CN113248616A - 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113248616A
CN113248616A CN202110764887.1A CN202110764887A CN113248616A CN 113248616 A CN113248616 A CN 113248616A CN 202110764887 A CN202110764887 A CN 202110764887A CN 113248616 A CN113248616 A CN 113248616A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
ser
leu
thr
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110764887.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113248616B (zh
Inventor
何霆
鲁薪安
齐菲菲
丁艳萍
李洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Yimiao Shenzhou Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Yimiao Shenzhou Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Yimiao Shenzhou Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Beijing Yimiao Shenzhou Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority to CN202110764887.1A priority Critical patent/CN113248616B/zh
Publication of CN113248616A publication Critical patent/CN113248616A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113248616B publication Critical patent/CN113248616B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了特异性识别GPC3靶点的抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1、6或12所示。还提供了靶向GPC3的嵌合抗原受体，其包含如SEQ ID NO:1、6或12所示的氨基酸序列。还提供了编码所述嵌合抗原受体的核酸分子，包含所述核酸分子的载体和细胞，以及所述抗体、嵌合抗原受体、核酸分子、载体或细胞在制备治疗GPC3阳性疾病的药物中的用途。

Description

靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及具有不同抗原识别域的靶向GPC3的scFv序列，基于这些scFv序列设计的嵌合抗原受体（CAR）和CAR-T细胞，以及其用于治疗GPC3阳性肿瘤、特别是肝癌的用途。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)是一种人工合成的受体分子，将其转入T细胞后形成CAR-T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T cell)，利用抗原抗体结合机制与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活T细胞，特异性识别并杀伤肿瘤（Jackson H J et al., Nature reviews Clinical oncology, 2016, 13(6):370-383）。CAR-T细胞识别肿瘤抗原不受人白细胞抗原（HLA）限制，能有效避免肿瘤细胞通过下调主要组织相容性复合体（MHC）分子表达而产生的免疫逃逸（Fesnak A D et al.,Nature Reviews Cancer, 2016, 16(9): 566-581）。
GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，Glypican-3）在HCC（肝癌）中高表达(74.8%)，在健康人肝脏、肾脏、胃等组织均不表达（Bi Y et al., Oncotarget, 2017, 8:52866-52876；Gao H et al., Clinical Cancer Research, 2014, 20:6418-6428）。且Anti-GPC3的单克隆抗体在临床试验中显示出很好的安全性（Abou-Alfa GK et al., J Hepatol, 2016,65:289-295；Zhu AX et al., Clinical Cancer Research, 2013, 19:920-928），靶向GPC3的CAR-T在治疗晚期HCC的I期临床试验中初显成效且安全性良好（Donghua Shi etal., Clinical Cancer Research, 2020, 19:3259）。因此GPC3是HCC相对有效且安全的CAR-T治疗靶点。
目前已知的靶向GPC3的CAR分子通常采用简单的二代CAR设计，而这些CAR分子可能会导致CAR-T进入体内后产生抗药抗体，CAR分子未结合抗原时自身产生激活信号诱导细胞耗竭，以及抗原识别域在与靶分子结合时无法达到免疫突触形成的最佳结合状态，或者免疫突触形成后向胞内的信号传递过强或过弱，从而影响CAR-T细胞在体内的存活、扩增及对肿瘤细胞杀伤性能的持续性及整个免疫系统功能的调节，最终体现为临床疗效和安全性的差异。因此，需要对现有的CAR分子进行结构改造，以获得疗效和安全性更优的CAR-T细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提出一种靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途，该嵌合抗原受体显著提高了靶向GPC3的CAR-T细胞在体内的扩增效率和持续时间，提高了杀伤肿瘤的效能，降低了毒副作用。
基于上述目的，本发明的第一方面提供了一种特异性识别GPC3靶点的抗体，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPG(X1)SVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVT(X2)TAD(X3)STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC(X4)RFYSYTYWGQGTLVTVSS；其中X1选自A或S；X2选自L或I；X3选自K或E；X4选自A或T，如SEQ ID NO:47所示；
所述轻链可变区VL的氨基酸序列如下所示：
DVVMTQSPLSLPVT(X5)GE(X6)ASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW(X7)(X8)Q(X9)PGQSP(X10)(X11)LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFG(X12)GTK(X13)EIK；其中X5选自P或L；X6选自P或N；X7选自Y或F；X8选自I或L；X9选自K或R；X10选自Q或R；X11选自L或I；X12选自G或Q；X13选自V或L，如SEQ ID NO:48所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或8所示；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或10所示；
优选地，所述抗体包含：
1) 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；和/或
2) 氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在本发明的优选的实施方案中，所述抗体为单链抗体scFv；
优选地，所述单链抗体scFv的重链可变区和轻链可变区由富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽链连接；
更优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、6或12所示。
在本发明的优选的实施方案中，在所述抗体的N末端添加保护肽段；
优选地，所述保护肽段富含8-15个极性氨基酸；
更优选地，所述保护肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:14、15、16、17或18所示；
进一步优选地，所述保护肽段通过柔性接头肽链与所述抗体的N末端相连；
再进一步优选地，在N末端添加了保护肽段的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:19或21所示。
本发明的第二方面提供了一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其包含上述的抗体、共刺激信号域和CD3ζ信号域；
优选地，所述共刺激信号域为天然的4-1BB共刺激信号域、天然的CD28共刺激信号域或改造后的4-1BB共刺激信号域；其中所述改造后的4-1BB共刺激信号域为将天然的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列中的QTTQE序列替代成FPEEE序列而获得的；
更优选地，所述共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或25所示；
进一步优选地，编码所述共刺激信号域的核苷酸序列如为SEQ ID NO:24或26所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述CD3ζ信号域为天然的CD3ζ信号域或改造后的CD3ζ信号域；其中所述改造后的CD3ζ信号域为在天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列上进行以下至少一种的结构改造：
1) 将天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
2) 将天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
3) 在天然的CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ；
优选地，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代；
更优选地，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代，同时CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ；
进一步优选地，所述CD3ζ信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、29或31所示；
最优选地，编码所述CD3ζ信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:28、30或32所示。
在本发明的优选的实施方案中，上述靶向GPC3的嵌合抗原受体还包含表达共刺激受体、分泌免疫检查点阻断剂、细胞因子或趋化因子、或者趋化因子受体的序列；
优选地，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2和CD226中的至少一种；和/或
所述分泌免疫检查点阻断剂选自PD-1 scFv、PD-L1 scFv和CTLA-4 scFv中的至少一种；和/或
所述细胞因子或趋化因子选自IL-2Rβ链、IL-7、IL-12、IL-15、CCL19、CCL21和CXCL10中的至少一种；和/或
所述趋化因子受体选自CXCR1、CXCR2、CXCR4、CCR2和CCR4中的至少一种；
更优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:33、35、37、39、41、43或45所示。
本发明的第三方面提供了一种核酸分子，其包含编码上述的抗体或上述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；
优选地，编码所述抗体的核苷酸序列包含：
1) 编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:3所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:5所示；和/或
2) 编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:9所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:11所示；
更优选地，编码所述抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、13、20或22所示；
进一步优选地，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:34、36、38、40、42、44或46所示。
本发明的第四方面提供了一种载体，其包含上述的核酸分子；
优选地，所述载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体；
更优选地，所述载体是慢病毒载体。
本发明的第五方面提供了一种细胞，其包含上述的核酸分子或上述的载体；优选地，所述细胞为自体或异体的T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润T细胞或调节性T细胞；
更优选地，所述细胞为自体或异体的T细胞。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物，其包含上述的抗体、上述的嵌合抗原受体、上述的核酸分子、上述的载体或上述的细胞，以及可药用载体。
本发明的第七方面提供了上述的抗体、上述的嵌合抗原受体、上述的核酸分子、上述的载体、上述的细胞或上述的药物组合物在制备治疗GPC3阳性疾病的药物中的用途；
优选地，所述GPC3阳性疾病为GPC3阳性肿瘤；
更优选地，所述GPC3阳性疾病为肝癌。
附图说明
图1表示不同CAR分子在T细胞中的转导效率。
图2表示CAR-T-2和CAR-T-3对靶细胞的杀伤效率。
图3表示GPC3 CAR-T对靶细胞的杀伤效率。
图4表示GPC3 CAR-T在Huh7细胞刺激不同天数的增殖。
图5表示GPC3 CAR-T在HepG2细胞刺激不同天数的分化。
图6表示CAR-T-3对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果。
图7表示CAR-T-3在荷瘤小鼠外周血中的数量变化。
图8表示CAR-T-4和CAR-T-5对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果。
图9表示CAR-T-4和CAR-T-5在荷瘤小鼠外周血中的数量变化。
具体实施方式
需要说明的是，除非另外定义，本说明书实施例使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本文使用的术语“scFv”是指这样的抗体片段——其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variableregionof light chain，VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。scFv优选是由一条核苷酸链编码的氨基酸序列。本发明使用的scFv可通过单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是公知的(参见例如，Sambrook分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N .Y.)。所述修饰优选在核酸水平上进行。上述scFv还可以包括其衍生物。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了其所源自的完整抗体的特异性。轻链和重链可以为任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv对靶抗原的特异性即可。在本文中，接头可为一段富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽链（其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS）。
本领域技术人员公知，“互补决定区”是指抗体可变区内的氨基酸序列，该区域赋予特异性和结合亲和力。通常，每个轻链可变区（LCDR1、LCDR2和LCDR3）中3个CDR，每个重链可变区（HCDR1、HCR2和HCDR3）中有3个CDR。当本发明限定了轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区的氨基酸序列时，6个CDR区的氨基酸序列也是固定的，那么抗体的特异性和结合亲和力也是可预期的。
本文使用的术语“特异性识别”意指本发明的抗原识别区不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。
本文使用的术语“抗原识别域”是指CAR特异性结合靶细胞上的抗原的部分。本领域技术人员应理解，在一些实施方案中，以高亲和力结合给定抗原的几乎任何分子都可用作抗原识别域。在一些实施方案中，抗原识别域包含T细胞受体(TCR)或其部分。
本文使用的术语“共刺激信号域”是指CAR增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育的部分。本发明的CAR可包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域包含以下任何一种或多种的共刺激结构域：例如TNFR超家族的成员、CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。
本文使用的术语“信号域”是指CAR转导效应子功能信号并指导细胞执行其特化功能的部分。转导效应子功能信号的结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合体的z链或其任何同源物(例如，h链、FceR1g和b链、MB1(Iga)链、B29(Igb)链等)，人CD3ζ链，CD3多肽(D、d和e)，syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其它分子，如CD2、CD5和CD28。在本发明中，优选使用CD3ζ信号域。
本文使用的术语“铰链区”是指介于抗原识别域和跨膜结构域之间的亲水区。所述铰链区可以使用各种不同抗体或抗原受体的铰链区，特别是CD分子的铰链区。在一个具体的实施方案中，所述铰链区可以选自CD8或CD28等蛋白的铰链区。所述CD8或CD28是T细胞表面的天然标记物。所述铰链区为CD8铰链区(CD8-hinge)，编码CD8铰链区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中的SEQ ID NO:6所示。在一个具体的实施方案中，所述铰链区为CD28铰链区(CD28-hinge)，编码CD28铰链区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中的SEQ ID NO:7所示。
在本文中使用时，“跨膜区”是指CAR跨质膜的区域。可以使用各种人体内蛋白的跨膜区，特别是各种不同抗原受体的跨膜区。优选使用的跨膜区是CD分子的跨膜区。在一个实施方案中，所述跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。在一个具体的实施方案中，所述跨膜区为CD8跨膜区(CD8-TM)，编码CD8跨膜区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中的SEQ ID NO:8所示。在一个具体的实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区(CD28-TM)，编码CD28跨膜区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中的SEQ ID NO:9所示。
本文使用的术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。
本文使用的术语“信号肽”是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。在本发明中，可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、集落刺激因子2受体α信号肽（CSF2Rα）、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。
本文使用的术语“骨架区”是指在轻链可变区与重链可变区中，氨基酸组成与排列相对比较保守的区域。具体的，在轻链可变区与重链可变区中，某些局部区域的氨基酸组成与排列顺序具有更高的变体程度，这些区域称为高变区。在轻链可变区与重链可变区中，非高变区的氨基酸组成与排列相对比较保守，称为骨架区。
本文使用的术语“柔性接头肽链”是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的CAR的任何结构域/区连接在一起。接头可由柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可使用较长的接头。
本文使用的术语“自体的T细胞”是指源自于相同个体的T细胞，该T细胞随后被重新施用到该个体。
本文使用的术语“异体的T细胞”是指源自个体之外的T细胞。
本文使用的术语“细胞毒性T细胞”是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。其表面抗原为CD3+、CD4+或CD8+，TCR（T细胞受体）有a和β两条多肽链组成。
本文使用的术语“肿瘤浸润T细胞”是指从肿瘤组织中分离出的浸润T细胞。
本文使用的术语“调节性T细胞”是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，可分为天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞，如Th3、Tr1。
本文使用的术语“载体”是指重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(MLV)。
在本文中，“亲和力”或“结合亲和力”KD通常通过测量平衡缔合常数（ka）和平衡解离常数（kd）并计算kd与ka的商（KD=kd/ka）来确定。KD值越小说明亲和力越强，KD值越大说明亲和力越弱。
CAR的结构通常包括胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号域（Gross etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10024, 1989；Eshhar et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90: 720, 1993）。第一代CAR胞内信号转导区只包含单一的CD3ζ链。CAR-T细胞活性差，体内存活时间短。第二代CAR增加了胞内共刺激域，如CD27、CD28、CD134（OX40）或CD137（4-1BB）等，可使CAR-T细胞持续增殖并释放细胞因子，增强抗肿瘤活性（Imai etal., Leukemia 18: 676, 2004；Zhao et al., Cancer Cell 28: 415, 2015）。第三代CAR使用两个共刺激域（Zhong et al., Mol. Ther. 18: 413, 2010），以增强CAR-T的激活。第四代CAR除了嵌合抗原受体基因外，整合表达免疫因子、共刺激因子配体、趋化因子、自杀开关等，可以增强CAR-T细胞的激活、扩增和杀伤；增加肿瘤局部的趋化以及招募；活化其它免疫细胞等。CAR-T技术作为一种突破性的过继细胞疗法，在血液瘤早期临床研究中取得了巨大的突破。
CAR-T细胞疗法在肝癌中也开展了一些探索性临床试验，是一种颇具前景的攻克肝癌疗法。然而CAR-T治疗实体瘤仍然面临着巨大的挑战，其疗效和安全性的两个重要问题是：1) CAR-T在体内的扩增和持续不足，治疗实体瘤疗效很差；2) CAR-T会引起细胞因子风暴、神经毒性和脱靶效应等毒副反应。实体瘤中CAR-T细胞疗法的局限性主要是由于肿瘤抗原的异质表达和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）所致，该环境包括物理屏障，例如致密的细胞外基质，上皮细胞功能异常；代谢检查点，例如缺氧；以及免疫屏障，例如免疫抑制分子和免疫抑制免疫细胞。一项荟萃分析研究表明CAR-T细胞疗法在实体瘤中的缓解率为9%（Hou Bet al., Dis Markers. 2019, 2019:3425291）。另一项荟萃分析表明，在实体瘤的研究中完全缓解率为4.1%，总体客观缓解率为10.0%，细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性的发生率分别为5.4%和12.1%（Grigor EJM et al., Transfus Med Rev. 2019;33(2):98-110）。此外，靶向人表皮受体2（HER-2）的CAR-T细胞由于在肺上皮细胞和胆管上皮细胞上特异性识别HER-2而导致患者死亡（Morgan RA et al., Mol. Ther. 18:843–51）。
如背景技术部分所述，目前已知的靶向GPC3的CAR分子通常采用简单的二代CAR设计，scFv为鼠源、共刺激信号域和胞内CD3ξ信号域都采用野生型分子，且抗原识别域与靶抗原的亲和力也未进行合适的筛选，而这些CAR分子存在临床疗效和安全性不理想的问题。因此，需要对现有的CAR分子进行结构改造，以获得疗效和安全性更优的CAR-T细胞。
靶点的选择、CAR的设计、CAR-T制备工艺是CAR-T治疗肝癌需要考虑的因素。为了确保CAR-T靶向GPC3的安全性，需要CAR分子中的scFv仅识别和结合肿瘤细胞上高表达的GPC3，而不识别正常细胞上的相同抗原。因此，需要开发scFv的精细设计和筛选策略，以避免CAR-T细胞可能对正常细胞产生的非特异性杀伤，同时，在CAR分子设计中使用人源化scFv以降低CAR-T细胞的免疫原性，增强CAR-T的持续性。除scFv之外的CAR结构设计主要考虑共刺激信号及CD3ζ信号的改造，以增强CAR-T对靶细胞的杀伤能力、体内扩增能力和安全性。
本发明首先对靶向GPC3的CAR分子的抗原识别域进行人源化改造，然后进行亲和力筛选、比较不同scFv的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤、扩增以及分化。针对共刺激信号域和CD3ζ信号域的信号传导的原理，对共刺激信号域和CD3ζ信号域氨基酸组成进行不同的设计，以获得疗效和安全性更优的CAR-T细胞。具体地，本发明对靶向GPC3的CAR分子作了以下的结构改进。
1. 靶向GPC3 CAR分子抗原识别域的设计
以特异识别GPC3靶点的单克隆小鼠抗体GC33的氨基酸序列为基础，设计CAR分子的抗原识别域。其中特异识别GPC3靶点的单克隆小鼠抗体GC33为：将GC33的轻链可变区和重链可变区用一段富含甘氨酸（Glycine）和丝氨酸（Serine）的柔性接头肽链（其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS）连接，形成单链抗体(single chain antibody fragment, scFv)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本发明对鼠源GC33 scFv的氨基酸组成进行改造，包括：
1）将鼠源GC33 scFv的抗体骨架区序列更换为人源胚系抗体骨架区序列，以改变抗原识别域与靶点的亲和力，并降低抗原识别域的免疫原性，分别得到了GC33人源化scFv-1和GC33人源化scFv-2；其中，GC33人源化scFv-1的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，编码GC33人源化scFv-1的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；GC33人源化scFv-1的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，编码GC33人源化scFv-1的VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；GC33人源化scFv-1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，编码GC33人源化scFv-1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
GC33人源化scFv-2的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，编码GC33人源化scFv-2的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示；GC33人源化scFv-2的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，编码GC33人源化scFv-2的VL的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；GC33人源化scFv-2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，编码GC33人源化scFv-2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
2）本发明在GC33人源化scFv的N末端添加富含极性氨基酸的8-15个氨基酸的保护肽段，保护肽段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 14、15、16、17或18所示，基本上由其组成或由其组成，并用一段富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽链（其氨基酸序列为GGGGSGGGGS）将保护肽段与GC33人源化scFv的N末端相连。在GC33人源化scFv-1（其氨基酸序列如SEQ IDNO: 6所示）的N末端添加了保护肽段（其氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示）后，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示，编码在N末端添加了保护肽段的GC33人源化scFv-1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所示。在GC33人源化scFv-2的N末端添加了保护肽段（其氨基酸序列如SEQID NO: 14所示）后，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示，编码在N末端添加了保护肽段的GC33人源化scFv-2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 22所示。
2. 靶向GPC3 CAR分子共刺激信号域的设计
以4-1BB共刺激信号域的天然序列（例如氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示，对应于NP_001552.2第214-255位）为基础，设计CAR分子的共刺激信号域，包括：
1）使用4-1BB共刺激信号域的天然序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 23，编码天然4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，基本上由其组成或由其组成；
2）将4-1BB共刺激信号域天然序列中的QTTQE序列替代成FPEEE序列，改造后的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示，编码改造后的4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示，基本上由其组成或由其组成；
本发明的共刺激信号域也可选择天然的CD28共刺激信号域。
3. 靶向GPC3 CAR分子CD3ξ信号域的设计
以CD3ζ信号域的天然序列（如氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，对应于NP_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位，编码天然CD3ζ信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示）为基础，设计CAR分子的CD3ξ信号域，包括以下设计中的至少一种：
1）将CD3ζ信号域的天然序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
2）将CD3ζ信号域的天然序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
3）CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代，同时CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域包含如SEQ ID NO: 29或31所示的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成；编码改造后的CD3ζ信号域的核苷酸序列包含如SEQID NO: 30或32所示的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成。
4. GPC3 CAR分子的组成
本发明涉及一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其包含上文改造的GC33人源化scFv分子、CD8α或CD28铰链区和跨膜区、改造的4-1BB共刺激信号域或CD28共刺激信号域以及改造的CD3ζ信号域，以及任选地集落刺激因子2受体α信号肽等构件。除非特殊说明，这些构件可以任意组合。
本发明涉及一种GPC3嵌合抗原受体，在以上组合后的CAR分子结构基础上可包含表达共刺激受体、分泌免疫检查点阻断剂、一种或多种细胞因子或趋化因子、或趋化因子受体的序列，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226等，所述分泌免疫检查点阻断剂选自PD-1 scFv、PD-L1scFv、CTLA-4 scFv等，所述一种或多种细胞因子或趋化因子选自IL-2Rβ链、IL-7、IL-12、IL-15、CCL19、CCL21、CXCL10等，或所述趋化因子受体选自CXCR1、CXCR2、CXCR4、CCR2、CCR4等。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含鼠源scFv、天然的4-1BB共刺激信号域、天然的CD3ζ信号域的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 34所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含鼠源scFv、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 35所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含改造的GC33人源化scFv-1、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 37所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含鼠源scFv、天然的CD28共刺激信号域、包含YXXQ的天然的CD3ζ信号域的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 40所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含改造的GC33人源化scFv-1、天然的CD28共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 42所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含鼠源scFv、天然的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ及IL-2Rβ链的CD3ζ信号域、包含IL-7细胞因子及CCL19趋化因子的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQID NO: 44所示。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含鼠源scFv、天然的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ及IL-2Rβ链的CD3ζ信号域、包含共刺激配体CD40L的嵌合抗原受体，如SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 46所示。
以下表1中为本发明中涉及的具体氨基酸和核苷酸序列。
表1
Figure 876263DEST_PATH_IMAGE001
Figure 324562DEST_PATH_IMAGE002
Figure 369878DEST_PATH_IMAGE003
Figure 279934DEST_PATH_IMAGE004
Figure 359886DEST_PATH_IMAGE005
Figure 447927DEST_PATH_IMAGE006
Figure 246119DEST_PATH_IMAGE007
Figure 710598DEST_PATH_IMAGE008
Figure 645056DEST_PATH_IMAGE009
本发明靶向GPC3的嵌合抗原受体并不限于以上结构，还可包含铰链区、跨膜结构域和信号肽等。本发明并不对铰链区、跨膜结构域和信号肽的序列作具体限定，例如可参见发明专利申请201510324558.X的序列表中公开的序列。
本发明的靶向GPC3的嵌合抗原受体基因可以通过慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子等转导至自体或异体的T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润T细胞、调节性T细胞等，特别是通过慢病毒载体转导至自体或异体T细胞。
本发明涉及靶向GPC3的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，尤其是靶向GPC3的嵌合抗原受体修饰的T细胞。
本发明涉及靶向GPC3的嵌合抗原受体在治疗GPC3阳性疾病，特别是GPC3阳性肿瘤（例如肝癌）中的用途。
GPC3阳性（其表达GPC3高于正常组织）疾病是指与肝脏有关的疾病，例如肝硬化和肝癌，其中GPC3的表达可通过单克隆抗体1G12检测或免疫组织化学方法检测。
其中除非特别指明，本文所述技术方案可以任意组合。
与现有技术CAR-T相比，本发明能显著提高靶向GPC3的CAR-T细胞在体内的扩增效率和持续时间，提高杀伤肿瘤的效能，降低毒副作用，最终达到提高临床疗效、减少疾病复发和降低副作用的目的。
下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。
实施例1：GPC3 CAR分子的设计
本实施例以设计具有不同抗原识别域、共刺激信号域和CD3ξ信号域的GPC3 CAR分子，以及CAR-T细胞制备为例。
抗原识别域设计原则：在不改变GC33 scFv性质和功能的同时，将GC33 scFv的抗体骨架区序列更换为人源胚系抗体骨架区序列，或在GC33 scFv的N末端添加富含极性氨基酸的保护肽段，以降低免疫原性，改善scFv与GPC3靶点的亲和力，减少CAR-T细胞自激活的可能性，增加向胞内传递信号的效率，抑制CAR-T的终末分化，延长CAR-T细胞在体内的存活时间，增加CAR-T细胞抗瘤性能。
共刺激信号域设计原则：在不改变CD28、4-1BB共刺激域性质和功能的同时，降低CAR-T细胞自激活的可能性，增加CD28、4-1BB向胞内传递信号的效率，延长CAR-T细胞在体内的存活时间，增加CAR-T细胞抗瘤性能。
CD3ζ信号域设计原则：通过对CD3ζ胞内信号区与信号传递相关的氨基酸位点进行改造，最终达到改善CAR-T细胞胞内信号传递通路，提升CAR-T细胞在体内的扩增能力、持续能力、改善细胞因子分泌状况，进而提升CAR-T细胞抗瘤性能。
初始的GC33 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；初始的4-1BB氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示，编码初始的4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示；初始的CD3ζ信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，编码初始的CD3ζ信号域的核苷酸序列如SEQ IDNO: 28所示。
将鼠源scFv、天然的4-1BB共刺激信号域、天然的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-1），得到如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。将鼠源scFv、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-2），得到如SEQ IDNO:35所示的氨基酸序列。将改造的GC33人源化scFv-1、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-3），得到如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。将鼠源scFv、天然的CD28共刺激信号域、包含YXXQ的天然的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-4），得到如SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。将改造的GC33人源化scFv-1、天然的CD28共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-5），得到如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列。
实施例2 靶向GPC3的CAR慢病毒转移质粒的构建和慢病毒制备
1）将编码靶向GPC3的scFv的嵌合基因通过基因合成的方法合成（北京博迈德基因技术有限公司），CAR-1、CAR-2、CAR-3、CAR-4和CAR-5的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:34、36、38、40或42。2）以已有的靶向CD19的CAR质粒为模板（靶向CD19的CAR核苷酸序列参见专利CN 105177031 B中SEQ ID NO: 13），利用PCR克隆出CAR分子中含有CD8α及CD28铰链区、CD8α及CD28跨膜区、4-1BB（对应于NP_001552.2）的胞内区、以及CD3ζ（对应于NP_000725.1）胞内区的核酸片段。3）以步骤1）获得的嵌合基因和步骤2）获得的核酸片段为模板，通过PCR克隆出编码靶向GPC3的CAR的完整核酸片段。4）通过限制性酶切和连接的方法，将步骤3）获得的完整核酸片段插入慢病毒载体pLenti6.3/V5（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA），获得载带靶向GPC3 CAR基因的慢病毒转移质粒。5）将慢病毒包装质粒pLP/VSVG、pLP1/MDK和pLP2/RSK（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）与步骤4）获得的转移质粒，用脂质体（Lipofectamine）3000（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）转染至HEK293T细胞，48小时后收集培养基，300 g离心去除细胞碎片后，用超速离心机25000 rpm离心3小时。将沉淀用1 mL生理盐水溶解，即为所需的慢病毒载体。
实施例3 CAR-T细胞制备
使用CD3/CD28免疫磁珠（Dynabeads）（Thermo Fisher）从健康志愿者的外周血单个核细胞（妙通（上海）生物科技有限公司，中国）中分离T细胞，将分离得到的T细胞（此时的T细胞与CD3/CD28 免疫磁珠连在一起）-含IL-2（500 IU/ml）的新鲜X-VIVO 15培养体系中培养48小时后，用实施例2制备的慢病毒载体感染T细胞。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并于上述培养体系中继续培养。细胞培养4天后，收集培养体系中的所有细胞，并用磁力架去除培养体系中的免疫磁珠，T细胞离心并计数，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEABiosciences，San Diego，CA，USA）检测各组细胞CAR含量。得到5种CAR-T细胞，分别为CAR-T-1细胞、CAR-T-2细胞、CAR-T-3细胞、CAR-T-4细胞和CAR-T-5细胞。图1显示，在慢病毒感染MOI=0.5时，各CAR基因的转导效率在20-80%之间。
实施例4：改造的GPC3 CAR抗原识别域的亲和力检测
本实施例以GC33人源化scFv-1与GPC3蛋白的亲和力为例。
利用HBS-EP+缓冲液（10mM HEPES；150mM NaCl；3mM EDTA；0.5% Tween20；pH 7.4）配置浓度为50 μg/mL的人GPC3-Fc蛋白（Acro BIOSYSTEMS, Newark, DE, USA）溶液。偶联Fc片段的GC33人源化scFv-1由北京义翘神州生物科技有限公司制备，利用HBS-EP+缓冲液配置浓度为50 μg/mL的GC33人源化scFv-1溶液。将Biacore CM5芯片（GE healthcare,Chicago, IL, USA）用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物预处理活化后，与人GPC3-Fc蛋白溶液孵育偶联，用乙醇胺封闭芯片后，与GC33人源化scFv-1孵育，随后用适宜pH的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗芯片，用Biacore™ T200设备（GE healthcare, Chicago, IL, USA）检测和分析scFv与GPC3的亲和力，包括结合速率常数Ka、解离常数Kd和平衡解离常数KD。
表2显示，GC33人源化scFv-1（其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示）与GPC3结合的KD值为5.12E-8 M，鼠源GC33抗体（其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）亲和力为0.67E-9 M，说明经过改造后的GC33人源化scFv-1与GPC3的亲和力降低，且在正常亲和力范围内，有效降低与非靶细胞的结合与杀伤。
表2
Figure 903999DEST_PATH_IMAGE010
实施例5：包含改造的GC33 scFv的抗原识别域的GPC3 CAR-T对靶细胞的杀伤效率
本实施例以比较包含初始的GC33 scFv（CAR-T-2，制备方法如实施例3所示）、改造的GC33人源化scFv-1（CAR-T-3，制备方法如实施例3所示）对表达GPC3的Huh7及HepG2靶细胞的杀伤效率为例。
利用1 mL生理盐水重悬Huh7及HepG2靶细胞，加入10 μL Calcein-AM（浓度1 μg/μL，ThermoFisher, USA），轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育10 min，孵育结束后使用10mL生理盐水洗两次，以标记靶细胞。向48孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning,NY, USA）每孔中加入1×105个上述标记的Huh7及HepG2细胞，按E: T = 1:1、5:1、10:1、15:1加入不同CAR-T细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育6 h，用荧光酶标仪（VarioscanLux, ThermoFisher）检测细胞上清的荧光值（激发波长: 495nm，发射波长: 515nm）。
图2显示，改造的GC33人源化scFv-1（CAR-T-3）与初始的GC33 scFv（CAR-T-2）均能通过识别GPC3靶蛋白有效杀伤Huh7及HepG2细胞，且改造的GC33人源化scFv-1的杀伤效率更强，说明在与靶细胞孵育的短时间内，这些CAR-T细胞均能被激活并裂解靶细胞，且改造后的GC33人源化scFv-1（CAR-T-3）具有更强的杀伤能力，为体内有效杀伤肿瘤细胞提供了基础。
实施例6：GPC3 CAR-T杀伤靶细胞的效率
本实施例以检测包含改造的抗原识别域、不同共刺激信号域和不同CD3ξ信号域的CAR-T（分别为CAR-T-1细胞、CAR-T-2细胞、CAR-T-3细胞、CAR-T-4细胞和CAR-T-5细胞，制备方法如实施例3所示）对表达GPC3的靶细胞的杀伤效率为例。
利用1 mL生理盐水重悬Huh7及HepG2靶细胞，加入10 μL Calcein-AM（浓度1 μg/μL，ThermoFisher, USA），轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育10 min，以标记靶细胞。向48孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning, NY, USA）每孔中加入1×105个上述标记的Huh7及HepG2细胞，按E: T = 1:1、5:1、10:1、15:1加入不同CAR-T细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育6 h，用荧光酶标仪（Varioscan Lux, ThermoFisher）检测细胞上清的荧光值（激发波长: 495nm，发射波长: 515nm）。
图3显示，具有不同抗原识别域、共刺激信号域和CD3ξ信号域设计的CAR-T（分别为CAR-T-1细胞、CAR-T-2细胞、CAR-T-3细胞、CAR-T-4细胞和CAR-T-5细胞）均能通过识别GPC3靶蛋白有效杀伤Huh7及HepG2细胞，且改造后的GC33人源化scFv-1（CAR-T-3）具有更强的杀伤能力，共刺激信号改造后也能提高CAR-T细胞的杀伤能力，说明在与靶细胞孵育的短时间内，这些CAR-T细胞均能被激活并裂解靶细胞。
实施例7：GPC3 CAR-T在靶细胞刺激下的增殖
本实施例以检测包含改造的抗原识别域、不同共刺激信号域、和不同CD3ξ信号域的CAR-T（分别为CAR-T-1细胞、CAR-T-2细胞、CAR-T-3细胞、CAR-T-4细胞和CAR-T-5细胞）在表达GPC3的Huh7靶细胞刺激下的增殖效率为例。
向6孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning, NY, USA）每孔中加入2×105个Huh7细胞，按E: T = 1: 1加入各种CAR-T细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4、8、12天，用台盼蓝将细胞染色计活细胞总数，并将细胞用自制的偶联PE荧光分子的GPC3CAR抗体标记，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA）检测各组细胞中CAR-T的比例，计算出各组中CAR-T的增殖倍数。
图4显示，与初始的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-1）相比，改造的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-2）在Huh7靶细胞刺激下的增殖效率显著提高，说明这些构件的改造能增强CAR-T的扩增效率和持续时间。
实施例8：GPC3 CAR-T在靶细胞刺激下的分化
本实施例以比较包含初始的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-1）、改造的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-2）在表达GPC3的HepG2靶细胞刺激下的细胞分化为例。
向6孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning, NY, USA）每孔中加入2×105个HepG2细胞，按E: T = 1: 1加入各种CAR-T细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养2、4天后，将细胞用自制的偶联PE荧光分子的GPC3 CAR抗体、CD45RA-BV510抗体（Biolegend）、CD62L-APC-Fire750（Biolegend）抗体标记，用全光谱流式细胞仪（Cytek® Aurora）检测各组细胞中CAR-T的分化。
图5所示，与初始的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-1）相比，改造的4-1BB胞内信号域及CD3ξ信号域的CAR-T（CAR-T-2）在HepG2靶细胞刺激下幼稚（naïve）及干细胞样记忆性T细胞（stem cell momery）的未分化细胞比例较高，可提高体内持续的抗肿瘤作用。
实施例9：CAR-T-3细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力、扩增能力及持续性能
本实施例以检测改造的GC33人源化scFv-1、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-3）对荷瘤小鼠的抗瘤能力、体内扩增能力及持续能力为例。
将分离纯化的T细胞按1.5×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/mL）的新鲜X-VIVO培养基中，按T细胞数与CD3/CD28免疫磁珠为1: 1加入免疫磁珠培养细胞48小时后，将T细胞分别感染含相应CAR的慢病毒以制备相应CAR-T细胞（同时培养不感染慢病毒的T细胞以供对照实验使用）。病毒感染24小时后，细胞离心换液，计数，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/ml）的新鲜X-VIVO中，继续维持原有的免疫磁珠刺激培养，细胞每48小时离心换液，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/ml）的新鲜X-VIVO中，培养至第11天时，收获细胞并计数，同时留取相应细胞样品进行流式检测分析CAR表达率，细胞以冻存液重悬后保存至液氮中待用。6-8周龄NCG小鼠（江苏集萃药康生物科技有限公司，中国）共24只，分为6只/组，共4组。每只小鼠从皮下接种2.0×106个Huh7-LAE细胞（ATCC，USA）7天后，对小鼠进行荧光素酶活体成像（Lumina II小动物活体成像系统，PerkinElmer，USA）分析，以验证小鼠皮下肿瘤模型是否成功。小鼠肿瘤模型制作成功后，第14天每组小鼠分别从尾静脉注射GPC3 CAR-T细胞（1×107个细胞/只），同时在另外两组小鼠分别注射相应细胞数的T细胞及相应体积的生理盐水作为对照。小鼠于CAR-T细胞注射后第5、8、12、15、19、22、26、33、40、47天进行小鼠活体成像分析，于CAR-T细胞注射后第5、12、15、19、26、33、40天进行外周血CAR-T检测。
图6显示，注射T细胞组的荷瘤小鼠已于注射后33后开始，注射CAR-T的小鼠全部存活，且与注射T细胞组的荷瘤小鼠相比CAR-T-3能完全抑制肿瘤的生长。
图7显示，小鼠尾静脉注射抗GPC3 CAR-T细胞治疗并于不同时间检测小鼠外周血CAR-T细胞含量。小鼠外周血在5天后能检测到明显较高水平的CAR-T细胞。12天后CAR-T含量下降，维持一定的水平。
以上结果说明CAR-T-3细胞（其包含改造的GC33人源化scFv-1、改造的4-1BB共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域连接形成的嵌合抗原受体CAR（CAR-3））在体内有很强的抗肿瘤效果及持续性。
实施例10：GPC3 CAR-T细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力、扩增能力及持续性能
本实施例以检测包含鼠源scFv、天然的CD28共刺激信号域、包含YXXQ天然的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-4），以及包含改造的GC33人源化scFv-1、天然的CD28共刺激信号域、改造的包含YXXQ的CD3ζ信号域的CAR-T（CAR-5）对荷瘤小鼠的抗瘤能力、体内扩增能力及持续能力为例。
将分离纯化的T细胞按1.5×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/mL）的新鲜X-VIVO培养基中，按T细胞数与CD3/CD28免疫磁珠为1: 1加入免疫磁珠培养细胞48小时后，将T细胞分别感染含相应CAR的慢病毒以制备相应CAR-T细胞（同时培养不感染慢病毒的T细胞以供对照实验使用）。病毒感染24小时后，细胞离心换液，计数，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/ml）的新鲜X-VIVO中，继续维持原有的Dynabeads刺激培养，细胞每48小时离心换液，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2（500 IU/ml）的新鲜X-VIVO中，培养至第11天时，收获细胞并计数，同时留取相应细胞样品进行流式检测分析CAR表达率，细胞以冻存液重悬后保存至液氮中待用。6-8周龄NCG小鼠（江苏集萃药康生物科技有限公司，中国）共24只，分为6只/组，共4组。每只小鼠从皮下接种5.0×106个HepG2-LAE细胞（ATCC，USA）7天后，对小鼠进行荧光素酶活体成像（Lumina II小动物活体成像系统，PerkinElmer，USA）分析，以验证小鼠皮下肿瘤模型是否成功。小鼠肿瘤模型制作成功后，第14天每组小鼠分别从尾静脉注射GPC3 CAR-T细胞（1×107个细胞/只），同时在另外两组小鼠分别注射相应细胞数的T细胞及相应体积的生理盐水作为对照。小鼠于CAR-T细胞注射后第5、8、12、15、18、21、25天进行小鼠活体成像分析，于CAR-T细胞注射后第4、7、10、13、16、19、22天进行外周血CAR-T检测。
图8显示，与注射T细胞组的荷瘤小鼠相比，CAR-T-4和CAR-T-5均能显著抑制肿瘤的生长。
图9显示，与CAR-T-4相比，CAR-T-5在体内的持续性有显著提高。具体而言，HepG2细胞皮下接种NCG小鼠构建肝癌模型成功后，小鼠尾静脉注射抗GPC3 CAR-T细胞治疗并于不同时间检测小鼠外周血CAR-T细胞含量。与CAR-T-4相比，CAR-T-5组小鼠外周血在4天后能检测到明显较高水平的CAR-T细胞。7天后CAR-T含量下降，CAR-T-5组CAR-T水平维持在较CAR-T-4高的水平。说明与包含天然CD3ξ信号域的CAR-T-4相比，包含改造的CD3ξ信号域的CAR-T-5细胞在体内的持续性能有显著提高。
从上述体外和体内实验结果可知，本发明对GPC3 CAR分子的抗原识别域、共刺激信号域和CD3ξ信号域的设计是非常成功的，其中经过scFv人源化改造以及共刺激信号、CD3ξ信号域改造后的CAR-T体内可以完全清除肿瘤且具有很好的持续性。另外，scFv及CD3ξ信号域的设计能显著提高GPC3 CAR分子在体内的扩增效率和持续时间。
序列表
<110> 北京艺妙神州医药科技有限公司
<120> 靶向GPC3的嵌合抗原受体及其用途
<130> CP12101400/CB
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 scFv氨基酸序列
<400> 1
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-1 VH氨基酸序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-1 VH的核苷酸序列
<400> 3
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc ctggacccca agaccggcga caccgcctac 180
agccagaagt tcaagggccg cgtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcttctac 300
agctacacct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-1 VL氨基酸序列
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-1 VL的核苷酸序列
<400> 5
gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgggcga gaacgccagc 60
atcagctgcc gcagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcactgg 120
ttcatccagc gccccggcca gagcccccgc atcctgatct acaaggtgag caaccgcttc 180
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaacac ccacgtgccc 300
cccaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336
<210> 6
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-1氨基酸序列
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 7
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-1的核苷酸序列
<400> 7
gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgggcga gaacgccagc 60
atcagctgcc gcagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcactgg 120
ttcatccagc gccccggcca gagcccccgc atcctgatct acaaggtgag caaccgcttc 180
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaacac ccacgtgccc 300
cccaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaagggcg gcggcggcag cggcggcggc 360
ggcagcggcg gcggcggcag ccaggtgcag ctggtgcaga gcggcgccga ggtgaagaag 420
cccggcagca gcgtgaaggt gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cgactacgag 480
atgcactggg tgcgccaggc ccccggccag ggcctggagt ggatgggcgc cctggacccc 540
aagaccggcg acaccgccta cagccagaag ttcaagggcc gcgtgaccat caccgccgac 600
aagagcacca gcaccgccta catggagctg agcagcctgc gcagcgagga caccgccgtg 660
tactactgcg cccgcttcta cagctacacc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 720
agcagc 726
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-2 VH氨基酸序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-2 VH的核苷酸序列
<400> 9
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc ctggacccca agaccggcga caccgcctac 180
agccagaagt tcaagggccg cgtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg cagcgaggac accgccgtgt actactgcac ccgcttctac 300
agctacacct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 345
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-2 VL氨基酸序列
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-2 VL的核苷酸序列
<400> 11
gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgggcga gaacgccagc 60
atcagctgcc gcagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcactgg 120
ttcatccagc gccccggcca gagcccccgc atcctgatct acaaggtgag caaccgcttc 180
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaacac ccacgtgccc 300
cccaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336
<210> 12
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-2氨基酸序列
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 13
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-2 VL的核苷酸序列
<400> 13
gacgtggtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga ccctgggcga gaacgccagc 60
atcagctgcc gcagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcactgg 120
ttcatccagc gccccggcca gagcccccgc atcctgatct acaaggtgag caaccgcttc 180
agcggcgtgc ccgaccgctt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gccagaacac ccacgtgccc 300
cccaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaagggcg gcggcggcag cggcggcggc 360
ggcagcggcg gcggcggcag ccaggtgcag ctggtgcaga gcggcgccga ggtgaagaag 420
cccggcgcca gcgtgaaggt gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cgactacgag 480
atgcactggg tgcgccaggc ccccggccag ggcctggagt ggatgggcgc cctggacccc 540
aagaccggcg acaccgccta cagccagaag ttcaagggcc gcgtgaccat caccgccgac 600
aagagcacca gcaccgccta catggagctg agcagcctgc gcagcgagga caccgccgtg 660
tactactgca cccgcttcta cagctacacc tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 720
agcagc 726
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv保护肽段1氨基酸序列
<400> 14
Gln Phe Asn Lys Gly Pro Trp Glu His
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv保护肽段2氨基酸序列
<400> 15
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv保护肽段3氨基酸序列
<400> 16
Gln Phe Asn Lys Pro Trp Glu His Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv保护肽段4氨基酸序列
<400> 17
Asn Lys Gly Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv保护肽段5氨基酸序列
<400> 18
Asn Gln Phe Asn Lys Gly Pro Trp Glu His Trp Ser His Glu Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-1的N末端添加保护肽段1的氨基酸序列
<400> 19
Gln Phe Asn Lys Gly Pro Trp Glu His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Leu Gly Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln
195 200 205
Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 20
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-1的N末端添加保护肽段1的核苷酸序列
<400> 20
caatttaata aaggtccttg ggaacatggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcggac 60
gtggtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc tgggcgagaa cgccagcatc 120
agctgccgca gcagccagag cctggtgcac agcaacggca acacctacct gcactggttc 180
atccagcgcc ccggccagag cccccgcatc ctgatctaca aggtgagcaa ccgcttcagc 240
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc 300
cgcgtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgcagcc agaacaccca cgtgcccccc 360
accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 420
agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgccgaggt gaagaagccc 480
ggcagcagcg tgaaggtgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaccga ctacgagatg 540
cactgggtgc gccaggcccc cggccagggc ctggagtgga tgggcgccct ggaccccaag 600
accggcgaca ccgcctacag ccagaagttc aagggccgcg tgaccatcac cgccgacaag 660
agcaccagca ccgcctacat ggagctgagc agcctgcgca gcgaggacac cgccgtgtac 720
tactgcgccc gcttctacag ctacacctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 780
agc 783
<210> 21
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33人源化scFv-2的N末端添加保护肽段1的氨基酸序列
<400> 21
Gln Phe Asn Lys Gly Pro Trp Glu His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Thr Leu Gly Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Ile Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln
195 200 205
Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 22
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33人源化scFv-2的N末端添加保护肽段1的核苷酸序列
<400> 22
caatttaata aaggtccttg ggaacatggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcggac 60
gtggtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc tgggcgagaa cgccagcatc 120
agctgccgca gcagccagag cctggtgcac agcaacggca acacctacct gcactggttc 180
atccagcgcc ccggccagag cccccgcatc ctgatctaca aggtgagcaa ccgcttcagc 240
ggcgtgcccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaagatcagc 300
cgcgtggagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgcagcc agaacaccca cgtgcccccc 360
accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc aagggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 420
agcggcggcg gcggcagcca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgccgaggt gaagaagccc 480
ggcgccagcg tgaaggtgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaccga ctacgagatg 540
cactgggtgc gccaggcccc cggccagggc ctggagtgga tgggcgccct ggaccccaag 600
accggcgaca ccgcctacag ccagaagttc aagggccgcg tgaccatcac cgccgacaag 660
agcaccagca ccgcctacat ggagctgagc agcctgcgca gcgaggacac cgccgtgtac 720
tactgcaccc gcttctacag ctacacctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 780
agc 783
<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 CAR的4-1BB共刺激信号域氨基酸序列
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 24
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33 CAR的4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列
<400> 24
aagcgcggcc gcaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60
accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc cgcttccccg aggaggagga gggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 25
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 CAR B1共刺激信号域氨基酸序列
<400> 25
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Phe Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Gln
20 25 30
Thr Thr Gln Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 26
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33 CAR B1共刺激信号域的核苷酸序列
<400> 26
aagcgcggcc gcaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg ccccgtgttc 60
cccgaggagg aggaggacgg ctgcagctgc cgccagacca cccaggagga gggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 CAR的CD3ζ信号域氨基酸序列
<400> 27
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 28
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33 CAR的CD3ζ信号域的核苷酸序列
<400> 28
cgcgtgaagt tcagccgcag cgccgacgcc cccgcctaca agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120
cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240
cgccgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgc 336
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 CAR的CD3ζM1信号域氨基酸序列
<400> 29
Arg Leu Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Ala Pro Ala Tyr Gln Lys Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 30
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33 CAR的CD3ζM1信号域的核苷酸序列
<400> 30
cgcctgaagt tcagccgcag cgccgaggcc cccgcctacc agaagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120
cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240
cgccgcggca agggccacga cggcctgttc cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgc 336
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GC33 CAR的CD3ζM2信号域氨基酸序列
<400> 31
Arg Leu Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Ala Pro Ala Tyr Gln Lys Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 32
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码GC33 CAR的CD3ζM2信号域的核苷酸序列
<400> 32
cgcctgaagt tcagccgcag cgccgaggcc cccgcctacc agaagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120
cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240
cgccgcggca agggccacga cggcctgttc cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgcct accgccacca ggccctgccc ccccgc 336
<210> 33
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-1氨基酸序列
<400> 33
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
370 375 380
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 34
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-1的核苷酸序列
<400> 34
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggatgtcg tgatgaccca gtccccactg tccctgccag tgacaccagg agagcctgca 180
tccatctctt gccggagctc ccagtctctg gtgcacagca acggcaatac ctacctgcac 240
tggtatctgc agaagccagg ccagagcccc cagctgctga tctacaaggt gtccaaccgg 300
ttctctggag tgccagaccg gttcagcggc tccggctctg gcaccgattt cacactgaag 360
atcagcaggg tggaggcaga ggacgtgggc gtgtactatt gctcccagaa tacccacgtg 420
ccccctacat ttggccaggg caccaagctg gagatcaagg gaggaggagg cagcggcgga 480
ggaggctccg gcggcggcgg ctctcaggtg cagctggtgc agtccggagc agaggtgaag 540
aagcctggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacagattat 600
gagatgcact gggtgcggca ggcacctgga cagggactgg agtggatggg cgccctggac 660
ccaaagaccg gcgatacagc ctactctcag aagtttaagg gcagggtgac cctgacagcc 720
gacgagagca cctccacagc ctatatggag ctgtctagcc tgcgcagcga ggataccgcc 780
gtgtactatt gcacccgctt ctacagttac acttattggg ggcagggcac tctggtcaca 840
gtctcttcaa ccaccacccc agccccccga ccaccaacac ccgcccccac catcgccagc 900
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 960
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1080
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 1140
agctgccgct tccccgagga ggaggagggc ggctgcgagc tgcgcgtgaa gttcagccgc 1200
agcgccgacg cccccgccta caagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1260
ggccgccgcg aggagtacga cgtgctggac aagcgccgcg gccgcgaccc cgagatgggc 1320
ggcaagcccc gccgcaagaa cccccaggag ggcctgtaca acgagctgca gaaggacaag 1380
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac 1440
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 1500
caggccctgc ccccccgc 1518
<210> 35
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-2氨基酸序列
<400> 35
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Phe Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Gln
370 375 380
Thr Thr Gln Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Glu Ala Pro Ala Tyr Gln Lys Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 36
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-2的核苷酸序列
<400> 36
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggatgtcg tgatgaccca gtccccactg tccctgccag tgacaccagg agagcctgca 180
tccatctctt gccggagctc ccagtctctg gtgcacagca acggcaatac ctacctgcac 240
tggtatctgc agaagccagg ccagagcccc cagctgctga tctacaaggt gtccaaccgg 300
ttctctggag tgccagaccg gttcagcggc tccggctctg gcaccgattt cacactgaag 360
atcagcaggg tggaggcaga ggacgtgggc gtgtactatt gctcccagaa tacccacgtg 420
ccccctacat ttggccaggg caccaagctg gagatcaagg gaggaggagg cagcggcgga 480
ggaggctccg gcggcggcgg ctctcaggtg cagctggtgc agtccggagc agaggtgaag 540
aagcctggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacagattat 600
gagatgcact gggtgcggca ggcacctgga cagggactgg agtggatggg cgccctggac 660
ccaaagaccg gcgatacagc ctactctcag aagtttaagg gcagggtgac cctgacagcc 720
gacgagagca cctccacagc ctatatggag ctgtctagcc tgcgcagcga ggataccgcc 780
gtgtactatt gcacccgctt ctacagttac acttattggg ggcagggcac tctggtcaca 840
gtctcttcaa ccaccacccc agccccccga ccaccaacac ccgcccccac catcgccagc 900
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 960
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1080
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgttccccg aggaggagga ggacggctgc 1140
agctgccgcc agaccaccca ggaggagggc ggctgcgagc tgcgcctgaa gttcagccgc 1200
agcgccgagg cccccgccta ccagaagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1260
ggccgccgcg aggagtacga cgtgctggac aagcgccgcg gccgcgaccc cgagatgggc 1320
ggcaagcccc gccgcaagaa cccccaggag ggcctgtaca acgagctgca gaaggacaag 1380
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac 1440
gacggcctgt tccagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc ctaccgccac 1500
caggccctgc ccccccgc 1518
<210> 37
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-3氨基酸序列
<400> 37
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
225 230 235 240
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Phe Pro Glu Glu Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Gln
370 375 380
Thr Thr Gln Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Glu Ala Pro Ala Tyr Gln Lys Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 38
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-3的核苷酸序列
<400> 38
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggacgtgg tgatgaccca gagccccctg agcctgcccg tgaccctggg cgagaacgcc 180
agcatcagct gccgcagcag ccagagcctg gtgcacagca acggcaacac ctacctgcac 240
tggttcatcc agcgccccgg ccagagcccc cgcatcctga tctacaaggt gagcaaccgc 300
ttcagcggcg tgcccgaccg cttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag 360
atcagccgcg tggaggccga ggacgtgggc gtgtactact gcagccagaa cacccacgtg 420
ccccccacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagg gcggcggcgg cagcggcggc 480
ggcggcagcg gcggcggcgg cagccaggtg cagctggtgc agagcggcgc cgaggtgaag 540
aagcccggca gcagcgtgaa ggtgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccgactac 600
gagatgcact gggtgcgcca ggcccccggc cagggcctgg agtggatggg cgccctggac 660
cccaagaccg gcgacaccgc ctacagccag aagttcaagg gccgcgtgac catcaccgcc 720
gacaagagca ccagcaccgc ctacatggag ctgagcagcc tgcgcagcga ggacaccgcc 780
gtgtactact gcgcccgctt ctacagctac acctactggg gccagggcac cctggtgacc 840
gtgagcagca ccaccacccc cgccccccgc ccccccaccc ccgcccccac catcgccagc 900
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 960
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1080
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgttccccg aggaggagga ggacggctgc 1140
agctgccgcc agaccaccca ggaggagggc ggctgcgagc tgcgcctgaa gttcagccgc 1200
agcgccgagg cccccgccta ccagaagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1260
ggccgccgcg aggagtacga cgtgctggac aagcgccgcg gccgcgaccc cgagatgggc 1320
ggcaagcccc gccgcaagaa cccccaggag ggcctgtaca acgagctgca gaaggacaag 1380
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac 1440
gacggcctgt tccagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc ctaccgccac 1500
caggccctgc ccccccgc 1518
<210> 39
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-4氨基酸序列
<400> 39
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr
275 280 285
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
290 295 300
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
305 310 315 320
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
325 330 335
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
340 345 350
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
355 360 365
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
370 375 380
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
450 455 460
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His
485 490 495
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 40
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-4的核苷酸序列
<400> 40
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggatgtcg tgatgaccca gtccccactg tccctgccag tgacaccagg agagcctgca 180
tccatctctt gccggagctc ccagtctctg gtgcacagca acggcaatac ctacctgcac 240
tggtatctgc agaagccagg ccagagcccc cagctgctga tctacaaggt gtccaaccgg 300
ttctctggag tgccagaccg gttcagcggc tccggctctg gcaccgattt cacactgaag 360
atcagcaggg tggaggcaga ggacgtgggc gtgtactatt gctcccagaa tacccacgtg 420
ccccctacat ttggccaggg caccaagctg gagatcaagg gaggaggagg cagcggcgga 480
ggaggctccg gcggcggcgg ctctcaggtg cagctggtgc agtccggagc agaggtgaag 540
aagcctggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacagattat 600
gagatgcact gggtgcggca ggcacctgga cagggactgg agtggatggg cgccctggac 660
ccaaagaccg gcgatacagc ctactctcag aagtttaagg gcagggtgac cctgacagcc 720
gacgagagca cctccacagc ctatatggag ctgtctagcc tgcgcagcga ggataccgcc 780
gtgtactatt gcacccgctt ctacagttac acttattggg ggcagggcac tctggtcaca 840
gtctcttcaa tcgaggtgat gtaccccccc ccctacctgg acaacgagaa gagcaacggc 900
accatcatcc acgtgaaggg caagcacctg tgccccagcc ccctgttccc cggccccagc 960
aagcccttct gggtgctggt ggtggtgggc ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg 1020
accgtggcct tcatcatctt ctgggtgcgc agcaagcgca gccgcctgct gcacagcgac 1080
tacatgaaca tgaccccccg ccgccccggc cccacccgca agcactacca gccctacgcc 1140
cccccccgcg acttcgccgc ctaccgcagc cgcgtgaagt tcagccgcag cgccgacgcc 1200
cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag 1260
gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc 1320
cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc 1380
tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc cgccgcggca agggccacga cggcctgtac 1440
cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgcct accgccacca ggccctgccc 1500
ccccgc 1506
<210> 41
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-5氨基酸序列
<400> 41
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Asn Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Phe Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Ile Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala
225 230 235 240
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Glu Val Met Tyr
275 280 285
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
290 295 300
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
305 310 315 320
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
325 330 335
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
340 345 350
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
355 360 365
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
370 375 380
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Leu Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Gln Lys Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
450 455 460
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe
465 470 475 480
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His
485 490 495
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 42
<211> 1506
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-5的核苷酸序列
<400> 42
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggacgtgg tgatgaccca gagccccctg agcctgcccg tgaccctggg cgagaacgcc 180
agcatcagct gccgcagcag ccagagcctg gtgcacagca acggcaacac ctacctgcac 240
tggttcatcc agcgccccgg ccagagcccc cgcatcctga tctacaaggt gagcaaccgc 300
ttcagcggcg tgcccgaccg cttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgaag 360
atcagccgcg tggaggccga ggacgtgggc gtgtactact gcagccagaa cacccacgtg 420
ccccccacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagg gcggcggcgg cagcggcggc 480
ggcggcagcg gcggcggcgg cagccaggtg cagctggtgc agagcggcgc cgaggtgaag 540
aagcccggca gcagcgtgaa ggtgagctgc aaggccagcg gctacacctt caccgactac 600
gagatgcact gggtgcgcca ggcccccggc cagggcctgg agtggatggg cgccctggac 660
cccaagaccg gcgacaccgc ctacagccag aagttcaagg gccgcgtgac catcaccgcc 720
gacaagagca ccagcaccgc ctacatggag ctgagcagcc tgcgcagcga ggacaccgcc 780
gtgtactact gcgcccgctt ctacagctac acctactggg gccagggcac cctggtgacc 840
gtgagcagca tcgaggtgat gtaccccccc ccctacctgg acaacgagaa gagcaacggc 900
accatcatcc acgtgaaggg caagcacctg tgccccagcc ccctgttccc cggccccagc 960
aagcccttct gggtgctggt ggtggtgggc ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg 1020
accgtggcct tcatcatctt ctgggtgcgc agcaagcgca gccgcctgct gcacagcgac 1080
tacatgaaca tgaccccccg ccgccccggc cccacccgca agcactacca gccctacgcc 1140
cccccccgcg acttcgccgc ctaccgcagc cgcctgaagt tcagccgcag cgccgaggcc 1200
cccgcctacc agaagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag 1260
gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc 1320
cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc 1380
tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc cgccgcggca agggccacga cggcctgttc 1440
cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgcct accgccacca ggccctgccc 1500
ccccgc 1506
<210> 43
<211> 902
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-6氨基酸序列
<400> 43
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
370 375 380
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Pro Asn Cys Arg Asn Thr
385 390 395 400
Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser
405 410 415
Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys
420 425 430
Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu
435 440 445
Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr
450 455 460
Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu
465 470 475 480
Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
485 490 495
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
500 505 510
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
515 520 525
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
530 535 540
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
545 550 555 560
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
565 570 575
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
580 585 590
Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
595 600 605
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
610 615 620
Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu
625 630 635 640
Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp
645 650 655
Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu
660 665 670
Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn
675 680 685
Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu
690 695 700
Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr
705 710 715 720
Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile
725 730 735
Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln
740 745 750
Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile
755 760 765
Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Ser
770 775 780
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
785 790 795 800
Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu
805 810 815
Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp
820 825 830
Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg
835 840 845
Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val
850 855 860
Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln
865 870 875 880
Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys
885 890 895
Met Lys Arg Arg Ser Ser
900
<210> 44
<211> 2706
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-6的核苷酸序列
<400> 44
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggatgtcg tgatgaccca gtccccactg tccctgccag tgacaccagg agagcctgca 180
tccatctctt gccggagctc ccagtctctg gtgcacagca acggcaatac ctacctgcac 240
tggtatctgc agaagccagg ccagagcccc cagctgctga tctacaaggt gtccaaccgg 300
ttctctggag tgccagaccg gttcagcggc tccggctctg gcaccgattt cacactgaag 360
atcagcaggg tggaggcaga ggacgtgggc gtgtactatt gctcccagaa tacccacgtg 420
ccccctacat ttggccaggg caccaagctg gagatcaagg gaggaggagg cagcggcgga 480
ggaggctccg gcggcggcgg ctctcaggtg cagctggtgc agtccggagc agaggtgaag 540
aagcctggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacagattat 600
gagatgcact gggtgcggca ggcacctgga cagggactgg agtggatggg cgccctggac 660
ccaaagaccg gcgatacagc ctactctcag aagtttaagg gcagggtgac cctgacagcc 720
gacgagagca cctccacagc ctatatggag ctgtctagcc tgcgcagcga ggataccgcc 780
gtgtactatt gcacccgctt ctacagttac acttattggg ggcagggcac tctggtcaca 840
gtctcttcaa ccaccacccc cgccccccgc ccccccaccc ccgcccccac catcgccagc 900
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 960
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1080
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 1140
agctgccgct tccccgagga ggaggagggc ggctgcgagc tgcccaactg ccgcaacacc 1200
ggcccctggc tgaagaaggt gctgaagtgc aacacccccg accccagcaa gttcttcagc 1260
cagctgagca gcgagcacgg cggcgacgtg cagaagtggc tgagcagccc cttccccagc 1320
agcagcttca gccccggcgg cctggccccc gagatcagcc ccctggaggt gctggagcgc 1380
gacaaggtga cccagctgct gcccctgaac accgacgcct acctgagcct gcaggagctg 1440
cagggccagg accccaccca cctggtgcgc gtgaagttca gccgcagcgc cgacgccccc 1500
gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggccg ccgcgaggag 1560
tacgacgtgc tggacaagcg ccgcggccgc gaccccgaga tgggcggcaa gccccgccgc 1620
aagaaccccc aggagggcct gtacaacgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac 1680
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcgccgc cgcggcaagg gccacgacgg cctgtaccag 1740
ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac gacgcctacc gccaccaggc cctgcccccc 1800
cgcggcagcg gcgccacaaa cttctctctg ctaaagcaag caggtgatgt tgaagaaaac 1860
cccgggccta tgttccatgt ttcttttagg tatatctttg gacttcctcc cctgatcctt 1920
gttctgttgc cagtagcatc atctgattgt gatattgaag gtaaagatgg caaacaatat 1980
gagagtgttc taatggtcag catcgatcaa ttattggaca gcatgaaaga aattggtagc 2040
aattgcctga ataatgaatt taactttttt aaaagacata tctgtgatgc taataaggaa 2100
ggtatgtttt tattccgtgc tgctcgcaag ttgaggcaat ttcttaaaat gaatagcact 2160
ggtgattttg atctccactt attaaaagtt tcagaaggca caacaatact gttgaactgc 2220
actggccagg aagaaaataa atctttaaag gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc 2280
ctaaagagac tattacaaga gataaaaact tgttggaata aaattttgat gggcactaaa 2340
gaacacggca gcggcgccac aaacttctct ctgctaaagc aagcaggtga tgttgaagaa 2400
aaccccgggc ctatggccct gctactggcc ctcagcctgc tggttctctg gacttcccca 2460
gccccaactc tgagtggcac caatgatgct gaagactgct gcctgtctgt gacccagaaa 2520
cccatccctg ggtacatcgt gaggaacttc cactaccttc tcatcaagga tggctgcagg 2580
gtgcctgctg tagtgttcac cacactgagg ggccgccagc tctgtgcacc cccagaccag 2640
ccctgggtag aacgcatcat ccagagactg cagaggacct cagccaagat gaagcgccgc 2700
agcagt 2706
<210> 45
<211> 884
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-7氨基酸序列
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
50 55 60
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
65 70 75 80
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys
85 90 95
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
115 120 125
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
165 170 175
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala
195 200 205
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly
210 215 220
Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
305 310 315 320
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
325 330 335
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
370 375 380
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Pro Asn Cys Arg Asn Thr
385 390 395 400
Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser
405 410 415
Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys
420 425 430
Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu
435 440 445
Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr
450 455 460
Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu
465 470 475 480
Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
485 490 495
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
500 505 510
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
515 520 525
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
530 535 540
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
545 550 555 560
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
565 570 575
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
580 585 590
Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
595 600 605
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
610 615 620
Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu
625 630 635 640
Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile
645 650 655
Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg
660 665 670
Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe
675 680 685
Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp
705 710 715 720
Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
725 730 735
Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu
740 745 750
Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr
755 760 765
Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu
770 775 780
Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe
785 790 795 800
Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu
805 810 815
Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala
820 825 830
Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu
835 840 845
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
850 855 860
Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly
865 870 875 880
Leu Leu Lys Leu
<210> 46
<211> 2655
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码CAR-7的核苷酸序列
<400> 46
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 120
tcggatgtcg tgatgaccca gtccccactg tccctgccag tgacaccagg agagcctgca 180
tccatctctt gccggagctc ccagtctctg gtgcacagca acggcaatac ctacctgcac 240
tggtatctgc agaagccagg ccagagcccc cagctgctga tctacaaggt gtccaaccgg 300
ttctctggag tgccagaccg gttcagcggc tccggctctg gcaccgattt cacactgaag 360
atcagcaggg tggaggcaga ggacgtgggc gtgtactatt gctcccagaa tacccacgtg 420
ccccctacat ttggccaggg caccaagctg gagatcaagg gaggaggagg cagcggcgga 480
ggaggctccg gcggcggcgg ctctcaggtg cagctggtgc agtccggagc agaggtgaag 540
aagcctggag ccagcgtgaa ggtgtcctgt aaggcctctg gctacacctt cacagattat 600
gagatgcact gggtgcggca ggcacctgga cagggactgg agtggatggg cgccctggac 660
ccaaagaccg gcgatacagc ctactctcag aagtttaagg gcagggtgac cctgacagcc 720
gacgagagca cctccacagc ctatatggag ctgtctagcc tgcgcagcga ggataccgcc 780
gtgtactatt gcacccgctt ctacagttac acttattggg ggcagggcac tctggtcaca 840
gtctcttcaa ccaccacccc cgccccccgc ccccccaccc ccgcccccac catcgccagc 900
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 960
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1020
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1080
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 1140
agctgccgct tccccgagga ggaggagggc ggctgcgagc tgcccaactg ccgcaacacc 1200
ggcccctggc tgaagaaggt gctgaagtgc aacacccccg accccagcaa gttcttcagc 1260
cagctgagca gcgagcacgg cggcgacgtg cagaagtggc tgagcagccc cttccccagc 1320
agcagcttca gccccggcgg cctggccccc gagatcagcc ccctggaggt gctggagcgc 1380
gacaaggtga cccagctgct gcccctgaac accgacgcct acctgagcct gcaggagctg 1440
cagggccagg accccaccca cctggtgcgc gtgaagttca gccgcagcgc cgacgccccc 1500
gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggccg ccgcgaggag 1560
tacgacgtgc tggacaagcg ccgcggccgc gaccccgaga tgggcggcaa gccccgccgc 1620
aagaaccccc aggagggcct gtacaacgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac 1680
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcgccgc cgcggcaagg gccacgacgg cctgtaccag 1740
ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac gacgcctacc gccaccaggc cctgcccccc 1800
cgcggcagcg gcgccacaaa cttctctctg ctaaagcaag caggtgatgt tgaagaaaac 1860
cccgggccta tgatcgaaac atacaaccaa acttctcccc gatctgcggc cactggactg 1920
cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt 1980
gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat agaaggttgg acaagataga agatgaaagg 2040
aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga 2100
tccttatcct tactgaactg tgaggagatt aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat 2160
ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat 2220
cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg 2280
ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat 2340
gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga ctctattata tctatgccca agtcaccttc 2400
tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc 2460
cccggtagat tcgagagaat cttactcaga gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct 2520
tgcgggcaac aatccattca cttgggagga gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg 2580
tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg agccatggca ctggcttcac gtcctttggc 2640
ttactcaaac tctga 2655
<210> 47
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 第16位选自Ala或Ser；第70位选自Leu或Ile；第74位选自Lys或Glu；第97位选自Ala或Thr；
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Xaa
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Xaa Thr Ala Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Xaa Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 第15位选自Pro或Leu；第17位选自Pro或Asn；第41位选自Tyr或Phe；第42位选自Ile或Leu；第44位选自Lys或Arg；第50位选自Gln或Arg；第51位选自Leu或Ile；第105位选自Gly或Gln；第109位选自Val或Leu；
<400> 48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Xaa Xaa Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (37)

1.一种特异性识别GPC3靶点的抗体，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH的氨基酸序列如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPG(X1)SVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVT(X2)TAD(X3)STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC(X4)RFYSYTYWGQGTLVTVSS；其中X1选自A或S；X2选自L或I；X3选自K或E；X4选自A或T；
所述轻链可变区VL的氨基酸序列如下所示：
DVVMTQSPLSLPVT(X5)GE(X6)ASISCRSSQSLVHSNGNTYLHW(X7)(X8)Q(X9)PGQSP(X10)(X11)LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFG(X12)GTK(X13)EIK；其中X5选自P或L；X6选自P或N；X7选自Y或F；X8选自I或L；X9选自K或R；X10选自Q或R；X11选自L或I；X12选自G或Q；X13选自V或L。
2.权利要求1所述的抗体，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或8所示；和/或所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或10所示。
3.权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体包含：
1) 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；和/或
2) 氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中，所述抗体为单链抗体scFv。
5.权利要求4所述的抗体，其中，所述单链抗体scFv的重链可变区和轻链可变区由富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽链连接。
6.权利要求5所述的抗体，其中，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、6或12所示。
7.权利要求1或2所述的抗体，其中，在所述抗体的N末端添加保护肽段。
8.权利要求7所述的抗体，其中，所述保护肽段富含8-15个极性氨基酸。
9.权利要求8所述的抗体，其中，所述保护肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:14、15、16、17或18所示。
10.权利要求9所述的抗体，其中，所述保护肽段通过柔性接头肽链与所述抗体的N末端相连。
11.权利要求10所述的抗体，其中，在N末端添加了保护肽段的抗体的氨基酸序列如SEQID NO:19或21所示。
12.一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其包含权利要求1-11中任一项所述的抗体、共刺激信号域和CD3ζ信号域。
13.权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激信号域为天然的4-1BB共刺激信号域、天然的CD28共刺激信号域或改造后的4-1BB共刺激信号域；其中所述改造后的4-1BB共刺激信号域为将天然的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列中的QTTQE序列替代成FPEEE序列而获得的。
14.权利要求13所述的嵌合抗原受体，其中，所述天然的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述改造后的4-1BB共刺激信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
15.权利要求14所述的嵌合抗原受体，其中，编码所述天然的4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码所述改造后的4-1BB共刺激信号域的核苷酸序列如SEQID NO:26所示。
16.权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ信号域为天然的CD3ζ信号域或改造后的CD3ζ信号域；其中所述改造后的CD3ζ信号域为在天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列上进行以下至少一种的结构改造：
1) 将天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
2) 将天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
3) 在天然的CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ。
17.权利要求16所述的嵌合抗原受体，其中，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代。
18.权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代，同时CD3ζ信号域的C端增加氨基酸序列YXXQ。
19.权利要求16-18中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述天然的CD3ζ信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述改造后的CD3ζ信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:29或31所示。
20.权利要求19所述的嵌合抗原受体，其中，编码所述天然的CD3ζ信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码所述改造后的CD3ζ信号域的核苷酸序列如SEQ ID NO:30或32所示。
21.权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，还包含表达共刺激受体、分泌免疫检查点阻断剂、细胞因子或趋化因子、或者趋化因子受体的序列。
22.权利要求21所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2和CD226中的至少一种；和/或
所述分泌免疫检查点阻断剂选自PD-1 scFv、PD-L1 scFv和CTLA-4 scFv中的至少一种；和/或
所述细胞因子或趋化因子选自IL-2Rβ链、IL-7、IL-12、IL-15、CCL19、CCL21和CXCL10中的至少一种；和/或
所述趋化因子受体选自CXCR1、CXCR2、CXCR4、CCR2和CCR4中的至少一种。
23.权利要求22所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:33、35、37、39、41、43或45所示。
24.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-11中任一项所述的抗体或权利要求12-23中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
25.权利要求24所述的核酸分子，其中，编码所述抗体的核苷酸序列包含：
1) 编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:3所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:5所示；和/或
2) 编码所述重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:9所示；和编码所述轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID NO:11所示。
26.权利要求24或25所述的核酸分子，其中，编码所述抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、13、20或22所示。
27.权利要求24所述的核酸分子，其中，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ IDNO:34、36、38、40、42、44或46所示。
28.一种载体，其包含权利要求24所述的核酸分子。
29.权利要求28所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
30.权利要求29所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体。
31.一种细胞，其包含权利要求24所述的核酸分子或权利要求28所述的载体。
32.权利要求31所述的细胞，其中，所述细胞为自体或异体的T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润T细胞或调节性T细胞。
33.权利要求32所述的细胞，其中，所述细胞为自体或异体的T细胞。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的抗体、权利要求12-23中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求24所述的核酸分子、权利要求28所述的载体或权利要求31所述的细胞，以及可药用载体。
35.权利要求1-11中任一项所述的抗体、权利要求12-23中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求24所述的核酸分子、权利要求28所述的载体、权利要求31所述的细胞或权利要求34所述的药物组合物在制备治疗GPC3阳性疾病的药物中的用途。
36.权利要求35所述的用途，其中，所述GPC3阳性疾病为GPC3阳性肿瘤。
37.权利要求36所述的用途，其中，所述GPC3阳性疾病为肝癌。
CN202110764887.1A 2021-07-07 2021-07-07 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途 Active CN113248616B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110764887.1A CN113248616B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110764887.1A CN113248616B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113248616A true CN113248616A (zh) 2021-08-13
CN113248616B CN113248616B (zh) 2022-04-12

Family

ID=77190951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110764887.1A Active CN113248616B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113248616B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114369621A (zh) * 2021-12-07 2022-04-19 深圳市先康达生命科学有限公司 一种基因生物制剂及其制备方法和应用
WO2023024084A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种嵌合抗原受体及其用途
CN117247466A (zh) * 2023-11-20 2023-12-19 北京艺妙神州医药科技有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006006693A1 (ja) * 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
CN105001342A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 一种重组人自身抗原SSB-La
CN111057158A (zh) * 2020-03-16 2020-04-24 南京蓝盾生物科技有限公司 一种靶向人gpc3的嵌合抗原受体及其应用
CN111349174A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向gpc3嵌合抗原受体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006006693A1 (ja) * 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
CN111925445A (zh) * 2004-07-09 2020-11-13 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
CN105001342A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 广州天宝颂原生物科技开发有限公司 一种重组人自身抗原SSB-La
CN111349174A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向gpc3嵌合抗原受体
CN111057158A (zh) * 2020-03-16 2020-04-24 南京蓝盾生物科技有限公司 一种靶向人gpc3的嵌合抗原受体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T.ZHANG: "Phase I dose escalating trail of GPC3-targeted CAR-T cells by intratumor injection for Advanced Hepatocellular carcinoma", 《CYTOTHERAPY》 *
唐凌峰: "嵌合抗原受体修饰T 细胞治疗肝细胞癌研究进展", 《山东医药》 *
龚非力主编: "《基础免疫学》", 30 October 1998, 湖北科学技术出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023024084A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种嵌合抗原受体及其用途
CN114369621A (zh) * 2021-12-07 2022-04-19 深圳市先康达生命科学有限公司 一种基因生物制剂及其制备方法和应用
CN114369621B (zh) * 2021-12-07 2023-10-31 深圳市先康达生命科学有限公司 一种基因生物制剂及其制备方法和应用
CN117247466A (zh) * 2023-11-20 2023-12-19 北京艺妙神州医药科技有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN113248616B (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112300269B (zh) Kras突变特异性t细胞受体筛选及抗肿瘤用途
CN108715859B (zh) 靶向cd22的嵌合抗原受体及其应用
CN113248616B (zh) 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途
CN106755107B (zh) 一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用
CN112469829B (zh) 包含抗gpc3单链抗体的car
CN109562126A (zh) 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
EP3882276A1 (en) Bispecific antibody, preparation method therefor and application thereof
CN107033248B (zh) 识别癌胚抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN109266667B (zh) 靶向cd5的嵌合抗原受体及其应用
CN107365798B (zh) 一种携带iCasp9自杀基因的CD19-CAR-T细胞及其应用
CN111944054B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
KR20200131279A (ko) 종양 특이적 t 세포 면역요법을 위한 il-13 수용체 알파 2 (il13ra2) 키메라 항원 수용체
CN108864307A (zh) 信号肽优化靶向cd19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的t细胞及制备方法和应用
CN111944053B (zh) 抗bcma的car及其表达载体和应用
CN112646033A (zh) 靶向cd123的嵌合抗原受体及其用途
CN110305847B (zh) 一种用于治疗肿瘤的基因工程细胞
CN112442508B (zh) 靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116120465B (zh) 一种靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体及其应用
CN113195526A (zh) 针对过继性t细胞疗法中的突变myd88l265p蛋白表位的特异性t细胞受体
CN114163538B (zh) 同时靶向gpc3和cd276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110964112B (zh) 增强抗psca嵌合抗原受体活性的人源化抗体及其应用
CN113789304A (zh) 高亲和力tcr及其应用
CN116063569B (zh) Epha2嵌合抗原受体及其用途
CN116239692B (zh) 分离的抗体、包含该抗体的car及其用途
CN115466331B (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant