CN107384949A - 表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）及其制备和应用 - Google Patents

表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达靶向GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及其制备和应用。嵌合抗原受体为包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3‑ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和胞内信号区。嵌合抗原受体修饰的iNKT细胞制备包括：构建嵌合抗原受体pRRL‑gc33‑28BBz，感染iNKT细胞，体外特异性扩增后获得针对GPC3靶向性的iNKT细胞。本发明中编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包括含核酸的质粒、含质粒的病毒以及病毒转导的转基因iNKT淋巴细胞可以有效地被用于肿瘤免疫治疗中。

Description

表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞(iNKT)及 其制备和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及用于过继免疫治疗的，靶向表达GPC3抗原的肝癌等实体瘤的iNKT细胞及其制备和应用。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种在细胞表面表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。GPC3可参与细胞分裂和癌细胞的生长。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位于细胞膜上，通过被蛋白酶剪切产生可溶性的进入人体血液的氨基端肽和含有硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合羧基端肽。其剪切体可作为肿瘤抗原进行检测。
GPC3蛋白在胎肝中高表达，不表达于正常成年人的肝脏以及正常组织中。GPC3在肝癌组织中高表达，而胆管细胞癌及正常的肝组织中则不表达。非肝细胞癌病例均为阴性，包括胆管癌、肝转移癌、肝细胞癌癌旁肝组织(包括肝硬化和血管瘤旁肝组织)。GPC3在黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的一部分特殊群体中，也具有较低程度的表达。由于GPC3在肝癌等恶性肿瘤中的高表达，以及其在正常组织中无表达，所以它被认为是肿瘤免疫治疗中一个非常好的治疗靶点。
GPC3作为肝癌诊断的检测近些年已经被广泛应用，一般认为，GPC3在肝癌病人血清中的特异性和敏感性要优于其他指标。近些年的科研结果也有利用了抗GPC3抗体的方法来进行的细胞毒性研究。现在应用较多的是GC33抗体，GC33抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。抗体作为免疫球蛋白，半衰期较短，并且随着时间的延长，需要重复给药或者加大药量才能达到肿瘤治疗的目的。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)由识别抗原的单链抗体和不同的胞内信号结构与连接而成。通常嵌合抗原受体CAR的胞外区包含了识别肿瘤相关抗原的ScFv，跨膜区包括CD8等分子的跨膜区，胞内信号区包含免疫受体酪氨酸活化基序ITAM和CD28、CD137等共刺激分子的胞内信号区。嵌合抗原受体细胞可以利用其单链抗体对肿瘤表面相关抗原的特异性识别，从而捕获肿瘤细胞，继而通过其胞内区信号分子将识别后的信号传递到细胞内，激活淋巴细胞的杀伤毒性，从而靶向杀伤体内的肿瘤细胞。
恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞,是T淋巴细胞中独特的亚群。其表达恒定的TCRVα14与NK细胞的部分标识。iNKT细胞也被认为是经典的1型NKT细胞。iNKT细胞与多种肿瘤和自身免疫性疾病有关，在这些肿瘤患者和病人体内iNKT细胞的数量显著减少，激活iNKT细胞能显著改善肿瘤和多种疾病的症状。iNKT细胞能特异性识别APC表面非经典MHC I类分子CDld提呈的糖脂类抗原并具有产生杀伤性细胞因子的能力，从而参与各种免疫调节，如抗肿瘤、抗感染、器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的发展。活化后的iNKT细胞分泌多种细胞因子，如IFN-γ和TNF-α等或者相关凋亡诱导配体(TRAIL)等，能够直接杀伤肿瘤细胞或者间接激活细胞毒性T细胞以及树突状细胞，从而参与不同的免疫应答。
肝脏作为人体最大的免疫器官，其组织内免疫细胞成分极为复杂。已有研究证明iNKT细胞在肝脏具有较高的分布比例。小鼠体内iNKT细胞在肝脏数量较多，约占肝内T细胞总数的30-50％，并且iNKT细胞在人类及小鼠体内的分布特点几乎一致。正常人体内iNKT细胞在外周血中分布较少(约0.01％-0.1％)，而其主要分布于人体肝脏中，这也提示iNKT细胞可能在肝炎以及肝脏肿瘤疾病中起着重要作用。iNKT如此特殊的分布状态可能与其细胞表面的趋化因子受体有关。由于自身表达磷酸鞘氨醇受体(S1P1R)及多种趋化因子受体(C-X-C chemokine receptor)使iNKT细胞选择性转移到肝脏等实体组织。有研究表明，肝脏局部会高表达CRCR6等趋化因子受体或配体，可以募集iNKT细胞特异性地向肝脏局部趋化，从而发挥免疫功能。iNKT可以介导肿瘤免疫，并且体外增殖的iNKT细胞同样表现出较好的细胞毒效应杀伤肿瘤细胞。近年来，iNKT淋巴细胞作为针对肿瘤的过继性免疫治疗手段进行了一些相关临床实验，取得了一定的效果，α-Galcer加DC免疫或者单纯输注体外扩增后的iNKT细胞可以有效地控制肿瘤。过去临床实验中输注的iNKT细胞体外特异性扩增后，数量明显增加，针对肿瘤的杀伤性细胞因子产生也明显增多，但是由于iNKT细胞的富集是器官特异性的，这在一定程度上也会限制了iNKT细胞对肿瘤本身的靶向特异性治疗。我们通过慢病毒感染等方式，将CAR基因修饰在iNKT细胞表面，将CAR-iNKT细胞以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)以非限制性方式选择性地定向到肝脏以及肝肿瘤细胞并特异性杀伤肝癌肿瘤细胞以提高其肿瘤特异性和杀伤效率，CAR-iNKT细胞也将是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略和手段。
目前为止，国内外尚无靶向GPC3的CAR-iNKT的明确方案提出。虽然WO2014201021A1中提出了一种免疫应答细胞，其中细胞在四种选项中可选iNKT，肿瘤抗原在近百种选项中可选GPC3，但靶向GPC3的CAR-iNKT这一具体组合并未经过实际验证(该申请并未验证任何一种免疫应答细胞的实际效果)。由于免疫系统中复杂的相互作用和肿瘤形成的不明机制，这样笼统的罗列并不能使得本领域技术人员得到任何靶向GPC3的CAR-iNKT可用的启示，更不能从中得出具体有效的靶向GPC3的CAR-iNKT及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种GPC3靶向性的iNKT细胞及其制备方法，以及提供GPC3靶向性的iNKT细胞在治疗肿瘤制剂中的应用。
为了解决上述问题，本发明所述的编码表达于人iNKT细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其嵌合抗原受体蛋白包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3-ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和CD28胞内信号区。
优选的，所述GPC3嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
更优的，所述GPC3嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了由所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸编码的蛋白。
本发明还公开了一种含有所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸的表达载体，所述表达载体为重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ。
本发明还公开了所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸用于制备iNKT细胞的用途。
本发明还公开了一种iNKT细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：采用Realtime-PCR从iNKT细胞的cDNA中克隆CD8跨膜区和hinge区，并通过RT-PCR从iNKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区，以及CD28和CD3ζ的胞内信号结构域，经酶切、胶回收后通过T4DNA连接酶连接到载体LT3REVIR(pRRL)，构建得到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；再通过全基因合成技术合成GPC3抗原受体(GC33)的核苷酸序列，经酶切、胶回收后克隆到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ，得到重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；然后包装成携带pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒；并利用该慢病毒感染iNKT细胞，使iNKT细胞表达该嵌合抗原受体，即得。
优选的，所述的制备方法还包括将转染后的iNKT细胞以含终浓度500IU/ml rhIL-2的AIM V培养基进行体外诱导扩增的步骤，并当细胞量达到培养瓶的80％时转入细胞培养袋中，隔天加入含500IU/ml的rhIL-2培养基进行扩增，采用流式细胞仪对被感染的iNKT细胞进行鉴定。
更优的，所述GPC3抗原受体(GC33)为权利要求1-3任一项所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸。
本发明还公开了一种GPC3靶向性的iNKT细胞，该细胞是采用上述方法制备。
本发明还公开了所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸在制备治疗原发性肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及其他GPC3阳性的过继免疫治疗药剂中的应用。
本发明还公开了所述GPC3靶向性的iNKT细胞在制备治疗原发性肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及其他GPC3阳性的过继免疫治疗药剂中的应用。
本发明的涉及编码iNKT细胞表面的GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，表达该嵌合抗原受体蛋白的iNKT细胞针对高表达GPC3的肿瘤细胞具有高度特异性的杀伤作用，其对表达GPC3的肿瘤细胞杀伤作用比起传统T细胞有更强的杀伤性，并且发挥杀伤作用的时间短，效率高。所述GPC3嵌合抗原受体蛋白，包含串联连接的胞外分子结合区、跨膜区以及胞内信号区。受体蛋白胞外分子结合区包含特异性识别GPC3蛋白的单链抗体scFv，上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过CD8铰链区与CD8和CD28跨膜区相连接后连接胞内信号区。
GPC3的单克隆抗体已被专利文献公开，如(CN101186650A)。已被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明中的单链抗体部分，其余可识别GPC3的C末端表位单克隆抗体也适用于本发明，本发明中针对GPC3的单链抗体scFv可以根据已公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程方法或者化学合成方法制备。
本发明涉及一种转基因iNKT淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的含有上述核酸的重组质粒以及包含该质粒的病毒。非病毒和普通病毒的转导方法都可以用于本发明。嵌合抗原受体基因修饰的iNKT淋巴细胞的转导方法是基于慢病毒或者逆转录病毒的转导方法，转导效率高，外源基因稳定表达，并且大大缩短体外培养iNKT细胞到达临床及数量的时间。本发明中编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包括含核酸的质粒、含质粒的病毒以及病毒转导的转基因iNKT淋巴细胞可以有效地被用于肿瘤免疫治疗中。
附图说明
图1为使用流式细胞仪分选培养物中的iNKT细胞鉴定。
图2为作为示例的本发明的包含编码嵌合抗原受体序列的慢病毒载体的结构示意图，以及本发明中CAR不同区域之间的连接关系示意图。
图3为本发明实施例中的病毒感染iNKT细胞后细胞表达的GC33(GPC3抗体)流式细胞技术检测结果。
图4为本发明实施例中表达GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞体外生长情况，显示在病毒感染后第10天，表达GPC3-CAR的iNKT细胞体外扩增约30倍。
图5为本发明所述的GPC3-CAR-iNKT细胞对人肝癌肿瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图。
图6为本发明实施例中GPC3-CAR-iNKT细胞体外杀伤肿瘤细胞时杀伤性细胞因子IL-2与IFN-γ的分泌能力检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。下述实施例中的实验方法，未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件如《分子克隆实验指南》第三版(Sambrook.J.等著，黄培堂等译，科学出版社)中所述条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所用的试剂：
AIM V细胞培养基，ThermoFisher公司；
Lymphoprep分离液(即用型)，Axis-Shield公司；
CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体，Biolegend公司；
IL-2、IL-7、IL-15、Peprotech公司；
α-GalCer，Enzo Life Sciences公司；
Anti-human-iNKT MicroBeads，Miltenyi Biotec公司；
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlugTM，BD公司；
FITC anti-human CD3、PE anti-human TCR Vα24-Jα18、PerCP/Cy5.5anti-humanCD8、PE/Cy7anti-human CD4、FITC anti-human IFN-γ，Biolegend公司；
总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNA Polymerase)、T4DNA连接酶，TaKaRa公司；
RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas公司；
BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI，Fermentas公司；
大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；
LT3REVIR(pRRL)，Addgene公司；
Trans5α化学感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司；
Lipofectamine-TM2000-Transfection Reagent转染试剂，ThermoFisher公司；
聚凝胺，上海伟进生物科技有限公司；
重组人纤粘连蛋白，TAKARA公司。
实施例1 iNKT细胞培养扩增
(1)使用肝素锂抗凝真空采血管收集人静脉血。使用Lymphoprep分离液，以密度梯度离心的方法分离获得人外周血单个核细胞(PBMCs)。
(2)PBMCs以AIM V细胞培养基洗三次，以含有终浓度为100ng/mlα-GalCer，500IU/mlrhIL-2的AIM V细胞培养基重悬，接种于75cm2细胞培养瓶中，转移至37℃，5％CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养。
(3)分别于第四天、第七天向培养瓶中加入含有终浓度为100ng/mlα-半乳糖酰基鞘氨醇，500IU/mlrhIL-2的AIM V细胞培养基，在37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。第10天转移细胞至225cm2细胞培养瓶，培养至第14天，使用流式细胞仪分选培养物中的iNKT细胞，结果见图1。
(4)将流式分选得到的iNKT细胞以含有终浓度为100ng/mlα-GalCer，500IU/mlrhIL-2的AIM V细胞培养基重悬，接种于预先使用终浓度为5μg/mL CD3单克隆抗体和终浓度为5μg/mL的CD28单克隆抗体包被的75cm2细胞培养瓶中，培养10天收集细胞，可以1×107个/管分装于细胞冻存管，置于液氮中保存。
实施例2核酸编码的嵌合抗原受体蛋白慢病毒表达载体的构建
核酸片段的扩增与纯化
(1)scFv(GPC3)序列的扩增
scFv(GPC3)序列的模板的序列：
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGAATACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGAGAGGTGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGAGGCGGATCTCAAGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCGACTACGAGATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGAGCACTGGACCCCAAGACCGGCGATACAGCCTACAGCCAGAAATTCAAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACGAGTCTACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACCCGCCGTGTATTACTGTACCCGGTTCTACTCCTACACCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCTTCT(SEQ ID NO.1)。
扩增所采用的引物：上游引物5’-3’(SEQ ID NO：2)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：3)用于扩增scFv(GPC3)；目的扩增条带大小为767bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。
(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列
GPC3嵌合抗原受体蛋白的除scFv(GPC3)外其他部分的核酸序列通过PCR方式获得。具体地，CD8-CD3ζ(Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)，分别和为模板，采用上游引物5’-3’(SEQ ID NO：4)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：5)扩增，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。目的条带分别为287bp和146bp，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。
另外，CD8-CD3deltaζ(delta Z)，CD8-CD137-CD3ζ(BBZ)和CD28a-CD28b-CD3ζ(28Z)分别通过如下方式获得：
A)加1ml Trizol(Invitrogen公司)于1×107健康人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)中裂解细胞后，采用酚-氯仿法抽提总RNA，采用ImProm-IITM逆转录试剂盒(promega公司)逆转录制备cDNA。以上述制备的cDNA为模板，分别：
(i)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：6)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：7)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，30s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。条带理论大小为105bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(ii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：8)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：9)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区-delta Z(即CD8-CD3deltaζ)，PCR扩增条件同上。条带理论大小为359bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：10)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：11)扩增获得CD28跨膜区-胞内信号区片段，PCR扩增条件同上，条带理论大小为240bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：12)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：13)扩增获得CD137胞内区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为146bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiiii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：14)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：15)扩增获得CD3zeta信号区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为359bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
B)核酸片段的拼接
(i)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：16)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：17)拼接获得CD8α铰链区-CD28跨膜区，拼接条件：CD8α铰链区(50ng)+CD28跨膜区(50ng)预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上下游引物后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。理论大小为216bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(ii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：18)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：19)拼接扩增获得CD137-CD3ζ，即为BBZ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为420bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：20)和下游引物5’--3’(SEQ ID NO：21)将CD8α铰链区-跨膜区与BBZ拼接及PCR获得目的片段：CD8α铰链区-跨膜区-BBZ胞内区，即CD8-CD137-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。理论大小为691bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiii)以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：22)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：23)将CD8α铰链区-CD28跨膜区-胞内区与Z采用同上的拼接和PCR扩增获得目的片段：CD8α铰链区-CD28跨膜区-28Z胞内区，即CD28a-CD28b-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为706bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(3)3’端带有F2A及CD8α信号肽的核酸片段的获得
以上游引物5’-3’(SEQ ID NO：24)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：25)扩增慢病毒载体中3’端带有F2A及CD8α信号肽的核酸片段，以为模板，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：56℃，40s；延伸：68℃，50s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min，理论大小为932bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
2.核酸片段的拼接
分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3ζ，CD8-CD137-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)及等摩尔的scFv(GPC3)(质量约为50ng)三片段按图2所示模式拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-3’(SEQ IDNO：26)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：27)后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
在与同上相同的实验条件下，采用上游引物5’-3’(SEQ ID NO：28)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：29)，在不添加3’端带有F2A及CD8α信号肽的核酸片段(质量约为50ng)，可以获得编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸GPC3-Z(SEQ ID NO：30)、GPC3-BBZ(SEQ ID NO：31)、GPC3-28Z(SEQ ID NO：32)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO：33)序列，上述各核酸序列分别编码具有如下氨基酸序列的GPC3嵌合抗原受体蛋白，GPC3-Z(SEQ ID NO：34)、GPC3-BBZ(SEQID NO：35)、GPC3-28Z(SEQ ID NO：36)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO：37)。
此外，分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3deltaζ片段与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段及等摩尔的scFv(GPC3)采用上游引物5’-3’(SEQ ID NO：38)和下游引物5’-3’(SEQ ID NO：39)同上条件进行拼接并PCR，扩增获得GC33-δZ(SEQ ID NO：40)，理论大小为1961bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一。
3.慢病毒质粒载体的构建
如图2所示，作为示例的构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G及基于空载体LT3REVIR(pRRL)的编码目的基因CAR的重组表达载体。
4.质粒转染293T包装慢病毒
4.1转染前24小时以4×106的密度接种293T细胞于100mm培养皿中，接种密度为60～70％，37℃，5％CO2培养。培养基为含10％FBS DMEM，次日在转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM；
4.1将20μg空质粒pRRL(mock对照)或20μg的各目的基因质粒pRRL-gc33-28BBz，分别与15μg包装质粒：和6μg包膜质粒：，溶入500μL MillQ水中，混匀；
4.2逐滴加入62μL 2.5M CaCl2(Sigma公司)，以1200rpm/min vortex混匀；
4.3最后逐滴加入500μL2×HeBS(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na2HPO4·2H2O，12mM葡萄糖，50mM HEPES(pH7.05，0.22μM过滤除菌)，1200rpm/min vortex混匀10s.
4.4立即逐滴加入培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO2，培养4～6h后，更换为含10％FBS DMEM。在转染次日观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)，～80％的阳性转染效率即为转染实验成功。在转染48h或72h后，使用0.45μm滤器过滤收集病毒，然后28000rpm，4℃离心2小时，弃离心上清，离心所得沉淀用1/10～1/50原液体积的AIM V培养基进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴细胞。
5.测定包装有mock或者GC33-28BBz的慢病毒滴度
第一天，以1×105/mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述培养液，含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μL/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO2培养。感染48h后，流式检测GC33，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(IU/mL)＝阳性率×稀释倍数×100×104。磷酸钙转染法包装的上述包含mock即空载体对照和各pRRL-gc33-28BBz的病毒的滴度均为约0.5～2×106U/mL的水平，经浓缩后所测的病毒滴度约为2×107U/mL。
实施例3.重组慢病毒感染iNKT细胞
实施例1获得的iNKT细胞以约1×106/mL密度加入AIM V培养基以细胞：磁珠比例为1∶1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度500IU/ml的rhIL-2刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述重组慢病毒感染iNKT细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度500U/mL的rhIL-2。感染的iNKT细胞在培养第8天时通过流式细胞检测嵌合抗原受体表达，并以未感染的iNKT细胞作为阴性对照，表达嵌合抗原受体的病毒感染iNKT细胞其阳性结果如附图3所示。该结果表明通过慢病毒感染的方法能够获得一定阳性率的CAR-iNKT细胞。
iNKT细胞在分别感染包装有不同嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×105/ml隔天传代培养、计数、并对传代的细胞培养液补加500IU/ml rhIL-2，细胞体外扩增结果见附图4所示，表明培养第10天约有20～40倍以上的扩增，表明表达不同嵌合抗原受体的iNKT细胞在体外能够进行一定数量的扩增，为后续体外毒性试验及体内试验提供了保证。
实施例4.CAR-iNKT细胞体外扩增能力检测实验
按照Miltenyi Biotec公司操作手册，使用Anti-human-iNKT MicroBeads进行iNKT细胞分选。
(1)制作OKT3抗体包被的细胞培养瓶：制备2μg/ml CD3抗体工作液(0.9％无菌生理盐水)。准备两个全新的75cm2大瓶，每个大瓶中加入5ml稀释好的抗体工作液。拧紧瓶口，轻轻摇晃瓶身，使CD3抗体稀释液充分浸润瓶底。用封口膜封好培养瓶管口，平放入4℃冰箱保存。
(2)离心收取细胞。
(3)从4℃冰箱中取出CD3抗体包被的培养瓶，弃去液体，加入10ml 0.9％无菌生理盐水洗涤一次培养瓶。
(4)使用含有100IU/ml IL-2，3μg/ml CD28抗体，5ng/mlrhIL-7，5ng/mlrhIL-15的AIM V培养基2ml将细胞沉淀充分混匀，注意轻柔操作，避免产生气泡。随后加入其余培养基(30ml左右，使细胞浓度不低于5×106个/ml)，混匀细胞。
(5)将混匀的细胞悬液移入75cm2细胞培养瓶，轻轻晃动混匀，放置于37℃培养箱中培养。
(6)培养过程观察细胞状态及培养基颜色，可根据生长情况补充适量的培养基。
(7)CD3抗体刺激4天后可将细胞转移至新的培养瓶，并补充对应体积的培养基。
(8)培养第10天收获细胞进行细胞计数和流式抗体染色。
实施例5.CAR-iNKT细胞体外杀伤肿瘤细胞实验
选用不同肝细胞癌细胞系作为靶细胞，效应细胞为实施例4中体外培养10天的，通过流式细胞术检测过表达GC33(GPC3抗体)阳性的iNKT细胞。如下所示选用的GPC3表达阳性或阴性的肝细胞癌细胞系为本实验所采用。所述的GPC3-CAR-iNKT细胞对人肝癌肿瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图见附图5所示。
靶细胞1：人肝母细胞瘤细胞系HepG2(GPC3表达阳性)
靶细胞2：人高分化肝癌系Huh7(GPC3表达阳性)
靶细胞3：人肝腹水腺癌细胞Sk-Hep-1(GPC3表达阴性)
检测GPC3-CAR-iNKT细胞对肿瘤细胞杀伤能力实验使用乳酸脱氢酶(LacticDehydrogenase,LDH)释放法。具体操作方法如下:
(1)调整靶细胞浓度至1×105个/ml；
(2)将靶细胞按照100μl/孔转移至96孔板中，每组设定三个复孔。
(3)设置靶细胞自然释放孔(阴性对照)。不加效应细胞只加100μl培养液。
(4)设置最大释放孔(阳性对照)。不加效应细胞只加100μl 10％NP40。
(5)在每个实验孔中加入效应细胞100μl，效应细胞：靶细胞＝0:1；1:1；3:1；10:1；30:1；50:1。
(6)37度5％CO2培养至相应时间。
(7)吸取培养液上清，检测LDH数值计算活性。杀伤活性(％)＝[(实验组A值-总自然释放A值)/(最大释放组A值-总自然释放A值)]×100％。
实施例6.CAR-iNKT细胞体外IFN-γ分泌能力检测实验
使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)检测：
Q-PCR反应在BIO-RAD IQ5型号定量PCR仪上进行，反应体系为：
基因表达量计算采用优化的2-ΔΔCT方法，以GAPDH基因作为内参，每个样品每次实验设置3个技术重复，每个处理设置4个生物学重复，实验结果见附图6。
所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和改变。
SEQUENCE LISTING
<110> 闾军 北京基因启明生物科技有限公司
<120> 表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）及其制备和应用
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 728
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacgtggtca tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cacctggcga acctgccagc 60
atcagctgta gaagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaatac ccacgtgcca 300
cctacctttg gccagggcac caagctggaa atcaagagag gtggcggagg atctggcgga 360
ggtggaagcg gcggaggcgg atctcaagtt cagctggttc agtctggcgc cgaagtgaag 420
aaacctggcg cctctgtgaa ggtgtcctgc aaggccagcg gctacacctt taccgactac 480
gagatgcact gggtccgaca ggctccagga caaggcttgg aatggatggg agcactggac 540
cccaagaccg gcgatacagc ctacagccag aaattcaagg gcagagtgac cctgaccgcc 600
gacgagtcta caagcaccgc ctacatggaa ctgagcagcc tgagaagcga ggacccgccg 660
tgtattactg tacccggttc tactcctaca cctactgggg ccagggaacc ctggtcacag 720
tctcttct 728
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatcacggct ctgcaccagt actg 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcagatct cagtgtcaga gagaaga 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatcgaattc ctagtgcgca gactcg 26
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatcgtcgac gatcagctct gcagtaaagg g 31
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatcacgcgt ctagcttaag tctcacttca agt 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatcagatct gatcgtcgac ttagcgaggg ggc 33
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gatcgtcgac tctagacggc ggtggtaccg 30
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatcagatct catgagaggt aaagcacc 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gatcagatct gactcttgat tgagtcat 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatcacgcgt agggtgataa ccagtgaga 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatcgaattc ctagtctaga tttgcccct 29
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gatcacgcgt gatcgaattc cagaacac 28
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gatcagatct gtagcttaag tctcacttca 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gatcgaatcc gatcgtcgac ttagcggagg 30
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gatcgtcgac aagtcgtcct cgcgtatgc 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gatcagatct tccgggacgg gggacggatt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gatcacgcgt tgcgcagact cgttgaggta 30
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gatcttcaga gtgaagtagc ttaagtctca catcc 35
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gatcgtcgac gacattgtcg acgtggga 28
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gatcacgcgt agtggcagag gagttttgcg ca 32
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gatcgtcgac gacattgtcg acgtggga 28
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gatcgaatcc ttcacatgca ggccctgccc 30
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gatcagatct gtagcttaag tctcacttcg aatt 34
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gatcacgcgt aggtagctta agtctcaaag tcgt 34
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gatcacgcgt ctagacaagt cgtccagtcg tcc 33
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gatcagatct gatcgacgtg gtacattgtc gac 33
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gatcgaatcc gatcgtcgac ttagcggagg 30
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gatcgtcgac aagtcgtcct cgcgtatgc 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gatcacgcgt ctagcttagc catgagagg 29
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gatcagatct gatcgtcgaa gctagtctag a 31
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gatcacggct gtctcacatc ccagtgttcg tcgactta 38
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gatcagatct gtgaagaagt actgctgcac c 31
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gatcagatct gtagcttaag tctcacttcg aatt 34
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gatcacgcgt aggtagctta aggacattgt cg 32
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gatcacgcgt ctagcttaag tctcacttca agt 33
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gatcagatct gatcgtcgtc tgggggc 27
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gatcgtcgac tctagacggc ggtggtaccg 30
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gatcagatct caagcttagc ctcggatcgt cgac 34
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gatcgtcgac gatcaaaccg atcgtcgac 29

Claims (12)

1.编码表达于人iNKT细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其嵌合抗原受体蛋白包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3-ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和CD28胞内信号区。
2.权利要求1所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其特征是：所述GPC3嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其特征是：所述GPC3嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.由权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸编码的蛋白。
5.一种含有权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ。
6.权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸用于制备iNKT细胞的用途。
7.一种iNKT细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：采用Realtime-PCR从iNKT细胞的cDNA中克隆CD8跨膜区和hinge区，并通过RT-PCR从iNKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区，以及CD28和CD3ζ的胞内信号结构域，经酶切、胶回收后通过T4DNA连接酶连接到载体LT3REVIR(pRRL)，构建得到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；再通过全基因合成技术合成GPC3抗原受体(GC33)的核苷酸序列，经酶切、胶回收后克隆到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ，得到重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；然后包装成携带pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒；并利用该慢病毒感染iNKT细胞，使iNKT细胞表达该嵌合抗原受体，即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括将转染后的iNKT细胞以含终浓度500IU/ml rhIL-2的AIM V培养基进行体外诱导扩增的步骤，并当细胞量达到培养瓶的80％时转入细胞培养袋中，隔天加入含500IU/ml的rhIL-2培养基进行扩增，采用流式细胞仪对被感染的iNKT细胞进行鉴定。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述GPC3抗原受体(GC33)为权利要求1-3任一项所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸。
10.一种GPC3靶向性的iNKT细胞，其特征在于，该细胞是采用权利要求7-9任一项所述的方法制备。
11.权利要求1-3任一项所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸在制备治疗原发性肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及其他GPC3阳性的过继免疫治疗药剂中的应用。
12.权利要求10的GPC3靶向性的iNKT细胞在制备治疗原发性肝细胞癌、黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及其他GPC3阳性的过继免疫治疗药剂中的应用。
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