CN103882057A - 携带p21ras单链抗体基因肿瘤特异性腺病毒载体的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带p21ras单链抗体基因肿瘤特异性腺病毒载体的构建及其装载在CIK细胞中的应用。本发明所制备的条件复制型肿瘤特异性腺病毒具有双重靶向性，并能够感染CIK细胞。同时将p21ras单链抗体和GFP基因克隆至重组腺病毒穿梭质粒pXC2P中，制备出携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500。本发明所制备的重组腺病毒可特异性的识别肿瘤细胞，对正常细胞毒性小，病毒携带的p21ras单链抗体基因能随病毒的复制而长效表达，通过体内外实验均显示出了良好的抗肿瘤效果。本发明所述的肿瘤特异性腺病毒载体可用于乳腺肿瘤等由p21ras蛋白过表达引起的相关肿瘤药物制剂的研发。

Description

携带p21ras单链抗体基因肿瘤特异性腺病毒载体的构建及其应用

技术领域

本发明属于医学生物学领域，涉及基因工程和肿瘤生物治疗领域。具体的涉及利用分子克隆技术，用肿瘤特异性启动子调控病毒E1A、E1B蛋白的表达，改造肿瘤特异性腺病毒的纤毛蛋白使腺病毒外壳具有5型／35型腺病毒嵌合型纤毛蛋白，同时在肿瘤特异性腺病毒基因中插入p21ras单链抗体基因，通过CIK细胞将携带该基因的双靶向肿瘤特异性腺病毒运载到肿瘤组织部位，协同发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

背景技术

目前，肿瘤已经成为一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤死亡率高、生存期短，已经严重威胁人们的身体健康。统计资料表明，全世界每年约有700多万人死于肿瘤，且有逐年上升趋势。据2005年新英格兰杂志报道癌症已成为中国男性第一位、女性第三位的死亡原因。因此，预防和治疗恶性肿瘤已成为医学研究的热点。

肿瘤传统治疗是以手术、化疗和放疗等方法为主，而这些常规的治疗手段无法彻底清除残存的肿瘤细胞，导致其治愈率低，复发率和病死率高，无法明显改善人们对肿瘤相对无奈的局面。随着分子生物学技术和基因工程的发展，肿瘤的分子生物学机制得到进一步阐明，肿瘤基因治疗技术也随之发展，为肿瘤治疗提供了一种新的且有希望的治疗手段。

ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三个主要成员，即H-ras、K-ras、N-ras，分别定位于第12、11和1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21ras蛋白，三种p21ras蛋白的氨基酸序列约有85％的同源性。

p21ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。p21ras蛋白合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。p21ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合，p21ras蛋白中GTP结合与在GTP酶激活蛋白作用下水解为GDP之间的循环形成了一种分子开关机制，即通过鸟嘌呤核苷酸不同形式的结合形成不同的激酶构象，也即ras蛋白的活性和非活性形式。p21ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21ras-GTP形式，从而激活p21ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱。

当ras基因发生突变或p21ras蛋白过表达或GTP酶激活蛋白缺失或生长因子受体活化及ras下游效应子的突变或扩增，均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras基因过表达，部分学者认为p21ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要作用。

用于肿瘤生物治疗的完整抗体由于分子量较大，其血管通透性弱，扩散入肿瘤内能力差，半衰期长，毒性高而限制了其靶向传递及肿瘤拮抗应用效果。利用基因工程技术构建的单链抗体(single chain fragment vriable，ScFv)是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1／6；渗透力强；在非靶向组织中滞留时间短、易从体内清除；且免疫原性低，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体反应；容易在原核表达系统中表达获得，易于基因操作和基因工程大量生产，实用性强。将ScFv基因用病毒载体等导入非淋巴细胞内，通过偶联定位信号序列，定向表达于亚细胞器(如细胞核、细胞浆或内质网)而构建的抗体称为细胞内抗体。这种抗体通过在细胞内结合某种特定蛋白使其失活，并且封闭该蛋白与其它蛋白相互作用，或干扰该蛋白的正常胞内定位，从而阻止其发挥正常生物学功能而起作用。细胞内抗体用于肿瘤基因治疗是通过将抗癌相关蛋白的抗体基因导入肿瘤细胞，在细胞内表达的ScFv与癌相关蛋白相互作用，从而抑制肿瘤的生长。

肿瘤靶向性溶瘤病毒，又称条件复制型病毒(conditionally replicating adenoviruscs，CRAd)，是一种通过基因工程技术改造病毒基因组，使其能够携带抑癌基因并选择性地在肿瘤细胞中完成感染、复制周期，从而特异性溶解、杀伤肿瘤细胞，而在正常体细胞内这种能力减弱甚至消失。改造后的病毒载体可选择性地杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞，该载体具有一定程度的靶向性。溶瘤病毒作为一种特殊的肿瘤治疗药物和基因治疗载体近两年来发展迅速，许多高效、靶向性病毒相继进入临床试验，显示出了广阔的应用前景。

虽然携带抑癌基因的溶瘤病毒在体外能显示出良好的抗肿瘤疗效，但仍无法完全消灭肿瘤。主要原因是溶瘤病毒进入人体后会受到多种免疫机制的清除。目前病毒主要给药方法是瘤内注射或静脉注射，由于各种免疫、生化或物理屏障的作用，导致病毒递送效率很低。所以，病毒进入体内后很快被补体、抗病毒抗体及各种吞噬细胞等破坏，不能发挥有效的抗肿瘤作用。为突破病毒类药物给药方式的技术瓶颈，人们逐渐研究开发出以细胞为运载工具的新型给药方式，利用某些细胞具有靶向肿瘤部位这一特性通过系统给药将所携带的病毒药物运载到肿瘤组织部位。

细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)作为肿瘤的细胞治疗方法之一，已成功地在临床上得到了广泛应用。科学家使用CIK细胞作为痘病毒运载工具，成功将病毒药物运载到肿瘤组织部位并显示出高效地抗肿瘤作用。该方法结合ClK细胞靶向肿瘤部位的特性和细胞自身溶瘤作用，不仅为病毒类药物运输定位于肿瘤病变部位找到了突破口，更为细胞治疗与基因、病毒治疗方案的融合提供了一个崭新的思路。

本发明利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21ras蛋白免疫后的Balb／c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(Linker)和所述两片段连接，构建出p21ras-Anti-ScFv单链抗体基因片段。用肿瘤特异性启动子端粒酶逆转录酶hTERT启动子和缺氧反应元件启动子HRE分别控制病毒复制所必须的E1A和E1B蛋白，将人5型腺病毒改造为只能够在肿瘤细胞中复制增殖的肿瘤特异性腺病毒。同时为解决5型腺病毒对CIK细胞吸附能力差的问题，本发明将对CIK细胞具有高侵染力的35型腺病毒的纤毛蛋白(Fiber)基因克隆至5型腺病毒的骨架质粒中，构建出具有5型／35型嵌合型腺病毒纤毛蛋白的肿瘤特异性腺病毒，从而增加了腺病毒对CIK细胞的结合能力，使肿瘤特异性腺病毒能够利用CIK细胞作为其运载工具。最后将p21ras-Anti-ScFv单链抗体基因及GFP基因克隆至肿瘤特异性腺病毒穿梭质粒pXC2P中，将经过重组包装后的携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500感染CIK细胞，并由CIK细胞将肿瘤特异性腺病毒KGHV500靶向运送至肿瘤组织，在CIK细胞杀伤肿瘤细胞死亡后释放出腺病毒感染肿瘤细胞。感染肿瘤细胞的腺病毒在肿瘤细胞内通过复制增殖杀伤细胞的同时还能够长效的表达抗p21ras蛋白产物，所产生的细胞内抗体阻断肿瘤细胞中p21ras蛋白信号转导途径，限制肿瘤的生长和扩散，可用于靶向治疗过表达p21ras蛋白的乳腺肿瘤，有望达到治疗p21ras蛋白过表达引起的各类乳腺肿瘤的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体，其中p21ras单链抗体(p21ras-Anti-ScFv)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述单链抗体的重链可变区、轻链可变区和位于重链可变区与轻链可变区之间的连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

该携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体为携带有p21ras单链抗体基因和绿色荧光蛋白基因的肿瘤特异性腺病毒载体，其由肿瘤特异性启动子hTERT和HRE分别调控腺病毒早期复制所必须的E1A、E1B蛋白，实现病毒在肿瘤细胞中选择性复制的双重调控；该双靶向肿瘤特异性腺病毒的骨架质粒嵌合了人35型腺病毒的纤毛蛋白，提高了病毒感染CIK细胞的能力；该双靶向肿瘤特异性腺病毒载体携带了p21ras-Anti-ScFv基因，可用于靶向治疗各类过表达p21ras蛋白的肿瘤；该双靶向肿瘤特异性腺病毒载体还携带了GFP基因，可作为信号分子用于肿瘤特异性腺病毒及p21ras单链抗体在肿瘤治疗过程中的研究；携带有p21ras-Anti-ScFv基因的肿瘤特异性腺病毒载体经过重组并包装成完整病毒后，能够由CIK细胞靶向运载至肿瘤组织，在CIK细胞杀伤肿瘤细胞死亡后释放携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒。该双靶向肿瘤特异性腺病毒在对肿瘤细胞进行二次杀伤的同时还会长效表达抗p21ras蛋白的细胞内抗体，阻断肿瘤细胞中p21ras蛋白的信号转导途径，限制肿瘤细胞的生长和扩散，用于靶向治疗p21ras蛋白过表达的各类肿瘤。

本发明的另一目的是将携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体应用在制备靶向杀伤肿瘤细胞特别是乳腺肿瘤细胞的药物制剂中，为相关肿瘤的治疗研究提供了一个新的选择；

a、该双靶向肿瘤特异性腺病毒载体包装为完整病毒后能够经过CIK细胞的运载靶向杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞；

b、该双靶向肿瘤特异性腺病毒载体在肿瘤细胞内能够长效表达抗p21ras蛋白单链抗体，从而靶向抑制由p21ras蛋白过表达所引起的肿瘤生长和扩散。

本发明用两种肿瘤特异性启动子hTERT和HRE分别调控腺病毒E1A、E1B蛋白的表达，并且病毒衣壳嵌合了人35型腺病毒的纤毛蛋白，增加了5型腺病毒感染CIK细胞的能力，使得CIK细胞能够靶向运载肿瘤特异性腺病毒至肿瘤组织，减少了机体免疫系统在肿瘤特异性腺病毒到达肿瘤细胞过程中的破坏和清除作用，最终提供一种更安全、高效的双靶向肿瘤特异性腺病毒。

本发明所提供的肿瘤特异性腺病毒载体从5’-3’依次包括以下可操作性相连的元件：hTERT启动子，E1A基因，CMV启动子，p21ras-Anti-ScFv，IRES，GFP基因，PolyA序列，HRE启动子，E1B基因。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

1、广谱抗p21ras蛋白单链抗体的制备，这是一种抗ras基因全蛋白序列的单链抗体，能广谱拮抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白；该单链抗体作为制备双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体研究的基础材料，用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

所述单链抗体的制备方法如下：

(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21ras蛋白免疫后的Balb／c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(Linker)和所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；

(2)在单链抗体的基因片段两端分别引入不同的酶切位点并与同步双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒。将鉴定连接正确的重组噬菌粒转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07进行挽救，通过噬菌体展示技术将目的单链抗体基因片段与表达载体中的gIII基因融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出阳性重组噬菌粒；

(3)将筛选获得的阳性重组噬菌粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，从而获得与E-tag标签融合表达的抗p21ras蛋白的可溶性单链抗体，以该单链抗体为一抗，以抗E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA和免疫细胞化学法检测目的单链抗体的特异性及亲和力，证实该单链抗体可特异性识别三种p21ras蛋白。

2、携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500的制备，分别用肿瘤特异性启动子hTERT和HRE替代原有启动子调控腺病毒早期复制所必须的E1A、E1B蛋白，使得腺病毒的复制增殖只能够在肿瘤细胞中完成，而不影响正常细胞。再将编码人35型腺病毒纤毛蛋白的基因嵌合到人5型腺病毒的骨架质粒中，构建出含有F5／35嵌合型纤毛蛋白的腺病毒，从而提高5型腺病毒感染CIK细胞的能力，使得CIK细胞能够运载肿瘤特异性腺病毒至肿瘤组织，增强了肿瘤特异性腺病毒对肿瘤细胞的作用效果。最后将p21ras单链抗体基因及GFP基因克隆至腺病毒穿梭质粒，构建出完整的携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体，使得p21ras单链抗体基因能够随病毒在肿瘤细胞中的复制而长效表达。该重组腺病毒可用于肿瘤的靶向治疗研究特别是由p21ras蛋白过表达引起的乳腺肿瘤等相关疾病的治疗研究，为今后肿瘤的治疗和抗癌新药的研发提供一种新的途径。

本发明所述的肿瘤特异性腺病毒KGHV500的制备及其应用，具体步骤如下：

(1)通过重叠延伸PCR使E1A上游的启动子缺失，并在缺失位置引入两个新的酶切位点Sal I和Xho I，将缺失启动子的部分E1A片段连入pMD-18T simple载体，得到重组质粒pMD-mE1A，人工化学合成hTERT启动子片段，并在启动子序列两端同时引入Sal I和Xho I酶切位点。将重组质粒pMD-mE1A与人工合成的hTERT启动子片段用Sal I和Xho I同步双酶切，连接，构建出完整的用hTERT启动子调控E1A蛋白表达的片段。最后将该完整片段替换腺病毒穿梭质粒上的原片段，构建出含有hTERT启动子的pXC1-hTERT。

(2)通过重叠延伸PCR使E1B上游的启动子缺失，并在缺失位置引入新的酶切位点Not I、Spe I和Cla I，将缺失启动子的部分E1B片段连入pMD-18T simple载体，得到重组质粒pMD-mE1B，人工化学合成HRE启动子片段，并在启动子序列两端同时引入Spe I和Cla I酶切位点。将重组质粒pMD-mE1B与人工合成的HRE启动子片段用Spe I和Cla I同步双酶切，连接，构建出完整的用HRE启动子调控E1B蛋白表达的片段。最后将该完整片段替换腺病毒穿梭质粒上的原片段，构建出双靶向肿瘤特异性腺病毒穿梭质粒pXC2P。

(3)人工化学合成包含有CMV启动子、p21ras-Anti-ScFv片段、IRES、GFP ORF、Poly A等基因和各调控元件的长片段，并在两端引入Not I和Spe I酶切位点。将重组腺病毒穿梭质粒pXC2P与人工合成含有p21ras单链抗体基因的长片段用Not I和Spe I同步双酶切，连接，从而构建出携带有p21ras单链抗体基因和GFP基因的由肿瘤特异性启动子调控E1A、E1B蛋白表达的肿瘤特异性腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv。

(4)将腺病毒骨架质粒pBHGE3用Spe I和Cla I双酶切，将酶切后含有纤毛蛋白Fiber5基因的片段连入之前构建的含有Spe I和Cla I酶切位点的pMD-mE1B中，得到重组质粒pMD-F5，人工合成含有5型腺病毒和35型腺病毒嵌合纤毛蛋白的基因片段，并在两端引入Age I和Sbf I酶切位点。将重组的pMD-F5载体与人工合成的F5／35嵌合型纤毛蛋白基因片段用Age I和Sbf I同步双酶切，连接，构建出含有F5／35嵌合型纤毛蛋白基因片段的重组质粒pMD-F5／35。最后将重组质粒pMD-F5／35用Spe I和Cla I双酶切，将含有F5／35嵌合型纤毛蛋白的基因片段与之前用Spe I和Cla I双酶切的骨架质粒pBHGE3大片段连接。构建出含有F5／35嵌合型纤毛蛋白基因的腺病毒骨架质粒pBHGE3-F5／35。

(5)将构建好的腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv与嵌合型骨架质粒pBHGE3-F5／35共转染HEK293细胞，经过同源重组后在293细胞中包装成完整的肿瘤特异性腺病毒KGHV500。通过测定病毒感染正常细胞及肿瘤细胞后的滴度，来分析病毒的肿瘤复制特异性。利用流式细胞术检测KGHV500病毒感染CIK细胞的能力。再用荧光定量PCR确定病毒所携带的单链抗体基因在肿瘤细胞内的表达情况。

(6)最后用荷载携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500的CIK细胞进行体外抑瘤实验及体内抑制裸鼠移植瘤实验。通过MTT法检测感染病毒后肿瘤细胞的活性，并通过观察注射腺病毒KGHV500后裸鼠移植瘤的生长情况确定肿瘤特异性腺病毒KGHV500分别在体内、外的抑瘤作用。

本发明的有益成果：本发明创造性地从经过p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴细胞内扩增获得抗体的轻、重链基因，通过噬菌体展示技术和间接ELISA简单、高效的获得了广谱的抗p21ras蛋白的ScFv片段。将人5型腺病毒改造为能够感染CIK细胞的双靶向肿瘤特异性腺病毒，增强了肿瘤特异性腺病毒在机体中对肿瘤细胞作用效果的同时也提高了肿瘤特异性腺病毒的安全性。最后将p21ras单链抗体基因连同GFP基因共同克隆至肿瘤特异性腺病毒载体，构建出完整的携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500，最终使得p21ras单链抗体基因能够随病毒在肿瘤细胞中的复制而长效表达，进一步增强了肿瘤特异性腺病毒对由p21ras蛋白过表达引起的乳腺肿瘤的抑制作用。最后分别在体外和体内研究了由CIK细胞荷载的KGHV500肿瘤特异性腺病毒对肿瘤细胞的杀伤及抑制作用。结果表明其在体外可以显著杀伤并抑制乳腺肿瘤细胞的生长和增殖，在体内可以显著抑制乳腺肿瘤的形成、生长及转移，并且没有明显的毒副作用，为今后乳腺肿瘤的治疗提供了一种新途径。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明获得的单链抗体基因比传统单链抗体基因的制备方法简单，减少了杂交瘤细胞株的制备过程。并且筛选出的单链抗体，具有抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白的广谱抗性，同时具有较低的免疫原性和较高的特异性和亲和力。

(2)本发明有机的利用了两种肿瘤特异性启动子调控病毒的复制和改造肿瘤特异性腺病毒的纤毛蛋白，从病毒对细胞的感染到病毒在细胞内的复制都做到了特异性。本发明所制备的肿瘤特异性腺病毒可以有效的靶向肿瘤细胞，进一步的提高了腺病毒的靶向性和安全性。

(3)本发明构建的携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒经体外实验证明能选择性的杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞，具有肿瘤靶向性。这种携带有p21ras单链抗体基因的新型双靶向肿瘤特异性腺病毒能高效的杀伤并抑制乳腺肿瘤的生长和扩散，为乳腺肿瘤的治疗提供了一个良好的新技术平台。

(4)本发明将肿瘤的过继免疫疗法、病毒疗法和基因治疗有机的结合在一起，在CIK细胞及肿瘤特异性腺病毒双重杀伤肿瘤细胞的同时，还可长时间、高效的表达p21ras单链抗体对肿瘤细胞进行再次杀伤，相对于单一的肿瘤治疗方法大大的增强了对肿瘤的杀伤能力。

附图说明

图1为p21ras蛋白免疫Balb／c小鼠的脾B淋巴细胞总RNA电泳图，M：DL2000，1、2为平行样品。

图2为小鼠脾B淋巴细胞cDNA扩增的轻、重链可变区片段电泳图，M：DNAMaker I，1-3为扩增出的重链可变区条带，4-5为扩增出的轻链可变区条带。

图3为构建的单链抗体基因片段，M：DL2000，1：单链抗体条带。

图4为含单链抗体基因重组噬菌体表达载体的Sfi I、Not I双酶切鉴定电泳图，M：DL2000，1-4：双酶切后的重组噬菌粒条带，均为平行样品。

图5为SDS-PAGE检测可溶性表达单链抗体的电泳图，M：14.4-94KDa蛋白质分子量标准，1-2：可溶性单链抗体，均为平行样品。

图6为重组腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv的构建流程图。

图7为重组腺病毒骨架质粒pBHGE3-F5／35的构建流程图。

图8为通过重叠延伸PCR构建的启动子缺失的E1A部分片段电泳图，M：DL2000，1为用引物E1Af1和E1Ar1扩增出的E1A启动子上游部分片段，2为用引物E1Af2和E1Ar2扩增出的E1A启动子下游部分片段，3为用引物E1Af1和E1Ar2扩增出的启动子缺失的E1A部分片段。

图9为含有hTERT启动子的重组pXC1-hTERT酶切鉴定电泳图，M：Trans2K Plus II DNA Maker，1为pXC1的EcoR I和Xba I双酶切电泳图，2为pMD-mE1A-hTERT重组质粒的EcoR I和Xba I双酶切鉴定图，3为pMD-mE1A-hTERT重组质粒的SalI和Xho I双酶切鉴定图，4为pXC1-hTERT重组质粒的EcoR I和Xba I双酶切鉴定图。

图10为通过重叠延伸PCR构建的启动子缺失的E1B部分片段电泳图，M：DL2000，1为用引物E1Bf1和E1Br1扩增出的E1B启动子上游部分片段，2为用引物E1Bf2和E1Br2扩增出的E1B启动子下游部分片段，3为用引物E1Bf1和E1Br2扩增出的启动子缺失的E1B部分片段。

图11为含有HRE启动子的重组pXC2P酶切鉴定电泳图，M：D15000+2000，1为pXC1-hTERT重组质粒的Xba I和Kpn I双酶切电泳图，2为pMD-mE1B-HRE重组质粒的Xba I和Kpn I双酶切鉴定图，3为pMD-mE1B-HRE重组质粒的Cla I和Spe I双酶切鉴定图，4为pXC2P重组质粒的Xba I和Kpn I双酶切鉴定图。

图12为含有嵌合型纤毛蛋白基因的重组腺病毒骨架质粒pBHGE3-F5／35酶切鉴定电泳图，1为5型腺病毒骨架质粒pBHGE3的Cla I和Spe I双酶切电泳图，2为pMD-F5／35重组质粒的Cla I和Spe I双酶切鉴定图，3为pMD-F5／35重组质粒的Age I和SbfI双酶切鉴定图，4为pBHGE3-F5／35重组质粒的Cla I和Spe I双酶切鉴定图。

图13为含有单链抗体基因及GFP基因的重组腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv的酶切鉴定电泳图，1为pXC2P的Spe I酶切电泳图，2为pXC2P的NotI酶切电泳图；3为pXC2P的Spe I和Not I双酶切电泳图，4为pXC2P-ScFv的Spe I和Not I双酶切鉴定图。

图14为不同重组病毒在正常细胞及肿瘤细胞中的复制能力示意图。

图15为不同重组病毒对CIK细胞吸附能力示意图。

图16为肿瘤特异性病毒KGHV500在肿瘤细胞中的表达情况示意图，1为乳腺癌细胞MDB-MB-231的内参基因GAPDH表达曲线，2为乳腺癌细胞MDB-MB-435的内参基因GAPDH表达曲线，3为乳腺癌细胞MCF-7的内参基因GAPDH表达曲线，4为MDB-MB-231的单链抗体基因表达曲线，5为MDB-MB-435的单链抗体基因表达曲线，6为MCF-7的单链抗体基因表达曲线。

图17为MTT法检测不同重组病毒对正常细胞及肿瘤细胞的杀伤率示意图。

图18为荷载KGHV500病毒的CIK细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤实验的影响。

图19为荷载KGHV500病毒的CIK细胞对MCF-7乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤实验的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：单链抗体基因片段的制备

1、p21ras蛋白免疫Balb／c小鼠：取5只鼠龄在6-8周的Balb／c小鼠(购自重庆第三军医大学实验动物中心)，每只注射100μg的本实验室经过原核表达纯化后的p21ras-K蛋白(p21ras-K蛋白的制备方法参照论文《重组p21ras蛋白的表达、鉴定与纯化及其多克隆抗体的制备》)，初次注射加等量的完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第二次注射，剂量同第一次，加等量不完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第三次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。两周后进行第四次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。3天后取其脾脏，用10ml灭菌的D-Hank's液冲洗研碎的脾脏。用滴管吸取培养皿内细胞的悬液，移入50ml离心管中，1000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为所需要的小鼠脾B淋巴细胞。

2、小鼠脾B淋巴细胞总RNA的提取和逆转录合成cDNA：将已分离得到的小鼠脾B淋巴细胞，使用传统的Trizol法提取总RNA。提取的具体步骤参照分子克隆指南(第三版)。最后将提取出的RNA尽快放在-80℃冰箱中。提取出的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见提取的总RNA的28S、18S、5S亚基大小正确，条带清晰无明显杂带，可用于下游的反转录实验。电泳图见附图1。

反转录使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒，具体步骤参见说明书操作。反转录出的cDNA可保存于-20℃冰箱。

3、重叠延伸PCR合成单链抗体基因片段：扩增小鼠轻、重链可变区引物和重叠延伸PCR构建单链抗体的Linker引物等均使用购自GE healthcare公司的重组噬菌体抗体系统(Recombinant PhageAntibody System，RPAS)。首先在PCR管内加入下列试剂进行轻链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA4μl；10×PCR Buffer5μl；dNTP(10mM)5μl；轻链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。另一只PCR管内加入下列试剂进行重链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA4μl；10×PCR Buffer5μl；dNTP(10mM)5μl；重链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。将上述体系配制好后放入PCR仪经95℃，5分钟；(94℃30秒，55℃45秒，72℃1分钟，30个循环)；72℃10分钟，结束反应。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。可见扩增的重链可变区大小约为350bp，轻链可变区大小约330bp，与预期一致，电泳图见附图2。

将大小正确的条带进行切胶纯化，胶回收的步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书操作；将纯化后的条带再次取2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟，确定胶回收后DNA的质量和大致浓度。

用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端引入Sfi I和Not I酶切位点：通过重叠延伸PCR法用Linker混合物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区片段进行连接，连接产物在RS Primers(酶切位点引物)作用下在重链的5’末端加上Sfi I限制性位点和轻链的3’末端加上Not I酶切位点，可用于后续与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)进行连接。具体步骤参照GE healthcare公司的RPAS系统说明书。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见单链抗体条带大小约780bp，与预期一致，条带集中，清晰无杂带，电泳图见附图3。目的条带进行切胶纯化及纯化后的浓度测定。对所构建好的单链抗体命名为p21ras-Anti-ScFv。

4、单链抗体基因片段的克隆：将构建出的单链抗体片段p21ras-Anti-ScFv连入pMD-18T载体(购自TAKARA公司)，构建出pMD-ScFv重组质粒。在200μl PCR管中配制如下连接体系：pMD-18T载体1μl；目的片段DNA0.1pmol-0.3pmol Solution I补足10μl。金属浴16℃反应4小时。将连接产物加入到100μl DH5α感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后立即冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于含有X-Gal的LB／Amp平板上37℃倒置培养10小时。

5、菌液PCR鉴定阳性重组子：挑取LB／Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH2O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR的模板。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer2.5μl；dNTP混合液(2.5mM each)2μl；M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH2O14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的930bp处出现条带，确定为阳性重组克隆。

实施例2：单链抗体库的建立及筛选鉴定

1、重组噬菌粒的构建

1.1重组pMD-ScFv载体及表达载体的双酶切：将经PCR鉴定正确的阳性pMD-ScFv克隆提取质粒，提取步骤按天根质粒小提试剂盒说明书操作。将重组的pMD-ScFv质粒及表达载体质粒pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)分别先进行Sfi I酶切，在200μl PCR反应管内分别加入表达载体质粒/pMD-ScFv载体各30μl；Sfi I酶(10U／μl)4μl；10×Buffer M5μl，ddH₂O11μl，上述体系配置好后50℃反应4小时。将酶切产物经过胶回收纯化后，在新的200μlPCR反应管中加入纯化产物30μl，Not I酶(10U／μl)2μl，10×Buffer H5μl，BSA2μl，Trion X-1002μl，ddH₂O9μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，重组的pMD-ScFv质粒双酶切后在780bp处出现目的条带，表达载体质粒双酶切后在3.5kb处出现目的条带。目的条带分别进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

1.2重组表达载体的连接：将经过Sfi I和Not I同步双酶切后的表达载体pCANTAB-5E与ScFv目的片段按摩尔比1∶5进行连接，从而构建出含有单链抗体基因的重组表达载体pCANTAB-ScFv。连接总体积为10μl，16℃反应4小时。将连接产物全部加入100μl的TG1感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后再冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB／Amp平板上37℃倒置培养10小时。

1.3重组表达载体的鉴定：挑取LB／Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH₂O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR反应的模板。PCR鉴定插入片段使用表达载体pCANTAB-5E的通用引物，S1F：CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC，S6R：GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer2.5μl；dNTPs(2.5mM each)2μl；S1F(10μM)0.5μl，S6R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH₂O14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的950bp处出现条带。将重组表达载体pCANTAB-ScFv进行Sfi I和Not I分步双酶切，可见在3.5kb和780bp处有酶切条带，确认为阳性重组克隆，电泳图见附图4。

2、噬菌体抗体库的富集和筛选

2.1噬菌体抗体库的富集：按细菌数量与辅助噬菌体数量1∶20的比例加入辅助噬菌体M13K07(购自GE healthcare公司)于鉴定为阳性含有pCANTAB-ScFv的重组子菌液内，放恒温摇床内37℃，150rpm，培养2小时。当看到液体变浑浊时，放入离心机内，室温下1500g离心25分钟，弃上清。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，200rpm，过夜振荡培养。所得的液体即为经过富集后的噬菌体培养液。

2.2间接ELISA法筛选单链抗体的特异性：将所得培养液室温下低速离心25分钟，吸取上清，上清内加入1／5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。用PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将p21Ras-H、N、K蛋白分别稀释至5μg／ml，在每个酶标板孔内加入100μl稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300μl，置振荡摇床上振摇3分钟，弃孔内液体，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100μl，置37℃恒温培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100μl适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1∶2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗M13g8p蛋白)100μl新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H₂SO₄50μl终止反应。使用酶标仪读取OD₄₅₀值，凡待测孔值／阴性对照孔值≥2即为阳性。

3、单链抗体的可溶性表达及鉴定

3.1单链抗体的可溶性表达：将经过ELISA筛选出的含有阳性重组噬菌体的菌液重新扩大培养至OD₆₀₀≈0.8。将培养好的菌液提取质粒，步骤按QIAGEN质粒小提试剂盒说明书进行。将3μl各个质粒分别转化至100μl BL21(DE3)感受态中。挑取阳性单克隆接于5ml的LB／Amp液体培养基中培养，取前一次的培养菌液按1／100比例加入到1L新的LB／Amp液体培养基中培养至OD₆₀₀≈0.8。收集培养后的菌体，用灭菌PBS缓冲液重悬菌体，加入100U／μl溶菌酶使溶菌酶终浓度达到1U／μl，室温放置15分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟后收集上清。

3.2可溶性表达单链抗体的鉴定

3.2.1SDS-PAGE确定单链抗体的相对分子量：在上一步所得的上清中加入一定量的2×SDS上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热10分钟，冷却后即可上样进行电泳。电泳完毕，取出分离胶放在盛有去离子水的容器中，加热沸腾后取出。加入快速染色液浸没分离胶即可，在脱色摇床上摇10分钟，当蛋白条带已可见时弃染色液。再次加入约50ml的水，加热沸腾2分钟，停止加热继续在脱色摇床上摇30分钟后观察结果。结果可见在30KDa处出现目的条带，与预期一致，电泳图见附图5。

3.2.2免疫细胞化学法检测可溶性表达的单链抗体与肿瘤细胞株的结合特异性及敏感性：采用人肝癌细胞株HepG2，人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人胃癌细胞株MKN-28，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人卵巢癌细胞株SKOV3，人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF-7共10种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的10种肿瘤细胞株收集于离心管内，离心弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入制备的可溶性单链抗体作为一抗，抗E-tag抗体作为二抗(购自Abcam公司)，通过SP法检测肿瘤细胞表达p21ras蛋白的情况。结果显示制备的可溶性单链抗体可与上述所有肿瘤细胞株呈不同程度的阳性反应，显示了良好的广泛的抗肿瘤细胞株谱系。

4、将鉴定结果正确的单链抗体进行测序：将可溶性表达结果正确含有单链抗体基因重组pMD-ScFv载体的菌液送测序公司测序，DNA测序结果表明单链抗体的基因序列排列方式为V_H-Linker-V_L，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现序列符合小鼠轻重链可变区基因结构，具体序列见SEQ ID NO：1。

实施例3：肿瘤特异性腺病毒KGHV500的制备

1、肿瘤特异性腺病毒穿梭质粒pXC2P的构建

1.1hTERT启动子替换病毒E1A启动子

1.1.1构建E1A基因启动子缺失突变的片段：以人5型腺病毒穿梭质粒pXC1(购自Microbix Biosystems Ins公司)为模板，用重叠延伸PCR构建出E1A启动子缺失的片段。具体步骤如下：用引物末端带有EcoR I酶切位点的E1Af1正向引物(5’-CGTCTTCAAGAATTCTCATGTTT-3’)和末端带有Sal I酶切位点的E1Ar1反向引物(5'-CCGCTCGAGCGGCGACGTCGACGCGTCACTACACGTCAGCTGACTATAATAATA-3’)扩增E1A启动子上游的部分片段894bp。用引物末端带有Xho I酶切位点的E1Af2正向引物(5’-ACGCGTCGACGTCGGCCGCTCGAGCGG GACTGAAAATGAGACATATTATCTGC-3’)和末端带有Xba I酶切位点的E1Ar2反向引物(5’-TGCATTCTCTAGACACAGGTGAT-3’)扩增E1A启动子下游的部分片段827bp。反应体系为10×TransTaq^TM-T Buffer5μl；dNTPs(2.5mM each)4μl；E1Af1／E1Af2(10μM)1μl，E1Ar1／E1Ar2(10μM)1μl；质粒pXC11μl；TransTaq^TM-T DNAPolymerase1μl；ddH₂O37μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟；(94℃1分钟，57℃1分钟，72℃2分钟，30个循环)；72℃延伸10分钟，4℃保存。将扩增得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA纯化回收试剂盒分别回收纯化两个目的条带。再同时以扩增出的两个目的片段为模板，以E1Af1为上游引物，E1Ar2为下游引物进行PCR反应，从而扩增出E1A基因启动子缺失突变的片段。配制如下PCR反应体系：10×TransTaq^TM-T Buffer5μl；dNTPs(2.5mM each)4μl；E1Af1(10μM)1μl，E1Ar2(10μM)1μl；之前纯化回收后的目的片段各1μl；TransTaq^TM-T DNA Polymerase1μl；ddH₂O36μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟；(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，30个循环)；72℃延伸10分钟，4℃保存。将扩增得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA纯化回收试剂盒回收纯化约1700bp左右的目的条带，回收所得片段即为E1A基因启动子缺失突变的片段，结果见图8。将该片段连接至pMD-18T simple载体上构建出pMD-mE1A，具体操作过程同本发明实施例1中的步骤4和步骤5。

1.1.2将hTERT启动子克隆至E1A基因启动子缺失突变的片段：将含有化学合成的hTERT启动子片段(NCBI登录号为NC_000005.10)的pUC57-hTERT和pMD-mE1A用Sal I和Xho I同步双酶切，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pUC57-hTERT载体双酶切后在300bp处出现目的条带，pMD-mE1A双酶切后在4.4kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有hTERT启动子的pMD-mE1A-hTERT。连接体系为：pMD-mE1A／Sal I／Xho I与hTERT／Sal I／Xho I按摩尔比1∶5进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3。

1.1.3用含有hTERT启动子的E1A片段替换pXC1中的原片段：将pMD-mE1A-hTERT和pXC1用EcoR I和Xba I同步双酶切，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pMD-mE1A-hTERT载体双酶切后在2kb处出现目的条带，pXC1双酶切后在8.2kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有hTERT启动子的pXC1-hTERT。连接体系为：pXC1／EcoR I／Xba I与E1A-hTERT／EcoR I／Xba I按摩尔比1∶7进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3，结果见图9。

1.2HRE启动子替换病毒E1B启动子

1.2.1构建E1B基因启动子缺失突变的片段：以人5型腺病毒穿梭质粒pXC1为模板，用重叠延伸PCR构建出E1B基因启动子缺失突变的片段，并将其连在pMD-18T simple载体上，构建出pMD-mE1B。步骤如下：用引物末端带有Xba I酶切位点的E1Bf1正向引物(5'-ATCACCTGTGTCTAGAGAATGCA-3’)和末端带有Not I酶切位点的E1Br1反向引物(5'-ATCGATGGACTAGTCCTAGCGGCCGCCAAGTTAAACATTATCTCACCCTTT-3’)扩增E1A启动子上游的部分片段336bp。用引物末端带有Spe I和Cla I酶切位点的E1Bf2正向引物(5’-GCGGCCGCTAGGACTAGTCCATCGATATGGAGGCTTGGGAGTGTTTG-3’)和末端带有Kpn I酶切位点的E1Br2反向引物(5’-GGCCGGTACCAGAAAATCCAGCAGGTA-3’)扩增E1B启动子下游的部分片段383bp。其余操作过程同本发明实施例3中的步骤1.1.1，最终得到约693bp左右E1B基因启动子缺失突变的片段，结果见图10。

1.2.2将HRE启动子克隆至E1B基因启动子缺失突变的片段：将含有化学合成的HRE启动子片段(NCBI登录号为NC_000006.12)的pUC57-HRE和pMD-mE1B载体用Cla I和Spe I同步双酶切，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pUC57-HRE载体双酶切后在240bp处出现目的条带，pMD-mE1B双酶切后在3.3kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有HRE启动子的pMD-mE1B-HRE。连接体系为：pMD-mE1B／Cla I／Spe I与HRE／Cla I／Spe I按摩尔比1∶5进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3。

1.2.3用含有HRE启动子的E1B片段替换pXC1-hTERT中的原片段：将pMD-mE1B-HRE和pXC1-hTERT用KpnI和Xba I同步双酶切，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pMD-mE1B-HRE载体双酶切后在900bp处出现目的条带，pXC1-hTERT双酶切后在9.5kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出同时含有hTERT启动子和HRE启动子的pXC2P重组质粒。连接体系为：pXC1-hTERT／Kpn I／Xba I与E1B-HRE／Kpn I／Xba I摩尔比按1∶7进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3，结果见图11。

2、肿瘤特异性腺病毒骨架质粒PBHGE3-F5／35的构建

2.1F5部分纤毛片段的克隆：用限制性内切酶Spe I和Cla I同步双酶切pBHGE3(购自Microbix Biosystems Ins公司)和前期构建好的含有Spe I和Cla I单克隆位点的pMD-mE1B，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pBHGE3载体双酶切后在9.4kb处出现含有部分人5型腺病毒纤毛蛋白基因片段的目的条带，pMD-mE1B双酶切后在3.3kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有部分人5型腺病毒纤毛蛋白基因片段的pMD-F5重组质粒。连接体系为：pMD-mE1B／Spe I／Cla I与F5／Spe I／ClaI按摩尔比1∶5进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3。

2.2F5／35嵌合纤毛片段的构建：用限制性内切酶Age I-HF和SbfI-HF同步双酶切pMD-F5和含有化学合成的人5型和35型腺病毒嵌合型纤毛片段(NCBI登录号分别为AC_000008和AC_000019.1)的pUC57-F5／35，37℃反应1小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pUC57-F5／35载体双酶切后在1.4kb处出现含有人5型和35型腺病毒嵌合型纤毛片段的目的条带，pMD-F5双酶切后在10.6kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有人5型和35型腺病毒嵌合型纤毛片段的pMD-F5／35重组质粒。连接体系为：pMD-F5／Age I-HF／Sbf I-HF与F5／35／Age I-HF／Sbf I-HF按摩尔比1∶5进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3。

2.3F5／35嵌合纤毛片段替换pBHGE3中的原片段：用限制性内切酶Spe I和Cla I同步双酶切pMD-F5／35和pBHGE3，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pMD-F5／35载体双酶切后在8.6kb处出现含有人5型和35型腺病毒嵌合型纤毛片段的目的条带，pBHGE3双酶切后在28kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有人5型和35型嵌合型腺病毒纤毛基因片段的pBHGE3-F5／35重组腺病毒骨架质粒。连接体系为：pBHGE3／Spe I／Cla I与F5／35／Spe I／Cla I按摩尔比1∶7进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3，结果见图12。

3、p21ras单链抗体基因及GFP基因的克隆

用限制性内切酶Spe I和Not I同步双酶切pXC2P和含有化学合成的p21ras单链抗体基因及GFP基因等一系列操作元件的pUC57-ScFv，37℃反应2小时。将酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，pUC57-ScFv载体双酶切后在3kb处出现含有p21ras单链抗体基因及GFP基因等操作元件片段的目的条带，pXC2P双酶切后在10.3kb处出现目的条带。将目的条带分别进行切胶纯化后连接，构建出含有p21ras单链抗体基因及GFP基因等一系列操作元件的pXC2P-ScFv重组腺病毒穿梭质粒。连接体系为：pXC2P／Spe I／Not I与ScFv／Spe I／Not I摩尔比按1∶5进行连接，连接总体积为10μl，16℃反应4小时。具体操作过程同本发明实施例2中的步骤1.2和步骤1.3，结果见图13。

4、肿瘤特异性腺病毒的制备及纯化

4.1肿瘤特异性腺病毒的制备：将腺病毒穿梭质粒和骨架质粒通过Lipofectamine2000(购自QIAGEN公司)共转染至HEK293细胞，利用同源重组和293细胞本身所表达出的E1区蛋白获得完整的病毒。具体转染步骤参见QIAGEN Effectene细胞转染试剂盒说明书。转染分组情况如下：(1)原始腺病毒穿梭质粒pXC1+野生型骨架质粒pBHGE3，最终获得野生型腺病毒WtAd5；(2)原始腺病毒穿梭质粒pXC1+嵌合型骨架质粒pBHGE3-F5／35，最终获得嵌合型纤毛腺病毒Ad5F5／35；(3)重组腺病毒穿梭质粒pXC2P+野生型骨架质粒pBHGE3，最终获得肿瘤特异性腺病毒KGHV200；(4)携带有p21ras单链抗体基因的重组腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv+野生型骨架质粒pBHGE3，最终获得肿瘤特异性腺病毒KGHV300；(5)重组腺病毒穿梭质粒pXC2P+嵌合型骨架质粒pBHGE3-F5／35，最终获得肿瘤特异性腺病毒KGHV400；(6)携带有p21ras单链抗体基因的重组腺病毒穿梭质粒pXC2P-ScFv+嵌合型骨架质粒pBHGE3-F5／35，最终获得携带有p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒KGHV500。

4.2肿瘤特异性腺病毒的纯化：当293细胞出现明显CPE现象，并有50％以上的细胞脱落时，1000rpm，离心5min，弃掉80％的上清液，用剩余上清重悬细胞沉淀，于-80℃和37℃反复冻融3次，再次离心后收集病毒上清液。用适量的病毒上清液再次感染293细胞，反复多次进行病毒的传代扩增，随病毒的富集，递次减少病毒感染量。将收集的病毒液，用腺病毒纯化试剂盒(购自CELL BIOLABS公司)回收重组腺病毒。由于试剂盒纯化腺病毒滴度过低，无法满足下一步实验要求，所以通过双重氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒。先用不连续密度梯度离心将细胞污染物和一些缺陷性病毒颗粒去除，然后用连续密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒完全分开。最后用透析法去除纯化病毒液中的氯化铯，最终所得腺病毒满足进一步实验的要求。

4.3肿瘤特异性腺病毒滴度测定：病毒滴度测定采用TCID50法，步骤如下：用高糖DMEM10％FBS准备10ml约10⁵个／ml的293细胞悬液，使用移液器在96孔板中每孔分配100μl(约10⁴个细胞)进行培养。在10个无菌1.5ml离心管中分别加入0.9ml高糖DMEM10％FBS，然后向1号管中加入0.1ml病毒原液，上下吹打混匀，稀释后更换枪头，再取0.1ml10^-1稀释液并转移至2号管，依次10倍倍比稀释至第10个最高稀释度。上述配液和稀释度可以根据接种量和估计的病毒滴度大概范围自行调整。取出细胞培养板，用移液器吸去96孔板中的培养液，然后用稀释的病毒液依次感染96孔板1-10列，每孔0.1ml，每列设置10个复孔。在11、12两列各孔加0.1ml高糖DMEM10％FBS做阴性对照。盖好96孔板并在37℃CO₂培养箱培养10天。10天后用荧光显微镜观察各孔，计数每列出现CPE的孔数。即使仅有小块或一些细胞出现CPE现象，该孔也计为阳性。如果存在CPE与死细胞难以判断，可与阴性对照做比较。确定每列出现阳性孔的百分率。如果阴性对照没有显示任何CPE现象并且细胞生长正常，同时最高稀释液表现100％感染(10／10)而最低稀释液表现100％阴性(0／10)，则测试有效。病毒滴度计算公式：对于0.1ml样品，滴度T=10^1+d(s-0.5)。d＝log10的稀释度=1(对于10倍的稀释度而言)；s=阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)将TCID50／ml转换为pfu／ml；T=a×10^b TCID50／ml＝a×10^b-0.7pfu／ml。注意：两次重复试验得到的滴度值应相差≤10^0.7，即≤0.7个log10。

实施例4：肿瘤特异性腺病毒KGHV500的抑瘤实验

1、肿瘤特异性腺病毒KGHV500在正常及肿瘤细胞中的复制能力分析

细胞接种6孔板，当细胞长至70％左右时，取10⁵的正常细胞或肿瘤细胞铺于6孔板培养24小时后，加入5MOI的病毒WtAd5、Ad5F5／35、KGHV200、KGHV400、KGHV500和等量的PBS缓冲液作为阴性对照分别感染乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和正常人乳腺细胞株MCF-10A、正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5。感染8小时后，弃培养液用PBS洗两次，加入新培养液，48小时后收集病毒感染液，在-20℃和37℃反复冻融三次以释放病毒。离心去上清检测病毒滴度，具体方法同实施例3中的步骤4.3。

由结果可见，WtAd5和Ad5F5／35无论是在肿瘤细胞还是正常细胞中都可以正常复制，且两者在不同细胞株中的复制能力相当，没有选择性。而KGHV200、KGHV400和KGHV500在肿瘤细胞中均可以正常复制，且复制能力大致相同；但在正常细胞中，KGHV200、KGHV400和KGHV500的复制能力显著降低，显示出了其在肿瘤细胞中选择性复制的靶向性。结果见图14。

2、肿瘤特异性腺病毒KGHV500对CIK细胞的吸附实验

收集悬浮培养14至21天的CIK细胞于15ml离心管中，以转速1000rpm离心3分钟，弃上清收集细胞沉淀，用1ml不含血清的RPMI1640培养液悬浮。以100MOI将病毒KGHV200、KGHV300、KGHV400、KGHV500和等量的PBS缓冲液作为阴性对照分别加入悬浮于无血清培养液的CIK细胞中，置于37℃培养箱内孵育6小时，每种病毒吸附实验做3个平行。为去除未吸附于细胞表面的病毒，对37℃培养箱内孵育6小时后的CIK细胞用PBS洗涤两次。加入一定量的含10％FBS的RPMI1640培养液悬浮细胞，于37℃培养箱内继续培养48小时。48小时后用流式细胞仪检测表达GFP细胞的比例。结果显示病毒KGHV200和KGHV300对CIK细胞的吸附能力较弱，而含有F5／35嵌合型腺病毒纤毛蛋白的病毒KGHV400和KGHV500比KGHV200和KGHV300对CIK细胞具有更强的吸附能力，结果见图15。

3、肿瘤特异性腺病毒KGHV500携带的单链抗体基因在肿瘤细胞中的表达能力分析

细胞接种6孔板，当细胞长至60％左右时，取10⁵的肿瘤细胞铺于6孔板培养24小时后，加入10MOI的病毒KGHV500感染乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7，感染8小时后，弃培养液用PBS洗两次，加入新鲜培养液，72小时后收集病毒感染液中的所有细胞，使用Trizol法提取细胞总RNA。使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒进行反转录，具体步骤参见说明书操作。用反转录产物进行荧光定量PCR，从而确定p21ras单链抗体基因的表达情况。引物p21rasRTf：TTAGTGATGGTGGTAGTTAC；p21rasRTr：CTCTTAGTGTCGTCTCTG；选择GAPDH作为内参基因，引物GAPDHRTf：TGACAACAGCCTCAAGAT；GAPDHRTr：GAGTCCTTCCACGATACC。从荧光定量PCR的曲线可以看出感染了病毒KGHV500的三株肿瘤细胞中均有p21ras单链抗体基因的表达，曲线1-3分别为MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7细胞株内参基因GAPDH的表达曲线，曲线4-5分别为MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7细胞内p21ras单链抗体基因的表达曲线，结果见图16。

4、肿瘤特异性腺病毒KGHV500的体外抑瘤实验

用20MOI的病毒KGHV400、KGHV500分别加于CIK细胞或PBS缓冲液中共同孵育6小时，PBS洗涤后继续培养。24小时后将预感染病毒的CIK细胞按效靶比2.5∶1或等体积有病毒颗粒的PBS缓冲液加入到铺有1×10⁴个处于对数生长期的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和正常人乳腺细胞株MCF-10A、正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5的96孔板中，未加病毒的CIK细胞作为对照组，每个条件设3个平行孔。培养72小时后加入20μl MTT溶液继续孵育4小时，终止培养，弃上清，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪于490nm处检测吸光值，计算出杀伤效率。

结果表明，各实验组对正常人乳腺细胞株MCF-10A和正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5的毒性很小。CIK细胞、KGHV400和KGHV500对乳腺癌细胞均有一定的杀伤作用。而CIK+KGHV500对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7的杀伤能力显著提高，说明病毒通过吸附于CIK细胞被成功带入到靶细胞中，在CIK细胞和病毒的双重杀伤作用下，肿瘤细胞杀伤率有非常显著的提升。而病毒携带的单链抗体基因所表达的p21ras单链抗体，阻断了p21ras蛋白的信号转导，抑制了肿瘤的生长，使得肿瘤杀伤效率进一步提升，结果见图17。

杀伤率(％)=[A(靶)+A(效)-A(效+靶)]／A靶×100％

5、肿瘤特异性腺病毒KGHV500的体内抑制裸鼠移植瘤实验

5.1裸鼠肿瘤模型的建立：实验细胞MDA-MB-231和MCF-7生长良好、汇合度达到80％时，使用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，PBS缓冲液洗涤细胞后将细胞密度调整成10⁷个细胞／200μl，作为单次注射用量。将制备好的细胞注射接种于SPF级4周龄雌性Ba1b／c裸鼠，每种肿瘤细胞接种20只，观察裸鼠成瘤后肿瘤特异性病毒KGHV500对体内肿瘤生长的抑制情况。

5.2肿瘤特异性腺病毒对肿瘤生长的体内抑制实验：对成瘤后的裸鼠进行分组注射治疗，具体分组情况为(1)PBS对照组；(2)CIK细胞；(3)KGHV400；(4)KGHV500；(5)预感染KGHV400的CIK细胞；(6)预感染KGHV500的CIK细胞。当瘤体平均直径达到0.5cm时，按上述分组进行瘤内多点注射治疗，每3天注射1次，共注射7次。注射后对裸鼠进行观察，每隔一天称量裸鼠体重，并测量裸鼠瘤体长、短径，计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。分析各分组裸鼠移植瘤的生长情况。结果显示在成瘤裸鼠中，实验组肿瘤生长速度明显减慢，特别是注射有CIK+KGHV500的实验组。说明瘤内注射的预感染KGHV500的CIK细胞组能够显著抑制肿瘤的生长，相比其它组具有更好的抑制肿瘤效果，且与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，结果见图18、19。

瘤体体积=1／2长径×短径²。

Claims (3)

1.携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体，其特征在于：肿瘤特异性腺病毒载体中插入的p21ras单链抗体基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体在制备靶向杀伤肿瘤细胞药物制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述携带p21ras单链抗体基因的肿瘤特异性腺病毒载体在制备靶向杀伤肿瘤细胞药物制剂中的应用，其特征在于：肿瘤细胞是乳腺肿瘤细胞。

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