CN107779462B

CN107779462B - 双同源重组谱系示踪技术

Info

Publication number: CN107779462B
Application number: CN201610756826.XA
Authority: CN
Inventors: 周斌; 何灵娟; 李燕; 蒲文娟
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2036-08-29
Also published as: CN107779462A

Abstract

本发明提供了双同源重组谱系示踪技术，具体地本发明提供了一种双同源重组系统在该系统中LoxP位点与Rox位点相嵌存在，通过该系统，在Cre重组酶或Dre重组酶作用下可以实现优先选择其中一种同源重组反应来阻断另外一种同源重组反应的发生,使用本发明的双同源重组系统可以对微生物、植物、动物进行遗传重组操作。

Description

双同源重组谱系示踪技术

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及双同源重组谱系示踪技术及其应用。

背景技术

遗传谱系示踪技术(Genetic lineage tracing)是研究发育、疾病与再生的有效手段。该技术主要利用P1噬菌体的Cre-LoxP位点特异性重组系统，该系统由Cre同源重组酶和LoxP位点组成，Cre可以特异性地识别LoxP位点，而不会识别其他位点。哺乳动物细胞中不存在Cre和LoxP，因此可以将Cre-LoxP系统导入哺乳动物体内。当两个同向的LoxP位点位于转录终止序列两侧，表达Cre的细胞内将去除终止序列，位于终止序列后的报告基因可以持续表达(如果这个位点的转录是持续开放的，如Rosa26位点)。

因为这个修饰是在DNA水平上进行的，可遗传至子代细胞，所以Cre-LoxP介导的谱系示踪是可遗传且永久性的，即使子代细胞经过谱系转变变成了其他类型的细胞，不再表达Cre，子代细胞也持续表达该报告基因(图1a)。尽管该技术在追踪体内细胞命运过程中具有强大的作用，但是也存在着明显的不足，许多关于细胞转分化的争议问题都是由于Cre表达的特异性问题。而Cre表达的特异性是则是谱系示踪技术结果准确性的关键。Cre可能并不绝对特异性的表达在靶向追踪细胞中，而在非靶向追踪细胞中Cre的表达就造成了所谓异位表达，而这种异位表达Cre的追踪结果就不一定准确了，如图所示(图1b)，如果本发明人认为Cre主要特异性的表达在A细胞中，那么B细胞中Cre的表达就视为异位表达，这时候如果本发明人做出B细胞来源于A细胞的转分化这一结论就有可能是错误的。遗传谱系示踪主要依赖于特定基因的启动子驱动Cre的表达，而基因表达的特异性并不总是特别明确，这是遗传谱系示踪技术的一个技术瓶颈。本发明旨在以一种新的谱系示踪策略来解决这一异位谱系示踪问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种遗传谱系示踪新工具及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物具有如下式(I)或式(II)所示的结构：

L-R-S-L-F1-R-F2,(I)

R-L-S-R-F1-L-F2,(II)

其中，L为loxP位点；R为rox位点；S为终止序列；F1为第一荧光标记编码基因；F2为第二荧光标记编码基因；“-”为任选的连接序列。

在另一优选例中，所述loxP位点的多核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在另一优选例中，所述rox位点的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一优选例中，所述终止序列选自下组：3xpolyA、5x polyA。

在另一优选例中，所述第一荧光标记和所述第二荧光标记的颜色不同。

在另一优选例中，所述第一荧光标记选自下组：绿色荧光标记(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光标记(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述第二荧光标记选自下组：绿色荧光标记(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光标记(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述式(I)或式(II)中，所述第一荧光标记的下游具有终止序列，优选的所述终止序列为PolyA序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物的序列选自下组：

DR1:SEQ ID NO.7；

DR5:SEQ ID NO.9；

DR11:SEQ ID NO.11；

DR12:SEQ ID NO.13。

本发明的第二方面，提供了一种重组酶系统，所述重组酶系统包括：

第一DNA构建物，所述第一DNA构建物为如权利要求1所述的DNA构建物；

第二DNA构建物，所述第二DNA构建物包括Dre基因和/或Cre基因。

在另一优选例中，所述第二DNA构建物包括Dre基因。

在另一优选例中，所述第二DNA构建物包括Cre基因。

本发明的第三方面，提供了一种基因工程化的细胞，所述细胞包括本发明第一方面所述的DNA构建物；或者所述细胞包括本发明第二方面所述的的重组酶系统。

在另一优选例中，所述细胞动物细胞(如，非人哺乳动物)、植物细胞、或微生物细胞(真核微生物细胞、原核微生物细胞)。

本发明的第四方面，提供了一种遗传重组方法，所述方法包括步骤：

提供一基因工程化的细胞，所述细胞中包括：

(1)第一DNA构建物，所述第一DNA构建物为如权利要求1所述的DNA构建物；和，

(2)第二DNA构建物，所述第二DNA构建物包括Dre基因和/或Cre基因；

所述Dre基因和/或Cre基因在所述细胞中表达后，对所述第一DNA构建物进行剪切，从而发生所述遗传重组。

在另一优选例中，所述第一DNA构建物整合于所述细胞的基因组中。

在另一优选例中，所述第二DNA构建物包括Dre基因，所述Dre基因表达Dre重组酶后，所述Dre重组酶切除所述两个LoxP位点之间的序列，从而发生所述遗传重组。

在另一优选例中，所述第二DNA构建物包括Cre基因，所述Cre基因表达Cre重组酶后，所述Cre重组酶切除所述两个rox位点之间的序列，从而发生所述遗传重组。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的DNA构建物、本发明第二方面所述的重组酶系统、本发明第三方面所述的基因工程化的细胞在制备转基因动物中的用途。

本发明的第六方面，提供了一种构建转基因动物的方法，包括如下步骤：

(1)提供基因组中含有所述第一DNA构建物的第一转基因动物，所述第一DNA构建物为本发明第一方面所述的DNA构建物；

(2)提供基因组中含有所述第二DNA构建物的第二转基因动物，所述第二DNA构建物包括Dre基因和/或Cre基因；

(3)将所述第一转基因动物和所述第二转基因动物交配，在子代动物中发生同源重组从而获得所述转基因动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.遗传谱系示踪原理及其技术瓶颈

(a)A细胞表达同源重组酶Cre，Cre识别A细胞中Rosa26位点上的loxP位点后切除了位于两个loxP位点之间的stop位点，从而使tdTomato红色荧光蛋白表达，由于该反应是在DNA水平上进行的，所以可遗传至子代细胞，因此，A细胞的后代也将永久表达tdTomato,由于B细胞没有Cre的表达，但是表达tdTomato，所以可以确定B细胞是A细胞的后代。(b)同a中一样，A细胞表达Cre并且使其自身及后代永久表达tdTomato，但是当B细胞也表达Cre时，B细胞也表达tdTomato，这时候就无法确定B细胞是否是A细胞的后代。

图2.双同源重组系统工具小鼠DR1的构建及验证

(a)ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠与报告基因小鼠R26-rox-tdTomato和R26-loxP-tdTomato小鼠交配后取E9.5天胚胎结果，结果显示只能发生Cre-loxP和Dre-rox同源重组反应，而不会发生Cre-rox和Dre-loxP同源重组反应。(b)DR1小鼠构建策略示意图。(c)DR1与ACTB-Cre和CAG-Dre交配后发生同源重组反应结果示意图。(d)DR1与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的E19.5全胚胎明场和荧光结果图。(e)DR1与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的E19.5胚胎切片ZsGreen和RFP免疫荧光结果图。每个图片代表至少3个单独样本。

图3.DR1能够正常进行可诱导性同源重组反应

(a)CAG-DreER基因敲入小鼠构建策略示意图。(b)CAG-DreER小鼠与报告基因小鼠R26-rox-tdTomato交配后全胚胎和切片免疫荧光结果图。E14.5>E16.5表示于E14.5注射tamoxifen诱导，E16.5天收取胚胎；No tam表示没有经过tamoxifen诱导的对照组。(c)DR1与CAG-DreER小鼠交配及tamoxifen诱导策略图。(d)DR1与CAG-DreER小鼠交配后在有或无tamoxifen诱导后的全胚胎和切片免疫荧光染色结果。Tam组tamoxifen诱导时间为E12.5。(e)DR1与UBC-CreER小鼠交配及tamoxifen诱导策略图。(f)DR1与UBC-CreER小鼠交配后经tamoxifen诱导后的E15.5全胚胎和切片免疫荧光染色结果,tamoxifen诱导时间为E13.5。

图4.Cre和Dre均不能与LoxP-rox混合位点发生同源重组反应

(a)图示为包含loxP和rox混合位点的DR31小鼠示意图。(b)DR31与ACTB-Cre和CAG-Dre交配后得到三种基因型E13.5胚胎(DR31；ACTB-Cre、DR31；CAG-Dre、DR31；ACTB-Cre；CAG-Dre)的全胚胎名场和荧光结果图。(c)b中所示胚胎切片ZsGreen和RFP免疫荧光结果图。(d)图示总结说明无论是单独的Cre、Dre还是Cre、Dre同时存在均不能与loxP-rox混合位点发生同源重组反应。

图5.双同源重组系统中可实现利用其中一种持续性同源重组的优先发生来阻断另外一种可诱导性同源重组反应的发生

(a)Tie2-Cre；DR1小鼠E15.5天心脏切片ZsGreen和血管内皮细胞标记基因CDH5免疫荧光染色结果，显示Tie-Cre主要标记血管内皮细胞。(b)Tie-Cre与Apln-DreER和DR1交配于E11.5进行tamoxifen诱导后得到的E13.5天Tie2-Cre；Apln-DreER；DR1胚胎及其同窝对照Apln-DreER；DR1的心脏切片ZsGreen和CDH5的免疫荧光结果，结果显示Tie2-Cre的存在阻断了Apln-DreER与DR1发生的可诱导性Dre-rox同源重组。(c)图示表示Tie2-Cre与Apln-DreER和DR1交配后发生的同源重组反应结果。

图6.Tnni3-Dre基因敲入小鼠的构建及验证

(a)Tnni3-Dre小鼠的构建策略示意图。(b)Tnni3-Dre小鼠的验证策略示意图。(c，d)Tnni3-Dre分别与R26-rox-tdTomato和DR1小鼠交配后，取其新生小鼠(P0或P1)心脏的全标本荧光拍照及其切片的TNNI3和tdTomato免疫荧光染色结果图，结果证明Tnni3-Dre识别rox位点发生同源重组反应标记了全部的心肌细胞。(e)Tnni3-Dre与R26-loxP-tdTomato小鼠交配后，取其成体8w心脏的全标本荧光拍照及其切片的TNNI3和tdTomato免疫荧光染色结果图，结果证明Tnni3-Dre不能识别loxP位点发生同源重组反应。

图7.心肌细胞中可实现持续性的Dre-rox同源重组反应阻断诱导性的Cre-LoxP同源重组反应

(a)图示表示三种不同基因小鼠获得的交配方法，在小鼠6周时进行tamoxifen诱导，并于3天后收取小鼠心脏组织。(b，c)aMHC-MerCreMer；DR1、aMHC-MerCreMer；DR1、Tnni3-Dre；aMHC-MerCreMer；DR1三种基因型小鼠心脏的全标本拍照及切片免疫荧光染色结果。(d)图示说明Tnni3-Dre存在时优先在心肌细胞中发生的Dre-rox同源重组反应阻断了aMHC-MerCreMer与DR1之间发生的Cre-loxP同源重组反应。

图8.在生理稳态过程中Kit⁺的心肌干细胞并不贡献于心肌细胞

(a)8周大小的Kit-CreER；DR1和Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠心脏的全标本名场和荧光拍照结果。出生后进行多次tamoxifen诱导。箭头表示ZsGreen⁺心肌细胞。(b)a中小鼠心脏切片的ZsGreen、RFP和TNNI3的免疫荧光染色结果，结果显示Kit-CreER；DR1小鼠心脏中检测到较多ZsGreen⁺tdTomato^-心肌细胞，而Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠心脏中则未检测到任何多ZsGreen⁺tdTomato^-心肌细胞。(c)Kit-CreER；DR1和Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠心脏中ZsGreen⁺tdTomato^-心肌细胞的定量结果，n＝4。(d)Kit-CreER；DR1和Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠心脏切片的ZsGreen、RFP和CDH5的免疫荧光染色结果,两种策略中均标记了大量的血管内皮细胞。(e)Kit-CreER；DR1和Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠心脏中ZsGreen⁺血管内皮细胞的定量结果，n＝4。

图9.双同源重组系统工具小鼠DR5的构建及验证

(a)DR5小鼠构建策略示意图。(b)DR5与ACTB-Cre和CAG-Dre交配后发生同源重组反应结果示意图。(c)DR5与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的全胚胎明场和荧光结果图。(d)DR5与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的胚胎切片ZsGreen和RFP免疫荧光结果图。每个图片代表至少3个单独样本。

图10.双同源重组系统工具小鼠DR11的构建及验证

(a)DR11小鼠构建策略示意图。(b)DR11与ACTB-Cre和CAG-Dre交配后发生同源重组反应结果示意图。(c)DR11与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的全胚胎明场和荧光结果图。(d)DR11与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的胚胎切片ZsGreen和RFP免疫荧光结果图。每个图片代表至少3个单独样本。

图11.双同源重组系统工具小鼠DR12的构建及验证

(a)DR12小鼠构建策略示意图。(b)DR12与ACTB-Cre和CAG-Dre交配后发生同源重组反应结果示意图。(c)DR12与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的全胚胎明场和荧光结果图。(d)DR12与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配后的胚胎切片ZsGreen和RFP免疫荧光结果图。每个图片代表至少3个单独样本。

图12.本发明的新同源重组遗传谱系示踪系统在体外也能够正常行使其功能。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种双同源重组系统，在该系统中LoxP位点与Rox位点相嵌存在，通过该系统，在Cre重组酶或Dre重组酶作用下可以实现优先选择其中一种同源重组反应来阻断另外一种同源重组反应的发生,使用本发明的双同源重组系统可以对微生物、植物、动物进行遗传重组操作。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

Dre-rox同源重组

Dre是一种高效的位点特异性的DNA同源重组酶，主存在于噬菌体中，不存在于哺乳动物中。Cre识别loxP位点发生同源重组反应，而Dre则识别rox位点发生同源重组反应，且Cre-loxP与Dre-rox两种同源重组反应之间不发生交叉反应。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明中所用的Dre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明中所用的rox位点序列如下：

TAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTA(SEQ ID NO.3)。

Cre-loxP同源重组

遗传谱系示踪技术主要利用P1噬菌体的Cre-LoxP位点特异性重组系统，该系统由Cre同源重组酶和LoxP位点组成，Cre可以特异性地识别LoxP位点，而不会识别其他位点。哺乳动物细胞中不存在Cre和LoxP，因此可以将Cre-LoxP系统导入哺乳动物体内。当两个同向的LoxP位点位于转录终止序列两侧时，表达Cre的细胞内将会去除终止序列。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明中所用的Cre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；其编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明中所用的loxP位点序列如下：

ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO.6)。

组成型启动子(constitutive promoter)

组成型启动子是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。目前使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Ocs启动子，后者虽来自细菌，但具有植物启动子的特性。

在本发明的DNA构建物中可以使用组成型启动子控制目的基因的表达。如，在Cre或Dre基因的上游，可操作的连接组成型启动子。

在本发明中，优选利用全身性表达的CAG启动子。

组织特异启动子(tissue-specific promoter)

组织特异启动子又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如Tnni3,cTNT启动子，在心肌细胞中特异性表达，。

在本发明的DNA构建物中可以使用组织特异性启动子控制目的基因的表达。如，在Cre或Dre基因的上游，可操作的连接组织特异性启动子，以使Cre或Dre基因能够在特定组织中表达。

诱导型启动子(inducible promoter)

诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。

在本发明的DNA构建物中可以使用诱导型启动子控制目的基因的表达。如，在Cre或Dre基因的上游，可操作的连接诱导型启动子。

双同源重组系统

本发明提供了一种双同源重组系统，包括：

第一DNA构建物，所述第一DNA构建物具有如下式(I)或式(II)所示的结构：

L-R-S-L-F1-R-F2,(I)

R-L-S-R-F1-L-F2,(II)

其中，L为loxP位点；R为rox位点；S为终止序列；F1为第一荧光标记编码基因；F2为第二荧光标记编码基因；和

第二DNA构建物，所述第二DNA构建物包括Dre基因和/或Cre基因。

在含有所述双同源重组系统的细胞中，Dre基因表达的Dre重组酶或Cre基因表达的Cre重组酶，对所述第一DNA构建物进行剪切，从而发生基因重组。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述第一DNA构建物的5’端还包括启动子序列。优选地，所述启动子为CAG启动子。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述第一DNA构建物的5’端还包括5’同源臂和/或3’端还包括3’同源臂。优选地，所述5’同源臂位于任选地所述启动子的上游。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述第一DNA构建物中还包括标记基因和/或增强表达序列。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述第一DNA构建物中还包括Frt位点序列、WPRE序列、和/或Neo序列。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述第一DNA构建物的序列选自下组的构建物DR1、DR5、DR11、DR12。

DR1:(L-R-S-L-F1-R-F2，其中F1为绿色荧光标记，F2为红色荧光标记)

在本发明的一个优选地实施方式中，所述构建物DR1包含如下序列：

ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGTGGCAGCGAGCTAACTTTAAATAATTGGCA TTATTTAAAGTTATCGCGATGAATAAATGAAAGCTTGCAGATCTGCGACTCTAGAGGATCTGCGACTCTAGAGGAT CATAATCAGCCNTACCACATTTTGTAGAGGTTTTACTNGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAA ACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATC ATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAAC CTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATA ATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTT GTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTG TAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGT TGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTT TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCCCATCAAGCTGA TCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTAGATCGAATTCGGCCGGCCGATATCGGCGCGCCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGA CCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTT CAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCC GCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCG CCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAG CGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAG AAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACG TGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGT GCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAG AAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTGATAAGATATCTCGAGGGATCTTTGTG AAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAA AATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGA TGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGAT GAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTT CAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAA GGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTAT AATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGT GTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAA TCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAA AATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAAT TTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT GGATCTGACATGGTAAGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCGAGGGACCTAGCATCCGTAACTTTAAATAATTGGCATTAT TTAAAGTTATAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTAGATCGAATTCGGCCGGCCTTCACGATGCCGCCACCATGG TGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGA GTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGC GGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCG CCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGG CGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACC AACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCC GCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAA GACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCC CACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGGGGCATGGCA CCGGCAGCACCGGCAGCGGCAGCTCCGGCACCGCCTCCTCCGAGGACAACAACATGGCCGTCATCAAAGAGTTCAT GCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCC TACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCC CCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCC CGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTG CAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGA AGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGC CCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTG CCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACG AGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.7)，

其中第1-第34位为loxP位点序列、第50-第81位为rox位点序列、第88-第918位为终止序列、第920-第953位为loxP位点序列、第1020-第1175位为绿色荧光标记编码基因、第1724-第2623位为终止序列、第2630-第2661位为rox位点序列、第2725-第4155位为红色荧光标记编码基因,其余为连接序列。

更优选地，所述构建物DR1包含如SEQ ID NO.8所示的序列，其中SEQ ID NO.8中，第1位-第1087位为5’同源臂、第1120-第2739位为CAG启动子、第2858-第2891位为loxP位点序列、第2907-第2938位为rox位点序列、第2945-第3775位为终止序列、第3777-第3810位为loxP位点序列、第3877-第4572位为绿色荧光标记编码基因、第4581-第5480位为终止序列、第5487-第5518位为rox位点序列、第5582-第7012位为红色荧光标记编码基因、第7080-第7667位为WPRE序列、第7677位-第7869位为终止序列、第7909位-第7942位为Frt位点序列、第7943位-第9423位为Neo序列、第9424位-第9685位为终止序列、第9703位-第9736位为Frt位点序列、第9761位-第14019位为3’同源臂。

DR5:(L-R-S-L-F1-R-F2，其中F1为红色荧光标记，F2为绿色荧光标记)

在本发明的一个优选地实施方式中，所述构建物DR5包含如下序列：

ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCGGACTCGTGGCAGCGAGCTAACTTTAAATAA TGCCAATTATTTAAAGTTATCGCGATGAATAAATGAAAGCTTGCAGATCTGCGACTCTAGAGGATCTGCGACTCTA GAGGATCATAATCAGCCNTACCACATTTTGTAGAGGTTTTACTNGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAA CCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAAT AGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT CTTATCATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTA AAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAG CTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTG TGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCA CATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAAT TGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAA GCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCCCATCA AGCTGATCCGGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTAGATCGAATTCGGCCGGCCTTCACGTGTTGCACTTAACGCGTGGCCGGCCTTCACGATCCCGCCACCATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACG AGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGG CGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCC GCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACG GCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCAC CAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCC CGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCA AGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTC CCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGGGGCATGGC ACCGGCAGCACCGGCAGCGGCAGCTCCGGCACCGCCTCCTCCGAGGACAACAACATGGCCGTCATCAAAGAGTTCA TGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC CTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCC CCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCC CCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCT GCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAG AAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGG CCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACT GCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTAC GAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

TTAACTTTAA ATAATGCCAATTATTTAAAGTTATAGGTCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTAGATCGAATTCGGCCGGCCTTCACGTGTTGCACTTAACGCGTGGCCGGCCTTCACGATCCCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGAT GACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCC TTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCG CCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCC CGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTG AGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGA AGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGA CGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCC GTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACC AGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTGA(SEQ ID NO.9)

更优选地，所述构建物DR5包含如SEQ ID NO.10所示的序列。

DR11:(R-L-S-R-F1-L-F2，其中其中F1为红色荧光标记，F2为绿色荧光标记)

在本发明的一个优选地实施方式中，所述构建物DR11包含如下序列：

TAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGCTAGCATTTAAATATAACTTCGTATAGCATACATT ATACGAAGTTATCGCGATGAATAAATGAAAGCTTGCAGATCTGCGACTCTAGAGGATCTGCGACTCTAGAGGATCA TAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACA TAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACA AATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATG TCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTC CCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATG GTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC CAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAG AGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGT TAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTT TCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCCCATCAAGCTGATCCGGAACCGCGATCGCTAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGTCGGCTGGAGGACTCCACCGGCAGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACG GCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGAC CAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAG CACCCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCG AGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCG CGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTG TACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGG AGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACAT CACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGGGG CATGGCACCGGCAGCACCGGCAGCGGCAGCTCCGGCACCGCCTCCTCCGAGGACAACAACATGGCCGTCATCAAAG AGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGG CCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATC CTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGT CCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTC CTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATG CAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCC ACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGT GCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAA CAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGCCTCGCTGGCCCTCGAGGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTA AAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAG ATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAG AAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGA AGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGC TTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTA TAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAA TAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGT GCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTC CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAAT AAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCAT CAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGACATGGTAAGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCGAGGGACCTATAGGGATAAC AGGGTAATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGTCGGCTGGAGGACTCCACCGGCAGCCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACA AGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGG CGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCC CAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACG GCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTA CGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATC ATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGC GCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAA GCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCC GCCTTGCCCTGA(SEQ ID NO.11)

更优选地，所述构建物DR11包含如SEQ ID NO.12所示的序列。

DR12:(R-L-S-R-F1-L-F2，其中F1为绿色荧光标记，F2为红色荧光标记)

在本发明的一个优选地实施方式中，所述构建物DR12包含如下序列：

TAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGCTAGCATTTAAATATAACTTCGTATAGCATACATT ATACGAAGTTATCGCGATGAATAAATGAAAGCTTGCAGATCTGCGACTCTAGAGGATCTGCGACTCTAGAGGATCA TAATCAGCCNTACCACATTTTGTAGAGGTTTTACTNGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAAC ATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCAC AAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCAT GTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCT CCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAAT GGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGT CCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGCGACTCTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTA GAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTG TTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTT TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCCCATCAAGCTGATCCGGAACCGCGATCGCTAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTAGTCGGCTGGAGGACTCCACCGGCAGCCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGC CACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGG AGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTA CCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAG GACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGT TCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAA GATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGC TTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGC ACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGG CTCCGCCTTGCCCTGAGGCCTCGCTGGCCCTCGAGGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAA TTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTAC TGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAA TGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACT CCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTG TGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAAT TATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCA CACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGG TTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC TTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTT TATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAT TCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGACATGGTAAGTAAGCTTGGGCTG CAGGTCGAGGGACCTATAGGGATAACAGGGTAATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGTCGGCTGGAGGACTCCACCGGCAGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGT GCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACC CAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGT ACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAA GTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACG CTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCT GGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAA GGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTAC TACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGG GCCGCCACCACCTGTTCCTGGGGCATGGCACCGGCAGCACCGGCAGCGGCAGCTCCGGCACCGCCTCCTCCGAGGA CAACAACATGGCCGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTC GAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCC CCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGA CATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGT CTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACT TCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGA CGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACC ATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACA ACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGACGA GCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.13)

更优选地，所述构建物DR12包含如SEQ ID NO.14所示的序列。

转基因动物的构建

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的构建转基因动物的方法，包括如下步骤：

(1)提供基因组中含有所述第一DNA构建物的第一转基因动物；

(2)提供基因组中含有所述第二DNA构建物的第二转基因动物；

优选地，所述动物为哺乳动物，如人、小鼠、家禽(如鸡、鸭、鹅、鸽)、家畜(如猪、牛、羊、马、驴、鹿)、狗、猫、猴。

包含本发明的DNA构建物的转基因动物，可以使用本领域常规的方法进行构建。

以下例举在本发明的一个优选地实施方式中，使用的转基因动物的构建方法，该方法包括步骤：

1.ES(Embryonic stem cell，ES)细胞打靶载体构建：

通过PCR的方法获得ZsGreen，tdTomato，RFP，Amcyan，EYFP，mCFP,核定位EGFP,核定位tdTomato等荧光蛋白DNA片段；通过在引物上引入loxp，rox，FRT位点的方法PCR扩增获得rox-stop-rox，loxp-stop-loxp，FRT-stop-FRT等元件，利用酶切连接及In-fusion的方法获得Knockin片段；通过Infusion的方式，将Knockin片段连入经XbaI/AscI C1007骨架载体，获得包含5'同源臂、Knockin片段、3’同源臂和DTA负筛选基因的质粒载体，并经酶切、测序证明正确。获得的该载体，即为针对Rosa26位点的Rosa系列定点敲入ES细胞打靶载体。

2.ES细胞电转和抗性克隆筛选：

C57BL/6J*129S3背景ES细胞按常规方法培养于丝裂霉素C处理的滋养层细胞上。将处于对数生长期的ES细胞胰酶消化后与35μg线性化的ES细胞打靶载体混匀，转移至无菌电穿孔杯中以240V、500μF的电参数进行电穿孔，重新悬浮后平均分配到三个已铺好滋养层细胞的10cm盘培养皿中培养。电转24h和48h后分别更换含有药物G418和Ganciclovir的培养液进行抗性克隆筛选，经7-8天选择性培养，待抗性ES细胞克隆长至肉眼可见时进行挑取。抗性克隆经胰酶消化后接种于96孔细胞培养板中培养，待细胞长满到60％-80％后取大部分细胞冻存，剩余细胞继续培养至长满100％后用于提取基因组DNA。

3.同源重组阳性克隆PCR鉴定：

以提取的ES细胞基因组DNA为模板，在同源重组臂外侧分别设计P1和P4引物，在CAG promoter序列上设计P2引物，在抗性基因Neo上设计引物P3引物。用P1与P2引物配对，鉴定5′臂同源重组阳性克隆，同源重组克隆应扩增出1846bp片段；用P3和P4引物配对鉴定3′臂同源重组阳性克隆，同源重组克隆应扩增出4838bp片段。5′臂和3′臂重组PCR鉴定均为阳性的ES细胞克隆为同源重组阳性克隆，进行后续的囊胚注射。

4.嵌合体小鼠获得：

同源重组阳性ES细胞经扩增后，胰酶消化至单细胞，每枚囊胚注射15个左右的ES细胞，将注射后的胚胎移植到2.5天假孕母鼠子宫中，每侧移植8-10枚。假孕母鼠自然分娩，产下的后代即为嵌合体小鼠。

5.阳性杂合子小鼠获得：

挑选毛色嵌合率大于50％的雄性嵌合鼠与C57BL/6J纯系小鼠交配，对获得的子代小鼠进行PCR鉴定，鉴定方法同阳性ES细胞PCR鉴定，PCR鉴定阳性小鼠即为Rosa26位点定点敲入的阳性杂合子小鼠。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的重组系统中LoxP位点与Rox位点相嵌存在，通过该系统，在Cre重组酶或Dre重组酶作用下可以实现使用其中一种同源重组反应来阻断另外一种同源重组反应的发生；

(2)使用本发明的重组系统能够解决传统谱系示踪中无法解决的异位同源重组问题。

(3)使用本发明的重组系统能够解决不同组织器官中有无干细胞的问题。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

材料

1.质粒与菌株含Gt(ROSA)26Sor同源臂的质粒购买于Addgene；DH5a感受态细胞购自天根生物；其他质粒为在此基础进行改建。

2.试剂：各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA polymerase、Taq酶及P CR相关试剂购自TaKaRa公司；L-阿拉伯糖、盐酸、四环素等常规化学试剂主要购自Sigma和上海化学试剂公司。胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；Ga teway LR反应试剂盒购买于Invitrogen；In-fusion反应试剂盒购自Takara公司。

3.细胞培养相关试剂：C57BL/6J*129S3小鼠背景的ES细胞，来自于上海南方模式生物研究中心；ES细胞培养所需的DMEM培养基(高糖，ES细胞级)、胎牛血清(ES细胞级)、G418、Gancyclovir、LIF、青链霉素、胰蛋白酶等分别购自Gibco公司、Sigma公司、Chemicon公司。

4.实验动物：实验中使用的C57BL/6J和ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，均饲养于SPF级环境中，室温维持在21-24℃范围内，保持12小时昼夜节律。所有动物实验方案均通过了上海南方模式生物研究中心伦理委员会的审核通过。

方法：

1.ES细胞打靶载体制备：PCR、限制性内切酶酶切、连接等反应体系及反应条件参照相关产品的说明书；电转前的质粒大量抽提操作参照Qiagen公司的质粒抽提说明书；质粒小量抽提的方法如下：

从带有抗性的LB平板上，挑选一个单克隆，接种到3ml LB培养基中，培养过夜；离心收集菌液，弃上清；加入100ul的Solution S1并吹打均匀；加入200ul Solution S2，上下轻柔颠倒4～6次至混合完全，室温静置5min；加入150ul预冷的Solution S3，立即上下轻柔颠倒4～6次至混合，放于冰上15min。将EP管用离心机离心(4℃，转速20000g，离心10min)，用移液器吸取上清液，加入另一EP管中；加入400ul氯仿，剧烈震荡；将EP管用离心机离心(室温，转速20000g，离心10min)，用移液器小心吸取上清液加入另一EP管中；加入2.5体积无水乙醇，混匀，冰上10min；将EP管用离心机离心(温度4℃，转速20000g，离心10min)弃上清，用移液器加入1ml 75％乙醇；将EP管用离心机离心(室温，转速20000g，离心5min)，弃上清，空气中干燥2～10min，加入20-50ul无菌水。

2.ES细胞培养及电转：

ES细胞复苏后接种于铺有小鼠胚胎成纤维细胞制备的滋养层上，37℃，7.5％CO2培养于ES细胞专用培养基，2-3天传代一次。收集处于对数期生长的ES细胞并计数，将1×107ES细胞重悬于800μl PBS中，加入约35μg线性化打靶载体，补加PBS将总体积加至900μl，将其混匀后加入电转杯中，冰上放置5-10min，240V、500μF，电击后将电转杯迅速转至冰上静置10min；将细胞悬液转移至新鲜培养基中。电转24小时后，培养基中加G418至300ug/ml；48小时后补加Gancidovir至0.5M，进行正负筛选；筛选7-8天后，于显微镜下挑克隆至96孔板培养，培养2天后细胞1传2，待细胞长满96孔板后，一份冻存，一份抽基因组。

3.ES细胞基因组抽提：ES细胞在96孔板上长满后，吸去培养基，PBS洗一次，吸去PBS，加72ul裂解液，8ul蛋白酶K溶液于56度恒温箱放置8-24小时。为了避免裂解液蒸发掉，需将96孔板用parafilm膜封好；向96孔板每孔加入160ul的无水乙醇，4度冰箱静置8-72小时；96孔板平板用离心机离心3000rpm，离心30min，离心完后，倒掉上清，用移液器向96孔板每孔加入200ul 75％乙醇，用离心机离心3000rpm，离心时间：30min；倒掉上清，空气中干燥5～10min，用移液器向96孔板每孔加入150ul无菌水。

4.小鼠鼠尾基因组抽提：剪取2周龄小鼠鼠尾2-5mm，加500μL裂解液以及50μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，56℃杂交炉过夜消化蛋白，之后12000rpm离心5min，吸取上清，加入两倍体积无水乙醇沉淀，12000rpm离心5min，75％乙醇洗涤一次，12000rpm离心5min，弃上清，晾干，溶解于200μL的超纯水中，用于后续的PCR鉴定。

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1.基于Cre-loxP和Dre-rox的双同源重组谱系示踪系统工具小鼠DR1的构建及验证

基于Cre-loxP的谱系示踪系统有两个关键因素，分别是Cre的表达谱以及含有loxP位点的报告基因系统。因此，改进现有的谱系示踪系统可以从这两个方面着手。由于获得精确的Cre的表达谱相对较难实现，所以，本发明的研究重点主要放在改进现有的含有loxP位点的报告基因系统上。由于现有谱系示踪系统存在一个相对很难解决的问题，就是当Cre出现了异位表达(即理论上Cre被认为表达在A类细胞中，而实际上Cre也表达在了其它类型的细胞中且较难被检测到)时，得到实验结果的可靠度极大降低，这也是目前许多重大科学问题出现争议的主要原因之一。为此，本发明人设计了一个可以防止Cre-loxP发生异位同源重组的双同源重组系统，在该系统中，本发明人将与Cre-loxP类似的同源重组系统Dre-rox引入了原来的报告基因系统中。本发明人首先将ACTB-Cre和CAG-Dre分别与报告基因小鼠R26-loxP-tdTomato和R26-rox-tdTomato交配，证明Cre只识别loxP位点，Dre只识别Rox位点，而不会发生Cre-rox和Dre-loxP同源重组反应(图2a)，这与本发明人之前的实验结果相一致。根据这一特性本发明人构建了同时含有两个loxP位点和两个Rox位点的报告基因系统DR1,在这个报告基因系统中，LoxP位点与Rox位点相嵌存在(图2b)。为了验证本发明的报告基因小鼠是否构建成功，本发明人首先将DR1报告基因小鼠分别与全身表达的ACTB-Cre和CAG-Dre杂交(图2c)，取胚胎观察全胚胎荧光情况，并做切片和免疫荧光染色。结果证实CAG-Dre；DR1小鼠胚胎全部显示tdTomato⁺ZsGreen^-，ACTB-Cre；DR1小鼠胚胎全部显示tdTomato^-ZsGreen⁺(图2d,e)，该结果初步证实本发明的双同源重组报告基因小鼠构建成功。

为了验证DR1是否能够与可诱导性的CreER或DreER发生正常的同源重组反应，本发明人计划将DR1与全身性表达的CreER和DreER小鼠杂交，为此本发明人首先构建了CAG-DreER基因敲入小鼠，并且验证其构建成功(图3a，b)。接下来，本发明人将DR1与CAG-DreER小鼠杂交，并取胚胎进行全胚胎荧光拍照和切片免疫荧光染色分析，结果显示，在经过tamoxifen诱导后，CAG-DreER；DR1小鼠胚胎显示tdTomato⁺ZsGreen^-。而在无tamoxifen诱导时，并没有荧光显示(图3c，d)。同样，本发明人将DR1与可诱导性的全身性表达的UBC-CreER小鼠杂交，在经过tamoxifen诱导后，UBC-CreER；DR1小鼠胚胎显示tdTomato^-ZsGreen⁺(图3e，f)。上述结果证明，本发明的DR1报告基因小鼠能够正常应用到可诱导性的遗传谱系示踪中。

根据本发明的设计原理，双同源重组报告基因系统在同一细胞中Cre-loxP和Dre-rox同源重组反应只能发生一种，其中一个同源重组反应的发生(如Dre-rox)能够切除另外一个同源重组反应的重组酶的一个识别位点(如loxP位点)，从而阻止了另外一个同源重组反应在同一细胞中的发生(图1中的细胞B)。在本发明的DR1中，当Dre-rox同源重组反应发生后，切掉了一个loxP位点和ZsGreen cDNA序列，在该细胞中就不能再发生Cre-loxP同源重组反应介导的ZsGreen表达。但是当Cre-loxP同源重组反应发生后，切掉了一个rox位点和STOP序列，而留下了LoxP-ZsGreen-polyA-rox-tdTomato序列。为了验证留下的loxP-rox位点是否能够被Dre或Cre识别发生同源重组反应而使tdTomato表达，本发明人构建了DR31小鼠(R26-loxP-ZsGreen-polyA-rox-tdTomato),且将该小鼠与ACTB-Cre和CAG-Dre小鼠交配，分别得到ACTB-Cre；DR31、CAG-Dre；DR31和ACTB-Cre；CAG-Dre；DR31三种小鼠胚胎，通过观察全胚胎荧光表达和切片免疫荧光染色分析，本发明人发现所有这些胚胎都只表达ZsGreen绿色荧光而不表达tdTomato红色荧光，说明Dre/Cre并不能与loxP-rox混合位点发生同源重组反应(图4)。

实施例2.双同源重组系统可实现Cre-loxP或Dre-rox选择性优先发生来阻断另外一种同源重组反应的发生

为了能够选择Cre-loxP或Dre-rox在本发明的DR1双同源重组系统中优先发生，本发明人同时将持续性和可诱导性的同源重组系统与DR1结合起来(如x-Dre；y-CreER；DR1或x-Cre；y-DreER；DR1)，理论上，在这一系统中，当持续性的同源重组反应(如Cre-loxP)发生后，那么可诱导性的同源重组反应(DreER-rox)将不能够再在同一细胞中发生。为了验证这一理论，本发明人首先以已有的冠状血管内皮细胞的工具小鼠(Tie2-Cre和Apln-DreER)为研究对象，Tie2-Cre主要标记心内膜细胞和冠状血管内皮细胞(图5a)，而Apln主要表达在冠状血管内皮细胞中，因此，理论上Tie2-Cre；Apln-DreER；DR1将优先在血管内皮细胞中发生Cre-loxP同源重组反应，表达ZsGreen绿色荧光蛋白，那么，当利用tamoxifen诱导Apln-DreER表达入核后，血管内皮细胞则无法再发生Dre-rox同源重组反应，因此无法再表达tdTomato红色荧光蛋白。本发明人将Tie-Cre、Apln-DreER和DR1小鼠交配，于E11.5天进行tamoxifen诱导，并在一窝胚胎中同时获得了E13.5的Tie2-Cre；Apln-DreER；DR1和Apln-DreER；DR1胚胎，通过这两组基因型胚胎切片和免疫荧光染色本发明人发现，Tie2-Cre；Apln-DreER；DR1组结果显示ZsGreen⁺tdTomato^-，而Apln-DreER；DR1作为阳性对照组显示了ZsGreen^-tdTomato⁺，说明Tie-Cre介导的持续性的Cre-loxP同源重组反应确实阻断了后来发生的Apln-CreER介导的诱导性Dre-rox同源重组反应(图5b，c)。综上，本发明的双同源重组系统可以实现优先选择其中一种同源重组反应来阻断另外一种同源重组反应的发生。

实施例3.利用双同源重组系统解决异位同源重组问题

接下来，本发明人将上述双同源重组系统策略应用到阻断细胞的异位同源重组反应中(图1b)。目前心血管领域仍然具有争议的一个重要科学问题是成体心脏中是否存在所谓Kit⁺干细胞分化成为心肌细胞，主要争议的焦点在于Kit驱动的Cre特异性表达问题。目前关于Kit⁺干细胞能够变成心肌细胞这一结论主要基于Kit-CreER的遗传谱系示踪结果，然而当Kit-CreER微量的表达在心肌细胞(此处即视为Kit-CreER异位表达)中时，上述谱系示踪结果的解释将不再可靠。此处有两种可能，其一是确实存在Kit⁺干细胞分化成为了心肌细胞，其二是并没有所谓Kit⁺干细胞分化成为了心肌细胞，而其实只是Kit本身表达在了心肌细胞中的结果。为了解决上述问题，本发明人将双同源重组遗传谱系示踪系统应用于此来阻断Kit-CreER在心肌细胞中的特异性表达。本发明人首先构建了心肌细胞特异性表达的Tnni3-Dre小鼠，并分别将其与报告基因小鼠Rosa26-rox-tdTomato和DR1报告基因小鼠交配进行验证(图6a，b)，结果显示，Tnni3-Dre均标记了100％的心肌细胞(图6c,d)，将Tnni3-Dre小鼠Rosa26-loxP-tdTomato交配，则没有发现任何被标记的细胞(图6e)，上述结果说明Tnni3-Dre构建成功。

为了验证Tnni3-Dre是否成功切除了DR1报告基因小鼠所有心肌细胞中位于两个rox位点之间的loxP位点，本发明人通过交配获得了Tnni3-Dre；aMHC-MerCreMer；DR1以及其同窝对照小鼠aMHC-MerCreMer；DR1和Tnni3-Dre；DR1(图7a)，通过在成体8周进行tamoxifen诱导，并于3天后收取心脏组织进行切片和免疫荧光染色分析，发现Tnni3-Dre；DR1通过Dre-rox同源重组使其100％的心肌细胞表达了tdTomato红色荧光蛋白，aMHC-MerCreMer；DR1由于可诱导性的Cre-loxP同源重组使其约91.43％的心肌细胞表达了ZsGreen绿色荧光蛋白，而Tnni3-Dre；aMHC-MerCreMer；DR1与Tnni3-Dre；DR1得到的结果一致，即全部心肌细胞均为tdTomato⁺ZsGreen^-(图7b,c)。上述结果说明Tnni3-Dre在心肌细胞中介导的持续性Dre-rox同源重组反应完全切除了两个rox位点之间的loxP位点，成功阻止了aMHC-MerCreMer在心肌细胞中介导的可诱导性Cre-loxP同源重组反应(图7d)，因此，本发明人可以将Tnni3-Dre和DR1应用到解决Kit在心肌细胞中的异位表达问题。

接下来，为了解决是否存在Kit阳性干细胞分化成为心肌细胞的问题，本发明人通过交配获得了Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1小鼠及其其同窝对照小鼠Kit-CreER；DR1，于出生后进行多次tamoxifen诱导，并在成体8周时收取心脏进行分析(图8a)。通过对上述小鼠心脏进行全标本荧光拍照及连续切片染色分析，本发明人发现Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1标记了约39.58％的血管内皮细胞，0个心肌细胞(ZsGreen⁺)，所有的心肌细胞均为tdTomato阳性，提示Tnni3-Dre标记了所有的心肌细胞。相反，Kit-CreER；DR1则标记了0.736％心肌细胞以及39.58％的血管内皮细胞(图8b-e)。Tnni3-Dre；Kit-CreER；DR1里面没有ZsGreen⁺的心肌细胞，不太可能是因为诱导效率不足，因为作为对照的Kit-CreER在相同条件下成功诱导出了ZsGreen⁺的心肌细胞。有一种解释可能是Kit⁺的干细胞在分化成为ZsGreen⁺的心肌细胞后又在Tnni3-Dre的作用下发生了二次同源重组，从而使ZsGreen⁺的心肌细胞变成了tdTomato⁺的心肌细胞，但本发明人认为这种情况不太可能发生，因为Dre并不能与loxP-rox混合位点发生同源重组反应(图4)。上述结果表明在成体心脏生理稳态过程中，并没有任何的Kit⁺的心肌干细胞(非心肌细胞)分化成为心肌细胞。

实施例4.其他双同源重组系统工具小鼠的构建和验证

为了进一步扩展该新同源重组遗传谱系示踪系统的应用，本发明人还构建了另外三个双同源重组系统报告基因小鼠，分别是DR5、DR11和DR12,这三种小鼠与DR1策略类似，不过rox位点、loxP位点和相应的荧光蛋白位置有所不同(图9-11)。通过将上述三种小鼠分别与全身持续性表达的ACTB-Cre和CAG-Dre交配对其进行验证，证明这三种小鼠均按设计原理工作，即构建成功(图9-11)。Cre或Dre介导的同源重组效率根据两个loxP位点或两个rox位点之间的长短而可能有所不同，DR11中两个loxP位点之间的cDNA长度(4.8kb)要远远高于DR1中两个loxP位点之间的cDNA长度(0.9kb)。所以评估Cre或Dre在该系统中的重组效率从而选择一个合适的报告基因非常重要。此外，一些Cre或CreER小鼠在构造的时候可能同时串联了GFP或tdTomato等荧光蛋白，这个时候需要选择不同颜色的报告基因小鼠来进行实验，本发明人构造的这四种小鼠能够根据不同的需要进行相应的选择。

实施例5.体外重组实验

为了验证该新同源重组遗传谱系示踪系统在体外也能够正常行使其功能，本发明人将构建DR1小鼠的质粒分别与pCAG-Dre、pCAG-Cre和空载质粒共转染与QBI293细胞系中，并于转染后36小时收集细胞，观察细胞内荧光蛋白的表达情况。与体内结果一致，当DR1与pCAG-Dre共转染时,细胞表达红色荧光蛋白，当DR1与pCAG-Cre共转染时，细胞表达绿色荧光蛋白(图12)。为了确定实验结果的准确性，本发明人将DR1与空载质粒共染作为阴性对照，结果显示，与空载质粒共转染时，细胞并没有荧光蛋白的表达(图12)。上述实验结果表明，本发明人构建的同源重组系统同样在体外正常发挥作用。

总结

在这项研究中，本发明人通过新的双同源重组系统解决了传统谱系示踪中无法解决的异位同源重组问题。本发明的工具能够实现在某种特定类型细胞中阻断一种同源重组反应的发生，从而阻断异位同源重组反应。本发明人利用Kit-CreER谱系示踪为例系统的展示了如何利用该技术解决异位同源重组问题。利用该项双同源重组谱系示踪技术将能够更为精准的解决细胞的起源、命运及组织损伤再生过程中细胞的转分化问题。此外，该项技术还能够实现体内同时靶向标记两种不同的细胞群，并且，利用该技术还可能帮助了解两种不同表型细胞之间的相互作用而不需要侵入性损伤或细胞移植等操作。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。