CN103074361A - 一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法 - Google Patents
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Abstract
一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，将第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌（Listeria ivanovii，在下文中简称Li）基因组的方法。
背景技术
Li属于李斯特菌属，仅对绵羊等动物致病，不对人致病，具有与李斯特菌属内另一种菌——单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm）相似的生物学特性。
Lm由于具有独特的能在感染的宿主吞噬细胞浆内生长的生物学特性，成为了良好的T细胞免疫活化佐剂，已在疫苗制备上得到了广泛应用，部分以Lm为载体的重组活菌治疗性肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。如Wood LM et al.报道构建的两种基因重组Lm活菌疫苗（Lm-LLO-CD105A和Lm-LLO-CD105B）能显著减小乳腺癌小鼠动物模型的原发性和转移性肿瘤组织体积、降低乳腺癌自发小鼠模型肿瘤发生率（Wood LM,Pan ZK,Guirnalda P，et al.Targeting tumor vasculature with novel Listeria-based vaccines directed against CD105.CancerImmunol Immunother.2011,60(7):931-942）。虽然以Lm为载体的重组活菌疫苗免疫保护效果较好，但由于Lm可对人致病，故作为载体的Lm需经严格地敲除致病相关基因进行减毒，且此类疫苗目前只能限制在特殊人群（如癌症病人）中小范围应用。与Lm同属李斯特菌属的Li因具有与Lm相似的生物学特性（能在吞噬细胞等宿主细胞浆内增殖），决定了其也具有活化T细胞免疫应答的佐剂效应，再加上其相对于Lm而言的低毒安全性，因此可望代替Lm在疫苗制备上发挥更广泛的作用。
要制备以Li为载体的重组活菌疫苗，需要将外源基因整合至Li基因组，但目前将外源基因整合至Li基因组的方法尚未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法。
本发明所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法包括以下步骤：
（1）将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒（命名为pCW203）的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；
（2）切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒（命名为pCW153）的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示；
或切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒（命名为pCW154）的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；
（3）将步骤（2）得到的第一目标重组质粒电转化第一重组菌（命名为LilacZ），然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；
或将步骤（2）得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌（命名为LiΔactAlacZ），然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。
上述方法中，制备第一重组质粒（pCW203）的步骤如下：
（1）扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，在下文中简称PRRSV）包膜蛋白GP5编码基因ORF5的基因片段（GenBank:JX105430.1），其上游带Hind Ⅲ酶切位点，下游带Xho I酶切位点；
（2）将上述ORF5基因片段插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第一重组质粒。
上述方法中，制备第二重组质粒（pCW153）的步骤如下：
（1）扩增上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带Not Ⅰ酶切位点的Li orfXYZ基因（GenBank:AJ249805.1），并将所述Li orfXYZ基因插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Not I酶切位点之间；
（2）扩增上游带Sal I酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因（序列见序列表的SEQ ID NO.2中(6642)..(8092)），并将所述Ery基因插入步骤（1）所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；
（3）扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li orfBAldh基因（GenBank:AJ249805.1），并将所述Li orfBAldh基因插入步骤（2）所得重组质粒的Xba I酶切位点与NotI酶切位点之间；
（4）从所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的PRRSV ORF5基因片段1（序列见序列表的SEQ ID NO.1中(10)..(1050)），并将所述PRRSV ORF5基因片段1插入步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（5）从步骤（4）所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的PRRSV ORF5基因片段2（序列见序列表的SEQ ID NO.3中(4692)..(5456)），并将所述PRRSVORF5基因片段2插入步骤（4）所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第二重组质粒。
上述方法中，制备第三重组质粒（pCW154）的步骤如下：
（1）扩增上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带Not Ⅰ酶切位点的Li mpl基因（GenBank:AY510073.1），并将所述Li mpl基因插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Not I酶切位点之间；
（2）扩增上游带Sal I酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因（序列见序列表的SEQ ID NO.2中(6642)..(8092)），并将所述Ery基因插入步骤（1）所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；
（3）扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li orfBAldh基因（GenBank:AJ249805.1），并将所述Li orfBAldh基因插入步骤（2）所得重组质粒的Xba I酶切位点与NotI酶切位点之间；
（4）从所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的PRRSV ORF5基因片段1（序列见序列表的SEQ ID NO.1中(10)..(1050)），并将所述PRRSV ORF5基因片段1插入步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（5）从步骤（4）所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的PRRSV ORF5基因片段2（序列见序列表的SEQ ID NO.3中(4692)..(5456)），并将所述PRRSVORF5基因片段2插入步骤（4）所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第三重组质粒。
上述方法中，制备第一重组菌（LilacZ）的步骤如下：
（1）扩增上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段，并将所述lacZ基因片段插入上述制备第二重组质粒的步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（2）将步骤（1）所得重组质粒电转化Li，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第一重组菌。
上述方法中，制备第二重组菌（LiΔactAlacZ）的步骤如下：
（1）扩增上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段，并将所述lacZ基因片段插入上述制备第三重组质粒的步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点之间；
（2）将步骤（1）所得重组质粒电转化Li，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第二重组菌。
本发明具有以下有益效果：
1、实施简单。利用本发明所述方法将外源基因整合至Li基因组仅需简单的几步常规分子克隆、细菌培养等相关操作，对仪器设备和操作技术的要求不高，成本低廉，制备成功后，重组菌可大量繁殖，易于大规模生产。
2、筛选容易。采用菌落颜色和抗生素耐药情况筛选目标菌，目标菌为不耐红霉素的白色菌落，筛选方法简单容易，肉眼即可判断。
3、外源拟整合基因范围广。本发明所述技术平台可将任何不含Hind Ⅲ、Xho I和BamHI的外源基因整合入Li基因组，适用范围广。
4、定点整合。利用本发明所述重组质粒和重组菌将外源基因定点整合至Li基因组orfBAldh基因上游，整合后的细菌生长不受影响。
5、整合后的细菌能稳定表达并分泌外源整合基因编码蛋白。整合的基因携带来源于Lm溶血素LLO的启动子（phly）和分泌信号肽（Secret signal），故能翻译出带分泌信号肽的外源整合基因编码蛋白，且由于分泌信号肽的引导作用，翻译出的蛋白能分泌至细菌胞外。
6、不含耐药基因。利用本发明所述构建的重组Li不引入外来的红霉素等抗生素基因，也没有携带抗红霉素等抗生素耐药性，保证了其在制备疫苗等领域的应用性。
7、敲除了致病基因actA和plcB，保证了重组菌的安全性。本发明所述重组菌LiΔactAlacZ的致病基因actA和plcB已被敲除，在该菌基础上得到的目标重组菌不含actA和plcB基因，故具有应用的安全性。
8、携带CD8+和CD4+T细胞识别表位作为T细胞免疫应答的检测标签。外源拟整合基因的上游融合了GP33 epitope基因，下游融合了GP61 epitope基因，故翻译的外源基因蛋白融合了GP33（CD8+T细胞识别表位）和GP61（CD4+T细胞识别表位），便于检测针对外源拟整合基因的特异性CD8+和CD4+T细胞应答。
9、携带western blot检测标签。外源拟整合基因的上游融合了HA western blot检测标签基因（HA epitope），下游融合了VSV-G western blot检测标签基因（VSV-G epitope），故翻译的外源基因蛋白融合了HA和VSV-G检测标签，便于western blot检测外源整合基因编码的融合蛋白。
附图说明
图1为PCR扩增PRRSV ORF3、PRRSV ORF4、PRRSV ORF5、PRRSV ORF6和lacZ基因片段的电泳结果图，图中，1为lacZ扩增产物，2为PRRSV ORF6扩增产物，3为PRRSVORF5扩增产物，4为PRRSV ORF4扩增产物，5为PRRSV ORF3扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约4001bp、542bp、620bp、554bp和782bp处分别有特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图2为第一重组质粒pcw203的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因（Amp）、启动子phly、分泌信号肽（secret signal）、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、可被外源拟整合基因替换的PRRSV ORF5基因（上下游分别带HindⅢ和Xho I单酶切位点）和BamH I单酶切位点。
图3为第一重组质粒pCW203 HindⅢ、Xho I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW203HindⅢ、Xho I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图4为PCR扩增Li orfXYZ和Li orfBAldh基因片段的电泳结果图，图中，1为LiorfBAldh扩增产物，2为Li orfXYZ扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约1537bp、1159bp处分别有特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图5为PCR扩增Li mpl基因片段的电泳结果图，图中，1为Li mpl扩增产物，M为DNAladder。由图可见，在约811bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图6为PCR扩增Ery基因片段的电泳结果图，图中，1为Ery扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约1471bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图7为重组质粒pCW101 HindⅢ、Not I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW101 HindⅢ、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图8为重组质粒pCW102 Hind Ⅲ、Not I双酶切及pCW103 Sal I、Spe I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW102阴性对照Hind Ⅲ、Not I双酶切反应液，2、3为pCW102 HindI、Not I双酶切反应液，4为pCW103 Sal I、Spe I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图9为重组质粒pCW104 Sal I、Spe I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW104 Sal I、Spe I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图10为重组质粒pCW105 Xba I、Not I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW105 Xba I、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图11为重组质粒pCW106 Xba I、Not I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW106 Xba I、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图12为PCR扩增PRRSV ORF5基因片段1的电泳结果图，图中，1为PRRSV ORF5基因片段1扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约1069bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图13为重组质粒pCW117 Not I酶切电泳结果图，图中，1为pCW117阴性对照Not I酶切反应液，2为pCW117 Not I酶切反应液，M为DNA ladder。
图14为重组质粒pCW118 Not I酶切电泳结果图，图中，1为pCW118阴性对照Not I酶切反应液，2为pCW118 Not I酶切反应液，M为DNA ladder。
图15为PCR扩增PRRSV ORF5基因片段2的电泳结果图，图中，1为PRRSV ORF5基因片段2扩增产物，2-4为PRRSV ORF5基因片段2扩增阴性对照，M为DNA ladder。可见，在约783bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
图16为本发明所述第二重组质粒pcw153的一种结构图谱，含有两段Li同源基因（LiorfXYZ和Li orfBAldh）、氨苄青霉素抗性基因（Amp）、红霉素抗性基因（Ery）、基因序列盒（gene cassette）：包含启动子phly、分泌信号肽（secret signal）、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、GP33 epitope基因、GP61 epitope基因、PRRSV ORF5基因、供外源基因插入的BamHI、Xho I位点。
图17为本发明所述第三重组质粒pcw154的一种结构图谱，含有两段Li同源基因（Li mpl和Li orfBAldh）、氨苄青霉素抗性基因（Amp）、红霉素抗性基因（Ery）、基因序列盒（genecassette）：包含启动子phly、分泌信号肽（secret signal）、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、GP33 epitope基因、GP61 epitope基因、PRRSV ORF5基因、供外源基因插入的BamH I、Xho I位点。
图18为第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154 BamH I、Xho I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW153BamH I、Xho I双酶切反应液，2为pCW154 BamH I、Xho I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图19为重组质粒pCW107和pCW108 Not I酶切电泳结果图，图中，1为pCW107阴性质粒对照Not I酶切反应液，2为pCW107 Not I酶切反应液，3为pCW108 Not I酶切反应液，M为DNA ladder。
图20为LilacZ和LiΔactAlacZ的PCR鉴定电泳结果图，图中，1为以LilacZ基因组为模板扩增actA，2为以Li基因组为模板扩增actA，3为以LiΔactAlacZ基因组为模板扩增actA，4为以LilacZ基因组为模板扩增orfBAldh，5为以Li基因组为模板扩增orfBAldh，6为以LiΔactAlacZ基因组为模板扩增orfBAldh，7为以E.coli/pCW107基因组为模板结果Ery，8为以LilacZ基因组为模板扩增Ery，9为以E.coli/pCW108基因组为模板扩增Ery，10为以LiΔactAlacZ基因组为模板扩增Ery，11为以Li基因组为模板扩增lacZ，12为以LilacZ基因组为模板扩增lacZ，13为以LiΔactAlacZ基因组为模板扩增lacZ，M为DNA ladder。
图21为pCW203-ORF6HindⅢ和Xho I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW203-ORF6Hind Ⅲ、Xho I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图22为pCW153-ORF6和pCW154-ORF6 BamH I和Xho I双酶切电泳结果图，图中，1为pCW153-ORF6 BamH I、Xho I双酶切反应液，2为pCW154-ORF6 BamH I、Xho I双酶切反应液，M为DNA ladder。
图23为利用双同源杂交培养将pcw153携带的gene cassette整合至LilacZ基因组的示意图。
图24为利用双同源杂交培养将pcw154携带的gene cassette整合至LiΔactAlacZ基因组的示意图。
图25为Li-ORF6和LiΔactA-ORF6的PCR鉴定电泳结果图，图中，1为以Li-ORF6基因组为模板扩增ORF6，2为以Li-ORF6基因组为模板扩增Ery，3为以Li-ORF6基因组为模板扩增lacZ，4为以LiΔactA-ORF6基因组为模板扩增ORF6，5为以LiΔactA-ORF6基因组为模板扩增Ery，6为以LiΔactA-ORF6基因组为模板扩增lacZ，M为DNA ladder。扩增结果符合预期，表明目标重组质粒（pCW153-ORF6或pCW154-ORF6）中两个Not I位点之间包括PRRSV ORF6在内的基因片段已整合至基因组内。
图26为目标菌分泌和非分泌蛋白western blot结果图，图中，1为Li-ORF6非分泌蛋白，2为Li-ORF6分泌蛋白，3为LilacZ分泌蛋白（原始菌对照）；4为LiΔactA-ORF6非分泌蛋白，5为LiΔactA-ORF6分泌蛋白，6为LiΔactAlacZ分泌蛋白（原始菌对照），7为Li-ORF3分泌蛋白，8为LiΔactA-ORF3分泌蛋白，9为Li-ORF3非分泌蛋白，10为LiΔactA-ORF3非分泌蛋白，11为Li-ORF4非分泌蛋白，12为LiΔactA-ORF4非分泌蛋白，13为Li-ORF4分泌蛋白，14为LiΔactA-ORF4分泌蛋白，15为Li-Rv0129非分泌蛋白，16为Li-Rv0129分泌蛋白，17为LiΔactA-Rv0129非分泌蛋白，18为LiΔactA-Rv0129分泌蛋白。可见目标菌均表达了符合预期带标签融合蛋白，且大部分表达的外源基因编码蛋白能分泌到细菌胞外，无外源基因整合的细菌对照样品未检测到杂交信号。
图27为PCR扩增Rv0129基因的电泳结果图，图中，1为空白对照，2为Rv0129扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约901bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
具体实施方式
本发明下述实施例中：质粒pHS-LV来源于美国宾夕法尼亚大学Dr.Hao Shen实验室（Shen H,Slifka MK,Matloubian M,Jensen ER,Ahmed R,Miller JF.Recombinant Listeriamonocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediatedimmunity.Proc Natl Acad Sci USA.1995,92(9):3987-91.）；携带PRRSV ORF3、ORF4、ORF5、ORF6基因的重组质粒（pRK5-GP3，pRK5-GP4，pRK5-GP5，pGBKT7-GP6）和携带结核杆菌Rv0129基因的重组质粒pET-Ag85c来自上海交通大学免疫所，大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）Top10购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学试剂盒和生化试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学工具酶购自New England Biolabs；培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；引物合成和基因测序由Invitrogen上海公司完成。
实施例1：制备第一重组质粒pCW203
（1）扩增PRRSV包膜蛋白GP5编码基因ORF5基因片段（GenBank:JX105430.1）
以重组质粒pRK5-GP5为模板作PCR扩增，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（ORF5-f.5’-TATGTAAGCTTTGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（ORF5-r5’-ATAACTCGAGGAGACGACCCCATT GTTCC-3’）0.8μl，pRK5-GP5 0.75μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O19.5μl。反应循环条件：94℃3min→（94℃30s，55℃30s，72℃1min20s）×20个循环→（94℃30s，66℃30s，72℃1min20s）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在620bp处可见一条特异条带，与预期相符（图1）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）PRRSV ORF5基因片段插入质粒pHS-LV Hind Ⅲ、Xho I酶切位点之间
分别对PRRSV ORF5基因片段和质粒pHS-LV用HindⅢ和Xho I双酶切。HindⅢ和XhoI双酶切反应体系和反应条件为：10×buffer23μl，10×BSA 3μl，基因样品15μl，Hind Ⅲ0.6μl，Xho I0.6μl，ddH2O7.8μl，37℃水浴反应1h。PRRSV ORF5基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pHS-LV经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为13054bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段用T4连接酶连接，得到第一重组质粒pCW203（图2）。连接反应体系和反应条件为：10×T4Ligase reaction buffer 1μl，基因片段酶切回收物1μl，质粒酶切回收物4μl，T4连接酶1μl，ddH2O3μl，室温反应2h。
连接反应液转化感受态E.coli Top10：用预冷枪头吸5μl连接反应液于预冷50μl感受态E.coli Top10中，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴30min，42℃水浴30s，冰浴3min。加入250μl37℃预热的SOC培养基，于37℃200r/min培养1h，取150μl菌液于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板（以下简称LB-Amp）中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于37℃培养18~24h，阳性菌（E.coli/pCW203）在该平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind Ⅲ和Xho I双酶切进行鉴定，结果如图3，从图3可以看出，在约620bp和大于10kb处出现两条条带，与预期相符，第一重组质粒pCW203构建成功。
实施例2：制备第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154
（1）扩增Li orfXYZ（GenBank:AJ249805.1）、Li mpl（GenBank:AY510073.1）、Li orfBAldh（GenBank:AJ249805.1）和Ery（序列见SEQ ID NO.2中(6642)..(8092)）基因片段
将Li菌种从-80℃冰箱取出，37℃水浴融化后划线BHI琼脂平板，于37℃培养24h，挑菌落转种5ml BHI液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养12-18h，用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提基因组DNA作为模板，扩增Li orfXYZ、Li mpl和Li orfBAldh基因片段。扩增LiorfXYZ的反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.5μl，上游引物（10μmol/L）（Li orfXYZ-f：5’-ATAAAGCTTGTCGACATACTAGTTTCCAGCAAAGCGATTC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Li orfXYZ-r:5’-AACTCTGCGGCCGCTTATTTTGGATTCATATACTG）0.8μl，Li基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O17.65μl。反应循环条件为：94℃ 5min→（94℃1min，44℃30s，72℃1min40s）×20个循环→（94℃1min，68℃30s，72℃1min40s）×10个循环→72℃10min→4℃。扩增Limpl的反应体系为：10×ultra pfu buffer2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.5，上游引物（10μmol/L）（Li mpl-f:5’-ATAAAGCTTGTCGACATACTAGTTTCGTTATG GCTTAAATTG-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Li mpl-r:5’-TTATGCGGCCGCTCTCTAATACCTGCGT AA-3’）0.8μl，Li基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu0.25μl，ddH2O17.65μl。反应循环条件为：94℃ 5min→（94℃1min，44℃30s，72℃1min30s）×20个循环→（94℃1min，67℃30s，72℃1min30s）×10个循环→72℃10min→4℃。扩增LiorfBAldh的反应体系为：10×ultra pfu buffer2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.5μl，上游引物（10μmol/L）（Li orfBAldh-f：5’-GCACGCTCTAGAACAAAAAACGGAAATCA GTTAG-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Li orfBAldh-r:5’-TATGCGGCCGCACTATTTTCGTAAGCGTTCG-3’）0.8μl，Li基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O17.65μl。反应循环条件为：94℃5min→（94℃1min，48℃30s，72℃2min）×20个循环→（94℃1min，67℃30s，72℃2min）×10个循环→72℃10min→4℃。以质粒pHS-LV为模板扩增Ery，反应体系为：10×ultra pfu buffer2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.5μl，上游引物（10μmol/L）（Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Ery-r:5’-AAAACTAGTCCCGGGGCGAATTG-3’）0.8μl，pHS-LV质粒样品1.5μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O18.65μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，57℃30s，72℃2min）×30个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，分别在1159bp、811bp、1537bp和1471bp处可见一条特异条带（见图4-图6）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）构建制备第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒pCW101和pCW102
分别对步骤（1）得到的Li orfXYZ和Li mpl基因片段及质粒pHS-LV用Hind III和Not I双酶切，Hind III和Not I双酶切体系和反应条件为：10×buffer23μl，10×BSA 3μl，基因样品15μl，Hind Ⅲ 0.6μl，Not I0.6μl，ddH2O7.8μl，37℃水浴反应1h。Li orfXYZ和Li mpl基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收回收。质粒pHS-LV经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为6030bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，Li orfXYZ与pHS-LV连接产物为pCW101；Limpl与pHS-LV连接产物为pCW102。连接反应液按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10，阳性菌（E.coli/pCW101、E.coli/pCW102）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用HindⅢ和Not II双酶切进行鉴定，鉴定结果见图7、图8，从图7可见，pCW101 Hind Ⅲ、Not Ⅰ双酶切后在约1159bp和6030bp处出现两条条带，与预期相符，pCW101构建成功；从图8可见，pCW102 Hind Ⅲ、Not Ⅰ双酶切后在约811bp和6030bp处出现两条条带，与预期相符，pCW102构建成功。
（3）构建制备第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒pCW103和pCW104
分别对步骤（1）得到的Ery基因片段和步骤（2）得到pCW101及pCW102用Sal I和Spe I双酶切。Sal I和Spe I双酶切体系和反应条件为：10×buffer33μl，10×BSA 3μl，基因样品15μl，Sal I0.6μl，Spe I0.6μl，ddH2O7.8μl，37℃水浴反应1h。Ery基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW101及pCW102经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，Ery与pCW101连接产物为pCW103；Ery与pCW102连接产物为pCW104。连接反应液按实施例1（2）中方法转化感受态E.coliTop10。阳性菌（E.coli/pCW103或E.coli/pCW104）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Sal I和Spe I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图8-图9，从图8可见，pCW103Sal Ⅰ、Spe Ⅰ双酶切后在约1471bp和7172bp处出现两条条带，与预期相符，pCW103构建成功；从图9可见，pCW104Sal Ⅰ、Spe Ⅰ双酶切后在约1471bp和6826bp处出现两条条带，与预期相符，pCW104构建成功。
（4）构建制备第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒pCW105和pCW106
分别对步骤（1）得到的Li orfBAldh和步骤（3）步得到的pCW103及pCW104用Xba I和Not I双酶切。Xba I和Not I双酶切体系和反应条件为：10×buffer33μl，10×BSA3μl，基因样品15μl，Xba I0.6μl，Not I0.6μl，ddH2O7.8μl，37℃水浴反应1h。Li orfBAldh基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW103及pCW104经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为7442bp和7096bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，Li orfBAldh与pCW103连接产物为pCW105；LiorfBAldh与pCW104连接产物为pCW106。连接反应液按实施例1（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW105或E.co/pCW106）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Xba I和Not I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图10-图11，从图10可见，pCW105Xba Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后在约1537bp和7442bp处出现两条条带，与预期相符，pCW105构建成功；从图11可见，pCW106Xba Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后在约1537bp和7096bp处出现两条条带，与预期相符，pCW106构建成功。
（5）从第一重组质粒pCW203中扩增PRRSV ORF5基因片段1（序列见SEQ ID NO.1中(10)..(1050)）
以第一重组质粒pCW203为模板作PCR扩增，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（ORF5-1-f：5’-TATTGCGGCCGCCAGTGTG-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（ORF5-1-r5’-TATTGCGGCCGCCGACTTATCATTTTCCTAATCTATTC’）0.8μl，第一重组质粒pCW203样品0.8μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O19.45μl。反应循环条件为：94℃3min→（94℃30s，56℃30s，72℃1min30s）×30个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在1069bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图12）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（6）构建制备第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒pCW117和pCW118
分别对步骤（5）得到的PRRSV ORF5基因片段1和步骤（4）得到pCW105及pCW106用Not I酶切。Not I酶切体系和反应条件为：10×buffer32μl，10×BSA2μl，基因样品5μl，Not I0.4μl，ddH2O10.6μl，37℃水浴反应1h。PRRSV ORF5基因片段1酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW105及pCW106经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，PRRSV ORF5基因片段1与pCW105连接产物为pCW117；PRRSV ORF5基因片段1与pCW106连接产物为pCW118。连接反应液按实施例1（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW117或E.coli/pCW118）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Not I酶切进行鉴定，鉴定结果见图13-图14，从图13可见，pCW117Not Ⅰ酶切后在约1069bp和10kb处出现两条条带，与预期相符，pCW117构建成功；从图14可见，pCW118NotⅠ酶切后在约1069bp和10kb处出现两条条带，与预期相符，pCW118构建成功。
（7）从pCW117中扩增PRRSV ORF5基因片段2（序列见SEQ ID NO.3中(4692)..(5456)）
以重组质粒pCW117为模板作PCR扩增，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.6μl，上游引物（10μmol/L）（ORF5-2-f：5’-ATAAAGATCTTAAAGCTGTTTATAATTTTGCTACTATGAAGGATCCATATCCATATGATGTTC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（5’-ATAAGTCGACATCAAATTCAACACTTTTAAATTGATAAACTCCTTTATAAATATCTGGTCCATTTAATCCCTCGAGGAGACGACCCC-3’）0.8μl，pCW117质粒样品0.8μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O19.25μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，54℃30s，72℃1min）×30个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在783bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图15）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（8）构建第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154
对步骤（7）得到的PRRSV ORF5基因片段2用Bgl II和Sal I双酶切，对步骤（6）得到pCW117及pCW118用BamH I和Xho I双酶切。Bgl II和Sal I双酶切体系和反应条件为：10×buffer32μl，10×BSA 2μl，基因样品5μl，Bgl II 0.4μl，Sal I0.4μl，ddH2O10.2μl，37℃水浴反应1h。BamH I和Xho I双酶切体系和反应条件为：10×buffer32μl，10×BSA2μl，基因样品5μl，BamH I0.4μl，Xho I0.4μl，ddH2O10.2μl，37℃水浴反应1h。PRRSV ORF5基因片段2双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW117及pCW118经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为9346bp和9000bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，PRRSV ORF5基因片段2与pCW117连接产物为第二重组质粒pCW153（见图16）；PRRSV ORF5基因片段2与pCW118连接产物为pCW154（见图17）。连接反应液按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW153或E.coli/pCW154）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I、Xho I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图18，从图18可见，pCW153和pCW154BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后在约628bp和9kb处出现两条条带，与预期相符，pCW153和pCW154构建成功。
实施例3：制备第一重组菌Li lacZ和第二重组菌LiΔactA lacZ
（1）扩增lacZ基因片段（序列见SEQ ID NO.1中(8192)..(12171)）
以质粒pHS-LV为模板PCR扩增lacZ，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.6μl，上游引物（10μmol/L）（LacZ-f：5’-ATAAGCGGCCGCTAGCTTTAAGGCTAAATGCCG-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（lacZ-r:5’-ATAAGCGGCCGCCTAGAGTGACTTTTATGTTGAG-3’）0.8μl，pHS-LV质粒样品1μl，ultra pfu0.25μl，ddH2O19.05μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，52℃30s，72℃4min20s）×20个循环→（94℃30s，70℃30s，72℃4min20s）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在4001bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图1）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）构建制备Li lacZ和LiΔactA lacZ用的中间重组质粒pCW107和pCW108
分别对步骤（1）得到的lacZ和实施例2步骤（4）得到pCW105及pCW106用Not I酶切。Not I酶切体系和反应条件同实施例2中步骤（6）。lacZ基因片段酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW105及pCW106经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，lacZ与pCW105连接产物为pCW107；lacZ与pCW106连接产物为pCW108。连接反应液按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.col/pCW107或E.col/pCW108）在表面涂有X-Gal的LB-Amp平板上长成蓝色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Not I酶切进行鉴定，鉴定结果见图19，从图19可见，pCW107和pCW108NotⅠ酶切后在约4001bp和10kb处出现两条条带，与预期相符，pCW107和pCW108构建成功。
（3）电转化用Li感受态细胞的制备
接种Li于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12~16h。吸取12.5ml菌液至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃培养至A600为0.4左右（约4h），加入penicillin G（终浓度：12.5μg/ml），继续培养至A600为0.7左右（约2.5h）。转移菌液于洁净、无菌、预冷的250ml聚丙烯离心管中，置冰浴20min。4℃离心10000r/min5min，弃上清。加入100ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重悬菌沉淀，于4℃离心10000r/min 5min，弃上清，再用100ml冰冷0.5mol/L蔗糖液洗2次。加入2ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重悬菌沉淀，分装预冷无菌EP管（50μl/管），立即于-70℃保存备用。
（4）质粒pCW107和pCW108电转化Li
从-70℃冰箱取出1支（3）步制备的Li细胞放于冰上融化，用预冷枪头吸入在冰上预冷的重组质粒pCW107或pCW1085μl，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴5min。用预冷枪头将EP管内全部液体吸入放冰浴预冷的电击杯（间距0.1cm）样品槽中，放冰上5min。取出电击杯置于电转化仪内电击1次（电击参数为2KV，5ms），立即取出电击杯放冰浴5min。加入750μl于37℃预温的0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基于电击杯中，轻轻用枪头吹出样品槽内菌液并混匀，将电击杯内全部液体吸至无菌EP管中，于30℃140rpm振荡培养2h。将全部菌液滴于含红霉素3μg/ml，X-gal 40μg/ml的BHI琼脂平板（以下简称BHI-Ery-X-gal平板）中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于30℃培养48~72h，阳性菌（Li/pCW107或Li/pCW108）生长为蓝色菌落。
（5）Li/pCW107和Li/pCW108双同源重组杂交培养
Li/pCW107或Li/pCW108划线接种BHI-Ery-X-gal平板42℃培养48h，长出的蓝色菌落再划线接种BHI-Ery-X-gal平板，于42℃培养48h。挑取蓝色菌落于2ml BHI液体培养基中，30℃220rpm振荡培养24h，吸取10μl菌液再转种2ml BHI液体培养基中，30℃220rpm振荡培养24h，重复上步（转种）4次。取100μl菌液用PBS作10倍稀释，取10-6稀释菌液涂布BHI-X-gal平板（含X-gal 40μg/ml的BHI琼脂平板）和BHI-Ery-X-gal平板，每个平板上涂布稀释菌液100μl。阳性菌落LilacZ和LiΔactA lacZ在BHI-X-gal平板上长成蓝色菌落，在BHI-Ery-X-gal平板上不生长。
（6）PCR鉴定Li lacZ和LiΔactA lacZ
用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提Li lacZ和LiΔactA lacZ基因组DNA作为模板，PCR扩增鉴定其中有无actA、orfBAldh、Ery和lacZ基因片段，根据扩增结果对Li lacZ和LiΔactAlacZ的基因重组情况进行鉴定。扩增actA反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.5μl，上游引物（10μmol/L）（Li actA-f：5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Li actA-r:5’-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’）0.8μl，Li/pCW107或Li/pCW108基因组DNA样品2.5μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O17.65μl。反应循环条件为：94℃ 5min→（94℃30s，55℃30s，72℃30s）×30个循环→72℃10min→4℃。扩增orfBAldh和Ery的反应体系和反应循环条件同实施例2（1）。扩增lacZ的引物和反应体系和反应循环条件同实施例3中步骤（1）。Li lacZ和LiΔactA lacZ的PCR鉴定，鉴定结果见图20。由图可见，经双同源杂交培养，lacZ已整合入Li基因组，Li lacZ和LiΔactA lacZ均不携带Ery基因，且LiΔactA lacZ中的actA基因被剔除。鉴定结果符合预期，Li lacZ和LiΔactA lacZ制备成功。
实施例4：利用上述制备的重组质粒和重组菌，将外源基因定点整合至Li基因组
一、以PRRSV ORF6基因（GenBank:AY885248.1）为外源拟整合基因
（1）PCR扩增上下游分别带Hind Ⅲ和Xho I酶切位点的PRRSV ORF6基因
以质粒pGBKT7-GP6为模板扩增PRRSV ORF6基因。反应体系为：10×ultra pfu buffer2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（ORF6-f：5’-TATGTAAGCTTTGGGGTCGTCTTTAGATGAC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（ORF6-r:5’-ATAACTCGAGCTTGGCATATTTGACAAGGTTTAC-3’）0.8μl，pGBKT7-GP6质粒样品0.75μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O19.5μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×20个循环→（94℃30s，66℃30s，72℃1min）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在542bp处可见一条特异条带，与预期相符（图1）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）PRRSV ORF6基因插入第一重组质粒pCW203 Hind Ⅲ、Xho I酶切位点之间
分别对（1）步得到的PRRSV ORF6基因片段和质粒pCW203用Hind III和Xho I双酶切。HindⅢ和Xho I双酶切反应体系和反应条件同实施例1步骤（2）。PRRSV ORF6基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW203经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度为13053bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，得到中间重组质粒（pCW203-ORF6）。连接反应液按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW203-ORF6）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind Ⅲ和Xho I双酶切进行鉴定，鉴定结果如图21，从图21可见，在约542bp和大于10kb处出现两条条带，与预期相符，中间重组质粒pCW203-ORF6构建成功。
（3）pCW203-ORF6的BamH I、Xho I片段替换第二重组质粒pCW153或第三重组质粒pCW154的BamH I、Xho I片段
分别对（2）步得到的中间重组质粒pCW203-ORF6和质粒pCW153或pCW154用BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切，酶切体系和反应条件同实施例2步骤（8）。pCW203-ORF6双酶切产物作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度为592bp的片段。pCW153或pCW154经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为8945bp和8599bp的片段。pCW203-ORF6酶切回收片段与pCW153酶切回收片段按实施例1步骤（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，得到第一目标重组质粒（pCW153-ORF6）；与pCW154酶切回收片段按实施例1（2）中连接反应体系和反应条件进行连接，得到第二目标重组质粒（pCW154-ORF6）。目标重组质粒两个Not I位点之间的gene cassette基因序列结构示意图见。连接反应液按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW153-ORF6或E.coli/pCW154-ORF6）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamHⅠ和Xho双酶切进行鉴定，鉴定结果见图22，从图22可见，pCW153-ORF6和pCW154-ORF6酶切后均在约592bp和大于8kb处出现两条条带，与预期相符，目标重组质粒构建成功。
（4）目标重组质粒（pCW153-ORF6或pCW154-ORF6）电转化Li lacZ或LiΔactA lacZ
按实施例3步骤（3）方法制备电转化用LilacZ或LiΔactAlacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤（4）方法电转化LilacZ或LiΔactA lacZ菌，阳性菌（LilacZ/pCW153-ORF6或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF6）于BHI-Ery-X-gal平板30℃培养48~72h后，生长为蓝色菌落。
（5）LilacZ/pCW153-ORF6或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF6单、双同源重组杂交培养
按实施例3步骤（5）方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153-ORF6经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌（Li-ORF6：ORF6基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）（见图23）；Li ΔactA lacZ/pCW154-ORF6经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌（LiΔactA-ORF6：ORF6基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）（见图24）。目标菌在BHI-X-gal平板上长成白色菌落，在BHI-Ery-X-gal平板上不生长。
（6）PCR鉴定目标菌基因整合效果
用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提目标菌（Li-ORF6和LiΔactA-ORF6）基因组DNA作为模板，PCR扩增鉴定其中有无Ery、lacZ和PRRSV ORF6基因片段，根据扩增结果对目标菌基因整合情况进行鉴定。扩增Ery的引物和反应体系同实施例2步骤（1），扩增lacZ的引物和反应体系同实施例3步骤（1），扩增PRRSV ORF6的引物和反应体系同本实施例“一”中的步骤（1）。
Li-ORF6和LiΔactA-ORF6的PCR鉴定，鉴定结果见图25。从图中可见，Li-ORF6和LiΔactA-ORF6基因组内均不含Ery基因，表明目标重组质粒中两个Not I位点以外的基因片段不能经双同源重组杂交整合至基因组；Li-ORF6和LiΔactA-ORF6基因组内均不含lacZ基因，表明经双同源重组杂交培养后，LilacZ或LiΔactA lacZ基因组内原有的lacZ已被替换掉；LilacZ或LiΔactA lacZ基因组内均含有PRRSV ORF6基因，表明经双同源重组杂交培养后，目标重组质粒中两个Not I位点之间包括PRRSV ORF6在内的基因片段已整合至基因组内。
（7）western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果
①目标菌蛋白样品的制备
分泌蛋白样品的制备：接种目标菌于2ml BHI液体培养基，于37℃ 220rpm振荡培养12-16h。吸取100μl菌液至2ml BHI液体培养基，37℃220rpm培养至A600约为1.0左右（约5h）。将菌液转至一干净EP管，加入预冷的100%三氯醋酸（TCA）200μl，混匀后置冰浴30min。4℃离心10000rpm30min，弃上清，加入1ml-20℃预冷丙酮洗涤沉淀，置冰浴10min。4℃离心10000rpm10min，弃上清，室温干燥沉淀。加入100μl含4%SDS的0.5mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，瞬时离心，将上清液吸至另一干净EP管，加入等倍体积的2×SDSPAGE电泳上样缓冲液，沸水浴煮沸5min，立即上样20-30μl。
非分泌蛋白样品的制备：吸取1.5ml生长至对数生长期的目标重组菌于一干净EP管中，离心13000rpm1min，弃上清，加入1ml PBS重悬菌沉淀，离心13000rpm1min，弃上清，加入150μl裂解缓冲液1（配方：0.5ml 0.1mol/L pH7.0,磷酸盐缓冲液，1g蔗糖，10mg溶菌酶，3.7ml ddH2O），于37℃孵育2h。加入1.35ml裂解缓冲液2（配方：40μl 1mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，8μl 0.5mol/L pH8.0 EDTA缓冲液，800μl 10%SDS，200μl 10mg/ml链霉蛋白酶，3.2mlddH2O），于37℃孵育30min。加入155μl预冷的100%TCA，置冰浴30min。4℃离心10000rpm30min，弃上清，加入1ml-20℃预冷丙酮洗涤沉淀，置冰浴10min。4℃离心10000rpm 10min，弃上清，室温干燥沉淀。加入150μl PBS缓冲液重悬菌沉淀，再加入等体积的2×SDS PAGE电泳上样缓冲液，沸水浴煮沸5min，立即上样20-30μl。
②western blot检测蛋白表达和分泌效果
按常规进行western blot检测，分离胶浓度：15%，一抗：抗HA标签小鼠单克隆（1:2000稀释）或抗VSV-G标签小鼠单克隆抗体（1:2000稀释），二抗：山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP（1:5000稀释）。结果见图26。从图可见，第一目标菌（Li-ORF6）和第二目标菌（LiΔactA-ORF6）均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。
二、以PRRSV ORF3基因（GenBank:AY885248.1）为外源拟整合基因
（1）PCR扩增上下游分别带Hind Ⅲ和Xho I酶切位点的PRRSV ORF3基因
以质粒pRK5-GP3为模板扩增PRRSV ORF3基因。反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（ORF3-f：5’-CGCGTAAGCTTTGGTTAATAGCTGTACATTCCTC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（ORF3-r:5’-ATAACTCGAGTCGCCGTACGGCACTGAG-3’）0.8μl，pRK5-GP3质粒样品0.75μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O 19.5μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×20个循环→（94℃30s，68℃30s，72℃1min）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在782bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图1）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）PRRSV ORF3基因插入第一重组质粒pCW203 Hind Ⅲ、Xho I酶切位点之间
按本实施例“一”中的步骤（2）方法进行，得到中间重组质粒（pCW203-ORF3）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW203-ORF3）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用HindⅢ和Xho I双酶切进行鉴定。
（3）pCW203-ORF3的BamH I、Xho I片段替换或pCW154的BamH I、Xho I片段
按本实施例“一”中的步骤（3）方法进行。pCW203-ORF3的BamH I、Xho I片段与pCW153BamH I、Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒（pCW153-ORF3），pCW203-ORF3的BamH I、Xho I片段与pCW154BamH I、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒（pCW154-ORF3）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW153-ORF3或E.coli/pCW154-ORF3）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。
（4）目标重组质粒（pCW153-ORF3或pCW154-ORF3）电转化Li lacZ或LiΔactA lacZ
按实施例3步骤（3）方法制备电转化用LilacZ或LiΔactA lacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤（4）方法电转化LilacZ或LiΔactA lacZ菌，阳性菌（LilacZ/pCW153–ORF3或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF3）于BHI-Ery-X-gal平板30℃培养48~72h后，生长为蓝色菌落。
（5）LilacZ/pCW153-ORF3或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF3单、双同源重组杂交培养
按实施例3步骤（5）方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153-ORF3经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌（Li-ORF3：ORF3基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）；LiΔactAlacZ/pCW154-ORF3经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌（LiΔactA-ORF3：ORF3基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）。目标菌在BHI-X-gal平板上长成白色菌落，在BHI-Ery-X-gal平板上不生长。
（6）PCR鉴定目标菌基因整合效果
按本实施例“一”中的步骤（6）方法进行。扩增PRRSV ORF3的引物和反应体系同本实施例“二”中的步骤（1）。
（7）western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果
按本实施例“一”中的步骤（7）方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌（Li-ORF3）和第二目标菌（LiΔactA-ORF3）均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。
三、以PRRSV ORF4基因（GenBank:AY885248.1）为外源拟整合基因
（1）PCR扩增上下游分别带Hind Ⅲ和Xho I酶切位点的PRRSV ORF4基因
以质粒pRK5-GP4为模板扩增PRRSV ORF4基因，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（ORF4-f：5’-TATGTAAGCTTTGGCTTCGTCCCTTCTTTT CC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（ORF4-r:5’-ATAACTCGAGAATTGCCAACAGAATGGCAAAAAG-3’）0.8μl，pRK5-GP4质粒样品0.75μl，ultra pfu0.25μl，ddH2O19.5μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，55℃30s，72℃1min）×20个循环→（94℃30s，66℃30s，72℃1min）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在554bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图1）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）PRRSV ORF4基因插入第一重组质粒pCW203 Hind Ⅲ、Xho I酶切位点之间
按本实施例“一”中的步骤（2）步方法进行，得到中间重组质粒（pCW203-ORF4）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.col/pCW203-ORF4）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind Ⅲ和Xho I双酶切进行鉴定。
（3）pCW203-ORF4的BamH I、Xho I片段替换或pCW154的BamH I、Xho I片段
按本实施例“一”中的步骤（3）步方法进行。pCW203-ORF4的BamH I、Xho I片段与pCW153BamH I、Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒（pCW153-ORF4），pCW203-ORF3的BamH I、Xho I片段与pCW154BamH I、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒（pCW154-ORF4）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW153-ORF4或E.coli/pCW154-ORF4）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。
（4）目标重组质粒（pCW153-ORF4或pCW154-ORF4）电转化Li lacZ或LiΔactA lacZ
按实施例3步骤（3）方法制备电转化用LilacZ或LiΔactA lacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤（4）方法电转化LilacZ或LiΔactA lacZ菌，阳性菌（LilacZ/pCW153-ORF4或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF4）于BHI-Ery-X-gal平板30℃培养48~72h后，生长为蓝色菌落。
（5）LilacZ/pCW153-ORF4或LiΔactA lacZ/pCW154-ORF4单、双同源重组杂交培养
按实施例3步骤（5）步方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153-ORF4经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌（Li-ORF4：ORF4基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）；LiΔactAlacZ/pCW154-ORF4经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌（LiΔactA-ORF4：ORF4基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）。目标重组菌在BHI-X-gal平板上长成白色菌落，在BHI-Ery-X-gal平板上不生长。
（6）PCR鉴定目标重组菌基因整合效果
按本实施例“一”中的步骤（6）方法进行。扩增PRRSV ORF4的引物和反应体系同实施例4、三、（1）。
（7）westernblot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果
按本实施例“一”中的步骤（7）方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌（Li-ORF4）和第二目标菌（LiΔactA-ORF4）均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。
四、以结核杆菌Rv0129基因（GenBank:AL123456.2）为外源拟整合基因
（1）PCR扩增上下游分别带Hind III和Xho I酶切位点的Rv0129基因
以质粒pET-Ag85c为模板扩增Rv0129基因，反应体系为：10×ultra pfu buffer 2.5μl，4dNTPs（10mmol/L.种）0.4μl，上游引物（10μmol/L）（Rv0129-f：5’-GCTCAAGCTTTCTCTAGGCCCGGTCTTCC-3’）0.8μl，下游引物（10μmol/L）（Rv0129-r:5’-AATACTCGAGGGCGGCCGGAGCAGCAG-3’）0.8μl，pET-Ag85c质粒样品0.75μl，ultra pfu 0.25μl，ddH2O19.5μl。反应循环条件为：94℃ 3min→（94℃30s，56℃30s，72℃1min）×20个循环→（94℃30s，70℃30s，72℃1min）×10个循环→72℃10min→4℃。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在901bp处可见一条特异条带，与预期相符（见图27）。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
（2）Rv0129基因插入第一重组质粒pCW203 HindⅢ、Xho I酶切位点之间
按本实施例“一”中的步骤（2）方法进行，得到中间重组质粒（pCW203-Rv0129）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW203-Rv0129）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用HindⅢ和Xho I双酶切进行鉴定。
（3）pCW203-Rv0129的BamH I、Xho I片段替换或pCW154的BamH I、Xho I片段
按本实施例“一”中的步骤（3）方法进行。pCW203-Rv0129的BamH I、Xho I片段与pCW153BamH I、Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒（pCW153-Rv0129），pCW203-ORF3的BamH I、Xho I片段与pCW154BamH I、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒（pCW154-Rv0129）。按实施例1步骤（2）中方法转化感受态E.coli Top10。阳性菌（E.coli/pCW153-Rv0129或E.coli/pCW154-Rv0129）在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。
（4）目标重组质粒（pCW153-Rv0129或pCW154-Rv0129）电转化Li lacZ或LiΔactA lacZ
按实施例3（3）步方法制备电转化用LilacZ或LiΔactA lacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤（4）中方法电转化LilacZ或LiΔactA lacZ菌，阳性菌（LilacZ/pCW153-Rv0129或LiΔactA lacZ/pCW154-Rv0129）于BHI-Ery-X-gal平板30℃培养48~72h后，生长为蓝色菌落。
（5）LilacZ/pCW153-Rv0129或LiΔactA lacZ/pCW154-Rv0129单、双同源重组杂交培养
按实施例3步骤（5）中方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153-Rv0129经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌（Li-Rv0129：Rv0129基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）；LiΔactA lacZ/pCW154-Rv0129经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌（LiΔactA-Rv0129：Rv0129基因替换了lacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游）。目标菌在BHI-X-gal平板上长成白色菌落，在BHI-Ery-X-gal平板上不生长。
（6）PCR鉴定目标重组菌基因整合效果
按本实施例“一”中的步骤（6）方法进行。扩增Rv0129的引物和反应体系同本实施例“四”中的步骤（1）。
（7）western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果
按本实施例“一”中的步骤（7）方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌（Li-Rv0129）和第二目标菌（LiΔactA-Rv0129）均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。
Claims (9)
1.一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；
（2）切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.2所示；
或切下步骤（1）得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；
（3）将步骤（2）得到的第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；
或将步骤（2）得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了β-半乳糖苷酶基因，能表达β-半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。
2.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第一重组质粒的步骤如下：
（1）扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒包膜蛋白GP5编码基因ORF5的基因片段，其上游带Hind Ⅲ酶切位点，下游带Xho I酶切位点；
（2）将步骤（1）所述ORF5基因片段插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第一重组质粒。
3.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第二重组质粒的步骤如下：
（1）扩增上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带NotⅠ酶切位点的绵羊李斯特菌orfXYZ基因，并将所述orfXYZ基因插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Not I酶切位点之间；
（2）扩增上游带SalI酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因，并将所述Ery基因插入步骤（1）所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；
（3）扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfBAldh基因，并将所述orfBAldh基因插入步骤（2）所得重组质粒的Xba I酶切位点与Not I酶切位点之间；
（4）从权利要求1所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因片段1，并将所述ORF5基因片段1插入步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（5）从步骤（4）所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因片段2，并将所述ORF5基因片段2插入步骤（4）所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第二重组质粒。
4.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第三重组质粒的步骤如下：
（1）扩增上游带Hind Ⅲ酶切位点、下游带NotⅠ酶切位点的绵羊李斯特菌mpl基因，并将所述mpl基因插入质粒pHS-LV的Hind Ⅲ酶切位点与Not I酶切位点之间；
（2）扩增上游带SalI酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因，并将所述Ery基因插入步骤（1）所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；
（3）扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfBAldh基因，并将所述orfBAldh基因插入步骤（2）所得重组质粒的Xba I酶切位点与Not I酶切位点之间；
（4）从权利要求1所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因片段1，并将所述ORF5基因片段1插入步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（5）从步骤（4）所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因片段2，并将所述ORF5基因片段2插入步骤（4）所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第三重组质粒。
5.根据权利要求3所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第一重组菌的步骤如下：
（1）扩增上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段，并将所述lacZ基因片段插入权利要求3中制备第二重组质粒的步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（2）将步骤（1）所得重组质粒电转化绵羊李斯特菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第一重组菌。
6.根据权利要求4所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第二重组菌的步骤如下：
（1）扩增上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段，并将所述lacZ基因片段插入权利要求4中制备第三重组质粒的步骤（3）所得重组质粒的Not I酶切位点；
（2）将步骤（1）所得重组质粒电转化绵羊李斯特菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第二重组菌。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于所述外源基因为不含Hind Ⅲ、Xho I和BamH I酶切位点的基因。
8.根据权利要求7所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于所述外源基因为猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4基因、结核杆菌Rv0129基因中的一种。
9.权利要求1至6中任一权利要求所述方法得到的第一目标菌，或权利要求1至6中任一权利要求所述方法得到的第二目标菌。
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