CN112225822B - 高扩增、存续能力和杀瘤作用的CAR-iNKT及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种嵌合抗原受体，其包含GPC3抗原结合结构域，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.29、31、33的ICD1、ICD2或ICD3细胞内信号刺激域以及氨基酸序列为SEQ ID NO.7的IL‑15‑IL‑15α融合蛋白，该嵌合抗原受体转入免疫细胞，特别是iNKT细胞后能够有效提高细胞增殖速度、存续时间和杀瘤效果。本申请还提供了相应表达载体、转导系统、制药用途以及独立的ICD1、ICD2、ICD3细胞内信号刺激域和IL‑15‑IL‑15α融合蛋白。

Description

高扩增、存续能力和杀瘤作用的CAR-iNKT及应用
技术领域
本申请属于癌症免疫治疗领域。具体地，本申请提供了嵌合抗原受体，其包含GPC3抗原结合结构域，细胞内信号刺激域以及IL-15-IL-15α融合蛋白；并提供了相应相应表达载体、转导系统、制药用途等。
背景技术
根据2018年全球肿瘤报告，全球肝癌新发病例为841080人，有781631人死于肝癌[1]。其中中国新发肝癌病例为392868人，有368960人死于肝癌[2]，几乎各占全球肝癌新发病例和死亡比例的一半。
现有肝癌治疗方式包括手术切除、肝移植、局部治疗（RFA、TACE、TAE、HIFA等）、系统治疗（索拉菲尼、仑伐替尼等）。手术切除可以实现治愈，但大多数肝癌发现时已错过最佳手术期，其治疗方式并不能令人满意。研究表明，中国肝癌患者中位生存期仅为23月，日本为60月，北美为33月，韩国为31月，欧洲为24月，埃及为11月，其他非洲国家仅为3月[3]。肝癌治疗急需更为安全有效的治疗方式。
嵌合抗原受体技术在血液肿瘤治疗中取得了显著疗效，Kymriah[4] 及Yescarta[5]于2017年获得FDA批准用于B细胞急性淋巴白血病、弥漫性大B淋巴瘤的治疗。GPC3高表达于70%的肝细胞癌细胞中，而在正常成年人组织细胞中不表达[6]。GPC3在肝母细胞瘤、鳞状细胞肺癌、睾丸和卵巢卵黄囊肿瘤、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌等肿瘤中也呈过表达状态[7]，是嵌合抗原受体技术靶向治疗的理想靶点。
GPC3基因位于X染色体，有11个外显子。转录本为2130 bp，编码580个氨基酸，其分子量约为70 kDa。GPC3多肽含有一个Furin限制性酶切位点，在Arg358 和 Cys359间将多肽剪切为两个片段：N-端为40 kDa，C-端为30 kDa。这两个亚单位可以通过一个或多个二硫键连接。N-端亚单位可以进一步剪切从而形成外周血循环中的可溶性GPC3。GPC3可于Cys495和Cys508发生硫酸肝素修饰。GPC3 Ser560通过磷脂酰肌醇锚着于细胞膜的脂质层[8]。
在正常生理条件下，GPC3广泛表达于不同胚胎细胞膜上，但不表达于正常成年人肝脏组织。人类GPC3突变会引起SGBS（simpson golabi behmel syndrome），表现为巨大儿伴随多器官和骨骼发育不良。GPC3锚着于细胞膜上，没有胞内区域，但可以与不同生长因子、趋化因子、细胞因子相互作用，从而在细胞膜表面形成浓度梯度，进而促使这些配体与他们的受体相结合[8]。
不变自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cell, iNKT)是胸腺来源T细胞中的独特亚群，具有CD1d限制性，并同时表达T细胞和自然杀伤细胞(natural killercell, NK)谱系特征的表面受体，具有T细胞和NK细胞的共同生物学特征和桥接先天免疫和过继免疫的重要作用。人类iNKT细胞中，Vα24-Jα18形成TCRα链后与Vβ11 TCRβ链形成TCR[9]。
iNKT细胞在胸腺中分化为至少三个效应亚群，类似于CD4+ T辅助细胞的亚群，也可类似于先天淋巴细胞(ILCs)的亚群 [10-12]。功能性iNKT细胞亚群根据不同细胞表面标记和特征转录因子的表达来区分。NKT1细胞与Th1细胞和ILC1s相似，因为它们都高表达转录因子T-bet并在激活之后都分泌IFN-γ。NKT1细胞也表现出比其他iNKT细胞亚群更大的细胞毒性功能。NKT1细胞与Th1细胞或ILC1s不同之处在于除了通过TCR激活产生IFN-γ外，还能产生IL-4等因子。NKT2细胞分泌的细胞因子包括IL-4和IL-13，类似于Th2细胞。而NKT17细胞在细胞因子分泌方面类似于Th17细胞[13-15]。
不同的iNKT细胞亚群在不同的组织中富集。NKT1细胞在肝脏中高度富集，而NKT17细胞主要位于淋巴结、皮肤和肺，脾脏中也有少量的细胞[16]。NKT2细胞位于多个部位，包括肺和脾脏，但它们在肠系膜淋巴结中特别丰富[16]。在周围淋巴结中，iNKT细胞能被迅速激活，并可能在对抗致病原中发挥关键作用[17]。
人类血液中的iNKT细胞可以分为DN iNKT(double-negative，DN)细胞，CD4+ iNKT细胞以及CD8+iNKT(CD8αα或CD8αβ) [9]。尤其是CD8+ iNKT细胞，目前仅在人类中发现。有研究显示DN iNKT和CD8+iNKT细胞激活时，其IFN-γ分泌和细胞毒性功能显著增加 [9]。
目前的GPC3嵌合抗原受体，如本专利接近的US 10731127B2、CN 109468279 A中，通过基因修饰，使T细胞表达针对GPC3抗原的嵌合性受体，其中 CAR 包括GPC3抗原结合结构域、跨膜结构域、 共刺激信号传导区和 CD3ζ 信号传导结构域，并对携带GPC3抗原的肝癌细胞表现出杀伤作用。但鉴于普通T细胞无法有效浸润到实体瘤中；实体瘤的肿瘤微环境缺氧，偏酸性，对CAR-T细胞的扩增及长期存续非常不利，从而严重影响CAR-T细胞的疗效。
发明内容
为解决以上问题，申请人利用iNKT细胞的归巢特性及非特异性杀伤功能，通过基因修饰使其携带能结合GPC3抗原的嵌合抗原受体，构建anti-GPC3-CAR-iNKT细胞能发挥特异性杀伤携带GPC3抗原的肝癌细胞。
通过基因修饰，使anti-GPC3-CAR-iNKT细胞在激活时特异表达促使anti-GPC3-CAR-iNKT细胞向CD8+anti-GPC3-CAR-iNKT细胞及CD4-CD8- anti-GPC3-CAR-iNKT细胞方向分化的细胞因子，从而更有利于发挥anti-GPC3-CAR-iNKT细胞对肝癌细胞的特异和非特异性杀伤功能。
通过对共刺激域的组合优化，提高anti-GPC3-CAR-iNKT细胞的扩增及长期存续能力，降低anti-GPC3-CAR-iNKT细胞的凋亡，充分发挥anti-GPC3-CAR-iNKT细胞在患者体内的抗瘤功能。
TRAF家族分子能通过与RIP、TRADD等下游分子相结合，最终激活NF-κB通路，促使细胞增殖，抗凋亡。通过借鉴与TRAF家族分子相结合的motif，我们设计出ICD1、ICD2、ICD3三个细胞内信号域，分别构建到CAR分子中，观察CAR-iNKT细胞在细胞内信号域分别为ICD1、ICD2、ICD3时对CAR-iNKT细胞增殖、细胞亚群及对肿瘤细胞杀伤能力的变化。
IL-15可以促使T细胞增殖，并向CD8+T细胞亚群分化，从而增加T细胞的细胞毒效应。但IL-15发挥作用必须与IL-15Rα相结合后才能与IL-15Rγ结合，从而激发细胞增殖和分化信号。在本发明中，通过在CAR分子中构建共表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白，从而促使CAR-iNKT细胞向CD8+CAR-iNKT细胞亚群分化，并促使CAR-iNKT细胞增殖，从而更有利于CAR-iNKT对肿瘤细胞的杀伤，满足临床应用转化的需要。
相比现有技术，本申请的技术方案肿瘤杀伤效率提高，CAR-iNKT细胞增殖速度快，可以缩短细胞体外培养周期，增加CAR-iNKT细胞在体内的存续时间，极大提高疗效，减少复发，减轻毒副作用。
一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体，包含GPC3抗原结合结构域、细胞内信号刺激域。
进一步地，所述嵌合抗原受体还包括IL-15-IL-15α融合蛋白。
进一步地，所述细胞内信号刺激域为氨基酸序列分别为SEQ ID NO.29、31、33的ICD1、ICD2或ICD3。
进一步地，所述细胞内信号刺激域为氨基酸序列为SEQ ID NO.33的ICD3。
进一步地，所述IL-15-IL-15α融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。
进一步地，所述GPC3抗原结合结构域为包含SEQ ID NO.9和11氨基酸序列的GC33ScFv。
进一步地，所述GPC3抗原结合结构域为氨基酸序列为SEQ ID NO.13的GC33 ScFv。
进一步地，所述嵌合抗原受体包括依次连接的GC33 ScFv、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、ICD1或ICD2或ICD3、CD3ζ信号传导结构域、IL-15-IL-15α融合蛋白。
进一步地，所述铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.21、19、23、35。
另一方面，本申请提供了免疫细胞，其转导了上述嵌合抗原受体。
进一步地，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或iNKT细胞。
进一步地，所述免疫细胞为iNKT细胞。
另一方面，本申请提供了上述嵌合抗原受体或免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。
另一方面，本申请提供了一种治疗癌症的方法，其中使用了上述嵌合抗原受体或免疫细胞。
进一步地，所述癌症为CPG3过表达的癌症。
进一步地，所述癌症为肝癌。
另一方面，本申请提供了上述嵌合抗原受体的表达载体。
进一步地，表达载体中包含核苷酸序列分别为SEQ ID NO.30、32、34的ICD1、ICD2或ICD3核酸序列。
进一步地，表达载体中包含核苷酸序列为SEQ ID NO.8的IL-15-IL-15α融合蛋白核酸序列。
另一方面，本申请提供了包含上述表达载体转导系统。
进一步地，所述转导系统为病毒转导系统和非病毒转导系统。
进一步地，所述转导系统为慢病毒转导系统。
另一方面，本申请提供了一种细胞内信号刺激分子，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO.29、31或33。
另一方面，本申请提供了上述细胞内信号刺激分子的核酸编码序列，所述核酸编码序列为SEQ ID NO.30、32或34。
另一方面，本申请提供了一种IL-15-IL-15α融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO.7。
另一方面，本申请提供上述IL-15-IL-15α融合蛋白的核酸编码序列，所述核酸编码序列为SEQ ID NO.8。
另一方面，本申请提供了上述细胞内信号刺激分子或其核酸编码序列，或者上述IL-15-IL-15α融合蛋白或其核酸编码序列在制备治疗癌症的嵌合抗原受体中的应用。
本发明中的CPG3过表达的癌症种类本领域技术人员可以从申请日前的现有技术和之后的研究中获知。
本发明的优化改构后胞内信号刺激域（本发明中以ICD1、ICD2、ICD3为实施例）可以促使CAR-iNKT增殖速度加快,促使CAR-iNKT分泌IFN-γ增多，增强CAR-iNKT细胞的杀瘤效能，减轻CAR-iNKT细胞耗竭状态，延长CAR-iNKT在体内的存续时间。
本发明的IL-15-IL-15Rα融合蛋白核酸可以促使CD8+CAR+iNKT细胞比例增加，促使CAR-iNKT分泌IFN-γ增多，增强CAR-iNKT细胞的杀瘤效能，减轻CAR-iNKT细胞耗竭状态，延长CAR-iNKT在体内的存续时间。
本发明包括包含上述一种或几种元件同时用于构建表达于T细胞、NK细胞或NKT细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸表达载体。可以根据需要选用各种市售的载体，或者可以根据分子生物学领域的常规技术构建载体。在一个具体实施方案中,本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pLV300。该质粒属于第四代自灭活慢病毒载体系统,该系统共有四个质粒即编码蛋白 Gag/Pol的包装质粒、编码 Rev蛋白的包装质粒、编码 VSV-G 蛋白的包膜质粒，及空载体pLV300，其可以用于重组引入目的核酸序列,即编码嵌合抗原受体蛋白的核酸序列。载体pLV300中由pGK-300 启动子调控嵌合抗原受体蛋白的表达。
本发明包括包含上述载体的病毒，包括但不仅限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒,也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转染T细胞、NK细胞或NKT细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。在本发明的一个实施方案中,所述病毒是包含上述 pLV300-anti-GPC3 CAR 重组载体的慢病毒。
本发明包括一种转基因T淋巴细胞、NK细胞或iNKT细胞,其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒,或包含该质粒的病毒系统。本领域常规的核酸转导方法,包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期 Amaxa 公司研发的 nucleofector 核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beauty system) 或 PiggyBac 转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高, 将nucleofector转染仪与SB睡美人转座子系统联合应用已有报道，该方法既能够具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的iNKT细胞的转导方法是基于慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高,外源基因能够稳定表达,且可以缩短体外培养iNKT淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。慢病毒转染导入的核酸通过转录、翻译表达在iNKT细胞膜表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明,本发明的表面表达嵌合抗原受体的转基因iNKT细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果 (亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸,包含该核酸的质粒,包含该质粒的病毒和转染有上述核酸,质粒或病毒的转基因iNKT细胞、 T淋巴细胞或NK细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
用本发明中的细胞内信号域与胞外靶点结合区相连接构建嵌合抗原受体蛋白时，胞外结合区包含特异性识别相应靶点（包括但不限于现有的已知靶点）的受体（配体）、特异的单链抗体 scFv、TCRm、VLR（本发明中以人GPC3靶点为实例进行探索）。受体（配体）、特异的单链抗体 scFv、TCRm或VLR可以根据上述文献公开的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。
本发明的核酸可以是 DNA 形式或RNA 形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的,即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
在现有CAR-T、CAR-NK治疗实体瘤技术中，由于普通T细胞、NK细胞无法有效浸润到实体肿瘤中，NK细胞在体外扩增有限，导致CAR-T、CAR-NK治疗实体瘤效应受到局限。在本发明中，通过胞内信号域的优化，可以促使CAR-iNKT得到有效扩增，并减少CAR-iNKT耗竭，增强CAR-iNKT在体内的存续时间；与此同时，在共表达IL-15-IL-15Rα的作用下，CAR-iNKT向着更有利于杀伤肿瘤的CD8+CAR-iNKT及CD4-CD8-CAR-iNKT表型分化，增强CAR-iNKT对肿瘤细胞的杀伤作用。这是目前治疗实体瘤的CAR-T、CAR-NK技术所不具备的优点。本发明中胞内信号域的组合及共表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白，为CAR-iNKT技术用于实体瘤的治疗提供了可能。
附图说明
图1为iNKT总细胞增殖曲线图；
图2（A）为CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD8+CAR+iNKT细胞亚群比例；
图2（B）为CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD8+CAR+iNKT细胞亚群比例；
图2（C）为CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD4+CAR+iNKT细胞亚群比例；
图2（D）为CAR-iNKT细胞培养不同时间时CD4-CD8-CAR+iNKT细胞亚群比例；
图3（A）为不同效靶比时anti-GPC3 CAR-iNKT对肝癌细胞Huh-7的杀伤效应；
图3（B）与细胞内信号域为4-1BB的anti-GPC3 CAR-iNKT相比，不同效靶比时各组anti-GPC3 CAR-iNKT对肝癌细胞Huh-7的杀伤效应提升倍数；
图4（A）为anti-GPC3 CAR-iNKT细胞与肝癌细胞共培养24小时后细胞培养上清中IFN-γ含量；
图4（B）为各组anti-GPC3 CAR-iNKT细胞与肝癌细胞Huh-7按3:1接种，共培养24小时后细胞培养上清中IFN-γ含量与细胞内信号域为4-1BB的anti-GPC3-CAR-iNKT组相比时，IFN-γ的变化倍数；
图5为anti-GPC3 CAR-iNKT细胞与肝癌细胞共培养24小时后LAG-3表达情况；
图6为anti-GPC3 CAR结构示意图；
图7为慢病毒载体结构示意图。
具体实施方式
术语和缩写
缩略语 英文全名 中文解释
CAR Chimeric Antigen Receptor 嵌合抗原受体
CAR-T Chimeric Antigen Receptor-T cell 嵌合抗原受体修饰的T细胞
CAR-iNKT Chimeric Antigen Receptor-iNKT cell 嵌合抗原受体修饰的iNKT细胞
CAR-NK Chimeric Antigen Receptor-NK cell 嵌合抗原受体修饰的NK细胞
TCR T cell Receptor T淋巴细胞受体
IFN-γ interferon-γ γ干扰素
IL-2 Interleukin-2 白细胞介素2
IL-15 Interleukin-15 白细胞介素15
IL-15Rα Interleukin-15 Receptor α 白细胞介素15受体α
ICD Intracytoplasmic signal domain 细胞内信号域
scFv single-chain fragment variable 单链（抗体）可变片段
pGK phosphoglycerate kinase 磷酸甘油酸激酶
α-GalCer α-galactosylceramide α-半乳糖神经酰胺
实施例1 包含嵌合抗原受体分子的慢病毒的制备
将HEK-293T细胞传代，待细胞长至60%-70%融合后，将含有CAR分子的表达载体与包装质粒一起用pEI试剂转染至HEK-293T细胞中，转染后4小时更换新鲜培养基。转染后48-72小时收集细胞培养上清。将上清进行超速离心以浓缩包装后含有CAR分子的慢病毒。对浓缩后慢病毒进行病毒滴度测定，-80℃冻存待用。
嵌合抗原受体中各部分的具体核苷酸和氨基酸序列参见序列表，其中已标注各部分名称。
实施例2 anti-GPC3 CAR中以不同细胞内信号刺激域构建及是否表达IL-15-IL15Rα融合蛋白对总iNKT细胞增殖的影响
以anti-iNKT mircrobeads从人外周血单个核细胞中分离出iNKT细胞后，在24孔板中按照每孔2x105 细胞接种，每孔加入X-VIVO完全培养基（含100 IU/ml及100 ng/ml α-Galcer）培养48小时后，收集各孔细胞，400xg离心5分钟，弃上清后，加入新鲜的X-VIVO完全培养基重悬后重新接种于24孔培养板中，每孔细胞分别加入含有4-1BB、ICD1、ICD2、ICD3、4-1BB-IL-15、ICD1-IL-15、ICD2-IL-15、ICD3-IL-15 CAR的不同慢病毒进行感染。24小时后，收集各孔细胞于离心管中，400xg离心5分钟后，计数，按5x105 cells/ml加入新鲜X-VIVO完全培养基进行培养，每48小时换液。分别培养至day 7、day14、day21时，取样分别计数及进行流式检测，以证明嵌合抗原受体分子的表达情况。
结果表明：细胞内信号刺激域ICD1、ICD3及IL-15-IL-15α融合蛋白可以明显促进iNKT细胞增殖（见图1），并促使CD8+CAR+iNKT细胞增多，在培养第7天时，各组CAR-iNKT细胞中CD8+CAR+iNKT细胞比例最高，细胞内信号域为ICD3的CAR-iNKT组中其CD8+CAR+iNKT细胞比例可达20%-30%（共表达IL-15-IL-15Rα或不表达IL-15-IL-15Rα）。之后随着培养时间延长，CD8+CAR+iNKT细胞比例逐渐降低，但相比于胞内信号刺激域为4-1BB的CAR-iNKT细胞，胞内信号刺激域为ICD1、ICD3的CAR-iNKT，其同时期的CD8+CAR+iNKT细胞比例增加2-3倍（图2（A）、图2（B））。
培养过程中，各组CD4+CAR+iNKT细胞比例逐渐增加（图2（C）），但与胞内信号刺激域为4-1BB的CAR-iNKT细胞相比，胞内信号刺激域为ICD1、ICD3的CAR-iNKT，其CD4+CAR+iNKT细胞的比例增加较少。而各组细胞中的CD4-CD8-CAR+iNKT细胞的比例随培养时间一直在减少，胞内信号域为ICD3的CAR-iNKT组中，其CD4-CD8-CAR+iNKT细胞比例在同一时间点的各组CAR-iNKT中最低（图2（D））。
实施例3 不同细胞内信号域及是否表达融合蛋白IL-15-IL-15Rα对CAR-iNKT杀伤肿瘤能力的影响
不同组别CAR-iNKT细胞培养至第21天时，按照效应细胞与靶细胞比例分别为1:3、1:1、3:1分别从各组中取0.33x105 CAR-iNKT细胞、1x105 CAR-iNKT细胞、3x105 CAR-iNKT细胞、与1x105 Huh-7细胞（用荧光染料CFSE混匀孵育10分钟）共培养6小时后，取各组培养上清用酶标仪检测上清中荧光强度（CAR-iNKT细胞杀伤能力越强，Huh-7细胞内释放出的CFSE越多，荧光强度越大），计算各组CAR-iNKT细胞的杀伤效率（图3）。细胞内信号域为ICD1、ICD3的CAR-iNKT细胞，其对肝癌细胞Huh-7的杀伤效能明显提升，共表达IL-15-IL-15Rα会明显增加细胞内信号域为ICD1、ICD3的CAR-iNKT细胞的杀伤效能（图3（A）、图3（B））。
实施例4 不同细胞内信号域及是否表达融合蛋白IL-15-IL-15Rα对CAR-iNKT细胞分泌IFN-γ的影响
各组CAR-iNKT细胞培养至第21天后，按效应细胞与靶细胞比例为3:1，将各组CAR-iNKT细胞（每组3x105 CAR-iNKT细胞）分别与1x105 Huh-7细胞于0.5 ml X-VIVO(不含IL-2及α-GalCer)共培养24小时后，收集细胞，400xg离心5分钟后取上清，以ELISA方法检测上清中IFN-γ含量。可见胞内信号域为ICD1、ICD3时可以明显增加anti-GPC3 CAR-iNKT细胞分泌IFN-γ的含量（图4（A）），各组CAR-iNKT细胞共表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白均可以提升IFN-γ的分泌能力，尤其当CAR-iNKT细胞胞内信号域为ICD3时，其 IFN-γ分泌能力约为细胞内信号域为4-1BB的CAR-iNKT的2倍（图4（B））。
实施例5 不同细胞内信号域及是否表达融合蛋白IL-15-IL-15Rα对CAR-iNKT细胞对免疫检查点LAG-3表达的影响
研究表明，在iNKT细胞中，LAG3（而非PD-1）表达增加会损伤iNKT细胞IFN-γ的分泌能力。将各组CAR-iNKT细胞培养至第21天后，按效应细胞与靶细胞比例为1:1，将各组CAR-iNKT细胞（每组1x105 CAR-iNKT细胞）分别与1x105 Huh-7细胞于0.5 ml X-VIVO(不含IL-2及α-GalCer)共培养48小时后，400xg离心5分钟后弃上清，，收集细胞，标记LAG-3抗体后，流式检测各组CAR-iNKT表面LAG3表达情况。细胞内信号域为ICD1、ICD3时会降低表达LAG-3的细胞比例，共表达IL-15-IL-15Rα时会降低表达LAG-3的表达比例（图5）。这表明在用ICD1、ICD3作为细胞内信号域及共表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白可以降低共抑制分子LAG3的表达，从而可能提升了CAR-iNKT细胞表达IFN-γ的能力，这与前文提到采用胞内信号域为ICD1、ICD3及共表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白可以增加CAR-iNKT细胞分泌IFN-γ相一致（图4（A）），从而提升了对应CAR-iNKT细胞对肿瘤细胞的杀伤能力（图3（A））。
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序列表
<110> 北京基因启明生物科技有限公司
<120> 高扩增、存续能力和杀瘤作用的CAR-iNKT及应用
<160> 40
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gcacgagggt gcagaacact gggactgcct gccttgctcc tgttgctttt gttgcgcccg 540
ccagcgacaa ggggaatcac ttgccctccc cccatgtctg ttgagcatgc cgatatctgg 600
gtgaagtctt atagtctgta cagccgggaa cggtacattt gcaatagcgg cttcaaaaga 660
aaagccggaa ctagttctct gactgaatgt gtcctgaaca aggccacaaa cgtcgcacac 720
tggacaacgc ccagtctgaa atgtattcgc gatcctgcct tggttcacca gaggccagct 780
cctccctcaa ctgtcaccac tgctggcgtg actccacagc cagagtcact gtcacccagc 840
ggtaaagagc cagccgcatc cagtccatca tctaacaaca ccgctgctac aacagcagca 900
attgtgccag gatcacaact gatgccaagc aagtcaccat ccaccggaac gacggaaatt 960
tcaagtcatg agtcctccca cggcacgccg agtcaaacca ctgctaaaaa ttgggaactg 1020
actgcatctg cttcacacca gcctccgggt gtataccctc agggacactc cgacacaact 1080
gtcgcaatta gcacatctac agttctcttg tgcgggcttt ccgccgtgtc tctgctcgca 1140
tgttatctta aatctagaca gacaccaccc cttgcctcag tggaaatgga ggccatggaa 1200
gcactccccg ttacatgggg aacttccagc cgcgacgaag atctggagaa ctgctcccac 1260
cacctg 1266
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
caagtgcaac tgcaacaatc cggtgccgaa ttggtaaggc caggtgctag cgtgaagctg 60
agctgtaagg caagcggcta taccttcacg gactatgaaa tgcactgggt caagcagacg 120
ccagtccatg gcttgaagtg gatcggcgca ctcgacccaa agaccgggga taccgcatac 180
tcccaaaaat tcaaagggaa agccacactg accgctgata agagtagctc tactgcctat 240
atggagttga gatctctcac ctctgaggat tccgcggtgt attactgcac acggttttac 300
agctacactt actggggtca gggaactctc gttaccgtgt ctgcc 345
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gly Ile
35 40 45
Asn Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser
85 90 95
Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys
<210> 12
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gatgtcgtga tgacgcaaac ccctttgagc ctgcctgttt cccttgggga ccaggcttcc 60
atttcttgta ggtcttccca gtctctggtt cactctaatg gcaataccta cctccactgg 120
tatctccaga aacctggggg gattaattca ccaaaattgc tgatctacaa ggtgagcaat 180
cgcttctccg gtgtcccaga ccggttttca ggctctggtt cagggaccga cttcacactc 240
aagatttcac gggtagaggc agaggacctg ggagtctact tctgctctca gaacacacat 300
gtgcctccaa cattcggctc tgggaccaag ctggaaataa ag 342
<210> 13
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser
130 135 140
Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gly Ile Asn Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys
<210> 14
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
caagtgcaac tgcaacaatc cggtgccgaa ttggtaaggc caggtgctag cgtgaagctg 60
agctgtaagg caagcggcta taccttcacg gactatgaaa tgcactgggt caagcagacg 120
ccagtccatg gcttgaagtg gatcggcgca ctcgacccaa agaccgggga taccgcatac 180
tcccaaaaat tcaaagggaa agccacactg accgctgata agagtagctc tactgcctat 240
atggagttga gatctctcac ctctgaggat tccgcggtgt attactgcac acggttttac 300
agctacactt actggggtca gggaactctc gttaccgtgt ctgccggcgg gggcggatca 360
ggcggcgggg gatccggagg cggaggatcc gatgtcgtga tgacgcaaac ccctttgagc 420
ctgcctgttt cccttgggga ccaggcttcc atttcttgta ggtcttccca gtctctggtt 480
cactctaatg gcaataccta cctccactgg tatctccaga aacctggggg gattaattca 540
ccaaaattgc tgatctacaa ggtgagcaat cgcttctccg gtgtcccaga ccggttttca 600
ggctctggtt cagggaccga cttcacactc aagatttcac gggtagaggc agaggacctg 660
ggagtctact tctgctctca gaacacacat gtgcctccaa cattcggctc tgggaccaag 720
ctggaaataa ag 732
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
atggcgcttc ctgtcactgc acttttgctg ccactggctt tgcttcttca tgccgcaaga 60
ccc 63
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu
1 5 10 15
Gly Cys Ile Leu Ile
20
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ttctggcttc cgattggctg cgctgccttt gtggtagtgt gcattctcgg gtgcatactg 60
atc 63
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
atttatattt gggctccctt ggccggcaca tgcggagttc ttctgctgag cctggtcatt 60
acc 63
<210> 21
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 22
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
acaactacac ctgcccctag acctcccaca ccagcaccaa caattgcatc tcagccgctg 60
tcactgcgac cagaggcatg cagaccagcc gctggtggcg ctgttcatac cagaggattg 120
gacttcgcat gcgat 135
<210> 23
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 24
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
cgcagcaaac ggtctcgact gttgcactct gattatatga atatgacacc ccgaagacct 60
ggccccacaa gaaagcacta tcagccatac gctcccccaa gagactttgc cgcttatagg 120
tcc 123
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
ggcgggggcg gatcaggcgg cgggggatcc ggaggcggag gatcc 45
<210> 27
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 28
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
aaacgaggca gaaagaaact cctgtatatc ttcaagcagc cctttatgag accagtccaa 60
accacccagg aggaagacgg ctgctcttgt aggttcccgg aggaagaaga gggtggatgc 120
gaactg 126
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Val Gln Pro Glu Glu Glu Glu Asp
1 5
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gttcaacctg aggaagaaga agat 24
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Arg Phe Thr Thr Gln Glu Glu Gly
1 5
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
agattcacaa cccaggagga ggga 24
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Arg Thr Pro Glu Glu Glu Glu Gln
1 5
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
cgaacccccg aagaggagga gcag 24
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 36
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
agggtaaaat tctccagaag tgcagatgcc cccgcttatc agcagggcca aaatcagctc 60
tataatgaac tgaatcttgg gcgccgcgag gaatacgatg tgctcgacaa acgacggggt 120
cgcgatccag aaatgggagg caagcctcag aggcgcaaga acccgcagga aggactctac 180
aatgagttgc agaaggacaa gatggcagaa gcatacagtg agattgggat gaaaggcgaa 240
aggaggaggg gaaaggggca tgatgggttg tatcagggct tgtctactgc tacaaaggac 300
acgtatgacg cactccacat gcaggctctg cccccaaga 339
<210> 37
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
acccctctcc agccactaag ccagttgctc cctcggctga cggctgcacg cgaggcctcc 60
gaacgtctta cgccttgtgg cgcgcccgtc cttgtcccgg ggtgtgatgg cggggtgtgg 120
ggcggagggc gtggcgggga agggccggcg acgagagccg cgcgggacga ctcgtcggcg 180
ataaccggtg tcgggtagcg ccagccgcgc gacggtaacg agggaccgcg acaggcagac 240
gctcccatga tcactctgca cgccgaaggc aaatagtgca ggccgtgcgg cgcttggcgt 300
tccttggaag ggctgaatcc ccg 323
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54
<210> 40
<211> 6217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800
aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920
atcgatagat acgaattaat tctaccaccc ctctccagcc actaagccag ttgctccctc 1980
ggctgacggc tgcacgcgag gcctccgaac gtcttacgcc ttgtggcgcg cccgtccttg 2040
tcccggggtg tgatggcggg gtgtggggcg gagggcgtgg cggggaaggg ccggcgacga 2100
gagccgcgcg ggacgactcg tcggcgataa ccggtgtcgg gtagcgccag ccgcgcgacg 2160
gtaacgaggg accgcgacag gcagacgctc ccatgatcac tctgcacgcc gaaggcaaat 2220
agtgcaggcc gtgcggcgct tggcgttcct tggaagggct gaatccccga cggatccgct 2280
agcgtttaaa cgcggccgcg aattcgtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 2340
aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 2400
aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 2460
atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 2520
gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 2580
cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 2640
ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 2700
ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 2760
gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 2820
gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 2880
cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 2940
atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 3000
aataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 3060
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 3120
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 3180
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt 3240
tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata 3300
atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 3360
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat 3420
cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 3480
tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 3540
cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct 3600
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 3660
aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 3720
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3780
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3840
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3900
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3960
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4020
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4080
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4140
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4200
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4260
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4320
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4380
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 4440
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4500
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4560
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4620
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4680
ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4740
ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4800
tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4860
accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4920
atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4980
cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 5040
tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5100
tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 5160
gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 5220
agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 5280
aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 5340
gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 5400
tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5460
gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5520
tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5580
aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5640
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5700
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 5760
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg 5820
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 5880
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 5940
gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 6000
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc 6060
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 6120
gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 6180
gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg 6217

Claims (17)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其包含GPC3抗原结合结构域、细胞内信号刺激域、IL-15-IL-15α融合蛋白；其中所述细胞内信号刺激域为氨基酸序列分别为SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.33的ICD1或ICD3。
2.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述细胞内信号刺激域为氨基酸序列为SEQID NO.33的ICD3。
3.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述IL-15-IL-15α融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。
4.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述GPC3抗原结合结构域为包含SEQ ID NO.9和11氨基酸序列的GC33 ScFv。
5.根据权利要求4的嵌合抗原受体，其中所述GPC3抗原结合结构域为氨基酸序列为SEQID NO.13的GC33 ScFv。
6.根据权利要求1-5任一项的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包括依次连接的GC33 ScFv、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、氨基酸序列为SEQ ID NO.29或SEQ IDNO.33的ICD1或ICD3、CD3ζ信号传导结构域、IL-15-IL-15α融合蛋白。
7.根据权利要求6的嵌合抗原受体，其中所述铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.21、19、23、35。
8.一种免疫细胞，其特征在于，其被转导了根据权利要求1-7任一项的嵌合抗原受体。
9.根据权利要求8的免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或iNKT细胞。
10.根据权利要求9的免疫细胞，其中所述免疫细胞为iNKT细胞。
11.根据权利要求1-7任一项的嵌合抗原受体或者根据权利要求8-10任一项的免疫细胞在制备治疗CPG3过表达的癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述癌症为肝癌。
13.根据权利要求1-7任一项的嵌合抗原受体的表达载体。
14.根据权利要求13的表达载体，其中包含核苷酸序列分别为SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.34的ICD1或ICD3核酸序列。
15.根据权利要求13或14的表达载体，其中包含核苷酸序列为SEQ ID NO.8的IL-15-IL-15α融合蛋白核酸序列。
16.一种细胞内信号刺激分子，其氨基酸序列为SEQ ID NO.29或33。
17.根据权利要求16的细胞内信号刺激分子的核酸编码序列，所述核酸编码序列为SEQID NO.30或34。
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