CN111349178A - 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体(car)及其抗癌的用途 - Google Patents

一种靶向gpc3的嵌合抗原受体(car)及其抗癌的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种靶向GPC3的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途，该嵌合抗原受体包括信号肽、靶向GPC3的抗原结合区、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，选用了具有中等亲和力的靶向GPC3的抗原结合区，并调整了轻链和重链可变区的连接顺序，能够有效抑制体内、体外肿瘤的生长，降低免疫因子的分泌水平，具有良好的临床应用前景。

Description

一种靶向GPC3的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种靶向GPC3的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病，而肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康，有研究显示，肝癌的发病率在恶性肿瘤中排名世界第5位，死亡率则位居第3位。在中国，由于存在较为严重的乙型肝炎病毒（HBV）感染等致癌风险因素，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻，每年有超过10万人死于肝癌及其并发症。尽管医学工作者对肝癌进行了较为深入的研究，并开展了大量的临床实践活动，先后提出了诸如肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等治疗方法和手段，但是仍然难以有效攻克该疾病，尤其是晚期患者难以进行手术治疗，死亡率更高。目前的常规疗法，如手术切除，化学药物疗法，放射疗法等副作用大，严重影响患者的生活质量。因此，临床上迫切需要开发新型的肿瘤治疗手段，以便满足患者的需求。
嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor gene-modified T cell，CAR-T）技术是于上世纪90年代兴起的一种新型细胞免疫疗法，该疗法是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建成为CAR-T细胞，然后将该细胞回输入患者体内，通过激活免疫应答反应治疗相关疾病。嵌合抗原受体的经典结构中包括抗原结合域、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，其中抗原结合域用于识别目标肿瘤细胞，对于抗肿瘤作用的发挥至关重要，选择适当的抗原结合域不仅能够有效定位目标肿瘤细胞，还能够有效降低副反应，提高治疗效果，该区域通常采用靶向肿瘤抗原抗体的scFv区，它包括抗体的轻链可变区（light chain variable，VL）和重链可变区（heavy chain variable，VH）；跨膜区定位于细胞膜上，连接胞内信号激活元件和胞外抗原结合域等元件，它的引入有利于CAR在T细胞膜表面的稳定表达；共刺激因子是决定CAR-T细胞能够被有效激活的关键因素，在早期的CAR结构中由于没有设置共刺激因子，导致了相应CAR-T细胞的激活程度和数量均难以达到理想效果，抗肿瘤作用逊色于其他抗肿瘤疗法，但是当带有共刺激因子的第二代CAR-T出现后，在临床上展现出了令人震惊的疗效，尤其是靶向CD19的CAR-T细胞在治疗血液肿瘤中取得了巨大成功，目前已经有诺华公司的Kymriah、吉利德公司的Yescarta被批准上市，常用的共刺激因子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、B7-H3等等，其中在CAR-T疗法临床试验中应用最多的共刺激因子为CD28和4-1BB；胞内信号域也是用于CAR-T细胞激活的关键元件之一，目前CAR-T细胞中常用的胞内信号域为CD3ζ胞内信号域。由于CAR-T细胞在抗肿瘤领域展现了巨大的应用前景，故研究人员也对于CAR结构进行了诸多改进或尝试，如引入刹车元件、自杀元件、双特异抗原结合域、信号肽区域、铰链区等等，在不同程度上改善了治疗效果。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3，GPC3）是具有HS的蛋白多糖，通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面，该基因编码580个氨基酸能够产生大约70 kD 的核心蛋白。有研究表明GPC3在体内的表达具有一定的组织或器官特异性，通常仅只在肺、间皮、卵巢、乳腺上皮、子宫内膜中微量表达，对于肿瘤组织而言同样具有较高的特异性，主要在成肝细胞瘤、非小细胞肺癌、睾丸和卵巢卵黄囊瘤、恶性黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、睾丸生殖细胞瘤、结肠癌、肾横纹肌样瘤中为高表达，然而在卵巢癌、胆管癌、GC和间皮瘤中表达下调，因此GPC3可被用作肿瘤检测的生物标志物之一，如CN106701954A、CN109580951A、CN107180154A等均公开了基于GPC3靶点进行相关肿瘤的检测。由于GPC3具有较高的肿瘤特异性，现有技术中也有研究人员开发基于GPC3的CAR-T细胞技术，如CN110724697A公开了靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体，CN109722437A公开了构建表达靶向GPC3的嵌合抗原受体和外源性IL12的免疫应答细胞，用于治疗GPC3阳性肿瘤，WO2014180306A1公开了靶向GPC3的嵌合抗原受体及其在治疗肝癌中的应用。上述研究中，虽然提出并制备了靶向GPC3的CAR-T细胞，并在细胞因子表达、双特异靶点选取等方面做了有益的尝试，但是仍然面临靶向性不强，副作用风险较高，易导致细胞因子风暴等技术问题，在一定程度上限制了CAR-T细胞的应用，尤其是在治疗难治愈、易复发的肝癌领域中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型靶向GPC3嵌合抗原受体及其应用，包括信号肽、靶向GPC3的抗原结合区、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述嵌合抗原受体不但能够有效靶向肿瘤细胞，还能够适当降低细胞因子表达水平，提高治疗的安全性、有效性和可行性，为开发新型的CAR-T细胞疗法提供了新思路。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种靶向GPC3的新型嵌合抗原受体及其应用，以便降低CAR-T细胞治疗的毒副作用，提高治疗的安全性、有效性和可行性，改善整体抗肿瘤效果。
本发明的详细技术方案如下：
提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向GPC3的抗原结合区、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向GPC3的抗原结合区含有：如SEQID NO:1所示重链互补决定区CDRH1，如SEQID NO:2所示重链互补决定区CDRH2，如SEQIDNO:3所示重链互补决定区CDRH3，如SEQID NO:4所示轻链互补决定区CDRL1，如SEQID NO:5所示轻链互补决定区CDRL2，如SEQID NO:6所示轻链互补决定区CDRL3。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述靶向GPC3的抗原结合区重链的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述靶向GPC3的抗原结合区轻链的氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述靶向GPC3的抗原结合区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述靶向GPC3的抗原结合区的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQID NO:11所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、B7-H3和/或它们的任何组合。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述共刺激因子选自4-1BB，其氨基酸序列如SEQID NO:12所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述信号肽氨基酸序列如SEQID NO:13所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述跨膜区为CD8a，其氨基酸序列如SEQID NO:14所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，所述铰链区为IgG4铰链区，其氨基酸序列如SEQID NO:15所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，其氨基酸序列如SEQID NO:16或SEQIDNO:17所示。
进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，其核苷酸序列如SEQID NO:18或SEQIDNO:19所示。
进一步的，本发明提供一种表达载体，包括编码所述嵌合抗原受体氨基酸的核苷酸或相应核苷酸。
进一步的，本发明中所述的表达载体为慢病毒载体。
进一步的，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达本发明中所提供的嵌合抗原受体。
进一步的，本发明提供一种本发明中所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，本发明中所述的应用，所述的肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌。
进一步的，本发明中所述的应用，所述的肿瘤为肝癌。
本发明所提供的靶向GPC3的嵌合抗原受体，筛选出了具有全新CDR结构域的靶向GPC3的抗原结合域，并且该抗原结合域的亲和力适中，既能够有效结合目标靶抗原，又能够防止由于亲和力过高，灵敏度过强而引起严重的副反应，在动物实验中表明，使用具有中等亲和力的抗原结合域能够有效抑制细胞因子的过高表达；在本发明中还尝试了调整重链可变区和轻链可变区的连接顺序，在调整顺序后，使得重链可变区在前，轻链可变区在后，该种结构能够进一步降低细胞因子的表达水平，并且能够有效降低实验动物的死亡率，延长生存周期，具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1 嵌合抗原受体结构图；
图2 嵌合抗原受体目标核酸片段酶切电泳图；
图3 Hep G2细胞杀伤率图；
图4 CAR-T细胞治疗小鼠肿瘤模型中IL-2分泌图；
图5 CAR-T细胞治疗小鼠肿瘤模型中IFN-γ分泌图；
图6荷瘤小鼠生存曲线图。
具体实施方式
实施例1 靶向GPC3的单克隆抗体的获得。
利用人源GPC3蛋白免疫BALB/c小鼠，获得抗人GPC3单克隆抗体。具体为：以重组人GPC3为免疫原，用PBS溶解重组抗原，与弗氏剂等体积混合，免疫6周龄BALB/c小鼠， 2 周后小鼠脱颈处死，取出脾脏，制备单个脾细胞悬液。同时复苏小鼠骨髓瘤细胞，用含10%胎牛血清的1640完全培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养，并传代培养2-3次，使得骨髓瘤细胞处于生长旺盛状态，然后消化细胞并制备骨髓瘤细胞悬液。将制备好的骨髓瘤细胞悬液及脾脏细胞悬液按1:1比例充分混合，离心共沉淀，在37℃水浴条件下，以PEG为融合剂进行细胞融合。融合结束后加入新鲜无血清培养基终止融合，并用HAT培养液重悬细胞。将细胞加入已铺有滋养细胞的96孔板中。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
使用含有HAT的RPM1640培养液进行培养筛选，培养7天后改用 HT的RPM1640培养液培，进行再次培养筛选。培养14天后，用ELISA方法检查各个克隆细胞的上清液并筛选GPC3抗体的阳性克隆，活动阳性克隆细胞进行保藏。取健康BALB/c小鼠，分别腹腔注射2×106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔中，10-14天后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，采用GEprotein G蛋白柱纯化获得靶向GPC3的单克隆抗体。用Lowrry 蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后，按1 mg/瓶分装后冻干，-20℃低温保存。
实施例2 靶向GPC3的单克隆抗体亲和力的测定。
通过间接ELISA 建立5 个浓度的人GPC3 抗原与15 个浓度的靶向GPC3抗体的结合反应曲线，据此计算，靶向GPC3抗体与人GPC3抗原的亲和力常数，如表1所示，本发明中筛选获得了6个具有较高亲和力的靶向GPC3单克隆抗体。根据文献报道（EGFR家族中等亲和力嵌合抗原受体修饰T细胞的广谱抗肿瘤效能，章浩）选用具有中低水平亲和力的抗原结合域，构建CAR-T细胞似乎更能够有效降低脱靶效应，豁免低水平表达目标抗原的正常细胞，从而能够有效发挥特异性杀伤肿瘤细胞的免疫作用，故本发明中选用亲和力中等3号单克隆抗体进行分析并制备目标CAR-T细胞，并选用亲和力最高的5号单克隆抗体作为对照，进行后续实验。
表1抗GPC3的单克隆抗体与目标抗原的解离常数
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实施例3靶向GPC3的单克隆抗体可变区基因的克隆。
基于5’RACE技术，通过简并引物克隆出抗GPC3的单克隆抗体的VL和VH基因，该核酸片段经过PCR引入酶切位点并富集后，采用PCR产物纯化试剂盒（OMEGA）进行纯化，将纯化产物连接于pUC19克隆载体上，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，氨苄抗生素筛选阳性克隆，将阳性克隆送交测序验证，并根据NCBIIgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析结果，筛选出功能性抗体可变区序列结果，其中重链可变区的CDRH1、CDRH2、CDRH3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的CDRL1、CDRL2、CDRL3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，该抗GPC3的单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
实施例4 嵌合抗原受体设计
本发明中为了获得能够有效发挥肿瘤杀伤作用，同时降低体内细胞因子表达水平，防止严重副反应发生，设计了包括信号肽、中等亲和力靶向GPC3抗体轻链、中等亲和力靶向GPC3抗体重链链、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域的嵌合抗原受体CAR-T M1；包括信号肽、中等亲和力靶向GPC3抗体重链链、中等亲和力靶向GPC3抗体轻链、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域的嵌合抗原受体CAR-T M2和包括信号肽、高亲和力靶向GPC3抗体轻链、高亲和力靶向GPC3抗体重链、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域的嵌合抗原受体CAR-T H，上述嵌合抗原受体的具体结构如图1所示。
实施例5携带嵌合抗原受体基因质粒载体的制备
通过PCR法扩增并获得CAR-T M1、CAR-T M2、CAR-T H基因序列，并在目标序列两端引入HindIII和EcoR I酶切位点，将获得的目标基因片段与慢病毒载体质粒GV401 (购自上海吉凯基因)进行HindIII和EcoR I双酶切反应，37℃，反应30min。酶切结束后，采用DNAExtraction kit Ver 4.0（购自Taraka公司）进行凝胶纯化，回收酶切片段。将上述核酸片段，等体积混合用，在T4连接酶的作用下，于20℃下反应4小时，形成GV401- CAR-T M1、GV401- CAR-T M2、GV401- CAR-T H质粒。随后，将上述质粒转化入DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，并通过HindIII和EcoR I双酶切进行鉴定，结果如图2所示，CAR-TM1和CAR-T M2的目标片段约为1700bp，而CAR-T H的目标片段约为1900bp。
实施例6慢病毒载体的制备
将GV401- CAR-T M1、GV401- CAR-T M2、GV401- CAR-T H质粒加入生长旺盛的293T 细胞中，37℃、5%CO2条件下培养48小时，2000 rpm离心10 min收集上清，使用0.45μm 滤膜和0.22μm 滤膜依次过滤除去细胞碎片和其他杂质，含病毒上清液经过透析浓缩后，采用TCID50法检测上述病毒的滴度，结果显示携带有CAR-T M1、CAR-T M2和CAR-T H基因的慢病毒滴度均达到107TCID50/mL以上。
实施例7 CAR-T细胞的制备
招募健康志愿者，采集20mL外周血，通过流式细胞仪法分离并获得外周血中的CD8+T细胞。将获得的CD8+T细胞与RPMI1640（含10%FBS）培养基中培养并传代培养2-3代，待细胞处于对数生长期后，收集细胞并分布于6孔板中，每孔1×107个细胞，虽然分别加入携带有CAR-T M1、CAR-T M2和CAR-T H基因的慢病毒，37℃培养5-7天，收集细胞并进行保藏。
实施例8靶向GPC3细胞体外抗肿瘤效果
为检测本发明所提供的CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果，选用可表达GPC3抗原的肝癌细胞系Hep G2细胞作为体外实验对象，验证体外肿瘤杀伤效果。将CAR-T M1、CAR-T M2、CAR-T H细胞以及PBS（作为阴性对照）与Hep G2细胞按照2:1比例进行混合，加入96孔培养板中置于5％CO2、37℃培养箱培养24小时后每孔加入20μL CCK-8，继续孵育2小时后，酶标仪检测450nm波长，测量OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。如图3所示，上述三种CAR-T细胞均能够有效杀伤Hep G2细胞，杀伤率均在70%以上，杀伤效率从高到低依次为CAR-T H、CAR-T M2、CAR-T M1组，其中CAR-T H细胞的杀伤效果最高，可能与该细胞中的抗原结合域与目标抗原的亲和力最高有关，而CAR-T M2细胞的杀伤效果次之，说明这种将调整重链、轻链连接顺序的方式能够改变抗原结合域的三维构象，仍可以与目标抗原的特定位点进行有效结合，进而识别靶标，引导CAR-T细胞发挥肿瘤杀伤效果。
实施例9靶向GPC3细胞体内抗肿瘤效果
为了进一步验证上述CAR-T细胞的抗肿瘤效果，本实施例以Balb/c小鼠移植瘤模型（负载肝癌细胞系Hep G2细胞）为生物体材料进行的相关药学实验，具体的实验步骤和结果如下：
9.1 免疫因子分泌情况
取对数生长期的Hep G2细胞，皮下注射BALB/C小鼠，每只1×106 个细胞，待7-10天后选取形成明显瘤块的小鼠作为实验对象。选取40只荷瘤小鼠，随机分为4组，分别为CAR-TH、CAR-T M2、CAR-T M1组以及生理盐水组，通过尾静脉注射方式分别注射3×106 个细胞和同体积生理盐水，每5天注射一次，共注射2次，第二次注射结束20天后尾静脉取血，分离获得血清，采用Elisa试剂盒说明书进行操作测定小鼠血清中IFN-γ、IL-2的水平。图4、图5中显示，三个CAR-T细胞治疗组中IFN-γ、IL-2等细胞因子的水平均有不同程度的升高，说明CAR-T细胞治疗可以引发体内的免疫因子释放，一方面有利于发挥肿瘤杀伤效果，另一方面如果免疫因子分泌过多也可能导致免疫因子风暴，进而引起发热、呼吸困难等不良反应，严重时可能危及患者生命。相比于CAR-T H来看，CAR-T M2、CAR-T M1治疗组中IFN-γ、IL-2分泌水平相对较低，其中CAR-T M2似乎更能够维持低水平的免疫因子，尤其是CAR-T M2组中IL-2分泌水平明显低于其他治疗组，而白介素是临床中引起免疫因子风暴的主要效应因子之一，说明其能够有效抑制免疫因子的过度分泌。这些结果提示采用中等亲和力的抗原结合域，以及采用轻链、重链顺序调整的嵌合抗原受体结构，似乎能够更有效的避免副反应的发生。
9.2 荷瘤小鼠生存率测定
上述Hep G2细胞荷瘤小鼠经治疗后，记录各组小鼠的生存情况，共记录40天。如图6所示，相对于生理盐水组，各个CAR-T治疗组均展示出了较好的抗肿瘤效果，小鼠生存期不同程度的延长，但是CAR-T H治疗组中小鼠的生存周期低于其他两个治疗组，这可以与该组中抗原结合域亲和力过高，从而导致可能存在明显的脱靶效应，且Elisa试验结果说明改组小鼠血清中免疫因子水平过高，导致了其生存率不佳。CAR-T M2、CAR-T M1治疗组的生产情况明显好转，且CAR-T M2治疗组的生存率和生存周期均较高，说明上述两种CAR-T细胞在体内实验中展现出了良好的治疗效果，更具临床应用前景。
序列表
<110> 北京广未生物科技有限公司
<120> 一种靶向GPC3的嵌合抗原受体(CAR)及其抗癌的用途
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu His Val Gln Phe Ser Cys Gly
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ile Thr Trp
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Lys Val Leu Ile Ser Val Cys Met Glu Thr Asp Ser Leu Val Ile Gln
20 25 30
Gln Arg Thr Gln Leu Lys Glu Asp Trp Tyr Asp Met Ser Cys Thr Ser
35 40 45
Ser Lys Asp Cys Ser Lys Glu Leu Ile Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
50 55 60
Phe Gln Cys Lys Trp His Val Pro Trp Leu Asp Ser Ile Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Gly Ser Val Ser Ser Ser Phe Cys Val Leu Lys Pro Met Gln Cys His
85 90 95
Lys Glu Tyr Thr Trp Glu Lys Gly Gly His Glu Lys Pro Lys Pro Trp
100 105 110
Ile Val Leu Asp Cys Pro Trp Lys Cys Val Ser Thr Leu Leu Pro Ala
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Cys Pro Lys Glu Ile Leu Ile Ala Gly Cys Arg Glu
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Lys Val Leu Ile Ser Val Cys Met Glu Thr Asp Ser Leu Val Ile Gln
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Gln Arg Thr Gln Leu Lys Glu Asp Trp Tyr Asp Met Ser Cys Thr Ser
35 40 45
Ser Lys Asp Cys Ser Lys Glu Leu Ile Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Phe Gln Cys Lys Trp His Val Pro Trp Leu Asp Ser Ile Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Gly Ser Val Ser Ser Ser Phe Cys Val Leu Lys Pro Met Gln Cys His
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Gly Thr Lys Leu Cys Pro Lys Glu Ile Leu Ile Ala Gly Cys Arg Glu
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Trp Lys Glu Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Gln Cys Tyr Tyr Met Ile Lys Leu
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Gly Val Pro Gln Ile Cys Val Ser Val His Met Tyr Ile Asn Gln Val
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Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu
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Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu
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Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala
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Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
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Ala Pro Ile Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ser Leu
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Thr Ile Thr Trp Lys Val Leu Ile Ser Val Cys Met Glu Thr Asp Ser
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Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Cys Lys Trp His Val Pro Trp Leu Asp Ser
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Pro Lys Pro Trp Ile Val Leu Asp Cys Pro Trp Lys Cys Val Ser Thr
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Gly Cys Arg Glu Trp Lys Glu Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Met Ile Lys Leu Ala Trp Met Gly Ser Leu Ile Lys Phe Ser Cys Arg
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Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Ala Trp Met Gly Ser Leu Ile Lys Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
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Ile Thr Leu Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys
385 390 395 400
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405 410 415
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
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515 520 525
Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu
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Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu
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Pro Pro Ala
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
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gatattctgc tgacccagag cccggcgctg agcctgacca ttacctggaa agtgctgatt 120
agcgtgtgca tggaaaccga tagcctggtg attcagcagc gcacccagct gaaagaagat 180
tggtatgata tgagctgcac cagcagcaaa gattgcagca aagaactgat tgatgcggcg 240
acctattatt gctttcagtg caaatggcat gtgccgtggc tggatagcat tggcacctat 300
ggcagcgtga gcagcagctt ttgcgtgctg aaaccgatgc agtgccataa agaatatacc 360
tgggaaaaag gcggccatga aaaaccgaaa ccgtggattg tgctggattg cccgtggaaa 420
tgcgtgagca ccctgctgcc ggcgggcacc aaactgtgcc cgaaagaaat tctgattgcg 480
ggctgccgcg aatggaaaga aaccaccggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 540
ggcggcggca gcgatgtggt gatgcagtgc tattatatga ttaaactggc gtggatgggc 600
agcctgatta aatttagctg ccgcagcagc cagagcctgt gcatggtggg cgtgccgcag 660
atttgcgtga gcgtgcatat gtatattaac caggtgaaag cgtgcgaaag ctgcgtgcat 720
accgcggtgc atccgtgggc ggataacggc agcggcaccg attttaccct gcatgtgcag 780
tttagctgcg gccagggcac caaactggaa ggcaaacata gctgcagcgc gaaacaggtg 840
caggcgaact atcataccag ctataccagc cgccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg 900
gaactggtgt gccatagcca gtggatgagc ctgctgaccc gcttttatag cgattggcag 960
acctgcccgc cgaccggccc gaacaaagcg tgcagcaaaa aacatcgcaa cacccatgtg 1020
ccggtgtggg gcggcagcaa aaccgtgagc agcggcagcc tgaccggccc gccgtgcccg 1080
ccgtgcccgg cgggcattta tatttgggcg ccgctggcgg gcacctgcgg cgtgctgctg 1140
ctgagcctgg tgattaccct gtattgcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcaaa 1200
cgcggccgca aaaaactgct gtatattttt aaacagccgt ttatgcgccc ggtgcagacc 1260
acccaggaag aagatggctg cagctgccgc tttccggaag aagaagaagg cggctgcgaa 1320
ctgggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcgcggtgc tgccgagcgc gagcgcggcg 1380
gcgccggcga ccggcggcgg cggcgcgggc ctgaccgcgg gcctggcgct gggcgcggcg 1440
ggcggcaccg cggtgctggc gctggcggcg ggcgcggcgc cgggcatggg cggcctgccg 1500
gcggcgctgg cgccgggcgg cggcctgacc gcgggcctgg gcctggcgct gatggcgggc 1560
gcgaccagcg gcattggcat gctgggcggc gcggcggcgg gcctgggcca tgcgggcctg 1620
accggcggcc tgagcaccgc gaccctggcg accaccgcgg cgctgcatat gggcgcgctg 1680
ccgccggcg 1689
<210> 19
<211> 1689
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
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gatgtggtga tgcagtgcta ttatatgatt aaactggcgt ggatgggcag cctgattaaa 120
tttagctgcc gcagcagcca gagcctgtgc atggtgggcg tgccgcagat ttgcgtgagc 180
gtgcatatgt atattaacca ggtgaaagcg tgcgaaagct gcgtgcatac cgcggtgcat 240
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ccgccggcg 1689

Claims (10)

1.一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向GPC3的抗原结合区、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向GPC3的抗原结合区含有：如SEQ ID NO:1所示重链互补决定区CDRH1，如SEQID NO:2所示重链互补决定区CDRH2，如SEQID NO:3所示重链互补决定区CDRH3，如SEQID NO:4所示轻链互补决定区CDRL1，如SEQ ID NO:5所示轻链互补决定区CDRL2，如SEQID NO:6所示轻链互补决定区CDRL3。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向GPC3的抗原结合区重链的氨基酸序列如SEQID NO:7所示，所述靶向GPC3的抗原结合区轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向GPC3的抗原结合区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向GPC3的抗原结合区的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。
5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQID NO:11所示；所述共刺激因子选自4-1BB，其氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；所述信号肽氨基酸序列如SEQID NO:13所示；所述跨膜区为CD8a，其氨基酸序列如SEQID NO:14所示；所述铰链区为IgG4铰链区，其氨基酸序列如SEQID NO:15所示。
6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:16或SEQID NO:17所示。
7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码核苷酸，其特征在于，其序列如SEQIDNO:18或SEQID NO:19所示。
8.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体。
9.权利要求8中所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。
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