CN114621351B - 多特异性抗体及其治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多特异性抗体及其治疗癌症的用途，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；该抗体具有全新的CDR区，其中靶向EGFR的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域选择具有中等较强亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；在双特异性抗体结构中引入了4‑1BB共刺激因子，使得能够通过CD3和4‑1BB双信号通路激活效应细胞，发挥更大的抗肿瘤效果；所述抗原结合域均采用单域抗体形式，可降低体内药物递送难度；靶向EGFR的抗原结合域与靶向CD3的抗原结合域采用2:1比例设置，有助于体内捕获肿瘤细胞，提高治疗的特异性，降低脱靶效应；此外，本发明中所提供的多特异性抗体还能够降低治疗过程中过度的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。

Description

多特异性抗体及其治疗癌症的用途
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种多特异性抗体及其治疗癌症的用途。
背景技术：
癌症是继心血管疾病和传染病之后的人类第三大死因，在发达国家中四分之一的死亡是由癌症引起的。尽管科研人员数十年坚持不懈的研究极大地促进了对癌症生物学、基因组学、蛋白质组学和前瞻性治疗的深刻理解，取得了许多积极的成果，但即使在现代癌症仍然是致命的，2020年有1700万新病例和950万例死亡，到2040年全球预计新癌症病例将上升至惊人的2750万，这凸显了开发新型癌症诊断和治疗手段的紧迫性和必要性。目前癌症的治疗手段以手术、放疗和化疗为主，但传统治疗方式由于以下原因而受到限制：(1)无法跨越生物屏障，(2)非特异性副作用，(3)对转移性肿瘤的影响很小，(4)缺乏有效的诊断/治疗检查程序。癌症根据其发生部位和生理特性不同，可分为血液瘤和实体瘤，以嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T细胞)为代表的免疫疗法在血液瘤中取得了较大成功，但与血液肿瘤不同，实体肿瘤微环境中存在大量的纤维基质和免疫抑制细胞，同时通过物理屏障和免疫屏障保护肿瘤组织、抵抗免疫细胞的攻击。除屏障外，实体肿瘤周围往往伴随血管畸形和纤维结缔组织增生，形成低氧、酸性、缺乏必需氨基酸(精氨酸、色氨酸等)的微环境，在这种环境下浸润T细胞存活困难、激活障碍，较难达到理想的肿瘤杀伤效果。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb，简称双抗)是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，双抗的概念于上世纪60年代提出，但由于受到生物工程技术和基因技术的限制，直到近十年才取得了突破性进步，2009年欧洲医药管理局批准了靶向EpCAM和CD3的双抗catumaxomab用于恶性腹水治疗，成为首个被批准的双抗药物；2014年，美国食品药物管理局批准靶向CD19和CD3的双抗blinatumomab，用于治疗急性淋巴白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中最常见的费城染色体阴性的复发或难治的前体B细胞急性淋巴细胞白血病(precursor B-cell lymphoblasticleukemia，BCP-ALL)，随后进一步拓展为包括费城染色体阳性的复发或难治的BCP-ALL。值得注意的是，除具有轻链和重链结构的传统抗体外，双特异性纳米抗体(bispecificnanobody，BsNb)也被开发出来，这种双抗具有更强的特异性、靶向性和更低的脱靶毒性的特点，并且与靶标抗原的结合力得到增强和血清半衰期也得到延长，使得其在感染、肿瘤及免疫领域诊断与治疗中已成为研究热点。为了进一步改善抗体的治疗效果，研究人员在双特异性抗体的基础上，又提出了多特异性抗体(multispecific antibody，MsAb)的概念，是指一个抗体分子可以与两个以上不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，是其靶向性得到强化。
T细胞表面的白细胞分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)可介导T细胞活化和募集T细胞至肿瘤靶标细胞周围，这使得CD3双特异性抗体(CD3-BsAbs)成为癌症免疫治疗领域中一种新兴的治疗方式。CD3-BsAbs通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞上的CD3发挥作用，CD3-BsAbs将这两种细胞类型交联允许形成免疫突触，类似于天然T细胞受体(TCR)/肽-主要组织相容性复合物(MHC)复合物，这种突触既能够特异性结合肿瘤靶细胞，又能够有效诱导T细胞活化，从而导致炎症细胞因子和溶细胞分子的分泌，这些分子能够在此过程中杀死肿瘤细胞，从而发挥多重抗肿瘤作用。CD3-BsAb疗法是一种被动形式的免疫疗法，与表达嵌合抗原受体转基因的T细胞的过继细胞治疗具有类似的亲缘关系，CAR由直接连接到细胞内CD3ζ链的TAA结合域和来自共刺激受体(例如4-1BB)组成，从而在抗原识别时激活T细胞。CD3-BsAbs和CAR T细胞在许多方面都相似：两者都针对表面TAA，都利用T细胞效应功能，并且都成功地用于临床治疗血液系统恶性肿瘤，并显示出相似类型的毒性特征。但与CD3-BsAbs相比，目前临床批准的CAR-T细胞的一些缺点是：(1)患者需要在输注CAR-T细胞之前进行淋巴清扫，(2)必须为每个患者单独生产CAR-T细胞，而CD3-BsAbs可以作为现成的可大规模生产的治疗药物，(3)CAR-T细胞在肿瘤被清除后留在患者体内，导致在靶向CD19的CAR-T细胞存在情况下持续B细胞耗竭，而CD3-BsAbs随着时间的推移从血液中清除。由此可见CD3-BsAb相比于CAR-T细胞具有更多的临床使用优势。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，也称为HER1或ErbB1，是由HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)组成的ErbB家族成员。EFGR是一个170kDa的跨膜受体，包含3个结构域，包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中胞外区可以识别并结合相应的配体，胞内区具有酪氨酸激酶活性，一旦被激活EGFR与其他ErbB家族成员形成同源二聚体或异源二聚体，然后磷酸化酪氨酸激酶，并激活下游信号通路，如RAS-RAF-MEK-ERK、JAK-STAT和PI3K-AKT-mTOR，这些信号最终导致肿瘤发展和进展。因此，EGFR成为肿瘤治疗中一个很有前景的靶点，研究人员开发出来多种靶向EGFR的抗体药物用于治疗实体肿瘤，包括：(1)西妥昔单抗，于2004年被FDA批准用于治疗EGFR阳性的晚期结肠癌，是第一个经FDA批准的EGFR单抗药物，它是一种人/鼠嵌合IgG1单克隆抗体，能够以高亲和力与内源性配体竞争结合EGFR胞外域，还可诱导产生ADCC作用杀伤肿瘤细胞；(2)帕尼单抗，是第一个完全人源化IgG2单克隆抗体，作用机制与西妥昔单抗相似，2006年9月被FDA批准用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌，2007年12月获EMEA批准用于治疗K-ras野生型结直肠癌；(3)尼妥珠单抗，是我国批准引进的第一个用于治疗恶性肿瘤的EGFR单抗药物，2008年，CFDA批准其用于与放疗或化疗联合治疗EGFR表达阳性的III/Ⅳ期鼻咽癌；(4)加西他布单抗，是第二代重组人IgG1EGFR抗体，于2015年被FDA批准用于联合吉西他滨、顺铂一线治疗转移性鳞状非小细胞肺癌。尽管靶向EGFR和CD3的双特异性抗体已被报道，如WO2021104430A1、CN111848806A、CN113874396A等，但是仍面临对实体肿瘤的靶向性不足，肿瘤杀伤活性有待提高等问题。
本申请提供了一种新型靶向EGFR和CD3的多特异性抗体，这种抗体一方面采用单域抗体结构，可减小抗体分子质量，便于药物递送和体内吸收，还可以降低载体构建和表达难度；另一方面，靶向EGFR抗体结构域和靶向CD3的抗体结构域采用2:1比例设置，提高针对肿瘤细胞表面EGFR抗原的靶向识别能力，且能够防止所述抗体聚集于非特异性部位；在抗体中设置共刺激因子结构域，可通过CD3和共刺激因子实现双途径激活T细胞，提高抗肿瘤疗效，同时可抑制部分免疫因子过度分泌，提供治疗过程的安全性和可控性，从而为新型抗肿瘤药物的开发奠定了基础。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中提供了一种多特异性抗体，包括：特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；所述第一抗原和第三抗原均为EGFR，第一抗原结合域和第三抗原结合域分别包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述第二抗原为CD3，包括如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6；所述第二抗原结合域连接有共刺激因子，所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。
现有技术中提出了多种CD3-BsAb，但多是用于治疗白血病、淋巴瘤等血液肿瘤，并且取得了令人满意的疗效，但如前所述，却在实体肿瘤的治疗中遭遇了困难，本发明中选择使用EGFR靶点与CD3靶点配合，该抗体具有全新的CDR区，其中靶向EGFR的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域选择使用具有中等较强亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；所述特异性抗体中靶向EGFR的抗原结合域与靶向CD3的抗原结合域采用2:1比例设置，有助于体内捕获肿瘤细胞，提高治疗的特异性，降低脱靶效应；在多特异性抗体结构中引入了4-1BB共刺激因子，使得能够通过CD3和4-1BB双信号通路激活效应细胞，发挥更大的抗肿瘤效果；此外，本发明中所提供的多特异性抗体还能够降低治疗过程中的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。
进一步的，第一抗原结合域和第三抗原结合域包括如SEQ ID NO:7所示的单域可变区。
进一步的，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:8所示的单域可变区。
进一步的，所述共刺激因子是4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
提供了一种核苷酸，编码所述的多特异性抗体。
提供了一种药物组合物，其包含所述的多特异性抗体。
提供了一种所述多特异性抗体或所述核苷酸或所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤选自消化系统肿瘤。
进一步的，所述肿瘤选自食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌。
EGFR是一种在恶性肿瘤中广泛表达的靶点，在多种实体肿瘤中广有表达，因此本发明所提供的多特异性抗体可用于肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、咽癌、直肠癌、肾细胞癌、小肠癌、食管癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、肛门区癌、腹膜癌、胃癌、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、神经内分泌瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌等实体肿瘤的治疗；本发明中证实所述抗体对于消化系统肿瘤更有效，优选用于食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌。
有益效果
本发明提供了一种靶向EGFR和CD3的新型多特异性抗体，具有全新的CDR区，其中靶向EGFR的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域选择具有中等较强亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；在双特异性抗体结构中引入了4-1BB共刺激因子，使得能够通过CD3和4-1BB双信号通路激活效应细胞，发挥更大的抗肿瘤效果；所述抗原结合域均采用单域抗体形式，可降低体内药物递送难度；靶向EGFR的抗原结合域与靶向CD3的抗原结合域采用2:1比例设置，有助于体内捕获肿瘤细胞，提高治疗的特异性，降低脱靶效应；此外，本发明中所提供的多特异性抗体还能够降低治疗过程中过度的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。
附图说明
图1：多特异性抗体结构示意图；
图2：多特异性抗体对TE-3细胞的杀伤作用；
图3：多特异性抗体对BGC-823细胞的杀伤作用；
图4：多特异性抗体对PANC-1细胞的杀伤作用；
图5：多特异性抗体对HCT-15细胞的杀伤作用；
图6：多特异性抗体对效应细胞穿孔素分泌的影响；
图7：动物体内肿瘤体积变化；
图8：TNF-α表达水平变化图；
图9：IL-6表达水平变化图。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1CD3单域抗体的筛选与制备
1.1 CD3单域抗体的筛选与制备
选取健康成年羊驼，将重组人源CD3抗原(本实验室保存)与弗氏完全佐剂按1:1的比例混匀，背部皮下多点注射免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。免疫成功之后采集羊驼外周血10mL，用于构建噬菌体展示文库。
将采集到的羊驼外周血利用淋巴细胞分离液试剂盒(Sigma-Aldrich)分离淋巴细胞；取1×107个细胞，采用Trizol法提取总RNA，步骤为：向含有淋巴细胞的EP管中加入1mLTrizol(购自Sigma公司)，反复吹打，置冰上放置5分钟；加入250μL氯仿，涡旋30秒后继续置冰上放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，置冰上放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1mL预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μL RNase-free水溶解沉淀，得到总RNA。以所述总RNA为模板，使用逆转录试剂盒(购自Roche公司)将其转化为cDNA，然后通过两轮PCR反应扩增和富集cDNA，并在产物两端引入Pst I和Not I酶切位点。通过酶切、连接反应将目标核酸分子连接至pMECS载体上，通过电转化法将携带有目标核酸的载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，PCR法筛选阳性克隆并保存于-20℃冰箱中。
取上述冻存的感受态细胞，复苏后接种于YT-AG培养基，培养至对数生长期后，加入VCSM13噬菌体，37℃静止感染60min；常温4000rpm离心10分钟，弃去上清，使用含氨苄青霉素和卡那霉素的YT-AK培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜；离心取上清置于50mL离心管中，加入PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，室温静置5min，4000rpm离心弃上清，沉淀用4℃预冷的PBS洗涤离心；经测试噬菌体滴度，符合进一步实验要求。
通过ELISA方法筛选阳性克隆；将筛选获得的阳性克隆，提取质粒电转化入大肠杆菌HB2151中，涂布于含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养液中，37℃摇床培养过夜，至OD600nm值达到0.6以上时，加入1M IPTG，28℃摇床培养12h，离心收集大肠杆菌，超声法破碎菌体，通过镍柱亲和层析法纯化抗体，共筛选获得1A2、1B7、2C5、3D6、3E3和5H9等6个符合要求的靶向CD3单域抗体。
使用Fortebio生物大分子相互作用仪(购自美国艾瑞生物公司)，检测上述单域抗体与人CD3的亲和力，结果如表1所示：
表1 各个单域抗体与目标抗原的亲和力检测
单域抗体 亲和力(nM)
1A2 3.17E-07
1B7 6.67E-06
2C5 5.82E-07
3D6 3.72E-08
3E3 3.55E-09
5H9 4.19E-09
据报道，在CD3-BsAb双抗中，靶向CD3的抗原结合域与目标抗原CD3的亲和力不宜过高，否则会导致CD3-BsAb过度富集于脾脏和淋巴结等富含T细胞的组织中，而影响CD3-BsAb与肿瘤细胞的结合(参见Mandikian,D.et al.Relative Target Affinities of T-Cell-Dependent Bispecific Antibodies Determine Biodistribution in a SolidTumor Mouse Model.Mol.Cancer Ther.2018,17,776–785)。在前期基于CD19、CD20等靶点开发针对血液肿瘤的双特异性抗体中，选择了亲和力处于中等范围的2C5单域抗体，并在体内、体外实验中取得了良好的抗肿瘤效果。但是实体肿瘤与血液中的免疫环境、肿瘤微环境具有较大差异，一方面实体肿瘤中效应细胞的可用性较低，对于血液系统恶性肿瘤，血液中的癌细胞被T细胞包围，使CD3-BsAb可以从无穷无尽的效应细胞池中提取，而实体瘤则需要T细胞浸润才能获得治疗效果，这就导致可能出现“免疫沙漠”现象(Lanitis,E.etal.Mechanisms regulating T-cell infiltration and activity in solidtumors.Ann.Oncol.2017,28)，在肿瘤部位减少或缺乏足够的效应细胞，导致非常少的引发肿瘤特异性T细胞归巢于肿瘤，还可能出现“免疫排除”现象(参见Kuczek,D.E.etal.Collagen density regulates the activity of tumor-infiltrating Tcells.J.Immunother.Cancer 2019,7,68)，在基质中显示T细胞浸润，而不是肿瘤巢，即效应细胞出现在非预期部位；另一方面，效应细胞的质量也受到影响，造成免疫细胞功能失调，增殖和产生溶细胞分子的能力受损，包括颗粒酶和穿孔素，从而表现出一定的肿瘤耐药性(参见Thommen,D.S.；Schumacher,T.N.T Cell Dysfunction in Cancer.Cancer Cell2018,33,547–562)。为了应对实体肿瘤更加复杂的肿瘤微环境和具有弱化趋势的免疫环境，本发明在中等亲和力抗体中，选用具有较高亲和力强度的3D6抗体的抗原结合域构成多特异性抗体，既能够保证有效募集和激活T细胞等效益细胞，又可能保持相对中等的亲和力，防止多特异性抗体汇聚于脾脏、淋巴等非靶向性部位，从而提高抗肿瘤效果。
用序列比对软件Vector NTI对3D6克隆株的测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(ComplementaryDetermining Regions，CDR)。经鉴定，3D6克隆株的CDR区为如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6，其可变区如SEQ ID NO:8所示。
1.2 EGFR单域抗体的筛选与制备
采用类似1.1节中的方法筛选靶向EGFR单域抗体，但在抗体选择时，筛选与目标抗原亲和力最高的单域抗体分子，这样可提高针对肿瘤细胞的靶向性，防止在实体肿瘤中脱靶现象的出现。
经鉴定，本发明中选择的靶向EGFR单域抗体的CDR区为如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3，其可变区如SEQ ID NO:7所示。
实施例2多特异性抗体的设计与制备
2.1多特异性抗体的设计
目前包括CD3靶点的双特异性抗体得到了普遍的研究和应用，但是在该类抗体结构中通常仅包括一个靶向肿瘤细胞的抗原结合域和靶向T细胞的CD3抗原结合域，即“1+1”式结构，这种方式容易造成对实体肿瘤的亲和力不强，产生非特异性结合而导致副反应，也可能因肿瘤细胞变异导致其EGFR表面抗原数量减少，而难以发挥可预期的抗肿瘤效果。因此，有研究人员提出了“2+1”式的多特异性抗体，这种结构中包括2个靶向肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域和1个靶向T细胞的CD3抗原结合域，能够提高对实体肿瘤细胞的识别能力。本实施例中构建了具有“1+1”式结构的EGFR-CD3BsAb，和“2+1”式的EGFR-CD3-EGFR MsAb，以便验证其抗肿瘤效果。进一步的，为了改善提升效益细胞质量，借鉴CART细胞中引入共刺激因子的作法，在多特异性抗体中引入4-1BB共刺激因子，以便提升实体肿瘤中T细胞的激活程度，所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
图1显示了本发明所提供的多特异性抗体的结构示意图，其中如图1A所示，EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体中包括依次连接的靶向EGFR的第一单域结合域、靶向CD3的第二单域结合域、靶向EGFR的第三单域结合域和4-1BB结构域；如图1B所示，EGFR-CD3BsAb抗体中包括依次连接的靶向EGFR的第一单域结合域、靶向CD3的第二单域结合域和4-1BB结构域。
2.2多特异性抗体的制备
将编码EGFR-CD3BsAb和EGFR-CD3-EGFR MsAb的DNA序列导入pcDNA3.3表达载体中，将上述表达载体电转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化后涂布于含有抗生素的LB平板上，37℃下在培养过夜，筛选阳性克隆。提取质粒，测序显示所述双特异性抗体序列正确。
使用Expi293表达系统试剂盒(购自ThermoFisher公司)将表达质粒共转染入Expi293细胞，转染后5天，收集上清液，通过镍柱亲和层析法纯化抗体，分别获得EGFR-CD3BsAb和EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体。通过HPLC-SEC检测抗体纯度，EGFR-CD3BsAb抗体纯度为95.7％，EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体纯度为96.2％。
实施例3多特异性抗体体外抗肿瘤实验
3.1效益细胞分离和培养
采用Ficoll密度梯度离心法分离人PBMC细胞：抽取新鲜人外周血10mL与10mL的无血清RPMI1640培养基混合，缓慢加到10mL密度梯度离心液Ficoll上层；室温下，12000rpm离心10min；取出离心管，弃去上层血浆，再小心吸取血浆与Ficoll中间的白层PBMC，放置于50mL离心管中；加入15mL无血清RPMI1640培养基，重悬后3000rpm离心10min，重复操作2次；加入15mL含10％血清的RPMI1640培养基，于37℃5％CO2条件下培养。
3.2肿瘤细胞培养
本发明中主要研究多特异性抗体对于消化系统肿瘤的杀伤作用，选用人食管癌细胞系TE-3、人胃癌细胞系BGC-823、人胰腺癌细胞系PANC-1和人结直肠癌细胞系HCT-15作为实验对象，考察细胞水平上的抗肿瘤作用。
复苏上述细胞，接种于含10％血清的完全培养基中，其中TE-3和BGC-823细胞采用RPMI1640培养基，PANC-1和HCT-15细胞采用DMEM培养基，于37℃5％CO2条件下培养细胞至对数生长期；使用携带有绿色荧光蛋白GFP基因的慢病毒载体转染上述肿瘤细胞，便于后续观测和实验。
3.3体外抗肿瘤实验
效应细胞与靶细胞按5:1比例接种于96孔板中，并分别加入50ng/mL的EGFR-CD3BsAb和EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体，以无菌培养基作为对照，37℃培养24h后，每孔加入2μl 7-AAD，37℃孵育1h后，利用Perkin Elmer Operetta高内涵成像仪进行拍照，检测各组细胞活的细胞数；计算细胞杀伤百分比，浓度杀伤百分比＝(空白组活的细胞数-各浓度抗体组活的细胞数)/空白组活的细胞数。
如图2-5所示，本发明中所提供的多特异性抗体可对多种消化系统肿瘤细胞产生杀伤作用，抑制其生长；总体来看，EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体的杀伤作用强于EGFR-CD3BsAb抗体，说明采用靶向EGFR抗原结构域与靶向CD3抗原结构域2:1比例，有利于抗体特异性识别并捕获肿瘤细胞，进而发挥抗肿瘤作用；在具体的细胞株中，HCT-15细胞对于EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体响应更显著，约90％的细胞被杀死。
3.4效应细胞抗肿瘤因子的分泌
选用人结直肠癌细胞系HCT-15与效应细胞1:5共培养，加入10ng/mL的EGFR-CD3BsAb和EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体，以无菌培养基作为对照，37℃培养24h后收集细胞上清，采用ELISA试剂盒(购自美国Abcam公司)检测细胞上清中的穿孔素浓度，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
如图6所示，效应细胞本身的穿孔素分泌处于低水平，而使用本发明提供的抗体后，穿孔素水平得到提升，这种趋势在EGFR-CD3BsAb和EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体差距不大，说明在上述两种抗体中均可通过CD3和4-1BB的双重刺激，使得T细胞的激活程度增加，诱导了大量穿孔素分泌。
实施例4多特异性抗体体内抗肿瘤实验
为了进一步验证本发明中所提供的双特异性抗体的体内抗肿瘤效果，本节中选择采用人结直肠癌细胞系HCT-15构建动物模型，研究体内抗肿瘤效果。
4.1动物模型制备与治疗
采用C57BL/6小鼠，6-8周龄，实验动物在SPF级恒温恒湿房间内饲养一周；培养HCT-15细胞，调整细胞浓度为1×107个/mL，剃去C57BL/6小鼠右侧腹部体毛，将100μL细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时，将实验动物随机分为三组，每隔3天分别注射EGFR-CD3BsAb抗体(5mg/kg)、EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体(5mg/kg)和等体积的生理盐水，共给药4次。
4.2肿瘤体积检测
以实验动物给药的首日记为第0天，此后没隔3天测量一次肿瘤体积，共测量30天。使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(L x W2)/2估算，其中L是长度或最长尺寸，W是肿瘤的宽度。
结果如图7所示，在治疗约2周后，多特异性抗体治疗组显示出了明显的肿瘤体积减小趋势，说明本发明所提供的多特异性抗体可在体内显著抑制肿瘤生长过程；在治疗的后期，EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体的治疗效果开始显著优于EGFR-CD3BsAb抗体，说明EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体在体内肿瘤治疗中更加有效。在前期的实验中本发明人发现，与传统抗体相比，使用单域抗体能够提升双特异性抗体在血浆中的半衰期，并且本发明中提供的EGFR-CD3-EGFR MsAb还携带有可促进T细胞激活的4-1BB结构域，可提高免疫效应细胞的募集和质量，且细胞学实验证明使用相应双特异性抗体可促进穿孔素分泌，在一定程度上接触肿瘤微环境对机体免疫的限制；该抗体中设计了2个靶向EGFR的抗原结合域，能够提高对体内肿瘤细胞的识别和捕获能力。
4.3血清中免疫因子浓度检测
给药4周后，小鼠眼眶静脉取血，3000r/min离心15min，取上层血清，采用ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司公司)，按照说明书所述步骤分别测量血清中TNF-α和IL-6的含量。
据报道TNF-α和IL-6是肿瘤免疫治疗而导致的免疫因子风暴中的主要细胞因子之一，虽然TNF-α和IL-6对于肿瘤的作用机制尚有争议，但是基本可以确定的是，如果短期大量释放上述因子，会造成免疫系统的过度应激，损伤正常组织和器官，引起发热、恶性、晕厥、器官衰竭等严重不良反应，所以如何管理和控制肿瘤免疫治疗中出现的免疫因子风暴成为肿瘤治疗中必须认真对待和解决的问题。如图8、9所示，本发明所述提供的多特异抗体注射如动物体内后，TNF-α和IL-6表达水平有不同程度的提高，这可能与T细胞激活并参与肿瘤免疫过程相关，免疫因子的分泌水平上升；EGFR-CD3BsAb抗体和EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体对于TNF-α的作用类似，但EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体治疗后，实验动物体内的IL-6水平低于EGFR-CD3BsAb抗体，说明至少部分免疫因子的分泌受到了一定程度的限制。
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。
序列表
<110> 广州明征生物科技有限公司
<120> 多特异性抗体及其治疗癌症的用途
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Met Ser Thr Gly Met
1 5
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Lys Ala Pro Trp Pro Gly Thr Ala Pro Ser Ser Trp
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Leu Leu Glu Trp Glu Leu Leu Val Val Ala Ala Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Thr Glu Asp Asp Trp Ile
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ile Thr Gly Leu Ser Thr Lys Ile
1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Glu His Ala Ser Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Met Ser Thr Gly Met Trp His Arg Pro Thr Pro
20 25 30
Gly Arg Glu Arg Glu Leu Ile Ala Leu Lys Ala Pro Trp Pro Gly Thr
35 40 45
Ala Pro Ser Ser Trp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ser Asn
50 55 60
Thr Val Tyr Leu Gln Met Ala Asn Leu Asn Thr Glu Asp Thr Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys His Ala Gly Gly Leu Leu Glu Trp Glu Leu Leu Val Val
85 90 95
Ala Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Ser Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Asn Ile Phe Ser Arg Thr
20 25 30
Glu Asp Asp Trp Ile Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala
35 40 45
Phe Val Ala Trp Ile Thr Gly Leu Ser Thr Lys Ile Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Gly Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ala
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ala Asn Ala Ala Glu His
85 90 95
Ala Ser Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Val
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40

Claims (8)

1.一种多特异性抗体，包括：特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；所述第一抗原和第三抗原均为EGFR，第一抗原结合域和第三抗原结合域分别包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述第二抗原为CD3，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6；所述第二抗原结合域连接有共刺激因子，所述共刺激因子选自4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述多特异性抗体中各个元件的连接顺序依次为第一抗原结合域、第二抗原结合域、共刺激因子和第三抗原结合域。
2.如权利要求1所述的多特异性抗体，第一抗原结合域和第三抗原结合域的单域可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.如权利要求1所述的多特异性抗体，第二抗原结合域的单域可变区氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
4.一种核苷酸，编码权利要求1-3中任一项所述的多特异性抗体。
5.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的多特异性抗体。
6.权利要求1至3中任一项所述的多特异性抗体或权利要求4中所述的核苷酸或权利要求5中所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，所述肿瘤选自消化系统肿瘤。
8.如权利要求7所述的应用，所述肿瘤选自食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌。
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