CN114921394A - 一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法。具体来说，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。此外，本发明还公开了涉及包含上述成分的疫苗载体应用方法，并且进一步提供了在受试者中诱导免疫应答的方法。本方案采用的重组绵羊李斯特菌株可稳定传代，且能诱导小鼠分泌细胞因子，相较于以往的绵羊李斯特菌株，具有更高的免疫原性、保护率，且更加安全。

Description

一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物疫苗技术领域，特别涉及一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法。

背景技术

绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)和单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)同属于李斯特菌菌属，能进入巨噬细胞等抗原递呈细胞，并在胞内增殖；LI极少引起人类疾病，具有安全性。减毒LM可作为构建疫苗的载体，类似地，LI也可以作为构建疫苗的载体，但相较于LM载体疫苗，LI载体疫苗在体内免疫器官中存活的时间更短，因此其免疫原性受到很大的限制。因此，利用未经改造的绵羊李斯特菌作为疫苗载体的方案在免疫原性、保护率等方面仍然存在一定的缺陷。

LM溶血素(Listeriolysin O,LLO)是一种由李斯特菌的hly基因编码的蛋白，分子质量为58.6～60kd，属于胆固醇依赖性细胞溶解素(Cholesterol-dependent cytolysins,CDC)家族的一个成孔毒素，能够协助细菌破坏吞噬体，促进菌体进入胞液，是细菌得以在胞质增殖的先决条件，并且能通过膜穿孔机制帮助LM从内化的宿主细胞液泡逃逸。逃逸出来的细菌分泌的蛋白被蛋白酶体降解加工后通过MHC-I分子递呈给CD8⁺T细胞，增强抗原递呈。

LI的溶血素(ivanolysin O,ILO)与LM的溶血素(LLO)的具体作用不完全相同，有研究者将编码LM溶血素的hly基因替换为编码LI溶血素的基因ilo得到一株重组菌LMΔhly::ilo，该重组菌可以在小鼠肝脏中增殖，但不能在脾脏中增殖。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于现有的利用绵羊李斯特菌作为载体的方案存在缺陷，针对现有技术的不足，提供一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。

可选地，所述重组绵羊李斯特菌的ilo基因片段缺失。

可选地，hly基因的启动子与重组前所述ilo基因的启动子序列相同。

可选地，hly基因位于重组前ilo基因所在的区域。

可选地，所述重组绵羊李斯特菌还包括异源性抗原。

可选地，hly基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。

一种疫苗，所述疫苗包含如上所述的重组绵羊李斯特菌。

一种在受试者中引入免疫应答的方法，将表达异源性抗原的异源基因导入如上所述的疫苗载体，得到目标疫苗；

给受试者施用有效量的所述目标疫苗。

有益效果：本发明是在LI菌株的基础上，敲除LI溶血素(即ilo基因表达的蛋白)，再回补LM溶血素(即hly基因表达的蛋白)，得到携带hly基因片段的溶血素改造株LIΔilo::hly。本发明获得的溶血素改造株LIΔilo::hly具有以下特点：

1、本发明获得的改造株LIΔilo::hly体外生长良好，且与亲本株有相似的生长特性，对鼠肝癌细胞Hepa1-6的黏附侵袭能力比LI略高，在鼠巨噬细胞RAW264.7内增殖能力较LI显著增强，表明其能够跟亲本菌一样，作为抗原递呈的载体，引发抗原特异性免疫应答，可作为一种制备疫苗的活菌载体加以应用，且性能更好；

2、本发明获得的改造株LIΔilo::hly在脾脏中被完全清除的时间相较LI延长了两天。脾脏是主要的外周免疫器官，疫苗载体菌株在脾脏中存在的时间更长有利于抗原递呈和诱导免疫应答；

3、改造株能够引起更强的免疫反应，诱导的细胞因子水平(如IFN-γ、TNF-α、IL-6)显著高于LI；

4、本发明获得的改造株LIΔilo::hly对小鼠毒力较LI弱，LD50高于LI，血清中ALT、AST的含量在免疫3d后恢复降低至免疫前水平，整体病理严重程度弱于LI，表明其具有良好的生物安全性；

5、LIΔilo::hly能诱导小鼠分泌细胞因子，并在免疫40d后仍保持较高的水平，相较LI，其诱导的细胞因子水平显著提升；

6、免疫攻毒试验结果表明，LIΔilo::hly免疫能在一定程度上保护LI再次感染，且保护率高于LI免疫后的保护率。

上述表明，本发明获得的改造株LIΔilo::hly做为疫苗载体，安全性更好、免疫原性更高，是一种更优良、有应用前景的疫苗载体。

附图说明

图1为本发明制备重组绵羊李斯特菌所需的打靶质粒的示意图和制备流程示意图；

图2为本发明中菌株LM、菌株LI、菌株LIΔilo、菌株LIΔilo::hly的体外生长曲线；

图3为本发明中重组绵羊李斯特菌在小鼠巨噬细胞RAW264.7内增殖倍数变化，其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；

图4为本发明中重组绵羊李斯特菌对鼠肝癌细胞Hepa1-6黏附率和侵袭率，A为黏附率，B为侵袭率，***表示P＜0.001(与LIΔilo相比)；

图5为本发明中重组绵羊李斯特菌和LI尾静脉注射至小鼠后的生存曲线，其中，A为LIΔilo::hly，B为LI；

图6为本发明中小鼠尾静脉接种菌株LM、LI、LIΔilo::hly、LIΔilo后脏器载菌量清除趋势，A、B、C分别表示肝、脾、肺三个脏器中各细菌含量；

图7为本发明中重组绵羊李斯特菌免疫小鼠后血清ALT和AST水平，A为ALT，B为AST，***表示有统计学差异，P<0.001；

图8为本发明中各菌株免疫小鼠后脏器病理变化(200×)，A为肝脏，B为脾脏，C为肺脏；

图9为本发明中各菌株对小鼠两次免疫后第9d、40d测定的细胞因子含量，A为IL-6，B为IL-4，C为IFN-γ，D为TNF-α，E为IL-12，*表示与LI组比较有统计学差异，P<0.05，#表示与PBS组比较具有统计学差异，P<0.05；

图10为本发明中两次免疫小鼠后的保护率，*表示P＜0.05(与LI相比)，#表示P＜0.05(与PBS相比)。

具体实施方式

本发明提供一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

研究发现，将结核分枝杆菌抗原插入LI基因组获得一株重组细菌，免疫小鼠可引起以分泌IFN-γ为主的抗原特异性CD8⁺T细胞免疫反应，证实LI可作为构建疫苗的载体。

本发明为提高LI作为疫苗载体的安全性和免疫原性进行改良，提供了一种将LI溶血素基因ilo替换为LM溶血素基因hly的技术方案，得到溶血素经过改造的重组LI菌株LIΔilo::hly，该改造株安全性、免疫原性、免疫保护率相较LI大大提升，可作为更优良的疫苗载体用于疫苗的制备领域。

在本发明提供的一个实施例中提供一种重组绵羊李斯特菌，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。在一个实施例中，该ilo基因在重组绵羊李斯特菌中的片段是缺失的，在另一个实施例中，hly基因的启动子与重组前所述ilo基因的启动子序列相同，相当于hly基因对ilo基因进行了回补。在可选的方案中，hly基因位于重组前ilo基因所在的区域。在另一个可选的方案中，重组绵羊李斯特菌还包括异源性抗原，以用于制备疫苗。其中，该异源性抗原可包括肿瘤细胞的特异性抗原。此外，hly基因的序列可如SEQ ID NO:19所示。

本公开的一个技术方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。

在一个实施例中，本发明还提供一种疫苗载体，该疫苗载体包含重组绵羊李斯特菌。该疫苗载体可制备针对哺乳动物癌细胞的疫苗，本公开使用的癌细胞包括任何癌症的恶性肿瘤细胞。“哺乳动物”包括人或非人类。

在一个公开的技术方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括将表达异源性抗原的异源基因导入如上所述的疫苗载体，得到目标疫苗；给受试者施用有效量的所述目标疫苗。该类表达异源性抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetal antigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA125)、癌基因(例如Her2)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据针对的细胞对象，选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。

在一个实施例中，本文提供诱导受试者中免疫应答的方法，该方法包括向受试者试用包含本文提供的重组绵羊李斯特菌，从而诱导免疫应答。用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。该施用方法包括静脉内或经口施用，在一个实施例中，即采用静脉注射的方式施用。

本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。

示例性的，本公开采用的绵羊李斯特菌为LI PAM55(Zhou M,Jiang M,Ren C,LiuS,Pu Q,Goldfine H,Shen H,Wang C.Listeria ivanovii infection in mice:restricted to the liver and lung with limited replication in the spleen.FrontMicrobiol,2016,7:790.)；单增李斯特菌为LM 10403s(Mahdy SE,Liu S,Su L,Zhang X,Chen H,Pei X,Wang C.Expression of the VP1protein of FMDV integratedchromosomally with mutant Listeria monocytogenes strain induced both humoraland cellular immune responses.Appl Microbiol Biotechnol,2019,103(4):1919-1929.)。需要补充说明的是，其他不同来源的绵羊李斯特菌和单增李斯特菌也同样适用本实施例。

实施例1：构建用于敲除ilo基因的第一打靶质粒，以及用于回补hly基因的第二打 靶质粒

具体地，本实施例中用于敲除ilo基因的打靶质粒主要用于使绵羊李斯特菌中的ilo基因缺失、失活或突变，从而影响绵羊李斯特菌本身的溶血素发挥功能。因此，条件性敲除、利用随机突变进行基因敲除、RNAi引起的基因敲除、基于同源重组的基因敲除等方式都可作为可选的敲除ilo基因的手段，基于手段的不同，后续可引起绵羊李斯特菌中的ilo基因缺失、失活或突变。

为了方便说明，本实施例采用基于同源重组的基因敲除方式，第一打靶质粒为包含ilo基因的上下游同源臂的质粒。在构建过程中选用的酶切位点、PCR引物等都可根据菌株的特性等调整。

此外，hly基因是单增李斯特菌中表达溶血素的基因。构建的重组绵羊李斯特菌具有两个特征，一个是包含单增李斯特菌的hly基因，另一个特征是绵羊李斯特菌本身的表达溶血素的ilo基因存在缺陷，该缺陷可包括缺失、失活或突变。

导入hly基因可采用病毒感染、基因定点插入等方式。病毒感染存在插入位置不确定的风险，而针对基因定点插入，可以选择将hly基因片段和启动子一同导入至绵羊李斯特菌中的非编码蛋白区域，也可以选择将ilo基因的启动子负责启动hly基因，以达到重组前和重组后绵羊李斯特菌的溶血素表达水平一致。

1.1制备第一载体质粒的载体骨架片段

首先获取用于构建第一打靶质粒的第一载体质粒，本实施例采用pCW107(Wang C,Zhang F,Yang J,Khanniche A,Shen H.Expression of Porcine Respiratory andReproductive Syndrome Virus membrane-associated proteins in Listeria ivanoviivia a genome site-specific integration and expression system.J Mol MicrobiolBiotechnol,2014,24(3):191-195.)作为第一载体质粒，其具有XbaI、NotI等酶切位点。本实施例按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒pCW107。

然后对第一载体质粒进行酶切并回收，得到可用于连接ilo基因上下游同源臂的载体骨架片段。取质粒pCW107以限制性内切酶XbaI和NotI酶切，酶切体系按试剂说明进行。37℃水浴1h进行酶切后加入0.5μL碱性磷酸酶(CIAP)，37℃水浴30min去磷酸化。然后将酶切混合物与适量6×Loading Buffer混合，在质量浓度1％的琼脂糖凝胶、94V的条件下进行电泳(以下电泳条件均于此相同)。成像后切下目的片段(7449bp)，按照OMEGA DNA产物纯化试剂盒说明书回收载体片段，以35μL Elution Buffer洗脱，并用Nanodrop对上述DNA片段进行浓度及纯度检测。

1.2克隆ilo基因的上下游同源臂

挑取脑心浸液肉汤培养基(Brain-Heart Infusion Broth,BHI)平板上的单个LI菌落于100μL纯水中，沸水浴煮沸15min，离心取上清作为模板。

针对上游片段，使用快速高保真pfu酶以引物对“LI-ilo-up-F，LI-ilo-up-R”扩增1060bp长的一段序列Up arm of ilo(LI-ilo基因上游同源臂)，PCR体系和反应程序见表1和表2，反应产物电泳，在紫外成像系统中切下含目的片段的凝胶，进行胶回收，以35μLElution Buffer洗脱，并用Nanodrop定量。其中，LI-ilo-up-F序列如SEQ ID NO:5，LI-ilo-up-R序列如SEQ ID NO:6。

表1PCR扩增体系

PCR体系	体积(μL)
		I-5<sup>TM</sup>2×High-Fidelity Master Mix	12.5
引物-F	1
		引物-R	1
模板	8
		ddH<sub>2</sub>O	2.5
总体积	25

表2PCR扩增条件

PCR扩增产物进行酶切和胶回收。由于上下游同源臂的长度较长，因此，采用分段连接的方式，将上下游同源臂依次连接至pCW107质粒上，对于上游同源臂酶切采用的是XbaⅠ和NotⅠ这两个酶切位点，采用表3的酶切体系进行酶切。

表3酶切体系

酶切体系	加入量(μl)
		Up arm of ilo	＜1μg
XbaⅠ	1
		NotⅠ	1
10×Buffer	2
		ddH<sub>2</sub>O	加至20
总体积	20

将上述酶切混合物与适量6×加样缓冲液混合后上样电泳，结束后于凝胶成像分析仪照紫外检测，并迅速切下目的片段，按照OMEGA胶回收试剂盒说明书操作回收目的片段，洗脱后利用Nanodrop对回收片段进行定量。

针对下游同源臂，采用与上游同源臂类似的方法扩增、酶切和回收，所用扩增引物为LI-ilo-down-F，LI-ilo-down-R，所用限制性内切酶为SpeII和NotI。其中，LI-ilo-down-F序列如SEQ ID NO:7，LI-ilo-down-R序列如SEQ ID NO:8。

1.3构建包含ilo基因上下游同源臂的第三打靶质粒

具体地，如图1所示，先将ilo基因的上游同源臂酶切回收片段(插入片段)与第一载体质粒骨架片段连接。将酶切和去磷酸化后的载体线性骨架片段和插入片段分别按表4混匀后，50℃连接15min。将连接产物按热休克法转化至大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板(含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)溶液的LB平板)，37℃培养16～20h。

表4连接体系的配制

连接体系	体积(μl)
		质粒载体	50ng
插入片段	摩尔比为5:1
		Sosoo mix	1
ddH<sub>2</sub>O	加至10
		共计	10

其中，采用的Sosoo mix为Trelief公司的无缝克隆试剂盒提供的混合液。

然后挑选平板上单个白色菌落进行增菌培养，分别以引物LI-ilo-up-F，LI-ilo-up-R进行扩增筛选，PCR体系中酶换成2×Taq Mastermix，其余成分和反应程序与表1、表2相同，反应产物电泳检测。然后将PCR筛选阳性的菌落以LA肉汤(含100μg/mL Amp溶液的LB肉汤)增菌，提质粒，以XbaI和NotI进行酶切，酶切结束后，酶切混合物进行电泳检测。最后按前述方法提取PCR筛选和酶切验证均符合预期的质粒，送往测序公司进行测序验证。将测序验证后完全正确的阳性质粒分别命名pCW618(序列如SEQ ID NO:1)，携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-20℃和-80℃。

然后将下游同源臂连接至pCW618中，得到第三打靶质粒。采用SpeIⅠ和NotⅠ对pCW618进行酶切、去磷酸化和回收，回收片段长7376bp。

采用与连接上同源臂类似的方式，将下游同源臂与酶切pCW618回收的片段进行连接、转化、PCR筛选和酶切筛选。其中，PCR筛选引物为LI-ilo-down-F，LI-ilo-down-R，酶切筛选所用限制性内切酶为SpeII和NotI，获得重组质粒命名为pCW619(序列如SEQ ID NO:2)，即第三打靶质粒。

1.4构建第一打靶质粒和第二打靶质粒

具体地，先采用NotI对第三打靶质粒pCW619进行酶切、去磷酸化和回收，得到第二载体片段。

对lacZ基因进行扩增，并插入到第三打靶质粒中，得到第一打靶质粒。其中，lacZ基因采用的扩增引物为lacZ-F和lacZ-R，采用NotⅠ进行酶切。后续将扩增的lacZ基因连接到第三打靶质粒pCW619中，转化、筛选和验证，PCR筛选引物为lacZ-F和lacZ-R，酶切筛选所用限制性内切酶为NotⅠ。最终得到携带lacZ基因的第一打靶质粒pCW620(序列如SEQ IDNO:3)。其中，lacZ-F序列如SEQ ID NO:9，lacZ-R序列如SEQ ID NO:10。对hly基因进行扩增，并插入到第三打靶质粒中，得到第二打靶质粒。其中，hly基因采用的扩增引物为hly-F，hly-R，采用NotⅠ进行酶切。后续将扩增的hly基因连接到第三打靶质粒pCW619中，转化、筛选和验证，PCR筛选引物为hly-F和hly-R，酶切筛选所用限制性内切酶为NotⅠ。最终得到携带hly基因的第二打靶质粒pCW621(序列如SEQ ID NO:4)。

实施例2：构建重组绵羊李斯特菌

在本实施例中，先将第一打靶质粒pCW620导入绵羊李斯特菌中。由于第一打靶质粒包含ilo基因的上下游同源臂，且在同源臂之间连接有lacZ基因，因此在绵羊李斯特菌发生DNA复制时，利用同源重组，可将绵羊李斯特菌中的ilo基因敲除，并引入第一打靶质粒上的lacZ基因。一方面，在ilo基因缺陷且包含lacZ基因的绵羊李斯特菌中可引入第二打靶质粒pCW621，第二打靶质粒包含ilo基因的上下游同源臂且同源臂之间连接有hly基因，利用同源重组，绵羊李斯特菌中的lacZ基因可被hly基因替代，从而得到本方案所描述的重组绵羊李斯特菌。另一方面，在ilo基因缺陷且包含lacZ基因的绵羊李斯特菌中引入第三打靶质粒pCW619，由于该质粒不包含lacZ基因但包含ilo基因的上下游同源臂，因此可利用同源重组，将绵羊李斯特菌中的lacZ基因敲除，从而得到ilo基因缺陷的绵羊李斯特菌，可作为重组绵羊李斯特菌的对比菌株。

2.1制备绵羊李斯特菌的感受态细胞

挑取BHI平板上新鲜培养的LI菌落接种于15mL含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤，37℃180rpm过夜培养；将上述肉汤培养物全部接种于250mL含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤，37℃180rpm摇育，以含0.5mol/L蔗糖的BHI肉汤调零，定期测定A₆₀₀值；当A₆₀₀值达到0.4时，加入盘尼西林G(终浓度为12.5μg/mL)，混匀后继续摇育；当A₆₀₀值达到0.7时，将肉汤培养物分装至50mL离心管，4℃13000rpm离心5min，弃上清；加入20mL0.5mol/L蔗糖溶液洗涤沉淀，4℃10000rpm离心10min，弃上清；重复洗涤1次；每管加入300μL 0.5mol/L蔗糖重悬，50μL/支分装1.5mL EP管，-80℃保存。

2.2制备ilo基因缺失且引入lacZ的绵羊李斯特菌株

先将第一打靶质粒转入绵羊李斯特菌的感受态细胞中。为了提高转入效率，本实施例采用电转的方式，先取感受态细胞LI冰浴自融；用预冷的枪头吸取5μL打靶质粒pCW620加入50μL上述感受态细胞中；轻柔混匀，冰浴5min；将液体转移至预冷的电转杯中，冰浴5min；在电压1500V条件下电击5ms；点击后电转杯取出冰浴5min，加入预热750μL含1mol/L蔗糖的BHI肉汤，30℃，150rpm摇育2h；将菌液涂布于BE₃-X-I平板，其中，BE₃-X-I平板是BHI琼脂灭菌后加入红霉素(Erythromycin)溶液(Ery终浓度为3μg/ml)得到。在BE₃-X-I平板中，平板表面涂布40μl X-gal和8μl IPTG，37℃培养48-72h。

电转后，基于蓝白斑筛选和质粒本身的抗性，在平板上挑选出单个蓝色菌落进行增菌培养，并进行后续的鉴定。

本实施例采用的鉴定方式包括PCR筛选和质粒筛选。PCR筛选时分别采用三对引物进行PCR筛选。第一对引物为LI-ldh-F和LI-ldh-R，用于检测乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)基因，作为阳参；第二对引物为Ery-F和Ery-R，用于检测第一打靶质粒上的Ery抗性基因；第三对引物为lacZ-F和lacZ-R，用于检测第一打靶质粒上lac-Z基因。此外，将PCR筛选的阳性菌接种于BE10肉汤(含10μg/mL Ery溶液的BHI肉汤)，30℃180rpm过夜培养；取新鲜菌液于1.5mL EP管中，13000rpm离心1min，弃去上清；加入250μL含有20mg/mL溶菌酶的Solution I(含RNA酶)，重悬细菌沉淀，于37℃水浴45min进行破壁；其余步骤按OMEGA质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒，电泳检测。其中，LI-ldh-F序列如SEQ ID NO:13，LI-ldh-R序列如SEQ ID NO:14，Ery-F序列如SEQ ID NO:17，Ery-R序列如SEQ ID NO:18。

将PCR筛选和质粒筛选后的菌株作为电转成功的菌株，用于后续的同源重组。在温度和红霉素抗性双重压力下连续传3代，以使第一打靶质粒插入片段与受体菌基因组间发生第一次基因同源重组。

将第3代平板生长出的蓝色菌落接种至BHI肉汤中，撤除红霉素及温度压力，30℃，180r/min培养24h连续传代培养6代以使打靶质粒与受体菌基因组间发生第二次同源重组，同时脱质粒，从而将ilo基因的上游同源臂和下游同源臂之间的基因片段，也就是ilo基因片段，替换为第一打靶质粒上的lacZ基因。取第3、4、5、6代肉汤培养物，10倍稀释至稀释度为10^-7、10^-8、10^-9，取100μl稀释后的菌液分别涂布于BE₃-X-I和B-X-I平板(BHI平板，使用前涂布X-gal和IPTG)，30℃下培养48h。

然后挑取第6代B-X-I平板上长出的蓝色菌落分别划线接种BE₃-X-I平板和B-X-I平板，30℃培养48h；挑取B-X-I平板上长出蓝色菌落且在相应BE₃-X-I平板未生长的菌落进行PCR验证。挑取符合蓝白斑预期和红霉素抗性筛选的菌落，分别以引物LI-ldh-F，LI-ldh-R、Ery-F，Ery-R和lacZ-F，lacZ-R进行PCR筛选，PCR体系中酶换成2×Taq Mastermix，其余成分和反应程序与表1、表2相同。PCR结束后电泳观察。

最后，对PCR筛选的阳性菌株测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为LIΔilo::lacZ，分别保存于-20℃和-80℃。

按照前述制备绵羊李斯特菌的感受态细胞的方式，制备LIΔilo::lacZ感受态，并将第三打靶质粒pCW619电转入LIΔilo::lacZ感受态细菌中，按前述方法进行同源重组，用引物对菌株进行筛选，其中，第一个引物对为ilo-F和ilo-R，第二个引物对为lacZ-F和lacZ-R，本次筛选是挑选ilo基因缺失且不携带lacZ基因的菌株。PCR筛选后符合条件的阳性菌株进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为LIΔilo，简称为溶血素缺陷株，即ilo基因缺失的绵羊李斯特菌株。其中，ilo-F序列如SEQ ID NO:11，ilo-R序列如SEQID NO:12。

2.3制备重组绵羊李斯特菌株

按照前述步骤制备LIΔilo::lacZ感受态，然后将第二打靶质粒pCW621电转LIΔilo::lacZ感受态细菌中，按前述方法进行同源重组，用引物对hly-F与hly-R进行PCR筛选出成功回补hly基因的菌株，对PCR筛选的阳性菌株进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为LIΔilo::hly，简称为溶血素改造株，即重组绵羊李斯特菌。其中，hly-F序列如SEQ ID NO:15，hly-R序列如SEQ ID NO:16。

实施例3：重组李斯特菌的体外生长特性

挑取平板上LM、LI、LIΔilo、LIΔilo::hly单个菌落分别接种于5ml BHI肉汤37℃培养24h，再吸取一定量的上述菌液接种于40ml BHI肉汤，置于摇床37℃，200rpm扩大培养，调节各菌液初始的A₆₀₀值为0.05左右，每隔1h吸取3ml菌液测定并记录A₆₀₀值(共连续测定11h)，记录各个时间点A₆₀₀值并绘制生长曲线，该实验独立重复三次，实验结果见图2。结果显示LIΔilo::hly、LIΔilo在各个时间点生长速度及生长趋势均与LI保持一致，且生长差异不具有统计学意义，表明绵羊李斯特菌溶血素敲除及回补后，重组菌株体外生长未受到明显影响。

实施例4：重组李斯特菌在鼠巨噬细胞内增殖能力测定

首先将鼠巨噬细胞复苏，以便进行实验。从液氮罐中取出冻存的RAW264.7巨噬细胞，置于37℃水浴锅中快速融化，转移到含5mL DMEM培养液的无菌离心管中，1000rpm离心5min后弃去上清，加入4mL含体积浓度20％的胎牛血清(FBS)的DMEM(20％FBS-DMEM)(含抗生素)培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置于CO₂培养箱中37℃培养。每天观察细胞生长状况，当细胞密度达到80％～90％进行传代。

细胞传至第3代，洗涤、消化后将细胞吹打到20％FBS-DMEM(不含双抗)培养液中制成细胞悬液，取适量悬液与苔盼蓝混合后用细胞计数板进行计数。将适量细胞悬液接种至24孔细胞培养板中(每孔1×10⁶个)，每孔再加入1mL含体积浓度10％的FBS的DMEM(10％FBS-DMEM)(不含抗生素)培养液，置于CO₂培养箱37℃过夜培养。

同时，准备需要与巨噬细胞共培养的细菌，吸取250μL过夜培养的新鲜LM、LI、LIΔilo、LIΔilo::hly菌液，接种于5mL BHI肉汤，37℃180rpm摇床中培养，定时测定A₆₀₀值，当A₆₀₀值为0.4时，取出试管。将试管中的菌液转移到15mL离心管中，4℃13000rpm离心5min，弃上清，用5mL PBS洗涤，4℃13000rpm离心2min，弃上清，用5mL含10％FBS-DMEM培养液重悬细菌置于冰上备用，此时细菌浓度约为10⁸CFU/mL。

然后将重组李斯特菌细菌感染巨噬细胞。将24孔细胞培养板取出，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入900μL 10％FBS-DMEM(不含双抗)培养液。以MOI约20：1的感染量加入100μL菌液，晃动培养板使细菌分布均匀，于37℃CO₂培养箱中作用1h。根据接种的细菌分为4组：①LM；②LI；③溶血素缺陷株LIΔilo；④溶血素改造株LIΔilo::hly。

感染后，将未能进入巨噬细胞的胞外细菌灭杀，弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含200μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM培养液(不含双抗)，37℃CO₂培养箱中作用1h以杀灭胞外细菌。

然后在不同时间点对细胞内的细菌计数，以检测重组李斯特菌在巨噬细胞内的增殖数量。取部分孔弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，多次吹打后将悬液转移到EP管中，用体积浓度0.1％Triton-100溶液连续10倍稀释，每一稀释度取20μL平行双样点种于BHI平板，37℃培养48h，菌落计数，此时计数的细菌标为2h组。剩余孔继续培养，之后每隔2h取部分孔洗涤细胞收集细菌直至8h。增殖倍数＝各时间点回收的胞内细菌数/入侵细胞的细菌数(2h时回收的胞内细菌数)。结果如图3所示，亲本株LI和改造株LIΔilo::hly均能在巨噬细胞内增殖，感染后一直呈现出现菌量增多的增殖趋势，感染4h、6h、8h后表现出与亲本株同样的增殖趋势增殖，增殖能力强于亲本株LI，差异有统计学意义(P<0.05)，表明回补hly基因后细菌在巨噬细胞内增殖的能力有一定程度提升。

实施例5.重组绵羊李斯特菌对鼠肝癌细胞黏附、侵袭能力测定

本实施例采用的鼠肝癌细胞为Hepa1-6细胞，其他类型的肝癌细胞也可作为实验对象。

首先复苏、计数培养Hepa1-6细胞，以及准备重组绵羊李斯特菌。此步骤与前一实施例的步骤类似，不过Hepa1-6为贴壁细胞，在传代培养时，消化步骤需加1mL胰酶。

然后进行黏附与侵袭的计数。首先将重组绵羊李斯特菌感染Hepa1-6细胞。将培养后的24孔板取出，弃去培养液，用PBS洗涤2次，加入900μL 10％FBS-DMEM(不含双抗)培养液。以MOI约20：1的感染量加入100μL菌液，晃动培养板使细菌分布均匀，于37℃CO₂培养箱中作用1h。根据接种的细菌分为4组：①LM；②LI；③溶血素缺陷株LIΔilo；④溶血素改造株LIΔilo::hly。

然后计算黏附率。弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，混匀后吸至EP管中；连续10倍稀释，取20μL稀释液点种于BHI平板(平行双样)，37℃培养48h，菌落计数；细菌黏附率计算公式＝(黏附细菌数/接种菌数)×100％。

最后计算侵袭率。先弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含200μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM培养液(不含双抗)，37℃CO₂培养箱中作用1h以杀死胞外细菌。弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL含20μg/mL庆大霉素的10％FBS-DMEM(不含双抗)细胞培养液置于37℃CO₂培养箱继续培养1h后弃去培养液，PBS洗涤2次，加入1mL体积浓度0.1％Triton-100溶液，混匀后吸至EP管中；连续10倍稀释，每一稀释度取20μL稀释液点种于BHI平板，37℃培养48h，菌落计数；细菌侵袭率计算公式＝(胞内细菌数/接种菌数)×100％。结果如图4-A所示，LM、LI、溶血素缺陷株LIΔilo、溶血素改造株LIΔilo::hly测定的黏附率分别为0.54％、0.56％、0.57％、0.48％，各菌株黏附率相差无几且差异无统计学意义(P>0.05)，即将溶血素hly回补至LI或将ilo溶血素基因敲除后不影响对鼠肝癌细胞Hepa1-6的黏附能力；LM、LI、溶血素缺陷株LIΔilo、溶血素改造株LIΔilo::hly对鼠肝癌细胞细胞的侵袭率分别为0.076％、0.062％、0.075％、0.024％，LM、LI、LIΔilo::hly三组之间侵袭率无统计学差异，侵袭率均高于LIΔilo，差异有统计学意义(P<0.05)见图4-B。

实施例6：重组绵羊李斯特菌对小鼠毒力的测定

复苏重组绵羊李斯特菌，根据下表，用PBS分别配制四个不同剂量的LIΔilo::hly。

表5重组绵羊李斯特菌株的接种量及菌悬液浓度

菌株	接种量	菌悬液浓度(CFU/mL)
			LIΔilo::hly	100μL	5×10<sup>5</sup>、5×10<sup>6</sup>、5×10<sup>7</sup>、5×10<sup>8</sup>

然后进行小鼠毒力测定。6～8周龄的C57BL/6雌鼠随机分组，剪耳标记，适应性饲养一周；75％酒精消毒小鼠尾部皮肤后，尾静脉缓慢注射100μL菌悬液；接种完毕后，对菌液进行10倍梯度稀释，各稀释度取20μL平行双样滴种于BHI平板，37℃培养，48h后进行菌落计数，以测定各接种液中菌液的实际剂量。连续10d观察和记录小鼠体重和死亡情况。5×10⁴、5×10⁵、5×10⁶、5×10⁷剂量组分别死亡0、0、2、7只，见图5，经改良寇氏法公式计算得到LD50为1.1×10⁷CFU，高于亲本株LI(本实验测定LI的LD50为6.3×10⁶CFU)。

实施例7：重组绵羊李斯特菌在小鼠体内的生长情况、细胞因子测定及免疫保护率

复苏重组绵羊李斯特菌，配制1.1×10⁷CFU/mL LIΔilo::hly菌悬液。然后测定脏器载菌量、血清ALT和AST的含量。小鼠随机分组，剪耳标记，适应性饲养一周后；经75％酒精消毒小鼠尾部皮肤，尾静脉缓慢注射100μL上述菌悬液；分别于接种后1、3、5、7、9和14d以颈椎脱臼法处死小鼠；无菌操作取出小鼠肝脏、脾脏、肺脏。并加入2mL、1mL、2ml体积浓度0.1％Triton X-100溶液于肝脏、脾脏、肺脏无菌收集管中，转移至裂解介质管进行匀浆；对匀浆液用无菌PBS进行10倍系列稀释，取20μL稀释液分别点种于BHI平板(平行双样)，37℃培养24～48h，对BHI平板生长的菌落计数，将菌落数换算成各脏器中的细菌载量(lg CFU/organ)可得到改造株在小鼠体内的生长规律。结果如图6所示，在接种后1d，LIΔilo::hly在小鼠肝、脾、肺脏器中的载菌量最高并呈现相似的清除趋势，随后菌量逐渐降低，分别在接种后第3d、5d、7d在小鼠肺脏、脾脏、肝脏内菌量均下降至检出限以下，表明细菌已从肝脏中清除，观察至接种后第14d脏器中也未检测到细菌，表明细菌未复燃。

同时分别于接种后1、3、5、7、9和14d取小鼠眼球血1ml，室温静置(避免晃动引起溶血反应)自凝3h，3000rpm离心20min取血清，检测其中ALT和AST的含量。ALT和AST是分布于肝细胞中的两种转氨酶，当机体肝脏受到病理损伤时，ALT和AST便从胞质中被释放进血液导致血清中含量增加，检测血清中ALT、AST的含量变化可以反应肝脏受损情况，因此可以作为评价疫苗候选株生物安全性的一个指标。免疫前后小鼠血清中ALT、AST水平检测结果如图7所示，尾静脉后1d水平最高，ALT、AST分别高达95U/L、200U/L，与接种前比较具有统计学差异，在第3、5、7、9和14d均降至与对照组相当的水平，与上述载菌量结果一致。

最后，为了对感染后的小鼠在病理水平进行鉴定，制备病例切片，并观察评分。尾静脉免疫后于第3d、14d无菌剖取小鼠的肝、脾、肺，经4％多聚甲醛溶液固定，送样至公司进行常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色等操作，对病理部位进行拍照分析，同时送样进行病理切片分级评定。LIΔilo::hly多在第3d出现病理改变，整体在第14d均基本恢复正常，脏器病理现象轻于LI组，下面将结合表6脏器病理评分表分析。

表6肝脏、脾脏、肺脏病理评分

图8-A显示LIΔilo::hly组肝脏第3d病理情况弱于LM、LI组，仅有轻微的肝细胞小灶性坏死(边缘黑色的空心箭头)和炎性细胞灶性浸润(黑色箭头)；LIΔilo组肝小叶内呈现炎性细胞小灶性浸润(黑色箭头)，少量的肝细胞水样变性(浅色箭头)，与评分结果吻合，第14d时，LIΔilo::hly组和LIΔilo组肝脏恢复程度与LI组保持一样，基本趋于正常状态。

图8-B显示第3d时LIΔilo::hly和LIΔilo组脾脏组织仅红髓中实质细胞数目减少，存有少量的中性粒细胞(浅色箭头)未有其他异常，第14d均未呈现病理改变现象，病理评分结果均为0。

图8-C显示LI、LIΔilo::hly组第3d组织气道周围少量的肺泡壁轻度增厚(黑色箭头)，肺泡腔较狭窄，第14d基本恢复正常，LIΔilo组第3d仅少量炎性细胞浸润，未造成明显的肺脏损伤。

其次，对感染后小鼠的细胞因子水平进行测定。小鼠随机分组，剪耳标记，适应性饲养一周后进行尾静脉接种两次，间隔一周，分别于第二次免疫后9d、40d颈椎脱臼处死，无菌操作取出小鼠脾脏放入装有预冷的RPMI1640离心管中，转移至生物安全柜中，于无菌培养皿铺上无菌200目尼龙网研磨过滤，收集后于温度4℃，转速1300rpm条件下离心5min，倒掉液体后，敲散底部细胞；每管加入4ml过滤除菌后的ACK lysis buffer，混合均匀后放置5min，充分裂解细胞悬液中的红细胞，随后加入5ml RPMI 1640终止，同条件下离心后倒掉液体，再用RPMI1640洗涤细胞两次，最终用2ml含10％FBS的1640重悬，即得到无菌脾细胞悬液。于24孔板中加入脾细胞悬液，LM免疫组和LIΔilo::hly免疫组加入LLO肽段混合液(LLO318-329AFDAAVSGKSVS、LLO 297-304 AYGRQVYL、LLO 253-264QIYYNVNVNEPT、LLO 91–99GYKDGNEYI、LLO 190–201 NEKYAQAYPNVS)、LI组加入ILO蛋白，刺激48h，1200rpm离心20min，取上清操作，同时设定标准品组(倍比稀释的标准品)、空白孔和样本孔，按照Elisa试剂说明书操作，测定各孔OD值，绘制标准曲线，计算TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ和IL-4等细胞因子含量并统计学分析。结果显示第9d、40d测定的LIΔilo::hly组的TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ和IL-4水平与PBS对照组比较均具有统计学意义，第9d TNF-α、IL-6、IFN-γ水平与第40d IL-6、IFN-γ水平均高于亲本株LI组并具有统计学差异，见图9。

最后，对重组绵羊李斯特菌的免疫保护率进行测定。LM、LI、LIΔilo::hly、LIΔilo、PBS每组均10只小鼠，分别尾静脉注射0.1×LD50相应菌液，第二次与第一次间隔7d；并于第二次免疫后一周进行攻毒，LM、LI组攻毒菌株和剂量分别为5×LD50LM和5×LD50LI；LIΔilo::hly、LIΔilo组攻毒菌株和剂量为5×LD50LI，PBS组攻毒菌株和剂量为5×LD50LI，攻毒方式均为尾静脉。观察14d记录死亡情况并计算保护率。图10显示测定LM、LI、LIΔilo::hly、LIΔilo、PBS组的生存率分别为60％、30％、40％、0％、0％，表明LIΔilo::hly组相较于LI保护率提高10％。

序列表

<110> 深圳市生医联盟生物科技集团有限公司

<120> 一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法

<160> 19

<210> 1

<211> 8498

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 1

tcatgtttga cagcttatca tcgtcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 60

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 180

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 900

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 960

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 1020

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 1080

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 1140

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1200

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1260

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1320

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1380

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 1440

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 1500

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 1560

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 1620

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 1680

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 1740

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 1800

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 1860

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 1920

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 1980

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 2040

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 2100

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 2160

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 2220

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 2280

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 2340

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 2400

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 2460

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat 2520

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 2580

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 2640

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 2700

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 2760

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 2820

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 2880

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 2940

aggccctttc gtcttcaaga attcccagca tggagccaca caactgtcgg cggccttcca 3000

attactgaat ggattagcga agatgaacaa ggtgcaatgg atactatttt cgtaagtgtt 3060

cgtgatgcag cttatgaaat tattaataaa aaaggcgcta cattctacgg cgttgctgca 3120

gctcttgctc gtattacaaa agcaattcta aataacgaaa atgcgatttt gccactttct 3180

gtttatttag atggccatta cggtatgaac gatatttata taggtgcacc agcagtcgtt 3240

aaccgtcaag gcgttcgcca tattgttgaa atgaacttaa atgacaaaga aaaagaacaa 3300

atgaaaaact ccgcagatac acttaaaaaa gttctagagc aagttaagga agtagcgctg 3360

acgtgattaa ggtagagttt attttcccct gaagattgtt tgaaagcttg atgagcagtt 3420

tggacaattt cgttgtattt agttttaatg gtaggtccat taaagttatc ttgaataact 3480

tgattttctg cagcgaactt cattccgaat ttgctatagt taatagttaa tggtttatta 3540

gtgccgttct ctaaaagtag caaaatttta ccgcggagct cttttagtgt agggaattta 3600

tcgctagaat ctgattttgg agttgtgtag aaaaatgctt tgtactgatt aattaaaggt 3660

tggattcgat aatcaaatct atcgttttta tgattatttt catcttttaa tcgcataata 3720

atggtttctt tagggtgttc ttttaaaaag ttaaccgttg tttctaatac tcctttaagt 3780

gaagcgtcta aatagatagg cccatgataa atttggaggt cctctttcgc tctaatatca 3840

atgtatcgta tcccggcctc tagttgttga aatagcgaca tcttttgggt ttgggcaagg 3900

gcttttgtga gcgtccagct gatattccct ttataactca tggtgtcatg tgttccaggg 3960

atagtaagtg aagttaattt cgtattgtca ggcagggctg acatccattg cttagtagtt 4020

atagaacttt gtgcagttct ataactgttt ttaattgagt gcgcttttcc ggctgatgga 4080

aaagtaataa tgtaacaaac taaacataat aatactacta aaacttggcg tgaacgaagc 4140

ttatacatta ttatttcctc ctttgatttg tataagccta tcttataaat aatttcatat 4200

cgaatcttta acatttgtta aagacgttaa agtttactag atttacaata aaaccataaa 4260

caaaggatat aatattgcgt ttctaaatct tggaagcgaa tctcgtcaat attatattgg 4320

aaggagaggg gtggaacata ctacttggca ttattaggtt aaaaaatgta gaaggagagt 4380

gaaaaccgcg gccgcttatt ttggattcat atactgctca atttggctat caatatataa 4440

atattgacct gatcgaagcg ttttttcata aatatctaca tatggcaagt ttcgttttct 4500

cgcgaaagca atttctgcat caatatcata cacgattttt ttgaagtgaa tgtcaacaac 4560

ccctgcctca gttatatcaa taagcgcata ttgagctaaa ttgtcttttg ttttctgatt 4620

ccctccacct ggtagtccaa cagaaccaga attaataatt aatttatcat ccgccgtcct 4680

tcttaacgac tgtctgtgga cgtgcccatt aatagcaata tcggcatctg ttccagaaaa 4740

catcttatca aagtgggctt gttcttcagt agcataaatt ggaaagctaa cggagtcagg 4800

catcgcatga aaaccatcta tttttgtttg cagtacttgt gtggagactt tttttggtaa 4860

tgtagagaaa tagcgaaact tttcatcacc taataaatcg taatcatact tcactaaatc 4920

ctcaatcatc cgtcttttca aagaatgatc aaaagatttc ccttctaaaa agtcaatata 4980

tacttgttca tggcctccaa gcacaaaagt aagcggattt agtttttcta acagttccaa 5040

acagatatct attccggacc ctttaagaac aatatcacca actgttatgt attcctcaac 5100

cccctcgttc gcagcatctt ttagcactgc ttttagcgct tccacattac cgtgaacatc 5160

tgatatgatt gcaatcctta ctttatccat tgcgattctc ctttcccttc gcaagctact 5220

attactattc aagcaaaacc gctttactct ttttaggata acttaatgat gcttgatgta 5280

caattttttt atgaatatcc cttttagcaa atgactcact ttcgcacaaa tgcgtatatt 5340

taaagttcat ttttaaagca gtaatttatt tttccagcag atactttcgg gaaatattaa 5400

aatctttttt atccaaaata agaatgagaa cagtagtttc aaaatcattt ttttcatgtt 5460

tattgataat cacctctatg ctatctgttc tttctaccaa gaatcgcttt gctggaaact 5520

agtcccgggg cgaattgcat ctgaccgaat tttacgtttc cctgaataat tctcatcaat 5580

cgtttcatca attttatctt tatactttat attttgtgcg ttaatcaaat cataattttt 5640

atatgtttcc tcatgattta tgtctttatt attatagttt ttattctctc tttgattatg 5700

tctttgtatc ccgtttgtat tacttgatcc tttaactctg gcaaccctca aaattgaatg 5760

agacatgcta cacctccgga taataaatat atataaacgt ataaagattt cataaagtct 5820

aacacactag acttatttac ttcgtaatta agtcgttaaa ccgtgtgctc tacgaccaaa 5880

actataaaac ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa aagaaattag ataaatctct 5940

catatctttt attcaataat cgcatccgat tgcagtataa atttaacgat cactcatcat 6000

gttcatattt atcagagctc gtgctataat tatactaatt ttataaggag gaaaaaatat 6060

gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat caaccaaaca aaaaataagt 6120

ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca aattaaagag ggttataatg 6180

aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt caaaacataa tatagataaa 6240

ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct ttgaaatcgg ctcaggaaaa 6300

ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat tgaaatagac 6360

cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc acgataattt ccaagtttta 6420

aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat cctataaaat atatggtaat 6480

ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg ttcttgatag tatagctaat 6540

gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat tattaaatac aaaacgctca 6600

ttggcattac ttttaatggc agaagttgat atttctatat taagtatggt tccaagagaa 6660

tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca gattaagtag aaaaaaatca 6720

agaatatcac acaaagataa acaaaagtat aattatttcg ttctgaaatg ggttaacaaa 6780

gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt ccttaaaaca tgcaggaatt 6840

gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttgtcaatag ctataaatta 6900

tttaataagt aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt aacttgtttt tcgtgtgcct 6960

attttttgtg aatcgtcgac aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgctaac 7020

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cgaatcttta acatttgtta aagacgttaa agtttactag atttacaata aaaccataaa 4260

caaaggatat aatattgcgt ttctaaatct tggaagcgaa tctcgtcaat attatattgg 4320

aaggagaggg gtggaacata ctacttggca ttattaggtt aaaaaatgta gaaggagagt 4380

gaaaaccgcg gccgctagct ttaaggctaa atgccgaatg gttggcacct accgcattgg 4440

caaccgtggc agaagagggc gcatccgttt tggcgaaaaa gagtaaaacg gcgaggatga 4500

gtgcacagcc agagcccagc cagaaaacaa actgattatt gatggtgaac atgatgccga 4560

caatcgaggc acacagcgcc cagccaacac agccaaacat ccgcgcgcga ccaaattcga 4620

aattactgcg acggctgact ttctcaataa atgcctctac tgctggcgca ccggcgttaa 4680

aacaaaagcc tagataaata ccaccaacaa tcgatcctac taaaatgttg tattgtaaca 4740

gtggcccgaa gataaaaata aagaacggcg caaacatcac taacatgccg gtaataatcc 4800

acagcaggta tttgcgcagc ccgagtttgt cagaaagcag accaaacagc ggttggaata 4860

atagcgagaa cagagaaata gcggcaaaaa taatacccgt atcacttttg ctgatatggt 4920

tgatgtcatg tagccaaatc gggaaaaacg ggaagtaggc tcccatgata aaaaagtaaa 4980

agaaaaagaa taaaccgaac atccaaaagt ttgtgttttt taaatagtac ataatggatt 5040

tccttacgcg aaatacgggc agacatggcc tgcccggtta ttattatttt tgacaccaga 5100

ccaactggta atggtagcga ccggcgctca gctggaatta attccgccga tactgacggg 5160

ctccaggagt cgtcgccacc aatccccata tggaaaccgt cgatattcag ccatgtgcct 5220

tcttccgcgt gcagcagatg gcgatggctg gtttccatca gttgctgttg actgtagcgg 5280

ctgatgttga actggaagtc gccgcgccac tggtgtgggc cataattcaa ttcgcgcgtc 5340

ccgcagcgca gaccgttttc gctcgggaag acgtacgggg tatacatgtc tgacaatggc 5400

agatcccagc ggtcaaaaca ggcggcagta aggcggtcgg gatagttttc ttgcggccct 5460

aatccgagcc agtttacccg ctctgctacc tgcgccagct ggcagttcag gccaatccgc 5520

gccggatgcg gtgtatcgct cgccacttca acatcaacgg taatcgccat ttgaccacta 5580

ccatcaatcc ggtaggtttt ccggctgata aataaggttt tcccctgatg ctgccacgcg 5640

tgagcggtcg taatcagcac cgcatcagca agtgtatctg ccgtgcactg caacaacgct 5700

gcttcggcct ggtaatggcc cgccgccttc cagcgttcga cccaggcgtt agggtcaatg 5760

cgggtcgctt cacttacgcc aatgtcgtta tccagcggtg cacgggtgaa ctgatcgcgc 5820

agcggcgtca gcagttgttt tttatcgcca atccacatct gtgaaagaaa gcctgactgg 5880

cggttaaatt gccaacgctt attacccagc tcgatgcaaa aatccatttc gctggtggtc 5940

agatgcggga tggcgtggga cgcggcgggg agcgtcacac tgaggttttc cgccagacgc 6000

cactgctgcc aggcgctgat gtgcccggct tctgaccatg cggtcgcgtt cggttgcact 6060

acgcgtactg tgagccagag ttgcccggcg ctctccggct gcggtagttc aggcagttca 6120

atcaactgtt taccttgtgg agcgacatcc agaggcactt caccgcttgc cagcggctta 6180

ccatccagcg ccaccatcca gtgcaggagc tcgttatcgc tatgacggaa caggtattcg 6240

ctggtcactt cgatggtttg cccggataaa cggaactgga aaaactgctg ctggtgtttt 6300

gcttccgtca gcgctggatg cggcgtgcgg tcggcaaaga ccagaccgtt catacagaac 6360

tggcgatcgt tcggcgtatc gccaaaatca ccgccgtaag ccgaccacgg gttgccgttt 6420

tcatcatatt taatcagcga ctgatccacc cagtcccaga cgaagccgcc ctgtaaacgg 6480

ggatactgac gaaacgcctg ccagtattta gcgaaaccgc caagactgtt acccatcgcg 6540

tgggcgtatt cgcaaaggat cagcgggcgc gtctctccag gtagcgaaag ccattttttg 6600

atggaccatt tcggcacagc cgggaagggc tggtcttcat ccacgcgcgc gtacatcggg 6660

caaataatat cggtggccgt ggtgtcggct ccgccgcctt catactgcac cgggcgggaa 6720

ggatcgacag atttgatcca gcgatacagc gcgtcgtgat tagcgccgtg gcctgattca 6780

ttccccagcg accagatgat cacactcggg tgattacgat cgcgctgcac cattcgcgtt 6840

acgcgttcgc tcatcgccgg tagccagcgc ggatcatcgg tcagacgatt cattggcacc 6900

atgccgtggg tttcaatatt ggcttcatcc accacataca ggccgtagcg gtcgcacagc 6960

gtgtaccaca gcggatggtt cggataatgc gaacagcgca cggcgttaaa gttgttctgc 7020

ttcatcagca ggatatcctg caccatcgtc tgctcatcca tgacctgacc atgcagagga 7080

tgatgctcgt gacggttaac gcctcgaatc agcaacggct tgccgttcag cagcagcaga 7140

ccattttcaa tccgcacctc gcggaaaccg acatcgcagg cttctgcttc aatcagcgtg 7200

ccgtcggcgg tgtgcagttc aaccaccgca cgatagagat tcgggatttc ggcgctccac 7260

agtttcgggt tttcgacgtt cagacgtagt gtgacgcgat cggcataacc accacgctca 7320

tcgataattt caccgccgaa aggcgcggtg ccgctggcga cctgcgtttc accctgccat 7380

aaagaaactg ttacccgtag gtagtcacgc aactcgccgc acatctgaac ttcagcctcc 7440

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gtagtcggtt tatgcagcaa cgagacgtca cggaaaatgc cgctcatccg ccacatatcc 7560

tgatcttcca gataactgcc gtcactccaa cgcagcacca tcaccgcgag gcggttttct 7620

ccggcgcgta aaaatgcgct caggtcaaat tcagacggca aacgactgtc ctggccgtaa 7680

ccgacccagc gcccgttgca ccacagatga aacgccgagt taacgccatc aaaaataatt 7740

cgcgtctggc cttcctgtag ccagctttca tcaacattaa atgtgagcga gtaacaaccc 7800

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aagcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 8040

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 8100

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tttttcatgg gtttcactct ccttctacat tttttaacct aataatgcca aataccgttt 8220

gccacccctc tcttttgata attataatat tggcgaaatt cgcttctaaa gatgaaacgc 8280

aatattatat gcttgcttta tagctttatt ctagtcctgc tgtcccttta tcgtcgttaa 8340

caaatgttaa tgcctcaaca taaaagtcac tctaggcggc cgctaaaaat atggaaaacc 8400

ccccgcttat cacacacaca taagcttgtg agacattcgt cgcgaatcat ttggggcgaa 8460

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tattcatata atataagcat attaaaagtt tgagtcactt atagtttcct actgcgaaaa 8580

catataattt agttcccacc catactaaaa ttgtgtcctt aactctctat taatttggct 8640

atacgtggct taatctttta attacataat ttttgtagca ttaaaattgc gaaaggagag 8700

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atgtaaaggt aaaagcggac tctgttgaaa aagaaaagct tcaaagtgat atacaatccg 8820

aaatgaaagc aatagattta caagctttac caaattgcta caaggcaaaa agcgattaca 8880

agaatttgaa aattactaat agtgaaaaag atagcatggg aatcacacat attacacttg 8940

cgatgaattc cgatggttat tttacagatc acgatgaaat aaaactccat attagcccag 9000

aaaataaaat tctctttata aatggcgatc taaaacaaac gcggcctact attacaaata 9060

aaatgaaact tacagaacaa gatgcgatag aaaaggcatt tgaagcaatc ggacgaaatg 9120

aagcaagtgt caatagctac ataggaagcc cgattaaaga aaaaagagta atcgtaaatt 9180

caaggacaaa gcgtttagta tatagtataa ggttgatttt ttctgaacca gtagtagcta 9240

gctggattat tcagattgac gctgagacgg gtgcagtttt acgaaaacag aatatgctat 9300

cggaagctaa ctctcaaggg acgaaaaaaa atattatagc tccaggaaaa ggatacgatc 9360

catcattaca aagaccattg aatgttttga agataaagaa ctttttctgc ctagttgaca 9420

gaacccgcaa aggactaata agaacgtttg atttgaacca taaactagtc ccggggcgaa 9480

ttgcatctga ccgaatttta cgtttccctg aataattctc atcaatcgtt tcatcaattt 9540

tatctttata ctttatattt tgtgcgttaa tcaaatcata atttttatat gtttcctcat 9600

gatttatgtc tttattatta tagtttttat tctctctttg attatgtctt tgtatcccgt 9660

ttgtattact tgatccttta actctggcaa ccctcaaaat tgaatgagac atgctacacc 9720

tccggataat aaatatatat aaacgtataa agatttcata aagtctaaca cactagactt 9780

atttacttcg taattaagtc gttaaaccgt gtgctctacg accaaaacta taaaaccttt 9840

aagaactttc tttttttaca agaaaaaaga aattagataa atctctcata tcttttattc 9900

aataatcgca tccgattgca gtataaattt aacgatcact catcatgttc atatttatca 9960

gagctcgtgc tataattata ctaattttat aaggaggaaa aaatatgggc atttttagta 10020

tttttgtaat cagcacagtt cattatcaac caaacaaaaa ataagtggtt ataatgaatc 10080

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aaaacacagt caaaacttta ttacttcaaa acataatata gataaaataa tgacaaatat 10200

aagattaaat gaacatgata atatctttga aatcggctca ggaaaaggcc attttaccct 10260

tgaattagta aagaggtgta atttcgtaac tgccattgaa atagaccata aattatgcaa 10320

aactacagaa aataaacttg ttgatcacga taatttccaa gttttaaaca aggatatatt 10380

gcagtttaaa tttcctaaaa accaatccta taaaatatat ggtaatatac cttataacat 10440

aagtacggat ataatacgca aaattgttct tgatagtata gctaatgaga tttatttaat 10500

cgtggaatac gggtttgcta aaagattatt aaatacaaaa cgctcattgg cattactttt 10560

aatggcagaa gttgatattt ctatattaag tatggttcca agagaatatt ttcatcctaa 10620

acctaaagtg aatagctcac ttatcagatt aagtagaaaa aaatcaagaa tatcacacaa 10680

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tattagcttt gaacaattct tatctcttgt caatagctat aaattattta ataagtaagt 10860

taagggatgc ataaactgca tcccttaact tgtttttcgt gtgcctattt tttgtgaatc 10920

gtcgacaagc tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg 10980

tgtatgaaat ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta 11040

ggcataggct tggttatgcc ggtactgccg ggcctcttgc gggatcgata gaaagcgtga 11100

gaaacagcgt acagacgatt tagagatgta gaggtacttt tatgccgaga aaactttttg 11160

cgtgtgacag tccttaaaat atacttagag cgtaagcgaa agtagtagcg acagctatta 11220

actttcggtt gcaaagctct aggattttta atggacgcag cgcatcacac gcaaaaagga 11280

aattggaata aatgcgaaat ttgagatgtt aattaaagac ctttttgagg tctttttttc 11340

ttagattttt ggggttattt aggggagaaa acataggggg gtactacgac ctccccccta 11400

ggtgtccatt gtccattgtc caaacaaata aataaatatt gggtttttaa tgttaaaagg 11460

ttgtttttta tgttaaagtg aaaaaaacag atgttgggag gtacagtgat agttgtagat 11520

agaaaagaag agaaaaaagt tgctgttact ttaagactta caacagaaga aaatgagata 11580

ttaaatagaa tcaaagaaaa atataatatt agcaaatcag atgcaaccgg tattctaata 11640

aaaaaatatg caaaggagga atacggtgca ttttaaacaa aaaaagatag acagcactgg 11700

catgctgcct atctatgact aaattttgtt aagtgtatta gcaccgttat tatatcatga 11760

gcgaaaatgt aataaaagaa actgaaaaca agaaaaattc aagaggacgt aattggacat 11820

ttgttttata tccagaatca gcaaagccga gtggttagag tatttaaaag agttacacat 11880

tcaatttgta gtgctccatt acatgatagg gatactgata cagaaggtag gatgaaaaaa 11940

gagcattatc atattctagt gatgtatgag ggtaataaat cttatgaaca gataaaaata 12000

ataacagaag aattgaatgc gactattccg cagattgcag gaagtgtgaa aggtcttgtg 12060

agatatatgc ttcacatgga cgatcctaat aaatttaaat atcaaaaaga agatatgata 12120

gtttatggcg gtgtagatgt tgatgaatta ttaaagaaaa caacaacaga tagatataaa 12180

ttaattaaag aaatgattga gtttattgat gaacaaggaa tcgtagaatt taagagttta 12240

atggattatg caatgaagtt taaatttgat gattggttcc cgcttttatg tgataactcg 12300

gcgtatgtta ttcaagaata tataaaatca aatcggtata aatctgaccg atagattttg 12360

aatttaggtg tcacaagaca ctcttttttc gcaccagcga aaactggttt aagccgagtg 12420

cgcaaaagac ataatcggga attc 12444

<210> 4

<211> 10054

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 4

tcatgtttga cagcttatca tcgtcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga 60

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 120

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 180

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 240

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 300

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 360

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 420

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 480

tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 900

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 960

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 1020

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 1080

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 1140

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1200

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1260

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1320

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1380

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 1440

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 1500

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 1560

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 1620

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 1680

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 1740

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 1800

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 1860

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 1920

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 1980

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 2040

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 2100

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gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 2220

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cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 2460

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat 2520

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aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 2640

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caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 2760

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 2820

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 2880

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 2940

aggccctttc gtcttcaaga attcccagca tggagccaca caactgtcgg cggccttcca 3000

attactgaat ggattagcga agatgaacaa ggtgcaatgg atactatttt cgtaagtgtt 3060

cgtgatgcag cttatgaaat tattaataaa aaaggcgcta cattctacgg cgttgctgca 3120

gctcttgctc gtattacaaa agcaattcta aataacgaaa atgcgatttt gccactttct 3180

gtttatttag atggccatta cggtatgaac gatatttata taggtgcacc agcagtcgtt 3240

aaccgtcaag gcgttcgcca tattgttgaa atgaacttaa atgacaaaga aaaagaacaa 3300

atgaaaaact ccgcagatac acttaaaaaa gttctagagc aagttaagga agtagcgctg 3360

acgtgattaa ggtagagttt attttcccct gaagattgtt tgaaagcttg atgagcagtt 3420

tggacaattt cgttgtattt agttttaatg gtaggtccat taaagttatc ttgaataact 3480

tgattttctg cagcgaactt cattccgaat ttgctatagt taatagttaa tggtttatta 3540

gtgccgttct ctaaaagtag caaaatttta ccgcggagct cttttagtgt agggaattta 3600

tcgctagaat ctgattttgg agttgtgtag aaaaatgctt tgtactgatt aattaaaggt 3660

tggattcgat aatcaaatct atcgttttta tgattatttt catcttttaa tcgcataata 3720

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gaagcgtcta aatagatagg cccatgataa atttggaggt cctctttcgc tctaatatca 3840

atgtatcgta tcccggcctc tagttgttga aatagcgaca tcttttgggt ttgggcaagg 3900

gcttttgtga gcgtccagct gatattccct ttataactca tggtgtcatg tgttccaggg 3960

atagtaagtg aagttaattt cgtattgtca ggcagggctg acatccattg cttagtagtt 4020

atagaacttt gtgcagttct ataactgttt ttaattgagt gcgcttttcc ggctgatgga 4080

aaagtaataa tgtaacaaac taaacataat aatactacta aaacttggcg tgaacgaagc 4140

ttatacatta ttatttcctc ctttgatttg tataagccta tcttataaat aatttcatat 4200

cgaatcttta acatttgtta aagacgttaa agtttactag atttacaata aaaccataaa 4260

caaaggatat aatattgcgt ttctaaatct tggaagcgaa tctcgtcaat attatattgg 4320

aaggagaggg gtggaacata ctacttggca ttattaggtt aaaaaatgta gaaggagagt 4380

gaaaaccgcg gccgcatgaa aaaaataatg ctagttttta ttacacttat attagttagt 4440

ctaccaattg cgcaacaaac tgaagcaaag gatgcatctg cattcaataa agaaaattca 4500

atttcatcca tggcaccacc agcatctccg cctgcaagtc ctaagacgcc aatcgaaaag 4560

aaacacgcgg atgaaatcga taagtatata caaggattgg attacaataa aaacaatgta 4620

ttagtatacc acggagatgc agtgacaaat gtgccgccaa gaaaaggtta caaagatgga 4680

aatgaatata ttgttgtgga gaaaaagaag aaatccatca atcaaaataa tgcagacatt 4740

caagttgtga atgcaatttc gagcctaacc tatccaggtg ctctcgtaaa agcgaattcg 4800

gaattagtag aaaatcaacc agatgttctc cctgtaaaac gtgattcatt aacactcagc 4860

attgatttgc caggtatgac taatcaagac aataaaatcg ttgtaaaaaa tgccactaaa 4920

tcaaacgtta acaacgcagt aaatacatta gtggaaagat ggaatgaaaa atatgctcaa 4980

gcttatccaa atgtaagtgc aaaaattgat tatgatgacg aaatggctta cagtgaatca 5040

caattaattg cgaaatttgg tacagcattt aaagctgtaa ataatagctt gaatgtaaac 5100

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tataacgtga atgttaatga acctacaaga ccttccagat ttttcggcaa agctgttact 5220

aaagagcagt tgcaagcgct tggagtgaat gcagaaaatc ctcctgcata tatctcaagt 5280

gtggcgtatg gccgtcaagt ttatttgaaa ttatcaacta attcccatag tactaaagta 5340

aaagctgctt ttgatgctgc cgtaagcgga aaatctgtct caggtgatgt agaactaaca 5400

aatatcatca aaaattcttc cttcaaagcc gtaatttacg gaggttccgc aaaagatgaa 5460

gttcaaatca tcgacggcaa cctcggagac ttacgcgata ttttgaaaaa aggcgctact 5520

tttaatcgag aaacaccagg agttcccatt gcttatacaa caaacttcct aaaagacaat 5580

gaattagctg ttattaaaaa caactcagaa tatattgaaa caacttcaaa agcttataca 5640

gatggaaaaa ttaacatcga tcactctgga ggatacgttg ctcaattcaa catttcttgg 5700

gatgaagtaa attatgatcc tgaaggtaac gaaattgttc aacataaaaa ctggagcgaa 5760

aacaataaaa gcaagctagc tcatttcaca tcgtccatct atttgccagg taacgcgaga 5820

aatattaatg tttacgctaa agaatgcact ggtttagctt gggaatggtg gagaacggta 5880

attgatgacc ggaacttacc acttgtgaaa aatagaaata tctccatctg gggcaccacg 5940

ctttatccga aatatagtaa taaagtagat aatccaatcg aataagcggc cgctaaaaat 6000

atggaaaacc ccccgcttat cacacacaca taagcttgtg agacattcgt cgcgaatcat 6060

ttggggcgaa tgtcgaaaca agcttattat tttttgagtt ttaacaaatg tcaaagaatg 6120

ggatgcttct tattcatata atataagcat attaaaagtt tgagtcactt atagtttcct 6180

actgcgaaaa catataattt agttcccacc catactaaaa ttgtgtcctt aactctctat 6240

taatttggct atacgtggct taatctttta attacataat ttttgtagca ttaaaattgc 6300

gaaaggagag actgtatgaa aagaaaaaca atttttctaa tttttttatt agtctttgtg 6360

ggttatttta atgtaaaggt aaaagcggac tctgttgaaa aagaaaagct tcaaagtgat 6420

atacaatccg aaatgaaagc aatagattta caagctttac caaattgcta caaggcaaaa 6480

agcgattaca agaatttgaa aattactaat agtgaaaaag atagcatggg aatcacacat 6540

attacacttg cgatgaattc cgatggttat tttacagatc acgatgaaat aaaactccat 6600

attagcccag aaaataaaat tctctttata aatggcgatc taaaacaaac gcggcctact 6660

attacaaata aaatgaaact tacagaacaa gatgcgatag aaaaggcatt tgaagcaatc 6720

ggacgaaatg aagcaagtgt caatagctac ataggaagcc cgattaaaga aaaaagagta 6780

atcgtaaatt caaggacaaa gcgtttagta tatagtataa ggttgatttt ttctgaacca 6840

gtagtagcta gctggattat tcagattgac gctgagacgg gtgcagtttt acgaaaacag 6900

aatatgctat cggaagctaa ctctcaaggg acgaaaaaaa atattatagc tccaggaaaa 6960

ggatacgatc catcattaca aagaccattg aatgttttga agataaagaa ctttttctgc 7020

ctagttgaca gaacccgcaa aggactaata agaacgtttg atttgaacca taaactagtc 7080

ccggggcgaa ttgcatctga ccgaatttta cgtttccctg aataattctc atcaatcgtt 7140

tcatcaattt tatctttata ctttatattt tgtgcgttaa tcaaatcata atttttatat 7200

gtttcctcat gatttatgtc tttattatta tagtttttat tctctctttg attatgtctt 7260

tgtatcccgt ttgtattact tgatccttta actctggcaa ccctcaaaat tgaatgagac 7320

atgctacacc tccggataat aaatatatat aaacgtataa agatttcata aagtctaaca 7380

cactagactt atttacttcg taattaagtc gttaaaccgt gtgctctacg accaaaacta 7440

taaaaccttt aagaactttc tttttttaca agaaaaaaga aattagataa atctctcata 7500

tcttttattc aataatcgca tccgattgca gtataaattt aacgatcact catcatgttc 7560

atatttatca gagctcgtgc tataattata ctaattttat aaggaggaaa aaatatgggc 7620

atttttagta tttttgtaat cagcacagtt cattatcaac caaacaaaaa ataagtggtt 7680

ataatgaatc gttaataagc aaaattcata taaccaaatt aaagagggtt ataatgaacg 7740

agaaaaatat aaaacacagt caaaacttta ttacttcaaa acataatata gataaaataa 7800

tgacaaatat aagattaaat gaacatgata atatctttga aatcggctca ggaaaaggcc 7860

attttaccct tgaattagta aagaggtgta atttcgtaac tgccattgaa atagaccata 7920

aattatgcaa aactacagaa aataaacttg ttgatcacga taatttccaa gttttaaaca 7980

aggatatatt gcagtttaaa tttcctaaaa accaatccta taaaatatat ggtaatatac 8040

cttataacat aagtacggat ataatacgca aaattgttct tgatagtata gctaatgaga 8100

tttatttaat cgtggaatac gggtttgcta aaagattatt aaatacaaaa cgctcattgg 8160

cattactttt aatggcagaa gttgatattt ctatattaag tatggttcca agagaatatt 8220

ttcatcctaa acctaaagtg aatagctcac ttatcagatt aagtagaaaa aaatcaagaa 8280

tatcacacaa agataaacaa aagtataatt atttcgttct gaaatgggtt aacaaagaat 8340

acaagaaaat atttacaaaa aatcaattta acaattcctt aaaacatgca ggaattgacg 8400

atttaaacaa tattagcttt gaacaattct tatctcttgt caatagctat aaattattta 8460

ataagtaagt taagggatgc ataaactgca tcccttaact tgtttttcgt gtgcctattt 8520

tttgtgaatc gtcgacaagc tttaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag 8580

tcaggcaccg tgtatgaaat ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct 8640

ggatgctgta ggcataggct tggttatgcc ggtactgccg ggcctcttgc gggatcgata 8700

gaaagcgtga gaaacagcgt acagacgatt tagagatgta gaggtacttt tatgccgaga 8760

aaactttttg cgtgtgacag tccttaaaat atacttagag cgtaagcgaa agtagtagcg 8820

acagctatta actttcggtt gcaaagctct aggattttta atggacgcag cgcatcacac 8880

gcaaaaagga aattggaata aatgcgaaat ttgagatgtt aattaaagac ctttttgagg 8940

tctttttttc ttagattttt ggggttattt aggggagaaa acataggggg gtactacgac 9000

ctccccccta ggtgtccatt gtccattgtc caaacaaata aataaatatt gggtttttaa 9060

tgttaaaagg ttgtttttta tgttaaagtg aaaaaaacag atgttgggag gtacagtgat 9120

agttgtagat agaaaagaag agaaaaaagt tgctgttact ttaagactta caacagaaga 9180

aaatgagata ttaaatagaa tcaaagaaaa atataatatt agcaaatcag atgcaaccgg 9240

tattctaata aaaaaatatg caaaggagga atacggtgca ttttaaacaa aaaaagatag 9300

acagcactgg catgctgcct atctatgact aaattttgtt aagtgtatta gcaccgttat 9360

tatatcatga gcgaaaatgt aataaaagaa actgaaaaca agaaaaattc aagaggacgt 9420

aattggacat ttgttttata tccagaatca gcaaagccga gtggttagag tatttaaaag 9480

agttacacat tcaatttgta gtgctccatt acatgatagg gatactgata cagaaggtag 9540

gatgaaaaaa gagcattatc atattctagt gatgtatgag ggtaataaat cttatgaaca 9600

gataaaaata ataacagaag aattgaatgc gactattccg cagattgcag gaagtgtgaa 9660

aggtcttgtg agatatatgc ttcacatgga cgatcctaat aaatttaaat atcaaaaaga 9720

agatatgata gtttatggcg gtgtagatgt tgatgaatta ttaaagaaaa caacaacaga 9780

tagatataaa ttaattaaag aaatgattga gtttattgat gaacaaggaa tcgtagaatt 9840

taagagttta atggattatg caatgaagtt taaatttgat gattggttcc cgcttttatg 9900

tgataactcg gcgtatgtta ttcaagaata tataaaatca aatcggtata aatctgaccg 9960

atagattttg aatttaggtg tcacaagaca ctcttttttc gcaccagcga aaactggttt 10020

aagccgagtg cgcaaaagac ataatcggga attc 10054

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 5

gcagatacac ttaaaaaagt tctagagcaa gttaaggaag tagcgc 46

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 6

tttccatatt tttagcggcc gcggttttca ctctccttct ac 42

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 7

agtgaaaacc gcggccgcta aaaatatgga aaaccc 36

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 8

aattcgcccg ggactagttt atggttcaaa tcaaacgtt 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 9

aatgcgggtc gcttcactta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 10

tgtgccgaaa tggtccatca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 11

ccgatgtcct ccctgtgaaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 12

atcggtacgc ccggattttt 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 13

gcatgctttt aagatgaagt ctcac 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 绵羊李斯特菌

<400> 14

caaaaaatca ttttagttgg cgacgg 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 单核李斯特菌

<400> 15

atgaaaaaaa taatgctagt ttttta 26

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 单核李斯特菌

<400> 16

ttattcgatt cgattggatt atctact 27

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 质粒pCW107

<400> 17

gtcgacgatt cacaaaaaat aggc 24

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 质粒pCW107

<400> 18

actagtcccg gggcgaattg 20

<210> 19

<211> 2673

<212> DNA

<213> 单核李斯特菌

<400> 19

aaaaataatg ctagttttta ttacacttat attagttagt ctaccaattg cgcaacaaac 60

tgaagcaaag gatgcatctg cattcaataa agaaaattca atttcatcca tggcaccacc 120

agcatctccg cctgcaagtc ctaagacgcc aatcgaaaag aaacacgcgg atgaaatcga 180

taagtatata caaggattgg attacaataa aaacaatgta ttagtatacc acggagatgc 240

agtgacaaat gtgccgccaa gaaaaggtta caaagatgga aatgaatata ttgttgtgga 300

gaaaaagaag aaatccatca atcaaaataa tgcagacatt caagttgtga atgcaatttc 360

gagcctaacc tatccaggtg ctctcgtaaa agcgaattcg gaattagtag aaaatcaacc 420

agatgttctc cctgtaaaac gtgattcatt aacactcagc attgatttgc caggtatgac 480

taatcaagac aataaaatcg ttgtaaaaaa tgccactaaa tcaaacgtta acaacgcagt 540

aaatacatta gtggaaagat ggaatgaaaa atatgctcaa gcttatccaa atgtaagtgc 600

aaaaattgat tatgatgacg aaatggctta cagtgaatca caattaattg cgaaatttgg 660

tacagcattt aaagctgtaa ataatagctt gaatgtaaac ttcggcgcaa tcagtgaagg 720

gaaaatgcaa gaagaagtca ttagttttaa acaaatttac tataacgtga atgttaatga 780

acctacaaga ccttccagat ttttcggcaa agctgttact aaagagcagt tgcaagcgct 840

tggagtgaat gcagaaaatc ctcctgcata tatctcaagt gtggcgtatg gccgtcaagt 900

ttatttgaaa ttatcaacta attcccatag tactaaagta aaagctgctt ttgatgctgc 960

cgtaagcgga aaatctgtct caggtgatgt agaactaaca aatatcatca aaaattcttc 1020

cttcaaagcc gtaatttacg gaggttccgc aaaagatgaa gttcaaatca tcgacggcaa 1080

cctcggagac ttacgcgata ttttgaaaaa aggcgctact tttaatcgag aaacaccagg 1140

agttcccatt gcttatacaa caaacttcct aaaagacaat gaattagctg ttattaaaaa 1200

caactcagaa tatattgaaa caacttcaaa agcttataca gatggaaaaa ttaacatcga 1260

tcactctgga ggatacgttg ctcaattcaa catttcttgg gatgaagtaa attatgatcc 1320

tgaaggtaac gaaattgttc aacataaaaa ctggagcgaa aacaataaaa gcaagctagc 1380

tcatttcaca tcgtccatct atttgccagg taacgcgaga aatattaatg tttacgctaa 1440

agaatgcact ggtttagctt gggaatggtg gagaacggta attgatgacc ggaacttacc 1500

acttgtgaaa aatagaaata tctccatctg gggcaccacg ctttatccga aatatagtaa 1560

taaagtagat aatccaatcg aataagcggc cgctaaaaat atggaaaacc ccccgcttat 1620

cacacacaca taagcttgtg agacattcgt cgcgaatcat ttggggcgaa tgtcgaaaca 1680

agcttattat tttttgagtt ttaacaaatg tcaaagaatg ggatgcttct tattcatata 1740

atataagcat attaaaagtt tgagtcactt atagtttcct actgcgaaaa catataattt 1800

agttcccacc catactaaaa ttgtgtcctt aactctctat taatttggct atacgtggct 1860

taatctttta attacataat ttttgtagca ttaaaattgc gaaaggagag actgtatgaa 1920

aagaaaaaca atttttctaa tttttttatt agtctttgtg ggttatttta atgtaaaggt 1980

aaaagcggac tctgttgaaa aagaaaagct tcaaagtgat atacaatccg aaatgaaagc 2040

aatagattta caagctttac caaattgcta caaggcaaaa agcgattaca agaatttgaa 2100

aattactaat agtgaaaaag atagcatggg aatcacacat attacacttg cgatgaattc 2160

cgatggttat tttacagatc acgatgaaat aaaactccat attagcccag aaaataaaat 2220

tctctttata aatggcgatc taaaacaaac gcggcctact attacaaata aaatgaaact 2280

tacagaacaa gatgcgatag aaaaggcatt tgaagcaatc ggacgaaatg aagcaagtgt 2340

caatagctac ataggaagcc cgattaaaga aaaaagagta atcgtaaatt caaggacaaa 2400

gcgtttagta tatagtataa ggttgatttt ttctgaacca gtagtagcta gctggattat 2460

tcagattgac gctgagacgg gtgcagtttt acgaaaacag aatatgctat cggaagctaa 2520

ctctcaaggg acgaaaaaaa atattatagc tccaggaaaa ggatacgatc catcattaca 2580

aagaccattg aatgttttga agataaagaa ctttttctgc ctagttgaca gaacccgcaa 2640

aggactaata agaacgtttg atttgaacca taa 2673

Claims (8)

1.一种重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。

2.根据权利要求1所述重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述重组绵羊李斯特菌的ilo基因片段缺失。

3.根据权利要求2所述重组绵羊李斯特菌，其特征在于，hly基因的启动子与重组前所述ilo基因的启动子序列相同。

4.根据权利要求3所述重组绵羊李斯特菌，其特征在于，hly基因位于重组前ilo基因所在的区域。

5.根据权利要求1所述的重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述重组绵羊李斯特菌还包括异源性抗原。

6.根据权利要求1所述的重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述hly基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。

7.一种疫苗载体，其特征在于，所述疫苗载体包括如权利要求1～6中任意一项所述的重组绵羊李斯特菌。

8.一种在受试者中引入免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括：将表达异源性抗原的异源基因导入如权利要求7所述的疫苗载体，得到目标疫苗；

给受试者施用有效量的所述目标疫苗。

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