CN112210015A

CN112210015A - 靶向gpc3的car及应用其的car-nk细胞

Info

Publication number: CN112210015A
Application number: CN202010971282.5A
Authority: CN
Inventors: 沈振波
Original assignee: Shantou Prokairong Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shantou Prokairong Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN112210015B

Abstract

本发明提供一种GPC3靶向性嵌合抗原受体，包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明GPC3靶向性的嵌合抗原受体可以显著提高NK细胞对肝癌细胞的杀伤性，且转导率高。

Description

靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏的原发性上皮性肿瘤，常与潜在的病毒性、代谢性、自身免疫性或酒精性慢性肝病相关。肝细胞癌是原发性肝癌的主要形式之一，占所有原发性肝癌的85-90％。

肝细胞癌的治疗取决于疾病分期，通常分为非常早期、早期、中期、晚期和末期(终末)，并针对每个阶段进行适当的治疗。患有早期肝细胞癌(A期，无症状的早期肿瘤)的患者可以选择可能的治疗选择(肿瘤切除，移植或消融)。患有中期肝细胞癌的患者(B期，无症状的多结节性肝癌)一般使用化学栓塞(TACE)治疗。肝细胞癌晚期(C期，症状性肿瘤，血管浸润或肝外转移)者应使用索拉非尼治疗，那些先前具有索拉非尼耐受性的患者可以用雷戈非尼治疗。末期肝细胞癌患者(D期) 仅能接受保守治疗。早期的肝细胞癌通过手术切除还具有治疗完全缓解的可能，但随着分期演进，肝细胞癌治疗后复发率和死亡率极高，因此亟待新的治疗手段。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞是最受关注的肿瘤免疫疗法之一，该技术通过在T细胞中转染嵌合抗原受体，使T细胞可以特异性靶向肿瘤表面抗原，同时胞内段结构域可以提供第一和第二信号活化T细胞，使其成为具有精确靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术，在多种肿瘤中特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出了极佳的疗效。2017年间FDA已批准了两个 CAR-T细胞免疫疗法上市，分别为诺华的Kymriah(CTL019)治疗复发或难治性儿童和成人B细胞急性淋巴细胞白血病，Kite的Yescarta(KTE-C19)治疗成人复发或难治性B细胞淋巴瘤。这一成果，成为CAR-T细胞治疗进程中的里程碑。但与此同时，安全性也成为困扰CAR-T临床应用的一大难题:细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，以及病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的进一步推广。

相比于T细胞杀伤的模式，NK细胞的杀伤模式对抗体亲和力要求更低，抗体选择范围更大；且NK细胞几乎不引起移植物抗宿主病D，因为成熟NK在体内寿命相对T细胞要短得多(一般7-10天)，近年来己逐步考虑采用NK细胞作为CAR的载体细胞。对于原代NK细胞或者细胞系的改造，主要是借鉴在CAR-T上积累的经验，但也有研究团队针对NK细胞的特点进行设计改造。例如有的研究人员为了提高 CAR-NK对肿瘤细胞的特异性识别效果，将胞外结构域设计为NK细胞表面活化性受体的配体。

CAR分子由负责靶向识别抗原的胞外结构域(受体胞外段或者单链抗体结构域(scFv，Single Chain Fragment Variable))、提供伸展性的铰链区、跨膜区、胞内段联合共刺激分子组成。胞内信号转导域的结构可决定嵌合抗原受体修饰后的免疫细胞活化信号的强弱，从而影响其抗肿瘤的效果。随着研究进展，研究人员发现不同的胞内结构域具有不同的抗肿瘤特性，因此需要根据不同的肿瘤、不同的宿主细胞选择合适的CAR分子。而且，目前针对NK细胞CAR的结构改造尚缺乏研究。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)，其在肝癌组织中高表达(阳性率高达74.8％)，而在正常肝组织中几乎不表达，是一种较为理想的肿瘤治疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CAR(嵌合抗原受体)及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肝癌细胞。

根据本发明的一个方面，提供一种GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

目前临床中所使用的CAR-NK中的嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T第二代和第三代的结构，虽然NK细胞的诸多生物学行为与T细胞类似，但也有其独特的信号转导模式，其中多种激活型受体可以通过多种途径活化NK细胞，且信号之间具有叠加效应。为了既可以提高CAR-NK细胞对于肝癌细胞的杀伤性，又尽可能地简化CAR的结构，提高转导率，经过不断地摸索试验，本发明筛选出由SEQ ID NO： 1所示的氨基酸序列构成的嵌合抗原受体。

另外，NK细胞中，部分激活型受体的跨膜区具有重要功能。本发明的CAR富含带有正电荷的赖氨酸，可与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DAP 12(DNAX- activationprotein 12，DNAX活化蛋白12)结合，进而介导下游信号转导。

作为上述技术方案的进一步改进，所述嵌合抗原受体由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列编码得到。

另一方面，本发明提供了一种表达基因，用于表达GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为上述技术方案的进一步改进，所述表达基因为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体中含有上述表达基因。

作为上述技术方案的进一步改进，所述表达载体为含有所述表达基因的慢病毒。

另一方面，本发明提供了一种基因工程改造的NK细胞，其特征在于：所述NK 细胞表达特异性识别GPC3的如上所述的嵌合抗原受体。

作为上述技术方案的进一步改进，所述NK细胞为NK-92细胞系。原代NK细胞存在转染效率低下，且体外扩增能力有限；肿瘤患者体内NK细胞常常功能受损，无法发挥足够的细胞毒活性；使用异体NK细胞则需要严格去除T细胞，防止GVHD (移植物抗宿主病)发生。NK-92拥有很多独特的优势，其可以大量扩增，且易于转染，很容易通过基因操作来构建稳定均一的CAR-NK；NK-92在体内寿命较短，易于控制输注剂量且可以反复输注可获得持续的抗肿瘤作用；NK-92缺乏KIR的表达，同种异体NK细胞疗法具有更广泛的抗瘤谱，因为它可以通过不匹配的KIR效应绕过自身MHC分子限制。

另一方面，本发明提供了基因工程改造的NK细胞在制备抗肝癌药物中的应用。

另一方面，本发明提供了一种基因工程载体，其特征在于，所述载体表达如上所述的嵌合抗原受体。

作为上述技术方案的进一步改进，药物组合物还包括药学可接受的辅料。

本发明提供的CAR对于GPC3具有特异性，其在NK细胞上表达之后所得到的CAR-NK细胞针对GPC3靶点具有特异识别性，该CAR-NK细胞可以靶向GPC3 抗原从而治疗肝癌。该GPC3特异性的CAR-NK细胞对肝癌杀伤细胞因子释放量大，对GPC3高表达的肝癌细胞系的毒性大，可以高效的杀伤GPC3高表达肝癌细胞。而且，本发明的CAR-NK细胞的转染效率高。

附图说明

图1为常规的针对GPC3的嵌合抗原受体的序列结构示意图；

图2为本发明构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞与NK 92细胞对照组细胞对于肝癌细胞的杀伤对比图；

图3为本发明的构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于不同肿瘤细胞的杀伤对比图；

图4为本发明的构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于肿瘤重量的影响效果图；

图5为本发明的构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于肿瘤体积的影响效果图；

图6为本发明的构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于肿痛的杀伤过程图示。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中使用的术语“嵌合”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的CAR获得特化细胞(例如NK细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。

下述实施例中使用的术语“约”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。

实施例1

1.CAR的序列选择

常规的针对GPC3的嵌合抗原受体(简称为常规CAR-GPC3)的序列结构如图 1所示。但是，这种嵌合抗原受体结构主要沿用了CAR-T的结构，其在NK细胞中应用时，转导率不高，杀伤性不强。经过不断地摸索试验，本发明筛选出由 SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的嵌合抗原受体(称为CAR1-GPC3)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.构建序列载体

利用PCR技术将CAR1-GPC3的核苷酸序列扩增出来，然后将CAR1-GPC3序列克隆至含有T2A序列、EF1a启动子序列、GFP序列、Puro序列和IRES序列的载体(pWPXLd-2A-EGFP质粒)中，得到具有依次串联的T2A序列、EF1a启动子序列、CAR1-GPC3序列、GFP序列、Puro序列和IRES序列的序列载体(称为 pWPXLd-CAR1-GPC3-2A-EGFP载体)。

3.CAR1-GPC3 NK转染细胞

(1)在10cm培养皿中培养NK-92细胞，待培养皿中的NK-92细胞密度达 80-90％时，更换培养基；

(2)更换培养基培养2小时后，用PEI分别将pWPXLd-CAR1-GPC3-2A-EGFP 载体与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、psPAX2共同转导入293T细胞，分别于转化后24小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基；

(3)培养基上清收集完毕，将上清1000g离心0.5小时后；

(4)收集病毒溶液过滤分装于15ml管，冻存于-80℃待用；

(5)慢病毒转染NK细胞：将NK-92细胞300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入表达CAR1-GPC3和GFP(空白对照)慢病毒后置于37℃， 5％CO2培养箱培养24h后，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，得到表达CAR1-GPC3的NK-92细胞；

(6)CAR1-GPC3 NK-92细胞扩增：将表达CAR1-GPC3的NK-92细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2-3天进行一次半量换液，两周后，NK-92细胞数可扩增50倍，GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，GFP阳性比例通过流式进行检测，即得到CAR1-GPC3 NK-92细胞或阴性对照(未经处理)细胞的比例。

实施例2：检测实施例1构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞以及常规CAR-GPC3- NK 92细胞对于肝癌细胞的杀伤效果

(1)原代肿瘤细胞培养：手术取得肿瘤组织样本，放入DMEM+10％FBS保存液中放置在冰盒中带到细胞室。在D-PBS溶液中剔除血块、脂肪等组织，将完整组织在分装有清洗液的离心管中涮洗，涮洗3-4遍，然后转移到培养皿中清洗，清洗两遍。

清洗之后，将组织放于一个干净培养皿中，加入少量培养基，用剪刀与镊子将组织剪碎，至无明显大块组织。加入新鲜配制的消化液，放入培养箱中消化30min，期间观察消化情况。消化完毕后，将其转移到离心管中收集细胞。

弃上清后将细胞清洗两次收集细胞。收集到的细胞加入完全培养基，混匀，将细胞悬液铺置培养瓶中，轻轻摇匀平面，显微镜下查看，放培养箱中培养。培养前三天，每天进行半换液处理，换液前培养基需先37℃水浴预热。第四天，将上清收集到离心管中，瓶子用培养基清洗两遍。离心弃掉上清，加入新鲜培养基，混匀，加入到原来的培养瓶，显微镜下观察，放培养箱中培养。接下来培养是隔2-3天换液一次，进行全换液。

观察细胞生长状态，细胞量生长至可铺满培养瓶80％面积时，可进行换到培养板培养。弃上清，用PBS洗两次，加入预冷的胰酶消化，加入10％FBS培养液进行终止消化，计数。

(2)在实验开始前的一天将原代肿瘤细胞(40000个细胞)均匀的铺于24孔中，待细胞贴壁；

(3)实验开始后，按照1:1的效靶比例，将CAR1-GPC3-NK 92细胞/常规CAR- GPC3-NK 92细胞/没有CAR的NK 92细胞铺在24孔中(40000个细胞)，总体系为 1ml，37度孵育7小时；

(4)作用7小时后，将培养基舍去，加PBS轻轻地漂洗两次，加入CCK8试剂200ul，37℃作用1-4小时；

(5)观察和计算对肿瘤细胞杀伤率。

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示。采用Prism 7.0软件进行所有数据的统计学处理。三组以上数据用One-Way ANOVA分析，再用Bonferroni’s correction 做两两比较。两组数据采用t-test或者Mann-Whitney检验。P＜0.05为差异显著。

图2显示了为本发明构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞与没有CAR的NK 92对照组细胞对于肝癌细胞的杀伤对比图。通过对比图可知，本发明的CAR1-GPC3-NK 92细胞对肝癌肿瘤细胞杀伤作用相对于没有CAR的NK92细胞的杀伤效果更好。

表1为没有CAR的NK92细胞、常规CAR-GPC3-NK 92细胞以及本发明的 CAR1-GPC3-NK 92细胞对于肝癌细胞的杀伤率。可以看出，相比于未经改造的 NK92细胞以及常规CCAR-GPC3-NK 92细胞，本发明的CAR1-GPC3-NK 92细胞可以显著提高对于肝癌细胞的杀伤性。

表1：杀伤率统计

实施例3：检测实施例1构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于不同癌症细胞的杀伤效果

具体操作同实施例2，只是杀伤对象换成其他的癌症细胞。

图3为本发明的构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞对于不同肿瘤细胞的杀伤对比图。通过对比图可知，本发明的CAR1-GPC3-NK 92细胞在肝细胞癌中相对于其它肿瘤的杀伤效果更好。

实施例4：

在杀伤实验中，检测上清中IFN-γ与CD107a的表达。进行完杀伤实验后，每个孔的细胞使用PB S(1mL)洗涤，然后加入100uLPBS进行重悬，使用CD56-PE 和CD 107a-APC来标记NK92细胞，CD56⁺CD107⁺代表活化的NK 92细胞,CD56⁺代表总的NK 92细胞，细胞活化率用CD56⁺CD107⁺/CD56⁺来表示。使用ELISA检测IFN-γ在上清中的表达。

表2为没有CAR的NK92细胞、常规CAR-GPC3-NK 92细胞以及本发明的 CAR1-GPC3-NK 92细胞杀伤肝癌细胞后的活化率比较。可知，本发明的CAR1- GPC3-NK 92细胞具有最好的活化率。

表2：活化率统计

实施例5：检测实施例1构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞以及没有CAR的NK 92细胞对于肝癌组织的杀伤效果

通过皮下注射，向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内移植入1×10⁶的Huh-7肝癌细胞，构建肝癌荷瘤小鼠模型；在肿瘤长到50mm³左右时，通过尾静脉输注 1×10⁷个实施例1构建的CAR1-GPC3-NK 92细胞(空白组:PBS，对照组：CAR的 NK 92细胞)。每个实验组设置5只重复实验小鼠，每三天量取肝癌肿瘤组织块体积，记录并制作肿瘤体积随时间变化的曲线，结果如图4所示。同时，称取肝癌肿瘤组织的重量，结果如图5所示；拍照记录肝癌肿瘤组织的形貌，结果如图6所示。

由图4～6可以看出，本发明实施例1构建的CAR1-GPC3-NK92细胞相比空白组和对照组，对于肝癌肿瘤组织具有良好的杀伤作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 汕头普罗凯融生物医药科技有限公司

<120> 靶向GPC3的CAR及应用其的CAR-NK细胞

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 672

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser

130 135 140

Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu

145 150 155 160

Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile Gly

165 170 175

Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

180 185 190

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

195 200 205

Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

210 215 220

Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ala Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu

245 250 255

Val Leu Ser Ala Leu Leu Val Trp Trp Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu

260 265 270

Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp

275 280 285

Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe

290 295 300

Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser

305 310 315 320

Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln

325 330 335

Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe

340 345 350

Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln

355 360 365

Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr

370 375 380

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

385 390 395 400

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

405 410 415

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

420 425 430

Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

435 440 445

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

450 455 460

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

465 470 475 480

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

485 490 495

Pro Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

500 505 510

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

515 520 525

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

530 535 540

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

545 550 555 560

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

565 570 575

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

580 585 590

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

595 600 605

Pro Pro Arg Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr

610 615 620

Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile

625 630 635 640

Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp

645 650 655

Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val

660 665 670

<210> 2

<211> 2016

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaaatac acatgttcct 300

cctacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 360

ggcagcggcg gtggcgggtc gcaggttcaa ctgcagcagt ctggggctga gctggtgagg 420

cctggggctt cagtgaagct gtcctgcaag gcttcgggct acacatttac tgactatgaa 480

atgcactggg tgaagcagac acctgtgcat ggcctaaaat ggattggagc tcttgatcct 540

aaaactggtg atactgccta cagtcagaag ttcaagggca aggccacact gactgcagac 600

aaatcctcca gcacagccta catggagctc cgcagcctga catctgagga ctctgccgtc 660

tattactgta caagattcta ctcctatact tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 720

tctgcactgg tgcctgtgtt ctgtggactc ctcgtagcca agagcctggt gctgtcagcc 780

ctgctcgtct ggtggtggag gagaaagagg aaggagaagc agtcagagac cagtcccaag 840

gaatttttga caatttacga agatgtcaag gatctgaaaa ccaggagaaa tcacgagcag 900

gagcagactt ttcctggagg ggggagcacc atctactcta tgatccagtc ccagtcttct 960

gctcccacgt cacaagaacc tgcatataca ttatattcat taattcagcc ttccaggaag 1020

tctggatcca ggaagaggaa ccacagccct tccttcaata gcactatcta tgaagtgatt 1080

ggaaagagtc aacctaaagc ccagaaccct gctcgattga gccgcaaaga gctggagaac 1140

tttgatgttt attccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1260

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 1320

caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1380

gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1440

acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgcagagtg 1500

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1560

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1620

cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1680

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1740

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1800

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcaacagaa ggagaaggag agagagaaga 1860

gatctattta cagagtcctg ggatacacag aaggcaccca ataactatag aagtcccatc 1920

tctaccagtc aacctaccaa tcaatccatg gatgatacaa gagaggatat ttatgtcaac 1980

tatccaacct tctctcgcag accaaagact agagtt 2016

Claims

1.一种GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于：

包括依次串联的特异性识别GPC3的单链抗体、跨膜区结构域和胞内区结构域；

所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列编码得到。

3.一种表达基因，用于表达GPC3靶向性的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求3所述的表达基因，其特征在于，所述表达基因为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求3或4所述的表达基因。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有所述表达基因的慢病毒。

7.一种基因工程改造的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞表达特异性识别GPC3的如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

8.如权利要求7所述的基因工程改造的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞为NK-92细胞系。

9.如权利要求7所述的基因工程改造的NK细胞在制备抗肝癌药物中的应用。

10.一种药物组合物，其包含如权利要求7所述的基因工程改造的NK细胞或所权利要求5所述的表达载体。