CN101683518B - Fhl1在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及FHL1在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。具体地说,本发明涉及FHL1在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途,以及FHL1在制备用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物中的用途。本发明还涉及一种含有编码FHL1的核苷酸序列的表达载体,以及所述表达载体在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途,和表达载体在制备用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物中的用途。本发明的表达载体能够有效抑制多种人类肿瘤细胞的生长,并且可以通过调节癌基因和抑癌基因的表达从而抑制多种人类肿瘤细胞的生长。
Description
技术领域
本发明涉及四个半LIM结构域蛋白的新医药用途,具体涉及四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
四个半LIM结构域蛋白(Four and a Half LIM domains protein,下文简称FHL)家族属于LIM超家族,其家族成员由4个半LIM结构域组成。LIM结构域由约50个氨基酸组成,富含半胱氨酸,形成2个锌指结构。LIM结构域介导许多蛋白与蛋白之间的相互作用,调节细胞骨架蛋白、酶以及转录因子的作用。已经发现FHL家族有5个成员,它们分别是FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5/ACT。FHL成员的表达具有组织特异性,FHL1、FHL2和FHL3主要在骨骼肌和心肌中表达,FHL4和FHL5/ACT主要在睾丸中表达。现已发现,FHL家族的功能主要表现在三个方面:第一方面,FHL家族蛋白在肌细胞的生长及分化过程具有重要作用;第二方面,FHL家族的成员可作为转录因子的辅助因子发挥作用;以及第三方面,FHL家族成员可能在肿瘤的发生发展中也具有重要功能。
肿瘤是一类严重危害人类生命健康的常见疾病。在西医领域,目前肿瘤治疗的传统模式主要有:手术治疗、化学治疗、放射治疗和生物学治疗。基因治疗是近年发展起来的一类新治疗方法,基因治疗的主要理论依据是基于肿瘤是一类“多基因病”,目前认为肿瘤的基本发病机理是由于基因表达调控异常、生长因子分泌功能失常、信号传导异常、使细胞发生恶性增殖而发生的。因此,从理论上分析,从基因水平调控细胞的基因表达过程是治疗肿瘤较为理想的手段和途径。近年来随着基因工程的飞速发展,基因治疗法已经开始用于肿瘤的治疗。但是,即便如此,临床上仍然需要安全、有效的肿瘤治疗的新方案。
虽然已有报道FHL1在多种人类肿瘤中表达水平下降,但FHL1是否能抑制人类肿瘤细胞的生长及如何调节这种生长的分子机理并不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供FHL1在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明人在研究中令人意外地发现,FHL1可以调节癌基因和抑癌基因在生物体内的表达,并由此进一步抑制哺乳动物特别是人类的肿瘤细胞的生长,为肿瘤的临床治疗提供了一种全新的有益方案。基于该发现,本发明人完成了本发明。
一方面,本发明提供了FHL1在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途。
基于本发明第一方面的用途,本发明第二方面提供了FHL1在制备用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物中的用途。
本发明第三方面提供了一种表达载体,其含有编码FHL1的核苷酸序列。进一步的,所述的载体是质粒或病毒。更进一步的,所述的病毒是腺病毒。
本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的表达载体在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途。
本发明第五方面提供了本发明第三方面所述的表达载体在制备用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物中的用途。
下面进一步详细地描述本发明。
本发明第一方面提供了FHL1在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途。
本发明所述的FHL1是一种已知的蛋白质,英文全称为:four anda half LIM domains1,其在NCBI(美国国立生物技术信息中心)给定的基因编号为2273。FHL1可以通过多种途径获得,例如用PCR方法从乳腺cDNA文库(Clontech,USA)中扩增含280个氨基酸的完整编码区FHL1cDNA序列。
另外,如本文使用的,术语“癌基因”是指其编码的产物与细胞的肿瘤性转化有关的基因,它能促进细胞的生长和转化。如本文使用的,术语“抑癌基因”是癌基因的反义词,其正常功能是抑制细胞生长和肿瘤发生。
通过本发明人的深入研究,发现FHL1可以调节哺乳动物细胞内癌基因的表达,和/或可以调节哺乳动物细胞内抑癌基因的表达。更具体地说,本发明人发现FHL1可以抑制哺乳动物细胞内癌基因的表达,和/或可以促进哺乳动物细胞内抑癌基因的表达。所述的哺乳动物细胞可以是来自哺乳动物任何组织或器官的细胞。进一步地,所述哺乳动物细胞包括但不限于来自以下组织或器官的细胞:乳腺、肝脏、肺脏、胃、前列腺、肠、肾、子宫、卵巢、皮肤。更进一步地,所述哺乳动物细胞包括但不限于来自以下组织或器官的细胞:乳腺、肝脏、肺脏、胃。另一方面,所述的哺乳动物细胞可以是在体细胞,也可以是离体细胞,虽然本发明是通过采用离体细胞进行试验发现的这些结果,但是,本领域技术人员清楚,通过本发明的方案和结果可以容易在哺乳动物的在体细胞中获得同样结果。此外,基于本发明的产业用途,所述的哺乳动物细胞优选是哺乳动物的在体细胞。这些发现是实现本发明的基础。
基于本发明第一方面的用途,本发明第二方面提供了FHL1在制备用于抑制哺乳动物肿瘤和/或癌细胞生长的药物中的用途。
用于本文的术语“肿瘤,,和“癌”,其含义和两者关系是本领域技术人员公知的,并且二者在许多情况下可以互换使用。所述的肿瘤和/或癌可以是医学上已知的任何肿瘤,包括恶性肿瘤和/或癌症。优选地,所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)包括,但不限于:
恶性肿瘤,包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、卵巢癌、胃癌、子宫颈癌、前列腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌);
中枢和周围神经系统的肿瘤,包括但不限于星形细胞瘤和神经胶质瘤;以及
其他肿瘤,包括但不限于黑素瘤。
更优选地,所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌和皮肤癌。
更进一步优选地,所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌。
根据本发明的第二方面,所述的哺乳动物的肿瘤和/或癌细胞可以是在体细胞,也可以是离体细胞,虽然本发明采用了离体细胞进行试验,但是,本领域技术人员清楚,通过本发明的方案和结果可以容易在哺乳动物的在体细胞中获得同样结果。此外,基于本发明的产业用途,所述的哺乳动物的肿瘤和/或癌细胞优选是罹患肿瘤和/或癌症的哺乳动物的在体细胞。
用于本文的术语“哺乳动物”是指罹患本发明所述肿瘤和/或癌症的受试者,其包括但不限于猪、狗、猫、牛、羊等家畜和人类。优选地,所述的哺乳动物是人类。
本发明第三方面提供了一种表达载体,其含有编码FHL1的核苷酸序列。进一步的,所述的载体包括但不限于可以作为表达载体使用的任何质粒、病毒和噬菌体。优选的,所述的载体是质粒和病毒。更进一步的,所述的病毒可以是本领域已知的可用作载体的病毒,优选的,所述的病毒是腺病毒。
本文所述的术语“表达载体”,其含义是本领域技术人员公知的,并且通常是指含有一个启动子顺序,能有效地促使插入的目的基因进行转录,进而翻译出该插入基因编码的蛋白产物的载体。
本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的表达载体在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途。所述的表达载体可以作为所述药物的一种组成部分。
本发明第五方面提供了本发明第三方面所述的表达载体在制备用于抑制哺乳动物肿瘤细胞生长的药物中的用途。所述的表达载体可以作为所述药物的一种组成部分。
根据本发明,含有FHL1的药物,或者含有编码FHL1的核苷酸序列的表达载体的药物,其可以通过本领域已知的任何途径给予有治疗需求的受试者,例如哺乳动物特别是人类。所述的给药途径包括但不限于:全身给药、皮肤局部给药、病灶区局部给药等。特别地,所述的给药途径包括但不限于:静脉内、动脉内、肌内、经口、经皮、腹膜内、肿瘤病灶区、经肺吸入或吹入、胃肠外、经粘膜、经鼻、经直肠。更特别地,所述的给药途径包括但不限于:静脉内和肿瘤病灶区。例如,非限制性地,根据本发明的含有FHL1的药物或者含有编码FHL1的核苷酸序列的表达载体的药物,其可通过肿瘤病灶区局部注射或者通过静脉注射给药。具体而言,可以参考有关重组质粒和腺病毒的本领域公知的给药方式给予有治疗需求的受试者,例如参考Clayman GL et al.J Clin Oncol,1998,16:2221-2232和Martin B et al.Cancer Res,1999,59:1391-1399中的方法通过肿瘤部位局部注射给药,或者参考Reid T et al.Cancer Gene Ther,2002,9:979-986中的方法通过静脉注射给药。以上文献以其全部内容通过引用并入本文。
根据本发明,所述的药物可以是本领域公知的任何可用于给药的药物形式,包括药物组合物、药物制剂等。具体地说,例如是用于局部给药的制剂例如栓剂、软膏剂、乳膏剂等;例如是用于胃肠外给药的制剂,例如局部注射用制剂和全身注射用制剂,具体剂型可以例如是注射用溶液剂、注射用粉针剂等。对于本发明的实施而言,本发明的药物优选是用于胃肠外给药的制剂,包括但不限于局部注射用制剂和全身注射用制剂,具体剂型包括但不限于注射用溶液剂和注射用粉针剂。更优选的,所述的药物是无菌的注射用含水溶液剂,或者是无菌的用于临床使用前用注射用水复溶配制的粉针剂,特别是冷冻干燥粉针剂。
另外,根据下文中提供的研究结果,本领域技术人员可以容易地确定在哺乳动物中使用时有效剂量。通常,治疗有效量按受试者的体重计,例如可以是1×109至1×1014VP/kg体重/天,优选1×1010至1×1013VP/kg体重/天,更优选1×1011至1×1012VP/kg体重/天。所述剂量单位中的“VP”是指病毒颗粒数(Viral Particle)的缩写。可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者,也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔给药。所述小剂量可以配制成单元剂量形式,例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然,也可以以一定的时间周期给药,例如一天给药一次、两天给药一次、一周给药一次、一月给药一次等。
另一方面,本发明提供的药物在具体的临床案例中,它们的具体使用量可因多种因素而可能需要作相应的变化,这些因素包括但不限于:受试者病况的严重程度,受试者的年龄、性别、体重,给药途径,药物剂型等等。
根据本发明的研究结果,已经发现,通过载体特别是腺病毒获得的FHL1表达载体能够有效抑制多种人类肿瘤细胞的生长,并且可以通过调节癌基因和抑癌基因的表达从而抑制多种人类肿瘤细胞的生长。
附图说明
图1显示FHL1哺乳动物细胞表达载体酶切鉴定结果,其中:1为DNA标记物;2为pcDNA3;3为pcDNA3-FHL1。
图2显示FHL1重组腺病毒载体酶切鉴定结果,其中:1为DNA标记物;2为pAdeasy-1;3为pAdeasy-FHL1。
图3显示FHL1重组腺病毒感染ZR75-1细胞后高表达FHL1,其中:1为pAdeasy-1;2为pAdeasy-FHL1。
图4显示FHL1重组腺病毒感染肿瘤细胞可抑制该肿瘤细胞的生长,其中:A为HepG2;B为MCF-7;C为Calu-3。
图5显示FHL1重组腺病毒感染HepG2细胞抑制其集落形成,其中:A为集落形成图;B为集落形成数比较图。
图6显示FHL1重组腺病毒注射能抑制肝癌细胞株HepG2植入的肿瘤生长。
图7显示FHL1重组腺病毒注射的瘤块中高表达FHL1蛋白,其中:1为pAdeasy-1;2为pAdeasy-FHL1。
图8显示FHL1重组腺病毒感染HepG2使细胞周期停滞在G1期,其中:1为pAdeasy-1;2为pAdeasy-FHL1。
图9显示FHL1重组腺病毒感染HepG2细胞影响癌基因及抑癌基因的表达,其中:1为pAdeasy-1;2为pAdeasy-FHL1。
图10显示FHL1重组腺病毒注射的瘤块中影响癌基因及抑癌基因的表达,其中:1、pAdeasy-1;2、pAdeasy-FHL1。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚,在下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1、FHL1哺乳动物细胞表达载体和FHL1重组腺病毒载体
(一)、方法
1、FHL1哺乳动物细胞表达载体的构建
按常规方法从乳腺cDNA文库(购自美国Clontech公司)中PCR扩增FHL1基因的完整编码区序列,PCR引物为:5′-GGGGTACCATGGCGGAGAAGTTTGA-3′和5′-GCTCTAGATTACAGCTTTTTGGCACAG-3′,PCR反应条件为:94℃5min后,94℃1min,60℃1min,72℃1min进行30次循环,最后72℃7min。分别用Kpn I和Xba I酶(购自英国Biolabs公司)在37℃下酶切PCR产物和相应哺乳动物细胞表达载体(pcDNA3,购自美国Invitrogen公司),酶切后的PCR产物和载体用T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)在12-16℃下进行连接,得到重组载体(其含有CMV启动子/增强子、FHL1基因的完整编码区序列、BGH polyA终止信号、氨苄青霉素抗性基因),将该重组载体转化大肠杆菌DH5α,获得转化子。提取重组载体,用Kpn I和Xba I酶酶切鉴定重组载体;DNA序列测定确定FHL1基因的完整编码序列是否完全正确;Western印迹分析重组FHL1蛋白是否表达,即用常规方法将蛋白进行SDS-PAGE后,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,用兔抗人FHL1抗体(购自美国ProteinTech公司)进行反应,然后用羊抗兔IgG抗体(购自美国Santa Cruz Biotech公司)进行反应和显色。
FHL1是本领域已知的。其中,FHL1基因的完整编码区DNA序列以及FHL1基因编码的氨基酸序列参见下文序列表部分的描述。
2、FHL1重组腺病毒表达载体的构建
按常规方法PCR扩增FHL1基因的完整编码区序列,PCR引物为:5′-GGGGTACCATGGCGGAGAAGTTTGA-3′和5′-CCGCTCGAGTTACAGCTTTTTGGCACAG-3′,PCR反应条件为:94℃5min后,94℃1min,60℃1min,72℃1min进行30次循环,最后72℃7min。分别用Kpn I和Xbo I酶(购自英国Biolabs公司)在37℃下分别酶切PCR产物和相应腺病毒表达载体(pShuttle-CMV,购自美国Stratagene公司),酶切后的PCR产物和载体用T4DNA连接酶(购自美国Promega公司)在12-16℃下进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,获得转化子。提取重组载体,用Kpn I和Xbo I酶酶切鉴定重组质粒是否构建成功;DNA序列测定确定FHL1基因的完整编码序列是否完全正确;Western印迹分析重组FHL1蛋白是否表达。
获得上述重组质粒后,用PmeI(购自英国Biolabs公司)在37℃下酶切含有FHL1基因完整编码序列的pShuttle-CMV载体,切胶回收线性化的片段,回收产物常规转化含有pAdEasy-1的BJ5183细胞(购自美国Stratagene公司),涂卡那平板,37℃孵育16-20小时。观察卡那平板,长出大、小两种菌落,挑取较小的5个菌落于卡那抗性的培养基中,37℃,200rpm摇床中过夜,提取质粒,PacI(购自英国Biolabs公司)在37℃下酶切,0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定,含有3.0kb或4.5kb大小片段的即表明重组成功。由于BJ5183细胞目的载体产量较低,故将成功重组的载体常规转化XL-10Gold感受态细胞(购自美国Stratagene公司)以扩增载体,涂卡那平板,37℃孵育16-20小时,挑取单克隆,所得菌液即为高扩增目的载体的XL-10Gold细胞。
3、FHL1重组腺病毒载体的包装和鉴定
PacI(购自英国Biolabs公司)酶切重组好的腺病毒载体以暴露出pShuttle-CMV载体上的左右末端重复序列(ITR),等体积酚:氯仿抽提以去除酶等杂质,用乙醇沉淀回收DNA,测定浓度后,按公司提供的说明书用转染试剂lipofectamine2000(购自美国Invitrogen公司)转染AD293细胞(AD293细胞是购自美国Stratagene公司的一种哺乳动物细胞株,由HEK293细胞衍生而来,用常规细胞培养基培养,贴壁能力强,用于产生感染性病毒颗粒),转染前一天将AD293细胞接种至24孔板,转染时细胞密度为70-80%,转染后4-6小时换成5%血清的培养基,继续培养7-10天,每3-4天更换一次培养基,直到出现明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),即细胞肿胀、变圆、漂浮。继续培养,待完全CPE时收获病毒:轻轻吹打使细胞脱壁,将细胞和上清一并收集于EP管中,在-80℃和37℃之间反复冻融3次以释放病毒,2500rpm离心15分钟以去除细胞碎片和杂质,将上清转移至新的EP管中,作为种子病毒存于-80℃备用。同时,快速CPE法测定种子病毒液的感染滴度,具体方法如下:将AD293细胞接种于24孔板,培养24小时,细胞密度达到90%时,细胞数为5×105细胞/孔,将各孔中的培养液吸出,每孔加入0.5ml的101至109倍稀释的病毒液(用完全培养基稀释),2小时后换成正常的培养基,培养48小时后观察CPE情况,选出发生100%CPE的最高稀释倍数,用以下公式计算病毒滴度:
取上述病毒液感染ZR75-1等乳腺癌细胞,感染强度(multiplicityof infection,简写为MOI)为50个噬斑形成单位(plaque forming unit,简写为pfu)/细胞,前一天将细胞接种于24孔板,感染时细胞密度为80-90%,感染后2小时换成无病毒的新鲜培养基,48小时后收集细胞,用兔抗人FHL1的特异性抗体(购自美国ProteinTech公司)Western免疫印迹方法检测FHL1基因的表达情况。表达成功后进行下一步的扩增与纯化。
4、FHL1重组腺病毒载体的扩增与纯化
将AD293细胞接种于15cm平皿,待细胞密度达到80-90%时,加入病毒液,MOI为2-5pfu/细胞。感染48小时左右细胞出现明显CPE时,弃上清,用细胞刮轻轻刮下细胞冻存于-80℃。累积到50-60个平皿时统一纯化病毒。
将收集的AD293细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次,2500rpm离心15分钟去除细胞碎片。配制CsCl密度梯度溶液:取30g的CsCl,加PBS(每升水溶液中含NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.4g,pH7.4)至终体积42.5ml,得密度为1.5g/ml的CsCl溶液;取15ml1.5g/ml的CsCl,加PBS至终体积21ml,得密度为1.35g/ml的CsCl溶液;取11ml的1.5g/ml的CsCl,加PBS至终体积20ml,得密度为1.25g/ml的CsCl溶液。依次将0.5ml的1.5g/ml的CsCl溶液、2.5ml的1.35g/ml的CsCl溶液、2.5ml的1.25g/ml的CsCl溶液加入到12ml超速离心管中,将待纯化病毒液加于各管CsCl梯度液上,35000rpm,10℃,离心1.5小时,在1.35g/ml的CsCl溶液和1.25g/ml的CsCl溶液之间可观察到白色雾状病毒带,收集病毒带,并与1.35g/ml的CsCl溶液混合,35000rpm,10℃,离心5.5小时,进一步纯化病毒,以Hanks液为透析液在4℃下透析病毒,每2小时更换一次透析液,共更换5次,取出纯化的病毒液,即含有FHL1重组腺病毒载体的溶液,加无菌甘油至终浓度为10%,分份包装,在-70℃下保存。
5、FHL1重组腺病毒纯度和滴度的测定
取24μl纯化的病毒,加入84μl的PBS和12μl的10%SDS,混匀,以108μl的PBS加12μl的0%SDS为空白对照,测定260nm和280nm波长处的光吸收值,即OD260nm和OD280nm值,据此估算病毒的纯度。病毒的纯度=OD260nm值/OD280nm值,该比值>1.3时,表明病毒纯度较高。然后计算病毒颗粒滴度(VP/ml)。以1个OD260nm值相当于1.1×1012病毒颗粒(VP)计算病毒颗粒滴度。病毒颗粒滴度(VP/ml)=OD260nm值×1.1×1012×稀释倍数。
有限稀释法测定病毒的感染滴度(IU/ml):取10μl纯化的病毒,加至990μl含有5%FBS的DMEM培养基中(102稀释),混匀后取出100μl,稀释于900μl含有5%FBS的DMEM培养基中(103稀释),以此类推直到1012稀释。同时将AD293细胞接种于96孔板,50μl/孔,细胞数为1×104细胞/孔。然后加入50μl的105至1012稀释的病毒液,共做8个稀释梯度,每个梯度做10个复孔。感染后第10至12天观察CPE,计数发生CPE的最高稀释倍数下的CPE孔数,根据以下公式计算病毒的感染滴度:
6、哺乳动物细胞的转染
在HEK293细胞(HEK293细胞是购自美国ATCC细胞库的一种永生化的人胚肾细胞,用常规细胞培养基培养,贴壁能力差)转染前24h,用含10%新生牛血清的DMEM培养基将细胞接种在细胞培养皿中。接种细胞密度以转染时细胞密度达90%为宜。按公司提供的说明书用细胞转染试剂Lipofectamine2000(购自美国Invitrogen公司)进行转染。
7、Western免疫印迹分析
(1)SDS-PAGE电泳:将变性的细胞总蛋白离心后以每孔20μg的总蛋白进行SDS-PAGE电泳;电压120V,约1.5h。
(2)转膜:电泳结束后,将蛋白转移至硝酸纤维素膜上;电压15V,转移约2h。
(3)封闭:5%脱脂奶粉(用TBST溶液配制,TBST溶液为每升水溶液中含Tris2.42g、NaCl8g、Tween-2010ml,pH7.6)室温封闭硝酸纤维素膜1h或4℃封闭过夜。
(4)一抗结合:在硝酸纤维素膜上,加入用5%脱脂奶粉按一定比例稀释的一抗(兔抗人FHL1抗体,购自美国ProteinTech公司),室温轻摇1h,TBST溶液洗膜3次,每次7min。
(5)二抗结合:在硝酸纤维素膜上,加入用5%脱脂奶粉按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的IgG(羊抗兔IgG抗体,购自美国Santa Cruz Biotech公司),室温轻摇1h,TBST溶液洗膜3次,每次7min。
(6)显影:按公司提供的说明(美国Pierce公司),用化学发光法显色5min,压片显影。
(二)结果
1、FHL1哺乳动物细胞表达载体和FHL1重组腺病毒载体的鉴定
FHL1哺乳动物细胞表达载体和FHL1重组腺病毒载体经酶切、DNA序列测定表明,插入到载体中的FHL1基因的完整编码区序列完全正确,即FHL1哺乳动物细胞表达载体(pcDNA3-FHL1)经KpnI和XbaI酶切后,可切出大小约840bp的FHL1完整编码区序列,而相应空载体(pcDNA3)不能切出此条带(参见图1);类似地,FHL1重组腺病毒载体(pAdeasy-FHL1)经PacI酶切后,可切出大小约4.5kb的条带(参见图2),而相应的空载体(pAdeasy-1)不能切出此条带,表明已重组成功。
2、FHL1重组腺病毒的纯度和滴度测定
快速CPE法测定FHL1重组腺病毒和相应对照重组腺病毒的滴度分别为5×108pfu/ml和4×108pfu/ml。FHL1重组腺病毒和相应对照重组腺病毒经扩增纯化后的纯度分别为1.31和1.34,说明纯度较高。纯化后的重组腺病毒和相应对照重组腺病毒的颗粒滴度分别为1.3×1012VP/ml和1.2×1012VP/ml,用有限稀释法测定的感染滴度分别为3.6×1010IU/ml和4.3×1010IU/ml。
3、FHL1哺乳动物细胞表达载体或重组腺病毒介导的FHL1蛋白
的表达
将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染HEK293细胞或用50MOI重组腺病毒感染人乳腺癌ZR75-1细胞,用FHL1抗体进行Westernblot,结果表明转染或感染后的细胞均能表达FHL1蛋白(参见图3,其中代表性地显示FHL1重组腺病毒感染ZR75-1细胞后能高表达FHL1,FHL1哺乳动物细胞表达载体转染HEK293细胞后有类似结果,但数据未列出)。
实施例2、FHL1抑制体外培养的多种肿瘤细胞的生长
(一)方法
用结晶紫实验测定FHL1对多种肿瘤细胞生长的影响,步骤如下:用0.25%胰酶(购自美国Sigma-Aldrich公司)消化多种肿瘤细胞,包括乳腺癌细胞株(MCF7、ZR75-1、MDA-MB-468、MDA-MB231)、肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC7721)、肺癌细胞株(A549、Calu3、H460)、胃癌细胞株(BGC823、MKN-1)。细胞计数后,稀释至合适的浓度,将0.5ml细胞液放入24孔板中,使每孔中的细胞数约为10,000个。按实施例1中所述方法将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染这些肿瘤细胞或用20-100MOI的FHL1重组腺病毒感染这些肿瘤细胞,培养1-4天后,除去培养基,每孔加入0.5ml的1%戊二醛(固定液),静止15-20min,去掉戊二醛。每孔加入0.5ml结晶紫(购自美国Sigma-Aldrich公司),放置15min(结晶紫储存于室温),用自来水浸没并冲洗几次,蒸馏水室温浸没15min,弃尽蒸馏水,在空气中干燥24孔(需要时过夜),每孔加入0.5ml的sorenson’s溶液(每升水溶液中含有:枸橼酸钠8.967g、0.1N HCl0.195L、90%乙醇0.5L),在水平摇床上摇动30min,每孔取100μl至96孔板,在590nm的波长处测定OD值,以OD值代表细胞相对生长速率。
(二)结果
结果表明,FHL1的表达能抑制上述所有肿瘤细胞的生长(参见图4,其代表性地显示FHL1重组腺病毒感染乳腺癌细胞株MCF7、肝癌细胞株HepG2和肺癌细胞株Calu3能抑制这些细胞的生长,其它细胞株有类似结果,但数据未列出)。
实施例3、FHL1抑制多种肿瘤细胞的锚定不依赖生长
(一)方法
用软琼脂实验测定FHL1对肿瘤细胞锚定不依赖生长的影响。首先,按实施例1中所述方法将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染肿瘤细胞或用20-100MOI的FHL1重组腺病毒感染肿瘤细胞,包括乳腺癌细胞株(MCF7、ZR75-1、MDA-MB-468、MDA-MB231)、肝癌细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC7721)、肺癌细胞株(A549、Calu3、H460)、胃癌细胞株(BGC823、MKN-1),然后采用60mm2细胞培养皿,在培养皿中加入3ml含0.7%琼脂的DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司),凝固后在其上加入3ml含上述20,000个肿瘤细胞和0.25%琼脂的DMEM培养基,每组细胞设3个平行样,培养3周后在倒置显微镜下计数每组细胞的集落形成数。
(二)结果
结果表明,FHL1的表达能抑制上述所有肿瘤细胞的集落形成(参见图5,其代表性地显示FHL1重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2能抑制细胞的锚定不依赖生长,其它细胞株有类似结果,但数据未列出)。
实施例4、FHL1抑制裸鼠多种肿瘤细胞的生长
(一)方法
按实施例1中所述方法将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染肿瘤细胞,包括肝癌细胞株HepG2、乳腺癌细胞株MCF7和肺癌细胞株Calu3,然后进行裸鼠成瘤实验。
将1×107个上述转染的细胞或未转染的细胞分别接种于5周龄雌性BALB/c裸鼠背部右后侧,共分4组,即FHL1哺乳动物细胞表达载体转染的肿瘤细胞组和相应的空载体转染的肿瘤细胞组;注射FHL1重组腺病毒的肿瘤细胞组和注射相应对照病毒的肿瘤细胞组。每组各10只裸鼠。对于腺病毒组而言,待肿瘤生长到长约1cm时,在肿瘤部位直接注射腺病毒,注射剂量为1×1010VP。观察接种部位有无渗出、肿瘤生长及裸鼠状况。测量肿瘤的最大直径L(cm)和最小直径D(cm),按如下公式计算各组肿瘤体积V(cm3)的大小:肿瘤体积(cm3)=L2×D×1/2。待细胞移植约10周,处死各组动物,取部分瘤块,用冰冷的0.9%生理盐水冲洗干净,放入5ml离心管中,立即加入1ml预冷至0℃的裂解液(1×PBS,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,1/1000的蛋白酶抑制剂),在冰浴中匀浆,按实施例1中的Western免疫印迹方法分析瘤块中FHL1蛋白的表达。
(二)结果
裸鼠开始出现瘤块后,每周测量瘤块大小,计算瘤块体积。结果表明,FHL1能抑制裸鼠中上述肿瘤细胞的生长(参见图6,其代表性地显示FHL1重组腺病毒注射能抑制肝癌细胞株HepG2植入的肿瘤生长,其它细胞株有类似结果,但数据未列出)。Western免疫印迹分析表明,注射FHL1重组腺病毒的瘤块中高表达FHL1蛋白,而注射相应对照腺病毒的瘤块中低表达FHL1蛋白(参见图7)。
实施例5、FHL1以Smad4依赖的方式使肿瘤细胞周期停滞在G1
期
(一)方法
用流式细胞技术检测细胞周期。将1×106个细胞接种到细胞培养板中,然后将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染HepG2或MCF7肿瘤细胞或用100MOI的FHL1重组腺病毒感染HepG2或MCF7肿瘤细胞,培养48小时后,收集细胞,用5ml的PBS洗涤细胞后,加入2ml的70%乙醇,-20℃孵育过夜。重复用PBS洗2次后离心沉淀细胞,用100μl的1mg/ml RNase A悬浮,在37℃下处理30min以消化RNA,再加400μl的50μg/ml PI,置暗处10min后,上流式细胞仪检测。
(二)结果
结果表明,FHL1的表达使S期明显降低,G0/G1显著增加,说明FHL1过量表达使细胞周期停滞在G1期(参见图8,其代表性地显示FHL1重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2的细胞周期情况,MCF7细胞株有类似结果,但数据未列出)。
实施例6、FHL1能抑制肿瘤细胞中癌基因的表达而促进抑癌基因
的表达
(一)方法
将1×106个细胞接种到细胞培养板中,然后将FHL1哺乳动物细胞表达载体转染肿瘤细胞株或用100MOI的FHL1重组腺病毒感染肿瘤细胞株,这些肿瘤细胞株包括乳腺癌细胞株MCF7和ZR75-1、肝癌细胞株HepG2和Hep3B、肺癌细胞株Calu3。将这些肿瘤细胞接种到细胞培养板中,培养24小时后,收集细胞,按实施例1中的方法分别用FHL1抗体(兔抗人FHL1抗体,购自美国ProteinTech公司)、p21(兔抗人p21抗体,购自美国Santa Cruz Biotech公司)和p15抑癌蛋白抗体(兔抗人p15抗体,购自美国Santa Cruz Biotech公司)、c-myc癌蛋白抗体(鼠抗人c-myc抗体,购自美国Santa Cruz Biotech公司)进行Western免疫印迹分析,检测上述肿瘤细胞中相应蛋白的表达情况。
另外,取实施例4中的裸鼠肿瘤组织,用Western免疫印迹分析检测肿瘤组织中p21和c-myc蛋白的表达情况。
(二)结果
结果表明,FHL1均在上述肿瘤细胞中表达,FHL1的过量表达抑制了c-myc癌蛋白的表达,但升高了p21和p15抑癌蛋白的表达(参见图9,其代表性地显示FHL1重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2后FHL1、c-myc、p21和p15蛋白的表达情况,其它细胞株有类似结果,但数据未列出)。
另外,将裸鼠肿瘤组织用Western免疫印迹分析检测p21和c-myc蛋白的表达情况,结果与上述体外实验结果一致(参见图10)。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>FHL1在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途
<130>IDC080081
<160>2
<170>PatentIn version3.4
<210>1
<211>843
<212>DNA
<213>智人
<220>
<223>FHL1基因的完整编码区
<400>1
<210>2
<211>280
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>FHL1基因编码的氨基酸序列
<400>2
Claims (6)
1.FHL1在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途,其中所述的FHL1抑制哺乳动物细胞内癌基因的表达,和/或促进哺乳动物细胞内抑癌基因的表达;所述癌基因是c-myc基因,所述抑癌基因是p21基因或p15基因;所述哺乳动物细胞是肝癌细胞HepG2。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述的哺乳动物细胞选自在体细胞或离体细胞;其中,在在体的肝癌细胞HepG2中,FHL1抑制c-myc基因的表达,和/或促进p21基因的表达;在离体的肝癌细胞HepG2中,FHL1抑制c-myc基因的表达,和/或促进p21基因或p15基因的表达。
3.含有编码FHL1的核苷酸序列的表达载体在制备用于调节癌基因和/或抑癌基因在哺乳动物细胞内表达的药物中的用途,其中所述的调节为抑制哺乳动物细胞内癌基因的表达,和/或促进哺乳动物细胞内抑癌基因的表达;所述癌基因是c-myc基因,所述抑癌基因是p21基因或p15基因;所述哺乳动物细胞是肝癌细胞HepG2。
4.根据权利要求3所述的用途,其中,所述载体选自质粒、病毒或噬菌体。
5.根据权利要求4所述的用途,其中,所述的载体是病毒。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述的载体是腺病毒。
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2008
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Xun Li,.Coordinate suppression of Sdpr and Fhl1 expression in tumors of the breast, kidney, and prostate.《CANCER SCIENCE》.2008,第99卷(第7期),第1326页. * |
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郭俊唐等.FHL家族与肿瘤的关系.《生物技术通讯》.2008,第19卷(第03期),第443页. * |
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