciosas, combinaciones de mutaciones conservadoras o combinaciones de mutaciones conservadoras y silenciosas.
El término "animal", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a un animal no humano que incluye, de modo no
taxativo, animales domesticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, primates no humanos tales como los monos), conejos, peces, roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, cobayos) y no vertebrados (por ejemplo, Drosophila melanogaster y Caenorhabdi tis elegans) .
Un ácido nucleico "aislado" hace referencia, a menos que específicamente se indique de otra manera, a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
"Ácido nucleico aislado que codifica una proteína" hace referencia, a menos que específicamente se indique de otra manera, a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas (o fragmentos de estas), lo que incluye dichas moléculas de ácido nucleico en un único vector o en vectores separados y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
La frase "homología de secuencia", tal como se usa en la presente con respecto a las secuencias de polinucleótidos del gen diana o donante, se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia donante que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia del gen diana luego de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos se puede lograr de varias maneras conocidas por el experto en la téenica, por ejemplo, mediante el uso de softwares informáticos disponibles para el público, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o ClustalW2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para alinear las secuencias, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.
MODALIDADES DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere, en parte, al reconocimiento y solución de desafíos técnicos asociados con la creación de alelos con inactivación condicional usando endonucleasas específicas para secuencias junto con una secuencia donante
flanqueada con secuencias de reconocimiento de recombinasas.
Este proceso depende de las secuencias específicas de direccionamiento de moléculas de ácido nucleico, tales como los cromosomas, con endonucleasas que reconocen y se unen a dichas secuencias e inducen un daño de cadena doble en la molécula de ácido nucleico. El daño de cadena doble se repara ya sea mediante la unión de extremos no homólogos propensos a errores o mediante recombinación homologa. Si se proporciona una base para la recombinación homologa in trans, se puede reparar el daño de cadena doble usando la base proporcionada. El daño de cadena doble inicial aumenta la frecuencia de direccionamiento mediante varias órdenes de magnitud, en comparación con el direccionamiento génico basado en la recombinación homologa. En principio, este método se puede utilizar para insertar cualquier secuencia en el sitio de reparación mientras que se flanquee mediante regiones homologas adecuadas de secuencias cercanas al daño de cadena doble. Sin embargo, este enfoque se asocia con determinados desafíos cuando se aplica para crear alelos con inactivación condicional. Los alelos con inactivación condicional incluyen normalmente, determinadas secuencias de reconocimiento de recombinasas, tales como los sitios loxP que flanquean el gen o partes del gen pero dejan la función intacta, de modo que
los alelos con inactivación condicional produzcan polipéptidos funcionales sustancialmente similares para el alelo no modificado pero que se puedan volver no funcionales en un determinado momento o dentro de determinados tejidos mediante la presencia de recombinasas que reconoce las secuencias de reconocimiento.
Un primer desafío que se asocia con el enfoque que se describió anteriormente para crear alelos con inactivación condicional reside en el hecho de que, al seguir el daño de cadena doble catalizado por la endonucleasa específica de secuencias, puede ocurrir una recombinación no deseada entre el exón donante y el exón (diana) cromosómico, en vez de en las regiones de homología fuera del donante que flanquea la secuencia de reconocimiento de recombinasas debido a la identidad de secuencia entre sí. Esto dará lugar a alelos que carecen de una o ambas secuencias de reconocimiento de recombinasas. Un segundo desafío reside en el hecho de que la endonucleasa específica de secuencias puede reconocer y escindir no solo el gen diana sino también el exón donante antes de que pueda servir como una base para la reparación. Los métodos y composiciones que se describen en la presente proporcionan una solución a estos desafíos.
A. Métodos de ejemplo
En varios aspectos de la invención, se proporcionan métodos para generar un alelo con inactivación condicional en una célula que comprende un gen dian . El método comprende las etapas de introducir en una célula que tiene un gen diana, una construcción donante o una nucleasa específica de secuencias que híbrida una secuencia dentro del gen diana pero no inhibe la función de la construcción donante, produciendo así un alelo con inactivación condicional en la célula. Estos y otros aspectos de la invención se describen a continuación.
En un aspecto particular de la invención, se produce un alelo con inactivación condicional en una célula que comprende un gen diana mediante la introducción en la célula de una construcción donante que comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3'. La secuencia donante comprende la secuencia de una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral. En determinadas modalidades, la secuencia donante y la secuencia diana son idénticas salvo al menos una mutación neutral. Una mutación neutral significa
cualquier mutación en la secuencia de nucleótidos de la secuencia donante que reduce la homología entre la secuencia donante y la secuencia diana pero deja la codificación potencial del donante para un polipéptido funcional intacto. La mutación neutral disminuye la cantidad de eventos de recombinación homólogos no deseados, en comparación con una secuencia de tipo salvaje, entre la secuencia donante y la secuencia diana que no dan lugar a un alelo con inactivación condicional (FIG. 7B, 7C, 7D). En algunas modalidades, la mutación neutral también anula la unión de la nucleasa específica de secuencias a la secuencia donante.
Los ejemplos de mutaciones neutrales incluyen mutaciones silenciosas, es decir, mutaciones que alteran la secuencia de nucleótidos pero no la secuencia de polipéptidos codificados. Las mutaciones neutrales también incluyen mutaciones conservadoras, es decir, mutaciones que alteran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de polipéptidos codificados pero no alteran sustancialmente la función del polipéptido resultante. Esto sucede, por ejemplo, cuando un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares (tamaño, carga, etc.). Por ejemplo, es posible agrupar los aminoácidos de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácido: Asp, Glu;
(4) básico: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Los ejemplos de mutaciones conservadoras se muestran en la Tabla 8. En determinadas modalidades, la secuencia donante comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 50 mutaciones silenciosas. En determinadas modalidades, la homología entre la secuencia donante y la secuencia diana es de 99 %, 98 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 78 %, 75 %, 70 %, 65
%, 60 %, 55 % o 50 %. En determinadas modalidades, la homología de secuencia entre la secuencia donante y diana es menor al 50 %. Se puede introducir cualquier cantidad de mutaciones neutrales que reducen o inhiben la cantidad de eventos de recombinación homologa entre la secuencia donante y la secuencia diana (FIG. 7B-7D), en vez de entre las regiones homologas y su secuencia similar en la molécula dirigida, pero mantiene la capacidad de la secuencia donante de codificar un polipéptido funcional. En determinadas modalidades, la donante comprende la secuencia que se muestra
en la FIG.4A-1 y 4A-2 (SEQ ID NO: 30), la FIG.4B-1 y 4B-2
(SEQ ID NO: 31) o la FIG. 14C (SEQ ID NOS: 44-46). En determinadas modalidades, al menos una mutación neutral anula la unión de la nucleasa específica de secuencias a la secuencia donante. En determinadas modalidades, varias mutaciones neutrales se esparcen a lo largo de la longitud de la secuencia donante para reducir la cantidad de pares de bases no modificadas, consecutivas a menos de 20-100 pares de base en cualquier posición en la secuencia donante.
Dado que las mutaciones dentro de la secuencia donante son neutrales, la secuencia donante codifica un polipéptido que es funcional y sustancialmente similar a, o indistinguible del codificado por la secuencia diana. La funcionalidad de un péptido o proteína se puede evaluar mediante métodos muy conocidos en la téenica, tales como ensayos funcionales, ensayos enzimáticos y ensayos bioquímicos. La secuencia donante puede reemplazar la secuencia diana en su posición en el gen diana sin cambiar sustancialmente las propiedades funcionales del polipéptido codificado por el gen diana. Sin embargo, una vez integrado en el gen diana, la remoción posterior de la secuencia donante a partir del gen diana puede dar lugar a la alteración, reducción o pérdida de la función del polipéptido codificado por el gen diana.
Dentro de la construcción donante, la secuencia donante se flanquea 5' y 3' mediante los sitios de reconocimiento de recombinasas. Estos sitios de reconocimiento de recombinasas son secuencias de ácido nucleico dentro de la construcción donante que se reconoce mediante una recombinasa que cataliza posteriormente la recombinación en los sitios de reconocimiento de la recombinación. La recombinación específica de secuencias es muy conocida en la téenica e incluye la hibridación específica de secuencias mediada por la recombinasa y la ligación de un polinucleótido flanqueado por los sitios de reconocimiento de la recombinasa. Los ejemplos de sitios de reconocimiento de recombinasas incluyen los sitios loxP (locus de X-sobre Pl) (Hoess et ál . , Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 79:3398-3401 (1982)), sitios frt (McLeod, M., Craft, S. & Broach, J. R., Molecular and Cellular Biology 6, 3357-3367 (1986)) y sitios rox (Sauer, B. y McDermott, J., Nucleic Acids Res 32, 6086-6095 (2004)).
La región de homología 5' se ubica a 5' o es "anterior" al sitio de reconocimiento de recombinasas 5' y es homologa a un ácido nucleico que flanquea la secuencia diana en su contexto de nucleótidos. De forma similar, la región de homología 3' se ubica a 3' o es "posterior" al sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y es homologa a un ácido nucleico que
flanquea la secuencia diana. En una modalidad, las regiones de homología tienen más de 30 bp, preferentemente varios kb de longitud. Por ejemplo, las regiones de homología pueden tener 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 500 bp, 800 bp, 1 kb, 1,1 kb, 1,5 kb, 2 kb y 5 kb de longitud. En determinadas modalidades, la región de homología 5' comprende 1,1 kb y la región de homología 3' comprende 1 kb. Las regiones de homología pueden ser homologas para las regiones del gen diana y también o al contrario, ser homologas para las regiones anteriores o posteriores del gen diana. En una modalidad, las regiones de homología son homologas para las regiones cromosómicas inmediatamente adyacentes a la secuencia diana. Por ejemplo, en el caso de la región de homología 5', la región de homología es homologa a una secuencia que tiene su nucleótido 3' mayor inmediatamente adyacente al primer nucleótido (5' mayor) de la secuencia diana. En una modalidad, las regiones de homología son homologas con respecto a las regiones cromosómicas que no están inmediatamente adyacentes a la secuencia diana en el cromosoma. En algunas modalidades, las regiones 5' y 3' son cada una 95-100 % homologas a las secuencias de ácido nucleico similares que flanquean la secuencia diana.
Para resumir el arreglo del componente descrito anteriormente, la construcción donante comprende, en orden de 5' a 3,' una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3'. La construcción donante puede incluir además determinadas secuencias que proporcionan soporte funcional o estructural, tales como las secuencias de un plásmido u otro vector que soporta la propagación de la construcción donante (por ejemplo, el vector pUC19). La construcción donante puede, opcionalmente, incluir además determinados marcadores o reporteros seleccionables, algunos de los que pueden flanquearse mediante los sitios de reconocimiento de recombinasas para la activación, inactivación o eliminación posterior. Los sitios de reconocimiento de recombinasas que flanquean al marcador o reportero opcional pueden ser iguales o distintos a los sitios de reconocimiento de recombinasas que flanquean la secuencia donante. En determinadas modalidades, se utiliza un único tipo de construcción donante para producir el alelo con inactivación condicional. Simultáneamente o en forma secuencial a la introducción de la construcción donante, se introduce una nucleasa específica para secuencias en la célula. La nucleasa específica de
secuencias reconoce y se une a una secuencia dentro del gen diana e introduce un daño de cadena doble en el gen diana. Como se describió anteriormente, la secuencia donante se modifica por medio de al menos una mutación neutral para reducir los eventos de recombinación homólogos que no tienen como resultado alelos con inactivación condicional. En determinadas modalidades, la nucleasa específica de secuencias escinde el gen diana una vez, es decir, se introduce un daño de cadena doble en el gen diana durante los métodos que se describen en la presente.
Los ejemplos de nucleasas específicas de secuencias incluyen las nucleasas con dedos de zinc (ZFN). Las ZFN son proteínas recombinantes compuestas de dominios de proteínas con dedos de zinc de unión al ADN y de dominios de nucleasa efectora. Los dominios de proteínas con dedos de zinc son dominios de proteínas ubicuas, por ejemplo, asociados con los factores de transcripción que reconocen y se unen a las secuencias de ADN específicas. Uno de los dominios de "dedos" puede estar compuesto de aproximadamente treinta aminoácidos que incluye residuos de histidina invariables en complejo con zinc. Si bien hasta ahora se han identificado 10 000 secuencias con dedos de zinc, la gama de proteínas con dedos de zinc se ha ampliado adicionalmente mediante sustituciones de aminoácidos
dirigidos en los dominios con dedos de zinc para crear nuevas proteínas con dedos de zinc diseñadas para reconocer una secuencia de nucleótidos de interés específica. Por ejemplo, se han utilizado bibliotecas que exhiben fagos para analizar las bibliotecas combinatorias con dedos de zinc para determinar la especificidad de la secuencia deseada (Rebar et ál . , Science 263:671-673 (1994); Jameson et ál . , Biochemistry 33:5689-5695 (1994); Choo et ál., PNAS 91:11163-11167 (1994), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad a la presente tal como se establece). Las proteínas con dedos de zinc con la especificidad de secuencia deseada se pueden unir luego a un dominio de nucleasa efectora, por ejemplo, como se describe en 6,824,978, tal como Fokl, descrito en las publicaciones de solicitud PCT N.° W01995/09233 y WO1994018313, cada una de las cuales de incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia, tal como se estableció.
Otro ejemplo de nucleasas específicas de secuencias incluye las endonucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN), que comprende un dominio efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica y un dominio de endonucleasas que cataliza un daño de cadena doble en el sitio diana. Los ejemplos de TALEN y los métodos de
realización y uso se describen mediante la publicación de patente PCR N.° WO2011072246, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, tal como se estableció.
Otro ejemplo de un sistema de nucleasas específicas de secuencias que se puede utilizar con los métodos y composiciones que se describen en la presente incluye el sistema Cas9/CRISPR (Wiedenheft, B. et ál. Nature 482, 331- 338 (2012); Jinek, M. et ál . Science 337, 816-821 (2012);
Mali, P. et ál . Science 339, 823-826 (2013); Cong, L. et ál .
Science 339, 819-823 (2013)). El sistema Cas9/CRISPR
(repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) explota la unión al ADN guiado por ARN y la escisión específica de secuencias del ADN diana. Un ARN guía (ARNg) contiene 20 nucleótidos que son complementarios a la secuencia de ADN genómica diana anterior de un sitio PAM genómico (motivos adyacentes de protoespaciadores) y una región de estructura del ARN constante. La proteína Cas9 (asociada a CRISPR) se une al ARNg y el ADN diana al cual se une el ARNg e introduce un daño de cadena doble en una ubicación definida anterior al sitio PAM. Cas9 alberga dos dominios de nucleasas independientes homologas a las endonucleasas HNH y RuvC y mediante la mutación de cualquiera
de los dos dominios, la proteína Cas9 se puede convertir en una nickasa que introduce daños de cadena doble (Cong, L. et ál . Science 339, 819-823 (2013)). Se contempla específicamente que los métodos y las composiciones inventivas se pueden usar con la versión que induce cadenas dobles de Cas9, así como también con otras nucleasas de ADN guiadas por ARN, tal como otros sistemas similares a la Cas9 bacteriana. En algunas modalidades, los ARN guías utilizados en los métodos que se describen en la presente son aquellos de las SEQ ID NOS: 36-42, respectivamente, en orden de aparición. La nucleasa específica de secuencias de los métodos y composiciones que se describen en la presente puede ser modificadas, quiméricas o ser aisladas de un organismo.
La nucleasa específica de secuencias se puede introducir en la célula en forma de una proteína o en forma de un ácido nucleico que codifica la nucleasa específica de secuencias, tales como ARNm o ADNc. Los ácidos nucleicos se pueden obtener como parte de una construcción más grande, tal como un plásmido o vector viral, o directamente, por ejemplo, mediante electroporación, vesículas lípidas, transportadores virales, microinyección y biolística. De manera similar, la construcción donante se puede obtener mediante cualquier
método adecuado para introducir ácidos nucleicos en una célula.
Sin vernos limitados por ningún mecanismo o teoría, siguiendo el daño de cadena doble introducido por la nucleasa específica de secuencias en la secuencia diana (por ejemplo, DSB inducido por ZFN; FIG. 3A, etapa 1), la resección de cadenas genera extremos cromosómicos de cadena simple 3'
(FIG. 3A, etapa 2). Para iniciar la reparación, los extremos cromosómicos de cadena simple se hibridan con pares de bases complementarios dentro de las regiones presentes en la construcción donante mediante la invasión de cadena (FIG.3A, etapa 3). La secuencia donante se puede utilizar luego como una base para extender los extremos de cadena simple 3' mediante la extensión de cadena mediada por polimerasa de ADN. Después de la extensión de cadena, la cadena extendida se híbrida con el extremo cromosómico de cadena doble en el otro lado del daño de cadena doble original y se completa la reparación mediante la síntesis de ADN, usando la cadena extendida como base y la ligación. El ADN de cadena doble resultante contiene la secuencia donante, flanqueada por sitios de reconocimiento de recombinasas (FIG.3A, etapa 4). Este modelo de hibridación de cadena dependiente de la síntesis de la reparación del daño de cadena doble es
consistente con la observación de que las extensiones más grandes del ADN externo con poca o ninguna homología con la secuencia endógena, tal como un gen reportero, se puede insertar precisamente en el punto del daño de cadena doble. Por consiguiente, las secuencias donantes flanqueadas por los sitios de reconocimiento de recombinasas se pueden integrar al daño de cadena doble mediante la resección de los extremos cromosómicos libres para exponer las regiones alrededor de la secuencia diana que son sustancialmente homologas a las regiones de homología en la construcción donante (FIG.3A). Las regiones de homología pueden tener cualquier longitud adecuada para la ubicación en una construcción donante y ser eficaces en la mediación de la hibridación de cadena, tal como se describió anteriormente, por ejemplo, una longitud combinada de 10-5000 bp, 100-1000 bp, 500-600 bp o 537 bp. Estas etapas, por lo tanto, crean un alelo con inactivación condicional en el sitio del gen diana, es decir, un alelo que comprende la secuencia donante flanqueada por los sitios de reconocimiento de recombinasas que produce un fenotipo que es sustancialmente similar o indistinguible del producido por el alelo génico diana semejante. Dos fenotipos son sustancialmente similares o indistinguibles si tras la inspección estándar por un experto no se puede detectar la
naturaleza del alelo subyacente del gen diana. En algunas modalidades, los métodos que se describen en la presente producen células que llevan alelos con inactivación condicional heterocigotos o alelos con inactivación condicional homocigotos, es decir, se sustituye una parte o todos los alelos endógenos por el alelo con inactivación condicional.
El gen diana puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína (o fragmentos de esta) dentro del material genético de la célula que la construcción donante está dirigiendo para producir una versión con inactivación condicional del gen. Por ejemplo, un gen diana puede ser un gen ubicado en el cromosoma de una célula eucariota que codifica una proteína de función desconocida o que está involucrado en un proceso celular. Dicho gen puede estar compuesto de una serie de exones e intrones. Una secuencia diana puede incluir un exón, intrón (lo que incluye un intrón artificial) o secuencias reguladoras del gen diana o varias combinaciones de estas. Una secuencia diana puede incluir todo el gen diana.
La célula puede ser cualquier célula eucariota, por ejemplo, una célula aislada de un animal, tal como una célula madre adulta, totipotente o pluripotente, un cigoto o una célula
somática. En determinadas modalidades, las células para uso en los métodos que se describen en la presente son células de animales no humanos, tales como animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, primates no humanos tales como los monos), conejos, peces, roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, cobayos), moscas y gusanos. En determinadas modalidades, las células para uso en los métodos son células humanas. Los métodos y composiciones que se describen en la presente se pueden utilizar para dirigirse a cualquier locus genómico. Se describen en la presente varios ejemplos específicos para dirigir loci diferentes. En determinadas modalidades, los métodos y composiciones que se describen en la presente se pueden usar para dirigir más de un locus genómico dentro de una célula, es decir, para el direccionamiento génico múltiple.
En un aspecto particular, adicional de la invención, se produce un animal con inactivación condicional usando los métodos que se describen en la presente. Para producir un animal con inactivación condicional, se introduce una construcción donante y una nucleasa específica de secuencias en una célula, tal como una célula madre pluripotente o cigota, tal como una célula madre embriónica o una célula
madre pluripotente inducida o una celula madre adulta para crear al menos un alelo con inactivación condicional en la célula. Los métodos para analizar el genotipo deseado son muy conocidos en la téenica e incluyen el análisis PCR, por ejemplo, tal como se describe en la presente en los ejemplos específicos. Luego la célula se introduce en un animal portador hembra para producir el animal con inactivación condicional a partir de una célula, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense N.° 7,13,608, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, tal como se estableció. En determinadas modalidades, la célula se extiende a una fase de dos células introducidas en un blastocisto o de otra manera cultivada o asociada con células adicionales antes de introducirse en el animal portador. En determinadas modalidades, el animal con inactivación condicional resultante lleva el alelo con inactivación condicional en su línea germinal de forma que el alelo con inactivación condicional se pueda transmitir a las futuras generaciones.
En un aspecto particular adicional de la invención, los métodos y composiciones que se describen en la presente se pueden usar para producir un alelo con inactivación. Este método incluye la escisión, inversión o la inhibición de
cualquier otro modo de la expresión normal de la secuencia donante flanqueada por el sitio de reconocimiento de recombinasa, una vez que se incorpora en el genoma como alelo con inactivación condicional. El alelo con inactivación condicional se convierte en un alelo con inactivación introduciendo una recombinasa en la célula que reconoce específicamente los sitios de reconocimiento de recombinasas. Por ejemplo, Araki et ál ., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 92:160-164 (1995). El término "recombinasa", tal como se usa en la presente, hace referencia, a menos que se indique específicamente de otra manera, a una enzima que reconoce secuencias de polinucleótidos específicas (sitio de reconocimiento de recombinasas) que flanquea un polinucleótido interferente y cataliza un intercambio de cadenas recíproco, lo que da lugar a la inversión o escisión del polinucleótido interferente. Un experto en la téenica reconoce la eficacia ventajosa de seleccionar una recombinasa para uso en los métodos que se describen en la presente, que reconoce específicamente los sitios de reconocimiento de recombinasa dentro de la construcción donante.
Se puede introducir la recombinasa en la célula que contiene la construcción donante mediante cualquier método en forma de proteína o secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
de recombinasa. Para producir un animal con inactivación, el animal con inactivación condicional producido como se describió anteriormente, se cruza con un animal transgénico que tiene un transgén que codifica una proteína de recombinasa que cataliza la recombinación en el sitio de reconocimiento de recombinasas 5' y 3'. Los ejemplos de animales que llevan un transgén de recombinasa se conocen en la téenica y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense N.° 7,135,608, que se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad, tal como se estableció. En algunas modalidades, el transgén que codifica la recombinasa se encuentra bajo el control de un promotor específico de tejidos, de modo que la recombinasa se expresa y, por consiguiente, se produce el alelo con inactivación, solamente en dicho tejido. En algunas modalidades, el transgén que codifica la recombinasa se encuentra bajo el control de un promotor inducible, de forma que la expresión de recombinasa se puede inducir en un tiempo específico. Por ejemplo, es posible controlar la activación de los promotores Tet-on o Tet-off mediante la tetracielina o uno de sus derivados. En algunas modalidades, el transgén que codifica la recombinasa se expresa en una determinada etapa de desarrollo o en respuesta a un compuesto administrado al
animal. Los ejemplos de recombinasas adecuadas para uso en los métodos descritos en la presente incluyen cualquier versión de la recombinasa Cre Pl, cualquier versión de la recombinasa FLP (flipasa) y cualquier versión de la recombinasa Dre, lo que incluye la versión de estas recombinasas (por ejemplo, fusiones con un dominio receptor de hormonas, tales como CreERT2 y Cre-PR o recombinasa regulada por tetracielina).
B. Composiciones de ejemplo
En un aspecto específico adicional de la invención, se proporciona una composición para generar un alelo con inactivación condicional de un gen diana. Dichas composiciones incluyen una construcción donante, una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasas 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasas 3' y una región de homología 3', tal como se describe en la presente. La secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral, tal como se describe en la presente. La composición comprende además una nucleasa específica de secuencias que reconoce al gen diana.
En determinadas modalidades, la nucleasa específica de secuencias es una nucleasa con dedos de zinc o una nucleasa efectora similar al activador de la transcripción. En determinadas modalidades, el sitio de reconocimiento de recombinasas es un sitio loxP o un sitio frt . Opcionalmente, la composición puede incluir también una recombinasa, tal como se describe en la presente.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una construcción donante que comprende la secuencia que se muestra en la FIG.4A-1 y 4A-2 (SEQ ID NO: 30), la FIG.4B-1 y 4B-2 (SEQ ID NO: 31) o la FIG.14C (SEQ ID NOS: 44-46).
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un ARN guía que comprende la secuencia que se muestra en la FIG. 14A (SEQ ID NO: 36-42).
En un aspecto adicional de la invención, una célula que comprende la construcción donante que comprende la secuencia se muestra en la FIG.4A-1 y 4A-2 (SEQ ID NO: 30), la FIG.
4B-1 y 4B-2 (SEQ ID NO: 31) o la FIG.14C (SEQ ID NOS: 44- 46). Esta célula se puede aislar de un animal producido mediante los métodos que se describen en la presente.
La invención puede ser entendida además mediante esta referencia con respecto a los siguientes ejemplos no taxativos de determinadas modalidades de la invención.
II. EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Debe entenderse que pueden llevarse a la práctica otras modalidades diferentes, dada la descripción general provista anteriormente.
Ejemplo 1: Microinyección pronuclear de ARNm ZFN Lrp5 en óvulos fertilizados de C57BL/6N.
Se obtuvo de Sigma-Aldrich un par de ZFN que dirige al exón 2 personalizado de eHi-Fi CompoZr de la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (Lrp5) . Las ZFN albergan una interfaz de endonucleasas Fokl (eHi-Fi) optimizadas que aumentan significativamente su eficacia al introducir daños de cadena doble (Doyon, Y. et ál . Na t Meth 8, 74-79 (2011)) en 5'-gacttccagttctccaagggtgctgtgtactggacagat-31 (SEQ ID NO: 29) (se subraya el sitio de escisión de ZFN). No se observó ninguna actividad significativa de direccionamiento fuera del sitio potencial. El ARN mensajero (ARNm) que codifica al par de ZFN se almacenó a -80 °C antes de su uso. Se utilizó el ARNm (Sigma-Aldrich) para la microinyección pronuclear y se utilizaron dos plásmidos que codifican al par de ZFN para la electroporación de células ES.
Para determinar la actividad de endonucleasas, se microinyectaron varias concentraciones de ARNm que codifica al Lrp5 en los pronúcleos de los cigotos C57BL/6N (Tabla 1). El ARNm de la ZFN Lrp5 (2 mg de cada ZFN en 5 pl) se descongeló y se diluyó en una solución amortiguadora de microinyección libre de DNasa y RNasa en 50 ng/pl (10 mM Tris y lmM de EDTA, PH 8,0). Las microinyecciones de ZFN, el ARNm ZFN Lrp5 se diluyeron a concentraciones funcionales de 2, 3, 4 o 5 ng/pl. Los cigotos de ratón se obtuvieron de hembras C57BL/6N con superovulación, apareadas con machos C57BL/6N
(Charles River) el día anterior a la microinyección. Los cigotos se extrajeron con un medio de M2 y fueron microinyectados en M2 siguiendo los procedimientos estándar (Nagy, A., et ál ., Manipulating t he Mouse Embryo: A Laboratory Manual, tercera edición (Coid Spring Harbor
Laboratory Press, Coid Spring Harbor, EUA, (2002)) y se transfirieron en oviductos de hembras ICR pseudopreñadas E0,5 (Taconic), 30 embriones por hembra pseudopreñada. Las hembras ICR se alimentaron con una dieta de alto contenido graso de 9 % (Harían, catálogo #2019) luego de la cirugía de transferencia de embriones hasta que las crías se destetaron.
Tabla 1. Microinyección pronuclear de ARNm ZFN Lrp5 en óvulos fertilizados de C57BL/6N. Los mutantes KO incluyen ratones con uno o más alelos mutantes. KO = con inactivación (del inglés, "knock-out").
Se aisló el ADN de las crías resultantes a partir del tejido de la cola y se analizó mediante amplificación por PCR y una posterior secuenciación para identificar las mutaciones grandes y pequeñas. Se purificó el ADN de la cola utilizando el kit de tejido por PCR Extract-N-Amp (Sigma, Cat# XNAT2) o utilizando un kit de sangre y tejido Qiagen DNeasy 96 (Qiagen Cat# 69582). Para determinar la eficiencia de la mutación mediada por ZFN y para caracterizar los tipos de mutaciones causadas por la reparación de NHEJ, se llevó a cabo un enfoque de PCR de 3 etapas. En la primera etapa, se realizó una PCR externa utilizando los cebadores P1 y P2 para detectar eliminaciones o inserciones grandes. En la segunda
etapa, se realizó una PCR interna utilizando los cebadores P3 y P4 para detectar eliminaciones o inserciones de tamaño mediano. En la tercera etapa, se realizó una secuenciación directa del producto de la PCR interna utilizando los cebadores P3 y P4 para identificar de 1 a 20 cambios de pares de base. Se analizaron cromatogramas individuales utilizando Sequencher 4.10.1 (Gene Codes Corp.). Cuando se detectaron dos indicadores diferentes, se determinó manualmente la necesidad de pares de base para cada alelo individual. Los alelos de un subconjunto de mutantes se analizaron adicionalmente mediante subclonación TOPO por PCR
(Invitrogen, Cat# K4575-J10). Se secuenciaron de doce a veinticuatro clones TOPO por ratón utilizando los cebadores M13F y M13R.
Se observaron las tasas de mutación de hasta 63 % de crías nacidas vivas (5 ng/ml ARNm ZFN). Las mutaciones variaron ampliamente de inserciones de uno a tres bp y eliminaciones que variaron de un único bp hasta -100 bp, así como tambien una gran eliminación de -800 bp (resumido en la FIG.1). Se identificaron varios animales quiméricos que poseen más de dos alelos, que probablemente sean resultado de una actividad ZFN continua luego de la primera división celular.
Adicionalmente, cinco animales fueron mutantes compuestos, es
decir, estos animales poseían dos alelos mutantes independientes del mismo gen y ningún alelo de tipo salvaje detectable del gen, lo que indica actividad ZFN en ambos cromosomas en una fase celular.
Ejemplo 2: Generación directa de alelos mutantes homocigotos funcionales mediante la microinyección de endonucleasas específicas de secuencias.
LRP5 juega un papel obligatorio en el desarrollo vascular de la retina al servir como correceptor de NORRIN. La señalización interrumpida de NORRIN conduce a defectos vasculares caracterizados por una falla en la formación de lechos capilares en las capas más profundas de la retina, así como también derrames vasculares (Xia, C.-H. et ál., Human Molecular Genetics 17, 1605-1612 (2008); Xia, C.-H., PLoS ONE 5, ell676 (2010); Junge, H. J. et ál . , Cell 139, 299-311 (2009)). Por lo tanto, se generaron ratones de dos meses con eliminaciones compuestas dentro y fuera del marco en Lrp5, tal como se describe en el Ejemplo 1 y se examinaron en busca del desarrollo vascular de la retina. El animal #542 es un heterocigoto quimérico funcional que sirvió como control. Este animal posee un alelo de tipo salvaje (una pequeña eliminación de 3 bp dentro del marco pareció ser silenciosa) y un alelo con una eliminación de 1 bp fuera del marco. El
animal #495 contiene un alelo con eliminación de 4bp fuera del marco y un alelo con eliminación de 1 bp fuera del marco. El animal #519 contiene un alelo con eliminación de 29 bp fuera del marco y un alelo con eliminación de 17 bp fuera del marco. El animal #555 tiene un alelo con eliminación de 3 bp dentro del marco y un alelo con eliminación de 1 bp fuera del marco y es heterocigoto funcional.
Para los análisis fenotípicos, se analizaron los animales que poseen mutaciones Lrp5 mediante angiografía por fluoresceína. Se anestesió a los ratones con una mezcla de ketamina/xilazina (80 mg/kg; 7,5 mg/kg) y se les dilató los ojos con Tropicamida al 1 % (Akorn, Inc.). Se realizó la angiografía por fluoresceína luego de la inyección intraperitoneal de una solución estéril de fluoresceína al 10 % (100 ml, AK-Fluor; Akorn, Inc.). Se capturaron imágenes 1 minuto después de la inyección de fluoresceína utilizando una configuración de imagen de foco 0 y sensibilidad 50.
Para los análisis histológicos, se sacrificaron ratones dos días después de la angiografía, se enuclearon y se procesaron para la histología. Los ojos se fijaron en formaldehído (PFA, por siglas en inglés) al 4 % antes de la disección de las retinas para una histología de preparación completa o se crioprotegieron en sacarosa al 30 % durante la noche y se
embebieron en el compuesto Tissue-Tek® OCT (Sakura) para las partes congeladas. Se realizó una tinción con Isolectina-B4 para la preparación completa y para partes, tal como se describió previamente (Gerhardt, H. et ál., J. Cell . Biol . 161, 1163-1177 (2003). Para los cortes congelados, se eliminaron la córnea y el cristalino y se lavaron los ojos exhaustivamente en PBS para eliminar el PFA. Se prepararon los cortes congelados de 12 mm y se tiñeron en busca de MECA32, un antígeno del marcador celular endotelial fenestrado PLVAP, básicamente como se describe en Junge et ál, Cell 139, 299-311 (2009).
Se muestra el fenotipo de retina de los tres ratones con mutaciones compuestas (495, 519 y 555) y de un ratón heterocigota mutante de control que posee un alelo de tipo salvaje (542) en la FIG.2A-2E. Los ratones que poseen las mutaciones compuestas mostraron un fenotipo mutante Lrp5. La angiografía fluorescente reveló que los ratones 542 y 555 no presentaron fallas neovasculares o derrames en los vasos sanguíneos evidentes (FIG.2A). Por el contrario, los ratones 495 y 519, que contienen eliminaciones compuestas fuera del marco en ambos alelos de Lrp5, presentaron varias oclusiones en arteriolas precapilares (FIG.2A, las flechas señalan los ejemplos de oclusiones en las arteriolas precapilares) y
derrames vasculares importantes, tal como se indicó mediante una señal de fluoresceína difusa en toda la retina. La barra a escala en el panel inferior derecho de la FIG. 2A-2E representa 200 mm para todos los paneles en la FIG.2A. Las proyecciones confocales de las retinas de preparación completa teñidas con isolectina confirmaron la falta del fenotipo mutante Lrp5 de ratones con mutaciones compuestas 495 y 519. Para cada ratón, se analizó una proyección de la profundidad máxima de la retina que contiene las tres capas vasculares (FIG.2B) e imágenes derivadas de la proyección de una capa vascular individual que se encuentra en la capa de fibras nerviosas (NFL, FIG.2C), la capa prexiforme interna (IPL, FIG.2D) y la capa plexiforme externa (OPL, FIG.2E). Mientras que las retinas heterocigotas funcionales (542 y 555) contienen una red de tres niveles de vasos sanguíneos, densa y bien organizada, las retinas con inactivación compuesta (495 y 519) tienen una vasculatura irregular con una densidad reducida (FIG.2B, 2C). Adicionalmente, 542 y 555 contienen redes capilares normales en la IPL (FIG.2D) y la OPL (FIG.2E), mientras que los ratones KO compuestos (495 y 555) tienen agrupaciones neovasculares anómalas en la IPL (FIG. 2D) y una pequeña cantidad de agrupaciones celulares endoteliales en la OPL (FIG.2E). La barra a escala en el
panel inferior derecho de la FIG.2A-2E representa 100 mm para todos los paneles en la FIG.2B-2E.
En resumen, el mutante 555, que posee un alelo con pérdida de función con una eliminación de 1 bp y un alelo funcional con una eliminación de 3 bp dentro del marco, presentó un fenotipo de retina normal, mientras que el mutante 495, que posee una eliminación de 4 bp y una de 1 bp, y el mutante 519, que posee dos eliminaciones más grandes (17 y 29 bp), fueron fenotípicamente heterocigotas mutantes, con un fenotipo que recapituló lo que se ha informado previamente (Xia, C.-H. et ál., Human Molecular Genetics 17, 1605-1612
(2008)). Estos resultados demuestran que la microinyección de las endonucleasas específicas de secuencias pueden producir directamente heterocigotos funcionales (mutantes compuestos), aunque se desconoce si estos animales son mutantes compuestos en todas las células.
Ejemplo 3: Generación de alelos con inactivación condicional mediante la comicroinyección de ARNm ZFN del exón 2 Lrp5 y construcciones donantes.
La FIG. 3A ilustra un boceto esquemático de la estrategia empleada para generar un alelo con inactivación condicional (Gu, H., Science 265, 103-106 (1994)) de Lrp5, exón 2 de direccionamiento. El par ZFN introduce un daño de cadena
doble en el exón 2 Lrp5 (indicado por la flecha entrecortada). El daño se repara por medio de la invasión del plásmido donante mediante la invasión de cadena y recombinación homologa entre las regiones de homología 5' y 3' Lrp5 del plásmido donante y las secuencias homologas 5' y 3' respectivas del exón 2. El locus resultante contiene el exón 2 Lrp5 optimizado por codones y flanqueado por dos sitios loxP (FIG.1A, inferior).
Las regiones de homología 51 y 31 Lrp5 en el plásmido donante tuvieron una longitud de 1,1 y 1 kb, respectivamente. Se sintetizaron las secuencias donantes modificadas por codones (donante 1, FIG.4A) y de tipo salvaje (donante 3, FIG.4C) mediante Blue Heron/Origene (Bothell, A) en un vector modificado pUC19. Se generó el donante 2 (FIG.4B) a partir del donante 3 mediante el remplazo de un fragmento MscI-BamHI de 300 bp con un fragmento sintetizado que contiene siete mutaciones silenciosas para anular el reconocimiento de ZFN. La inserción en el donante 1 es una orientación opuesta en comparación con la inserción en los donantes 2 y 3. Por lo tanto, se llevó a cabo una amplificación por PCR utilizando cebadores que unen la estructura de plásmidos en combinación con cebadores específicos para el locus Lrp5, utilizando combinaciones de cebadores de orientación opuestas. La
secuencia donante, con la excepción de los sitios loxP, corresponde al conjunto de genomas de ratón NCBI37/mm9 cr.19:3658179-3660815. Se utilizaron plásmidos donantes circulares en todos los experimentos.
Se introdujeron mutaciones silenciosas en la secuencia del exón 2 Lrp5 de tipo salvaje para producir una versión optimizada por codones que mantenga el potencial de codificación de proteínas del exón, pero reduzca la homología general entre C57BL/6 de tipo salvaje y el exón 2 Lrp5 donante únicamente a 78 % (donante 1, FIG.4A; FIG.5A-5B). Para preservar el empalme normal de ARN, se excluyeron de la modificación los primeros 13 bp o los últimos 11 bp del exón 2. La FIG.5A-5B ilustra una secuencia de alineación de tres donantes de ADN con inactivación condicional Lrp5, que excluye las regiones de homología 5' de 1,1 kb y 3' de 1 kb. Se realizó una alineación utilizando el programa de alineación ClustalW2, disponible en htt ://ww .ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. La homología general entre el exón 2 del donante 1 (modificado por codones) y el donante 3 (tipo salvaje) es 311/397 = 78 %. La homología general entre el exón 2 del donante 2 (modificado únicamente por sitios de unión ZFN) y el donante 3 es 390/397 = 98 %. Los sitios LoxP se indican mediante letras mayúsculas
en negrita, las secuencias de intrones se indican mediante letras minúsculas y las secuencias del exón 2 (de tipo salvaje o modificadas) se indican mediante letras mayúsculas. Los sitios de unión ZFN se encuentran encuadrados con líneas punteadas y la secuencia en la cual se híbrida el exón de tipo salvaje se encuentra subrayada. Las mutaciones silenciosas se encuentran encuadradas con líneas ininterrumpidas.
Se comicroinyectaron diferentes combinaciones de ARNm ZFN y construcciones donantes en pronúcleos C57BL/6N (Tabla 2), básicamente como se describe en el Experimento 1, con excepción de que se diluyeron juntos el ARNm ZFN y la construcción donante a una concentración funcional (2,5 - 5 ng/ml para el ARNm ZFN y 2,5 o 3 ng/ml para la construcción donante).
Tabla 2 Comicroinyección de ARNm ZFN Lrp5 (ARNm) y plásmido donante 1 CKO. Los mutantes KO incluyen ratones con uno o más
alelos mutantes. KO = inactivación; CKO = inactivación condicional. aUn ratón (#95) fue falso positivo (plásmido donante 1 integrado en un locus Lrp5) . bRatones #140 y #155.
Se analizó el ADN aislado de las muestras de cola de 168 de las crías resultantes para identificar ratones que poseen un alelo con inactivación condicional (FIG.3B). Los respetivos pares de cebadores utilizados para el análisis de los mutantes en ausencia (P1-P4) o presencia (P5-P12) del plásmido donante se indican en la FIG.3B. En primer lugar, se determinó la frecuencia de mutación ZFN total tal como se describió en el Experimento 1 y 2. Los análisis iniciales para identificar ratones que poseen un potencial alelo con inactivación condicional se llevaron a cabo mediante el ensayo en busca de la presencia del sitio LoxP 5' utilizando un ensayo de nucleasa 5' (TaqMan®, Livak, K. J., Genet . Anal . 14, 143-149 (1999)). En resumen, se construyeron reacciones de 20 ml con una mezcla maestra Type-it Fast para PCR con sondas para SNP de Qiagen 2X, 50 - 120 ng de base de ADN, 400 nM de cebadores y 200 nM de sonda a base de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) fluorogénicos específicos para el reconocimiento del sitio LoxP (Weis, B., BMC Biotechnol 10, 75 (2010)). Se cielaron térmicamente las reacciones en un
Applied Biosystems 7900HT (Life Technologies). Se determinó
la presencia de LoxP 5' mediante el análisis con un software de detección de secuencias Applied Biosystems, versión 2.3 (Life Technologies), mediante la visualización de la evolución de fluorescencia en los cultivos multicomponentes y de amplificación. Luego se realizó un análisis PCR específico para el locus Lrp5 utilizando los cebadores P5/P6 para detectar un producto 5' específico para la secuencia del exón 2 Lrp5 modificado por codones presente tanto en el donante 1 como en el 2 (pero no en el donante 3 utilizado para el experimento con células ES del Ejemplo 4). De manera similar, se realizó la PCR utilizando cebadores P7/P8 para analizar el extremo 3'. Para validar la presencia de loxP tanto de 5' como 3' , se realizó un análisis PCR utilizando los cebadores
P9/P10 y P11/P12, respectivamente, que tendrá por resultado productos solamente si se encuentra presente la secuencia loxP adecuada en el locus Lrp5. Al aislarse el ADN de una mezcla de subclones quiméricos, se observaron resultados positivos falsos, es decir, los productos de PCR parecen positivos para los alelos tipo sándwich 5'-3' Lrp5 incluso en ausencia de tales alelos con inactivación condicional verdaderos. Pueden producirse resultados de falsos positivos, por ejemplo, si uno de los alelos posee solo el sitio loxP 51 y otro alelo posee solo el sitio loxP 3'. Para confirmar la
presencia de un alelo con inactivación condicional, en oposición a un falso positivo, se amplificó un producto de PCR del exón 2 Lrp5 de ~2,8kb utilizando los cebadores P5/P8 (ambos cebadores se hibridan fuera de los brazos de homología donante), se clonó utilizando y clonación TOPO (Life Technologies) y se secuenció totalmente. Este análisis identificó alelos con inactivación condicional, alelos solo con un único sitio loxP y alelos solo con una secuencia de exón 2 derivada de un donante (es decir, no los sitios loxP). Los alelos identificados como falsos positivos por los análisis de secuenciación fueron analizados en busca de la presencia de una copia integrada del vector donante completo en el alelo Lrp5 mediante PCR adicional, utilizando los cebadores flanqueantes P5 y P8 en combinación con cebadores específicos para la estructura del plásmido donante. Se determinó la presencia de inserciones genómicas aleatorias con los cebadores P6 y P7 (donante 1 y donante 2) en combinación con los cebadores específicos para la estructura del plásmido donante (P13-P14). Para las inserciones aleatorias del donante 3, se utilizaron cebadores específicos para la estructura del plásmido donante (P13-P14) en combinación con los cebadores P15 y P16 que se unen a la secuencia de tipo salvaje Lrp5 del donante 3. Todas las
secuencias de cebadores y condiciones de reacción se establecen en la Tabla 3. Se establecen todas las condiciones para los estudios PCR en la Tabla 7.
Se confirmaron dos ratones (#140 y #155) como portadores de alelos con inactivación condicional mediante la secuenciación completa de un producto de PCR clonado obtenido utilizando cebadores ubicados fuera de las regiones de homología. Para ambos ratones, se transmitió el alelo con inactivación condicional a su progenie. Además del alelo con inactivación condicional, el animal #155 también tuvo un alelo de baja frecuencia (no transmitido a la progenie) solo con el sitio loxP 5' solamente. El animal #95 fue un falso positivo ya que el análisis PCR inicial indicó un alelo con inactivación condicional, pero análisis detallados revelaron que un plásmido donante de longitud completa se integró en su lugar en el exón 2 Lrp5. Las tasas de mutación de inactivación para cada combinación de ARNm ZFN y ADN donante varió de 28 a 67 %
(Tabla 2).
Tabla 3. Secuencias de nucleótidos de cebadores. Cebador P19: F= fluoróforo (fluoresceína); Q=inactivador (Iowa Black FQ, Integrated DNA Technologies); IQ=inactivador interno (ZEN, Integrated DNA Technologies). Las bp LNA se encuentran subrayadas. El experimento de coinyección en cigotos de ratón (4,5 ng/ml ARNm ZFN y 3 ng/ml de ADN donante) se repitió, mediante la coinyección de ARNm ZFN Lrp5 y ya sea un donante 1 o un donante de exón 2 tipo sándwich optimizado por codones que posee siete mutaciones silenciosas respecto a la secuencia de tipo salvaje, que anula la unión ZFN y la hibridación del donante (donante 2, FIG.4B; FIG.5A-5B). Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 4. La coinyección del donante 1 con el ARNm ZFN Lrp5 tuvo como resultado una de las doce crías que poseían un alelo con inactivación condicional (#243, 8,3 % tasa de inactivación condicional).
La coinyección del donante 2 con el ARNm ZFN Lrp5 tuvo como resultado tres de treinta y cinco crías (8,6 %) que poseían la secuencia de exón 2 donante en el locus Lrp5. Sin embargo, solo uno de estos se confirmó posteriormente como portador de un alelo con inactivación condicional de baja frecuencia (#250). El segundo de los tres animales poseía solamente un alelo con el sitio loxP 3' (#274); el último animal (#280) albergó un alelo con la secuencia de exón 2 donante
solamente(sin sitios loxP) y otro alelo con plásmido del donante 2 completamente integrado (falso positivo). Estos resultados indican que el plásmido donante con la homología de secuencia más baja para la secuencia de exón 2 Lrp5 endógena (donante 1, FIG. 4A) fue más eficiente en la generación condicional de alelos con inactivación condicional.
Tabla 4. Comicroinyección de ARNm ZFN Lrp5 y donante 1 CKO o plásmidos del donante 2. Se realizaron todos los experimentos utilizando 4,5 ng/ml de ARNm ZFN y 3 ng/ml de ADN plásmido del donante. La tasa total de CKO fue 1/12 (8,3 %) para el donante 1 y 1/35 (2,9 %) para el donante 2. aRatón #243; bRatón #250; cUn ratón (#274) portaba un alelo solo de sitio 3'loxP; dUn ratón (#280) portaba un alelo solo con el exón 2 donante (sin sitios loxP) y un alelo falso positivo (plásmido del donante 2 integrado en el locus
Lrp5) .
o 4: Generación de alelos con inactivación condicional mediante la coelectroporación de la ZFN del exón 2 Lrp5 y el
donante.
Se cotransfectaron células ES de C57BL/6N mediante la electroporación con plásmidos que codifican los dos componentes pares de ZFN Lrp5 solos o en junto con el plásmido donante utilizado para los experimentos de microinyección o con un plásmido del exón 2 Lrp5 de tipo salvaje y tipo sándwich (donante 3). Se cultivaron las células ES C2 (Gertsenstein, M. et ál., PLoS ONE 5, ell260
(2010)), se expandieron y se electroporaron utilizando métodos ya establecidos (Nagy, A., Gertsenstein, M. , Vintersten, K. y Behringer, R. Manipulating t he Mouse Embryo: A Laboratory Manual, tercera edición.800 (Coid Spring Harbor Laboratory Press: 2002)). En resumen, quince millones de células se electroporaron con 15 mg de cada plásmido de ZFN con o sin plásmido donante de 15 pg. Se recuperaron las células electroporadas en el medio y se colocaron diluciones seriales en placas de 10 cm en una capa de alimentación. Se cultivaron células durante 7-8 días luego de lo cual se eligieron 144 clones (1,5 placa de 96 pocilios) de cada experimento y se colocaron en placas de 96 pocilios con células de alimentación para su expansión. Dos días después
de la colocación en placas, se dividieron las células 1:2 en nuevas placas de 96 pocilios con células de alimentación. Luego se almacenó una placa a -80 °C y se dividió la otra placa en una nueva placa de 96 pocilios solo con gelatina al 1 % sin células de alimentación para el análisis de ADN. Se aisló el ADN tal como se describió en el Ejemplo 1 excepto que se lisaron las células ES durante la noche y se precipitó el ADN, se lavó y se volvió a suspender en una solución amortiguadora de TE al día siguiente, básicamente como se describió en Ramírez-Solis, R. et ál., Anal Biochem 201, 331- 335 (1992).
Tabla 5. Electroporación de plásmidos que codifican la zona par ZFN Lrp5 sola o en combinación con los donantes CKO 1, 2 o 3 en células ES de C57BL/6N. Se realizaron todos los experimentos utilizando 15 mg de ADN donante y/o 15 pg de cada uno de ZFN1 y ZFN2. aClon ES del donante 1 #C8; bun clon del donante 2 (F5) portaba solo un alelo de 5' loxP y un alelo solo de exón 2 (sin sitios loxP), el clon H10 portaba un alelo solo con loxP 3'; cdos clones del donante 3 (E3 y E4) portaban alelos con loxP 5
solamente. El clon E3 también portaba un alelo falso positivo (integración del plásmido del donante 3). El clon E4 también portaba un alelo menor CKO verdadero (uno positivo de 240 clones TOPO secuenciados). ND: no investigado; NA: no aplica.
Los resultados del análisis de ADN se muestran en la FIG.3B, derecha, y se resumen los resultados en la Tabla 5. La frecuencia general de los alelos con inactivación observados en las células ES utilizando electroporación (17 ¾) fue menor que el obtenido in vivo mediante la inyección pronuclear. Los patrones de alteración genética del experimento de electroporación de células ES fueron similares a aquellos observados luego de la microinyección. La coelectroporación del donante 1 con el plásmido ZFN Lrp5 tuvo como resultado un clon con inactivación condicional (clon C8) de 144 analizados que portan alelos derivados del donante. Uno de estos clones (H10) portaba solo el alelo con el sitio loxP 3'; el otro (F5) portaba un alelo con la secuencia del donante 2 (sin sitios loxP) solamente y un alelo con el sitio loxP 5' solamente. La coelectroporación del donante 3 (de tipo salvaje) con el ARNm ZFN Lrp5 tuvo como resultado dos clones de células ES dirigidas (E3 y E4). Ambos contenían solamente un alelo con el sitio loxP 5'. Adicionalmente, E3 portaba otro alelo resultante de la integración del plásmido del
donante 3 (falso positivo). Resulta interesante que el clon E4 también tuvo un subclón muy extraño positivo para ambos sitios loxP (alelo con inactivación condicional), posiblemente resultante de redirecciona iento posterior del alelo previamente dirigido. Estos resultados confirman que utilizar un donante con baja homología respecto al exón endógeno es más eficiente en la generación de alelos con inactivación condicional. La Tabla 6 proporciona un resumen general de los datos de los experimentos a partir de la microinyección y de los experimentos con células ES.
Tabla 6. Resumen de los alelos Lrp5 derivados del plásmido donante CKO.
Ejemplo 5: Función génica normal del alelo con inactivación condicional.
Para determinar si las mutaciones silenciosas en el alelo con inactivación condicional obtenidos del donante 1 (FIG.4A;
FIG. 5A-5B) afectaron la función normal del gen Lrp5, los ratones que poseen un alelo con inactivación (#140) y un alelo con inactivación condicional (#155) se reprodujeron con ratones homocigotas con inactivación Lrp5 generados utilizando el par ZFN del Ejemplo 3. Los ratones del control con coincidencia de edad de 16 días posnacimiento (P16) (FIG. 6A, +/+) provinieron de un cruzamiento heterocigótico Lrp5.
Los otros ratones utilizados en los experimentos provinieron de un cruzamiento entre una hembra KO/KO Lrp5 y un macho CK0/+ Lrp5. La hembra KO/KO Lrp5 (FIG.6B) es la madre adulta de K0/+ (FIG.6C, P16) y CKO/KO (FIG.6D, P16). Las FIGS.6A-6D muestran proyecciones confocales representativas de preparaciones completas de retinas teñidas con isolectina B4 (IB4) (barras a escala: 50 pm). Para cada proyección que se presenta en las FIGS.6A-6D, la imagen a la izquierda ilustra la proyección XY máxima y la imagen de la derecha ilustra la proyección Z que presenta vasculaturas en la capa de las fibras nerviosas (NFL), la capa plexiforme interna (IPL) y la capa plexiforme externa (OPL) (las etiquetas se encuentran en el panel derecho inferior de la FIG.6D). El animal sin Lrp5 presentó una complejidad vascular reducida en la proyección XY y ausencia de capas vasculares profundas (FIG.6B). Los ratones que poseen el alelo con inactivación condicional en
el contexto de no poseerlo presentaron un fenotipo vascular normal (FIG.6D), lo que indica que el alelo con inactivación condicional es funcional. La FIG. 6E muestra cortes transversales retiñíanos de los ojos opuestos con respecto a los representados en la Figuras 6A-6D teñidos con IB4, ECA32 y DAPI. Los ratones con inactivación homocigota expresaron de manera ectópica el marcador celular endotelial fenestrado MECA32, mientras que los ratones CKO/KO, K0/+ y +/+ son negativos a MECA32.
En resumen, los animales con inactivación homocigota presentaron los fenotipos de retina descritos anteriormente (FIG. 6A-6D), mientras que los fenotipos de retina de ratones que poseen un alelo con inactivación y un alelo con inactivación condicional no fueron discernibles de aquellos ratones de tipo salvaje o ratones que tienen tanto un alelo con inactivación como un alelo de tipo salvaje (Fig.6A-6D), lo que indica que el alelo con inactivación condicional es un alelo funcional. En conjunto estos resultados demuestran que una secuencia donante con flanqueo de sitio de reconocimiento de recombinasas que tiene mutaciones neutrales puede utilizarse junto con una nucleasa específica de secuencias para generar alelos con inactivación condicional completamente funcionales in vitro e in vivo.
La FIG. 7A-7D ilustra el posible mecanismo que dio lugar a los alelos Lrp5 que se observaron en estos estudios. La homología total entre la secuencia genómica Lrp5 y el donante 1 se reduce mediante múltiples mutaciones silenciosas (FIG.7A, asteriscos). Luego de la resección de los extremos cromosómicos, se produce la invasión de cadena en las regiones grandes de 100 % de homología fuera de los sitios loxP, lo que lleva a un alelo con inactivación condicional que tiene ambos sitios loxP. Debido a la homología limitada en la región entre los sitios loxP, los eventos de cruzamiento dentro de los sitios loxP son poco comunes. El donante 2 contiene regiones más grandes de 100 % de homología entre los sitios loxP, lo que permite que ocurra una invasión de cadena dentro de los sitios loxP, lo que tiene como resultado alelos que tienen solo un sitio loxP 3' (FIG.7B), solo un sitio loxP 5' (FIG.7C) o ningún sitio loxP (FIG. 7D). Las combinaciones de cebadores P9+P10 y P11+P12 dieron lugar ambas a productos de PCR para los eventos de acuerdo con la FIG.7A. El uso del par de cebadores P9+P10 tuvo como resultado un producto para los eventos ilustrados en la FIG. 7C pero no para los eventos ilustrados en la FIG.7B o 7D. De manera similar, los pares de
cebadores P11+P12 dieron lugar a un producto para los eventos ilustrados en la FIG.7B pero no para los eventos ilustrados en la FIG.7C o 7D. Las combinaciones de cebadores P5+P6 y P7+P8 tuvieron como resultado productos de PCR independientemente del estado del loxP.
Tabla 7. Condiciones para las reacciones PCR utilizadas en los Ejemplos descritos anteriormente.
Tabla 8. Sustituciones conservadoras
Ejemplo 6: Mutagenesis mediada por Cas9/CRISPR del exón 2
Lrp5 utilizando diferentes AR guías.
Para confirmar que pueden utilizarse otras endonucleasas específicas de secuencias con los métodos y composiciones
descritos en la presente, se produjeron alelos de Lrp5 utilizando el sistema Cas9/CRISPR. Se cultivaron células hepatoma murinas Hepal-6 en RPMI complementadas con FBS al 10 %, L-glutamina y antibióticos. Luego de la tripsinización y granulado, se electroporaron 106 células con 2 mg por plásmido que contiene ADNc que codifica hCas9 o 15 pg de Cas9 que codifica ARNm (FIG.14A-14D, SEQ ID NO: 43) utilizando el kit AMAXA Nucleofector V con el programa AMAXA Nucleofector T-028 (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se colocaron en una placa de 6 pocilios. La eficiencia de nucleofección alcanzó 80-95 %, tal como se evaluó mediante expresión GFP (PMAXGFP). Se cambió el medio fresco 24 hs posnucleofección y se cultivó el ADN genómico purificado 72 hs posnucleofección utilizando un kit de tejido y sangre DNeasy (Qiagen). Se transcribió ARNm HCas9 in vitro con un ultra kit MMESSAGE MMachine T7 (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante, lo que incluye una reacción de cola poliA. Se purificó y concentró el ARNm utilizando extracción estándar con fenol:cloroformo y precipitación de ARN.
Se generaron tres exones 2 Lrp5 de ratón con direccionamiento de ARN guía únicos (ARNg) (FIG.14A; ARNg Lrp5 T2, ARNg Lrp5 T5 y ARNg Lrp5 T7; SEQ ID NOS: 36-38).
Se cotransfectaron células N1H/3T3 o Hepal-6 ya sea con pares de dedos de cinc que codifican ADN (pZFNl+pZFN2) o con Cas9 (+pRK5-hCas9) junto con un exón 2 Lrp5 que se direcciona al ARN guía (p_ARNg T2, p_ARNg T5 o p_ARNg T7) o un plásmido de control (PMAXGFP). La secuencia de ARNg T7 se superpone con el extremo 3' de la secuencia del sitio de unión de la proteína ZFN correcta.
Para detectar mutaciones en el locus Lrp5 luego de la cotransfección, que indica la hibridación mediada por Cas9 y la posterior reparación, se realizaron ensayos SURVEYOR (Transgenomic) básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este ensayo, se hibridan los productos de la PCR. En caso de mutaciones, el complejo de hibridación contiene una falta de coincidencia que se híbrida mediante nucleasa SURVEYOR. En este ejemplo, se amplificó un producto de PCR de ~2,7kb específico para el locus genómico de exón 2 Lrp5 utilizando los cebadores P9 y P12 (SEQ ID NOS: 9 y 12) utilizando los siguientes parámetros y LA Taq (Takara): 95 °C durante 3 min, 35 ciclos de 95 °C durante 45 seg; 57 °C durante 45 seg; 70 °C durante 2 min 30 seg, seguido por 72 °C durante 7 min. Un tercio de los productos PCR se utilizó en el ensayo SURVEYOR. Se resolvieron los productos digeridos resultantes mediante electroforesis en un gel de agarosa al
1,5 %. Se identificó un corte de nucleasa mediante la presencia de fragmentos más cortos, que indicó la presencia de alelos mutantes que se hibridan con tipos salvajes.
Los tres exones 2 Lrp5 de ratón con direccionamiento de ARN guía (ARNg) mediaron eficientemente las mutaciones inducidas por Cas9 (FIG.8). La actividad de cada par ARNg/Cas9 parece ser varias veces mayor que la mutagénesis mediada por ZFN en estos experimentos. Se calcularon las tasas de mutación a partir de la secuenciación de alelos clonados TOPO a partir de un producto de PCR de 2,7 kb del locus genómico de exón 2 Lrp5. La alineación de secuencias individuales a tipos salvajes determinó la eliminación exacta (cuantificada anteriormente) o los tamaños de inserción (no se muestran datos). Se amplificó una región genómica de 2,7kb mediante PCR con los cebadores P9 y P12, tal como se describió anteriormente. Los productos PCR fueron clonados directamente utilizando clonación TOPO-TA (Invitrogen) para capturar todos los tamaños posibles de eliminación. Luego de la transformación y colocación en placas de colonias individuales, se seleccionaron clones, se aisló ADN plásmido y se secuenció de acuerdo con el método Sanger utilizando los cebadores P20 y P21. La FIG. 9A-9B ilustra un resumen de tasas de mutaciones ARNg/Cas9 (figura 9A) y tamaños de las
eliminaciones (figura 9B) en células hepatoma murinas Hepal- 6.
Ejemplo 7: Direccionamiento génico mediado por Cas9/CRISPR usando un vector donante con inactivación condicional optimizada con codones.
Las células Hepal-6 se cotransfectaron con plásmido Cas9 o ARNm, un ARNg y el donante 1 CKO Lrp5 que comprende la secuencia de exones optimizados por codones. Al comparar, algunas células se cotransfectaron con plásmidos de ZFN Lrp5 g el donante plásmido (FIG. 10). Después de 72 horas, se analizó el ADN genómico de las células transíectadas mediante PCR con un cebador específico para el exón donante Lrp5 optimizado por codones (P7; SEQ ID NO: 7) y un cebador específico para una región por fuera del brazo de homología 3' (P12; SEQ ID NO: 12). Se utilizaron los cebadores P7 y P12 para la reacción PCR con REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma) con las siguientes condiciones: 95 °C durante 3 min, 38 ciclos de 95 °C durante 45 seg.; 63 °C durante 45 seg; 72 °C durante 1 min.30 seg., seguido por 72 °C durante 7 min. Los productos PCR se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 %. Tal como se describe anteriormente, el vector donante 1 del exón 2 Lrp5 contiene un exón optimizado por codones (C0exon2) que alberga muchas
mutaciones neutrales, lo que excluye de la mutación los primeros 13 bp y los últimos 11 bp, así como también sitios loxP flanqueantes exógenos. La PCR anterior usa un cebador directo específico para la secuencia C0exon2 y un cebador inverso fuera del brazo de homología en el locus genómico, produciendo así un producto de PCR solamente si se incorpora la secuencia de exones donantes en el locus correcto Lrp5. El uso del ARNg/Cas9 tuvo como resultado la integración de la secuencia donante en el locus Lrp5 con gran eficacia, superando lo que se observó al usar el sistema ZFN y la misma estrategia de vectores donantes (FIG.10).
Ejemplo 8: Introducción dirigida mediada por Cas9/CRISPR de sitios loxP.
Para determinar si la estrategia de diseño donante y el sistema Cas9/CRISPR pueden ser utilizados para introducir sitios loxP en un locus genómico, el ADN genómico de las células transfectadas, como se describe en el Ejemplo 7, se analizó mediante análisis PCR usando un cebador ubicado fuera de los brazos de homología y un cebador anclado ya sea en 5' o 3' de los sitios loxP a partir del donante. Para la reacción genómica 5' hasta loxP 5', se utilizaron los cebadores P9 y PIO (SEQ ID NOS: 9 y 10) con un protocolo del sistema estándar Expand High Fidelity PCR System (Roche),
salvo una adición de DIVISO a una concentración final de 2 %. Los parámetros PCR fueron los siguientes: 95 "C durante 3 min, 45 ciclos de 95 °C durante 45 seg.; 63 °C durante 45 seg; 72 °C durante 1 min.30 seg., seguido por 72 °C durante 7 min. Para la reacción genómica 3' hasta loxP 3', se utilizaron los cebadores Pll y P12 siguiendo el protocolo estándar REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma). Los parámetros PCR fueron los siguientes: 95 °C durante 3 min.,
40 ciclos de 95 °C durante 45 seg.; 62,5 °C durante 45 seg; 72 °C durante 1 min.30 seg., seguido por 72 °C durante 7 min. Los productos PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Los productos PCR se obtuvieron del sitio loxP 3' a partir de las muestras aisladas de las células que se transíectaron ya sea con cualquiera de los dos ARNg Lrp5 diferentes y el donante CKO (FIG.11; p_ARNg T2). De manera similar, los productos PCR se obtuvieron a partir de las muestras aisladas de las células que se transfectaron con ARNg T7 para el sitio loxP 5' (FIG.11). Por lo tanto, la FIG. 11 muestra que las células Hepal-6, los daños de cadena doble mediados por Lrp5 ARNg T2/Cas9 y Lrp5 ARNg T7/Cas9 dieron lugar a la introducción del sitio loxP en el locus Lrp5 usando la estrategia del vector donante de exones optimizados por codones. Solamente las células electroporadas
con Cas9, ARNg y donante mostraron evidencia de sitios loxP
5' (FIG.11, superior) y 3' (FIG.11, inferior) en el locus genómico Lrp5. El ARNg T7 dio lugar a una presencia loxP 5' más prominente, mientras que los sitios loxP integrados no se detectaron con las ZFN. La ausencia de sitios loxP detectables en las muestras de ZFN y los bajos niveles en las muestras de ARNg en estos experimentos usando células Hepal-6 se puede explicar mediante las tasas de recombinación homologas en las líneas celulares y el hecho de que se analizó el conjunto celular completo transíectado, sin subconjuntos clónales. Se utilizó una única muestra de ADN genómico de ratón con un genotipo Lrp5 CKO/en peso como control positivo. Estos resultados muestran que la estrategia del diseño CKO se puede utilizar en células somáticas y que efectivamente reduce la frecuencia de los eventos de cruzamiento no deseados entre el daño de cadena doble y la ubicación de ambos sitios loxP 3' y 5'. En resumen, el direccionamiento de los loci genómicos específicos mediante la introducción de daños en el ADN mediados por nucleasa guiada con ARN, que son reparados posteriormente utilizando una secuencia donante de CKO modificada optimizando por codones, puede utilizarse para insertar sitios loxP y producir de este modo alelos de inactivación condicional.
Ejemplo 9: Direccionamiento de los loci genómicos UsplO, Nnmt y Notch3.
Para confirmar que otros genes pueden direccionarse con los métodos de la invención, se generaron donantes y ARNg para los loci genómicos UsplO, Nnmt y Notch3. Estos Cas9/ARNg y donantes se introdujeron células Hepal-6 tal como se describieron en el Ejemplo 6 y como se ilustra en la FIG.12 para introducir daños de cadena doble en el ADN en los loci respectivos y su posterior reparación utilizando el donante optimizado por codones como base. Se realizaron ensayos SURVEYOR básicamente como se describió anteriormente. Se amplificaron los productos de PCR de tamaño 2,2 - 2,7kb, específicos para los loci genómicos Lrp5, Uspl O y Notch3 utilizando los cebadores P9, P12, P22, P23, P24, P25 (SEQ ID
NOS: 9, 12, 22, 23, 24 y 25, respectivamente) y los siguientes parámetros con LA Taq (Takara): 95 °C durante 3 min, 35 ciclos de 95 °C durante 45 seg.; Ta durante 45 seg (Lrp5=57C, UsplO & Notch3 = 63); 70 °C durante 2 min. 30 seg., seguido por 72 °C durante 7 min. Se utilizó un séptimo, 1/3 y los productos PCR completos, respectivamente, en el ensayo SURVEYOR según las instrucciones del fabricante (transgenómico). Los productos digeridos resultantes que representan el corte de nucleasa donde las cadenas de tipo
salvaje y los alelos imitantes se escindieron, se resolvieron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 %.
La FIG.12 y la FIG.13 presenta que, tal como se observó con el locus Lrp5 , los loci genómicos UsplO, Nnmt y Notch3 fueron direccionados eficientemente mediante complejos ARNg/Cas9 específicos (FIG.12) y se integraron los sitios loxP (FIG. 13).
Ejemplo 10: Generación de alelos con inactivación condicional e inactivación de Lrp5 utilizando endonucleasas específicas para una secuencia guiada por ARN y donantes optimizados por codones.
Puede dirigirse el locus Lrp5 con los ARNg específicos para Lrp5 descritos en la presente para introducir un exón de tipo sándwich optimizado por codones, que crea de este modo alelos con inactivación. La posterior expresión de la proteína recombinasa Cre en células que poseen el alelo con inactivación condicional puede extraer el exón de tipo sándwich lo que tiene como resultado un alelo con inactivación.
'
'
Tabla 9. Secuencias de nucleótidos cebadores
Pese a que la invención anterior ha sido descrita en detalle a modo ilustrativo y de ej emplo con fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como que limitan el alcance de la invención . Las descripciones de todas las patentes y bibliografía científica citada en la presente se incorporan expresamente en su totalidad a modo de referencia .
Claims (30)
1. Un método para generar un alelo con inactivación condicional en una célula que comprende un gen diana. Tal método comprende las etapas de: a. introducción en la célula de una construcción donante, donde la construcción donante comprende una región 5' de homología, un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasa 3' y una región 3' de homología, donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral; y b. introducción en la célula de una nucleasa específica para una secuencia que híbrida una secuencia dentro del gen diana, lo que produce de este modo un alelo con inactivación condicional en la célula.
2. El método de la reivindicación 1, donde la nucleasa específica para la secuencia es una nucleasa de dedo de cinc (ZFN).
3. El método de la reivindicación 1, donde la nucleasa específica para la secuencia es una nucleasa efectora tipo activador de transcripción (TALEN).
4. El método de la reivindicación 1, donde la nucleasa específica para la secuencia es un dímero ZFN que híbrida al gen diana solamente una vez.
5. El método de la reivindicación 1, donde la nucleasa específica para la secuencia es una nucleasa guiada por ARN.
6. El método de la reivindicación 5, donde la nucleasa guiada por ARN es Cas9.
7. El método de la reivindicación 1, donde la nucleasa específica para la secuencia se introduce como una proteína, ARNm O ADNC.
8. El método de la reivindicación 1, donde el sitio de reconocimiento de recombinasa es un sitio loxP, un sitio frt o un sitio rox.
9. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia donante comprende siete mutaciones silenciosas.
10. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia de homología entre la secuencia donante y la secuencia diana es de 98 % o menos.
11. El método de la reivindicación 10, donde la secuencia de homología entre la secuencia donante y la secuencia diana es de 78 -Ó.
12. El método de la reivindicación 1, donde la construcción donante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30, 31, 44, 45 o 46.
13. El método de la reivindicación 1, donde la región de homología 5' comprende al menos 1,1 kb y donde la región de homología 3' comprende al menos 1 kb.
14. El método de la reivindicación 1, donde el gen diana se selecciona del grupo que consta de Lrp5, UsplO, Nnmt y Notch3.
15. El método de la reivindicación 1, donde la célula se aisló de un mamífero.
16. El método de la reivindicación 15, donde el mamífero se selecciona del grupo que consta de ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayos, gatos, perros, ovejas, caballos, vacas, monos y seres humanos.
17. El método de la reivindicación 1, donde la célula es un cigoto o una célula madre pluripotente.
18. Un método para generar un animal con inactivación condicional, tal método comprende las etapas de: a. introducción de una construcción donante en una célula que comprende un gen diana, donde la construcción donante comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasa 3' y una región de homología 3', donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral; b. introducción de una nucleasa específica para la secuencia en una célula, donde la nucleasa escinde al gen diana; e c. introducción de la célula en un animal portador para producir el animal con inactivación condicional desde la célula.
19. El método de la reivindicación 18, donde la célula es un cigoto o una célula madre pluripotente.
20. Un método para generar un animal con inactivación, tal método comprende las etapas de: a. introducción de una construcción donante en una célula que comprende un gen diana, donde la construcción donante comprende una región de homología 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasa 3' y una región de homología 3', donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral; b. introducción de una nucleasa específica para la secuencia en la célula, donde la nucleasa escinde al gen diana; c. introducción de la célula en un animal portador para producir un animal transgénico a partir de la célula transfectada; y d. reproducción del animal con inactivación condicional con un animal transgénico que tenga un transgén que codifique una proteína recombinasa que catalice la recombinación en los sitios de reconocimiento de recombinasa 5' y 3'.
21. El método de la reivindicación 20, donde la célula es un cigoto o una célula madre pluripotente.
22. El método de la reivindicación 20, donde el sitio de reconocimiento de recombinasa es un sitio loxP y donde la recombinasa es recombinasa Cre.
23. El método de la reivindicación 20, donde el sitio de reconocimiento de recombinasa es un sitio frt y donde la recombinasa es recombinasa FLP.
24. El método de la reivindicación 20, donde el sitio de reconocimiento de recombinasa es un sitio rox y donde la recombinasa es recombinasa Dre.
25. El método de la reivindicación 20, donde el transgén que codifica la recombinasa se encuentra bajo control de un promotor específico para un tejido o un promotor inducible.
26. Una composición para generar un alelo con inactivación condicional de un gen diana que comprende: a. una construcción donante que comprende una región 5' de homología, un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', una secuencia donante, un sitio de reconocimiento de recombinasa 3' y una región 3' de homología, donde la secuencia donante comprende una secuencia diana que tiene al menos una mutación neutral al compararla con la secuencia del gen diana; y b. una nucleasa específica para una secuencia que reconoce el gen diana.
27. La composición de la reivindicación 26, donde la nucleasa específica para una secuencia se selecciona del grupo que consta de ZFN, TALEN y nucleasa guiada por ARN.
28. Una construcción donante que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30, 31, 44, 45 o 46.
29. Una célula que comprende la construcción donante de la reivindicación 28.
30. Un animal no humano con inactivación condicional preparado de acuerdo con el método de la reivindicación 18.
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