CN108034669B - 一种抗vegf基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用 - Google Patents

一种抗vegf基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用，该基因由导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子依序串联组成。本发明中修饰的T细胞增殖速度快、具有识别肿瘤的机制、杀瘤谱广、典型的个性化生物治疗模型。

Description

一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用。
背景技术
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。它由某些肿瘤细胞分泌，通过与血管内皮上的相应受体结合促进内皮细胞增殖，同时可增加血管通透性使内皮细胞迁移，诱导肿瘤血管生成，维持肿瘤的继续生长，是目前发现的最强烈的血管生成因子，与诸多生理及病理过程有关。
人VEGF基因定位于染色体6p21.3，为单一基因，全长14kb，由8个外显子、7个内显子组成。编码产物为34～45kD的同源二聚体糖蛋白。VEGF介导了许多生理性和病理性的血管生成,在组织血管增生时,其表达也增强。胚胎发育的组织处于分化状态下的细胞其表达高于成年和已分化完全的细胞。生理状态下，VEGF可高水平地表达于胎盘,许多胚胎组织和一些有生理性血管增生的成人正常组织(如增生期子宫内膜)。此外,在动物和成人的正常肾小球细胞、心肌细胞、前列腺上皮、精液及肾上腺皮质和肺的某些上皮细胞也有低水平表达。病理状态下，在愈合中的皮肤伤口、银屑病、迟发性过敏反应、类风湿性关节炎的滑膜层细胞中均有VEGF的过度表达。
由于VEGF能够为肿瘤提供营养，维持肿瘤继续增长，所以VEGF成为治疗实体瘤的重要靶点。因此，开发一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和医用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种抗VEGF基因，其基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗VEGF基因(又称AntiVEGF-CD3融合基因)由导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子依序串联组成；其中，所述共刺激分子包括4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区的共刺激分子。
本发明中，作为优选的技术方案，所述
导引子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
VEGF抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
CD3抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
CD8Hinge区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
CD8跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
4-1BB胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
CD3ζ胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
第二方面，本发明提供了利用所述抗VEGF基因修饰的T细胞，所述T细胞为单核细胞诱导的异质T细胞，且经过携带有所述抗VEGF基因的慢病毒感染得到。
第三方面，本发明提供了该T细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)将导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3；
2)取外周血，分离外周血单个核细胞；用重组干扰素α2a的培养基诱导培养后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和同体血浆诱导继续培养；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该异质T细胞待病毒感染；
3)复苏293T细胞，步骤1)得到的重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3与慢病毒包装质粒采用脂质体转染法转染293T细胞，获得pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒；
4)将步骤3)得到的所述pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒感染步骤2)制得的异质T细胞，获得抗VEGF基因修饰的T细胞(高效性抗VEGF嵌合抗原受体修饰的T细胞)。
第四方面，本发明提供了该T细胞的应用。高效性抗VEGF嵌合抗原受体修饰的T细胞，在空间上缩短T细胞和肿瘤细胞的距离，在数量上增加T细胞的密度，达到高效的肿瘤杀伤效果，因此，该T细胞在制备治疗肿瘤药物中能够获得有效的应用。该T细胞尤其对肝癌细胞系HepG2具有较强杀伤率，因此在制备治疗肝癌的药物中能够得到应用。在应用时，可以将其制备成试剂盒或其他医学上可以接受的形式。
本发明中，作为优选的技术方案，应用时，所述T细胞采用患者自体的T细胞；所用T细胞的数量为0.5×106-1×109/kg。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
由于VEGF能够为肿瘤提供营养，维持肿瘤继续增长，所以VEGF成为治疗实体瘤的重要靶点。为此，本发明利用第二代CAR-T细胞技术修饰的T细胞来治疗肿瘤。CAR修饰的T细胞治疗肿瘤，是一种利用人体自身或者直系亲属外周血分离得到T细胞，并对其修饰，使其能够识别肿瘤细胞进行精准杀伤的治疗手段。相对于目前临床使用的放疗、化疗而言，具有毒副作用小的特点。CAR-T细胞技术是利用回输的T细胞能特异性的结合肿瘤细胞，并对肿瘤细胞进行杀伤的一种技术。为了调动患者自身的T细胞，本发明在原有的CAR基础上进行了创新，可提高T细胞的杀伤效率。
本发明所述的CAR-AntiVEGF-CD3，高效性嵌合抗原受体是由VEGF抗原结合区和CD3抗原结合区构成。由于T细胞本身含有CD3抗原，修饰后的T细胞中含有CD3抗体，CD3抗体与抗原结合，在空间上缩短T细胞和肿瘤细胞的距离，在数量上增加T细胞的密度，达到高效的肿瘤杀伤效果。同时VEGF抗原结合区可与肿瘤细胞上的VEGF抗原结合，会导致多个T细胞攻击肿瘤细胞，增强杀伤肿瘤效果，具有高效性。
本发明中修饰的T细胞增殖速度快、具有识别肿瘤的机制、杀瘤谱广、典型的个性化生物治疗模型。
附图说明
图1为本发明所述的嵌合抗原受体AntiVEGF-CD3的融合基因片段的设计图。
图2为本发明所述的嵌合抗原受体AntiVEGF的基因片段的设计图。
图3为本发明所述的慢病毒表达质粒pLent-AntiVEGF-CD3的示意图。
图4为本发明所述的慢病毒表达质粒pLent-AntiVEGF的示意图。
图5为本发明所述的流式细胞术检测pLent-AntiVEGF-CD3感染T细胞的效率图(左为流式峰图，右为散点图)。
图6为本发明所述的流式细胞术检测pLent-AntiVEGF感染T细胞的效率(左为流式峰图，右为散点图)。
图7为本发明中CAR-T细胞对肝癌细胞系HepG2杀伤率图。
图8为本发明中CAR-T细胞对C3H小鼠肿瘤生长的抑制效率图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
一种抗VEGF基因，其基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，所述抗VEGF基因(又称AntiVEGF-CD3融合基因)由导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子依序串联组成；其中，所述共刺激分子包括4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区的共刺激分子(如图1所示)。
其中，AntiVEGF-CD3融合基因的各模块序列如下：
(1)导引子Leader(SEQ ID NO.2)
(2)VEGF抗原结合区(SEQ ID NO.3)
(3)CD3抗原结合区(SEQ ID NO.4)
(4)CD8Hinge区(SEQ ID NO.5)
(5)CD8跨膜区(SEQ ID NO.6)
(6)4-1BB胞内区(SEQ ID NO.7)
(7)CD3ζ胞内区(SEQ ID NO.8)
pLent-AntiVEGF-CD3载体的构建方法如下：
分别按照上述从(1)-(7)的顺序委托北京博迈德基因技术有限公司合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体(购自Vigene公司)BamHI-NotI位点(见图1)，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3。
同时构建不含(3)序列的载体作为对照组，载体为pLent-AntiVEGF(见图2)。
实施例2
利用所述抗VEGF基因修饰的T细胞，所述T细胞为单核细胞诱导的异质T细胞，且经过携带有所述抗VEGF基因的慢病毒感染得到。
pLent-AntiVEGF-CD3修饰T细胞的制备
1)将导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3，更详细的说，是采用实施例1的方法构建重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3；
2)异质性T细胞的制备
取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
3)慢病毒包装
复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。重组质粒pLent-AntiVEGF-CD3与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G采用脂质体转染法转染293T细胞。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化。72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存，获得pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒(如图3)；
4)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
用上述慢病毒感染T细胞。从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺(购自Sigma公司)加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒，得到pLent-AntiVEGF-CD3修饰T细胞，将该T细胞进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达。
实施例3
pLent-AntiVEGF修饰的T细胞的制备
1)采用实施例1的方法构建不含(3)序列的载体作为对照组，载体为pLent-AntiVEGF；
2)异质性T细胞的制备
取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
3)慢病毒包装
复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。重组质粒pLent-AntiVEGF与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G采用脂质体转染法转染293T细胞。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化。72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存，获得pLent-AntiVEGF慢病毒(如图4)；
4)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
用上述慢病毒感染T细胞。从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺(购自Sigma公司)加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒，得到pLent-AntiVEGF修饰的T细胞，得到的T细胞进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达。
实施例4
空载质粒pLent-C-GFP修饰的T细胞的制备
1)异质性T细胞的制备
取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该T细胞待病毒感染。
2)慢病毒包装
复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。空载质粒pLent-C-GFP与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G采用脂质体转染法转染293T细胞。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化。72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存，获得pLent-C-GFP慢病毒；
4)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
用上述慢病毒感染T细胞。从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺(购自Sigma公司)加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个上述诱导的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒，得到空载质粒pLent-C-GFP修饰的T细胞，将该T细胞进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达。
对实施例2-4的结果检测结果如图5、图6，以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，重组pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒感染T细胞其阳性率46.7％，pLent-VEGF慢病毒感染T细胞其阳性率为40.0％，空载慢病毒感染T细胞其阳性率为48.75％。
实施例5
CAR-T细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤活性研究
体外毒性实验使用的材料如下：
以肝细胞癌细胞系HepG2作为靶细胞，效应细胞为如实施例2-4所验证的体外培养15天的FACS检测嵌合抗原受体表达的阳性细胞记为嵌合抗原受体阳性(CAR+)的T细胞。
效靶比视情况分别为10:1，3:1，1:1和1:3，靶细胞数量为1×104/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为细胞混合后4-6h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T细胞，
对照组1：靶细胞最大释放LDH，需加入一定体积的细胞裂解液；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
对照组4：空白培养基的背景；
对照组5：体积校准的背景，空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。
检测方法：采用
Figure BDA0001472373510000092
非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照
Figure BDA0001472373510000093
非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
Figure BDA0001472373510000091
实验结果表明：
具体如图7所示，本发明的表达嵌合抗原受体pLent-AntiVEGF-CD3的T细胞和pLent-AntiVEGF的T细胞对肝癌细胞系HepG2均表现出显著的特异性细胞毒性作用，但是前者的细胞毒性作用要高于后者，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。其中pLent-AntiVEGF-CD3在效靶比10:1时对肝癌细胞HepG2的细胞毒性高达95％，而pLent-AntiVEGF对肝癌细胞HepG2的细胞毒性为24.5％。
效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的表达嵌合抗原受体pLent-AntiVEGF-CD3的T细胞对肝癌细胞HepG2的特异性细胞毒性作用。
实施例6
CAR-T细胞对C3H小鼠肿瘤生长抑制作用
18-22g雄性C3H小鼠(购自沈阳蓝谱达斯实验用品科技有限公司)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的肝癌细胞HepG2细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL肝癌细胞HepG2细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
C3H肝癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成5组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只正常T细胞；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只空载感染的T细胞；
d.治疗三组，尾部静脉注射2×106个细胞/只pLent-AntiVEGF修饰的T细胞。
e.治疗四组，尾部静脉注射2×106个细胞/只pLent-AntiVEGF-CD3修饰的T细胞。
每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图8所示。从第一次免疫pLent-AntiVEGF-CD3修饰的T细胞起10天内，80％小鼠几乎触摸不到肿瘤。同时从第一次免疫pLent-AntiVEGF修饰的T细胞起10天内，21.3％的小鼠几乎触摸不到肿瘤。说明本发明中的嵌合抗原受体pLent-AntiVEGF-CD3具有高效性。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Figure IDA0001472373560000011
Figure IDA0001472373560000021
Figure IDA0001472373560000031

Claims (7)

1.一种抗VEGF基因，其特征在于：该基因由导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子依序串联组成；
所述共刺激分子包括4-1BB胞内区和 CD3ζ胞内区的共刺激分子；
导引子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
VEGF抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；
CD3抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；
CD8Hinge区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；
CD8跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示；
4-1BB胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；
CD3ζ胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的抗VEGF基因，其特征在于：其基因片段为序列表 SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
3.利用如权利要求2所述抗VEGF基因修饰的T细胞，其特征在于：所述T细胞为单核细胞诱导的异质T细胞，且经过携带有所述抗VEGF基因的慢病毒感染得到。
4.根据权利要求3所述的T细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3；
2)取外周血，分离外周血单个核细胞；用重组干扰素α2a的培养基诱导培养后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和同体血浆诱导继续培养；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+阳性率> 80％，CD3+CD56+双阳性率> 20％，视为T细胞诱导成功，并留取该异质T细胞待病毒感染；
3)复苏293T细胞，步骤1)得到的重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3与慢病毒包装质粒采用脂质体转染法转染293T细胞，获得pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒；
4)将步骤3)得到的所述pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒感染步骤2)制得的异质T细胞，获得抗VEGF基因修饰的T细胞。
5.如权利要求3所述的T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备治疗肝癌的药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所用T细胞的数量为0.5×106-1×109/kg。
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