CN101891819A - 一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及其制备方法，该单链抗体的基因片段是由广谱抗p21Ras蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的轻、重链可变区基因片段通过柔性寡核苷酸链(Linker)连接而构建，该单链抗体基因片段与噬菌粒表达载体连接构建得到重组噬菌粒，将该重组噬菌粒转化琥珀抑制型大肠杆菌TG1进行融合表达，通过噬菌体文库展示，利用间接ELISA筛选、鉴定出阳性重组噬菌粒，将所得阳性重组噬菌粒转化非琥珀抑制型大肠杆菌BL21(DE3)，进行单链抗体的可溶性表达，经间接酶联免疫吸附试验及免疫细胞、组织化学实验证实该可溶性表达的单链抗体与H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白结合特异性强，亲和性高，该单链抗体用于构建细胞内抗体等小分子抗体并用于ras基因相关肿瘤的诊断研究。

Description

一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗p21ras基因表达蛋白的单链抗体及该抗体的制备方法。

背景技术

Ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三个主要成员，即H-Ras、K-Ras和N-Ras，分别定位于第12、11和1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21Ras蛋白，三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85％的同源性。p21Ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。

p21Ras蛋白合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。p21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合，p21Ras蛋白中GTP结合与在GTP酶激活蛋白作用下水解为GDP之间的循环形成了一种分子开关机制，即通过鸟嘌呤核苷酸不同形式的结合形成不同的激酶构象，也即Ras蛋白的活性和非活性形式。p21Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21Ras-GTP形式，从而激活p21Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱。

当ras基因发生突变或p21Ras蛋白过表达或GTP酶激活蛋白缺失或生长因子受体活化及ras下游效应子的突变或扩增，均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras蛋白过表达，部分学者认为ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要作用。

肿瘤生物治疗成为继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗模式。肿瘤生物治疗方法主要有细胞因子技术、过继免疫疗法、抗体药物、肿瘤疫苗技术及基因治疗等。其中抗体药物主要有鼠源性单抗、人源化鼠单抗、完全人源化抗体等。用于临床的单抗及其改型药物已有20多种，进行临床试验和临床前研究的有几百种。

用于肿瘤生物治疗的完整抗体由于分子量较大，其血管通透性弱，扩散入肿瘤内能力差，半衰期长，毒性高而限制了其靶向传递及肿瘤拮抗应用效果。利用基因工程技术构建的小分子抗体，如Fab、单链抗体(ScFv)、单域抗体、二硫键稳定的ScFv、双特异性抗体、细胞内抗体等，则克服了上述缺陷，在肿瘤靶向传递、肿瘤影像诊断及治疗方面展示了广泛的应用前景。其中的单链抗体(single chain fragment variable，ScFv)是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1/6，渗透力强，易从体内清除。单链抗体分子连接细胞毒素、药物或放射性同位素等形成的免疫毒素(或称为生物导弹)用于肿瘤治疗显示了良好的杀伤效果。目前，近十种ScFv在进行临床前研究和临床应用。将ScFv基因用病毒载体等导入非淋巴细胞内，通过偶联定位信号序列，定向表达于亚细胞器(如细胞核、细胞浆或内质网)而构建的抗体称为细胞内抗体。此型抗体能够特异性结合细胞内靶分子，干扰或阻断靶分子的加工、分泌过程或去除靶分子，影响靶分子的生物学功能。

我们在成功制备广谱拮抗三种p21ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株基础上，利用PCR扩增及重组噬菌体展示技术构建并表达出五株广谱拮抗三种p21ras蛋白的单链抗体。构建的单链抗体基因片段可用于制备细胞内抗体、双价及多价单链抗体。可用于靶向治疗过表达p21ras蛋白的肿瘤。

发明内容

本发明提供一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及该抗体的制备方法，尤其涉及该抗体线性基因片段的构建及利用重组噬菌体展示技术表达该单链抗体并进行鉴定。

本发明要解决的技术问题之一构建单链抗体基因片段。该线性片段与T载体连接并转化感受态DH5α菌，DNA测序而获得目的单链抗体片段的核苷酸序列。

本发明要解决的技术问题之二是构建重组噬菌体质粒，该重组质粒由单链抗体基因片段与噬菌粒表达载体pCANTAB-5F连接而成。

本发明要解决的技术问题之三是提供融合及可溶性表达目的单链抗体的宿主大肠杆菌TG1及BL21(DE3)，该宿主菌分别转化含目的片段的重组噬菌体质粒。

本发明要解决的技术问题之四是提供融合及分泌性表达的目的单链抗体的鉴定及筛选方法。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体，其特征在于：这是一种抗ras基因全蛋白序列的单链抗体，能广谱拮抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21Ras蛋白；该单链抗体作为制备双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体研究的基础材料，用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

所述的单链抗体的制备方法，其特征是步骤如下：

(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从广谱抗p21Ras蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株中扩增获得其轻、重链可变区基因片段，通过柔性寡核苷酸链(Linker)将所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；

(2)通过重叠延伸聚合酶链式反应，在单链抗体的基因片段两端引入Sfi I和Not I双酶切位点并与同样双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒，利用表达载体pCANTAB-5E上的通用引物进行菌液PCR鉴定，筛选出插入片段大小及方向正确的重组噬菌粒；

(3)将上述鉴定正确的重组噬菌粒转化琥珀抑制型大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13KO7进行挽救，目的单链抗体基因片段与表达载体中的基因3融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出对应的阳性重组噬菌粒；

(4)将筛选获得的阳性重组噬菌粒转化至非琥珀抑制型大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶表达，从而获得广谱抗p21ras蛋白的可溶性单链抗体，该可溶性单链抗体是目的单链抗体基因片段与表达载体上的E-tag标签融合表达的产物，以该单链抗体为一抗，以抗E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA和免疫组化技术检测目的单链抗体，证实该单链抗体可特异性识别细胞和组织中的H-ras、K-ras、N-ras三种p21Ras蛋白。

附图说明

图1pMD19-T载体的结构图；

图2噬菌粒表达载体pCANTAB-5E结构模式图；

图3噬菌粒表达载体pCANTAB-5E基因序列图；

图4杂交瘤细胞株的总RNA电泳图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1-2：分别为提取的杂交瘤细胞株的总RNA；

图5PCR扩增的杂交瘤细胞株的轻重链可变区片段电泳图，其中

M：DNA Marker I，

泳道1-3：重链可变区条带，

泳道4-5：轻链可变区条带；

图6PCR扩增后的单链抗体基因片段电泳图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1：单链抗体(ScFv)基因片段条带；

图7单链抗体基因片段与T载体连接并转化感受态DH5α，铺X-gal平板后蓝白斑图；

图8菌液PCR进一步鉴定经蓝白斑初筛后正确的克隆重组率电泳图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1-14：用T载体通用引物M13-47/48进行菌液PCR后扩增产物；

图9阳性重组T载体克隆质粒进行Sfi I和NotI顺序双酶切后电泳图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1-9：不同的T克隆质粒双酶切后产物条带；

图10噬菌粒表达载体pCANTAB-5E质粒进行Sfi I和Not I顺序双酶切后电泳图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1-4：表达载体质粒双酶切后产物条带；

图11菌液PCR法鉴定目的单链抗体基因片段与噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接后阳性克隆电泳条带图，其中，

M：DL2000(Marker)，

泳道1-6：用表达载体上的S1/S6引物PCR扩增后的产物条带；

图12融合表达的单链抗体进行间接ELISA鉴定其与三种p21ras蛋白的结合特异性的酶标板图。

图13可溶性表达的单链抗体SDS-PAGE图，其中，

M：蛋白质分子量标准14.4-94KDa(Marker)，

泳道1-5：分别为五株单链抗体表达产物经尿素变性溶解及PEG8000浓缩后产物条带，

泳道6：未经尿素变性溶解的可溶性单链抗体产物条带；

图14间接ELISA鉴定五株可溶性表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的结合特异性图。

图15可溶性表达的五株单链抗体与肿瘤细胞株进行免疫细胞化学SP法染色后光镜图，图内A、B、C、D分别为HepG2人肝癌细胞株、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株、MDA-MB-435人乳腺癌细胞株、SKOV3人卵巢癌细胞株ICC染色SP法400×(胞质和胞膜阳性，颗粒状)。

图16可溶性表达的五株单链抗体与肿瘤组织进行免疫细胞化学SP法染色后光镜图，

图内A、B、C、D分别为乳腺浸润性导管癌、胃腺癌、接肠腺癌、膀胱尿路上皮癌IHC染色SP法400×(胞质和胞膜阳性，颗粒状着色)。

图17单链抗体KGH-R1-ScFv的DNA测序图

图18单链抗体KGH-R2-ScFv的DNA测序图

图19单链抗体KGH-R3-ScFv的DNA测序图

图20单链抗体KGH-R4-ScFv的DNA测序图

图21单链抗体KGH-R5-ScFv的DNA测序图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体，其特征在于：该抗体可广谱拮抗H、K、N-ras蛋白。该抗体的基因片段通过PCR扩增广谱抗p21ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株基因组DNA而获得，将抗体的线性基因片段连接入噬菌粒表达载体后经噬菌体展示技术而获得表达。该抗体可以用于构建细胞内抗体、双价及多价单链抗体等小分子抗体并用于表达p21ras肿瘤的诊断及治疗性研究。

所述的广谱抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白的单链抗体的基因片段是通过柔性连接片段(linker)连接广谱拮抗H、K、N-ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株的轻、重链可变区片段而获得。

所述的广谱抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21ras蛋白的单克隆抗体的轻、重链可变区片段是通过聚合酶链反应方法，以杂交瘤细胞株的互补DNA为模板，用特异性轻重链混合引物分别扩增而获得。

所述的柔性连接片段(linker)连接单克隆抗体杂交瘤细胞株的轻、重链可变区片段是利用重叠延伸法，用特异性linker引物PCR扩增而实现。

所述的单链抗体基因片段通过与T载体连接并转化感受态DH5α，经鉴定阳性的重组克隆的菌液测序而获得其核苷酸序列，T载体的结构图见附图1。

所述的重组噬菌粒是将连接于T载体上的单链抗体基因片段经扩增后进行Sfi I和Not I顺序双酶切，与同样双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E用T4DNA连接酶连接构建而成。噬菌粒表达载体pCANTAB-5E含有氨苄抗性基因(Amp)、Plac启动子以及M13噬菌体间隔区片段，因此可受IPTG诱导，在M13KO7辅助下可产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒。在该载体fd噬菌体基因III(gIII)序列中，有位于gIII信号肽和编码区序列之间的Sfi I、NotI克隆位点，用于克隆ScFv基因。紧跟其后的是E tag序列和琥珀终止码TAG。其结构及序列图见附图2、3。

所述的融合表达单链抗体的基因工程宿主菌TG1为琥珀抑制型菌株，经辅助噬菌体M13KO7挽救后表达的蛋白为目的单链抗体与表达载体的基因3蛋白(g3p)融合形式并展示在噬菌体尾部表面。

所述的可溶性表达单链抗体的基因工程宿主菌BL21(DE3)为非琥珀抑制型菌株，表达的蛋白为目的单链抗体连有表达载体上的E-tag的可溶性抗体形式。

所述的单链抗体的鉴定包括了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法鉴定融合表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的结合特异性，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测可溶性表达的单链抗体的相对分子量，间接ELISA、免疫细胞/组织化学SP法可溶性表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的结合特异性及与肿瘤细胞株/肿瘤组织内表达的p21ras蛋白的结合特异性。

所述的单链抗体可以用于构建细胞内抗体、双价及多价单链抗体等小分子抗体并用于表达p21ras肿瘤的诊断及治疗性研究。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(上、下册)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：Trizol法提取杂交瘤细胞株总RNA并逆转录合成互补DNA

1.1杂交瘤细胞株总RNA的提取

Trizol试剂可以溶解破碎细胞，细胞内的RNA、DNA、基因组蛋白等物质释出。溶解液经异丙醇及无水乙醇等处理，低温下高速离心获得杂交瘤细胞株总RNA。具体步骤包括：将细胞培养瓶放在冰上，将培养液倒干净，用D-Hanks液冲洗细胞两次，加入1ml trizol，用移液管抽吸数次，观察到细胞呈泥沙样脱落时将细胞转到1.5ml的离心管中。10-15分钟后，加氯仿200ul，上下颠倒使其彻底混匀，冰上放置5分钟。4℃离心，12000g，15分钟。从离心机中取出放在冰上，吸出上清。加入与上一步骤上清等体积的异丙醇，上下颠倒使其混匀，冰上放置10分钟。4℃离心10分钟，12000g，弃上清，加1ml 75％的酒精，再震荡混匀，4℃离心8000g，离心5分钟，用吸管吸去上清，留下RNA。再次加入1ml 75％乙醇，4℃，8000g离心5分钟，吸去上清。将离心管倒置在滤纸上，使酒精流出来，加入20ul灭菌DEPC水。在55-60℃孵育10分钟。提取的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏/40分钟，Marker为DL2000。可见提取的总RNA的大小亚基大小正确，条带清晰无杂带，电泳图见附图4。

1.2逆转录合成cDNA

逆转录是以RNA为模板，在RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)作用下，利用4种dNTP为原料，在引物的3’端以5’-3’方向合成与RNA互补的DNA链的过程。以提取的杂交瘤细胞株的总RNA为模板合成cDNA的步骤具体为：取200ul离心管1只在冰上加入引物oligo(dt)18(0.5ug/ul)1ul；计算出的RNA体积；DEPC水补足为12ul，用小号枪头轻柔吹打混合3-5秒，简单离心使其沉淀，70℃孵育5分钟。在冰上依次加入5×buffer 4ul，RiboLockTmRibonudease inhibitor(20u/ul)1ul，dNTP Mix(10mM)2ul，轻柔震荡混合，简单离心使其沉淀。37℃孵育5分钟，加入RevertAidTm H Minus M-MuLv Reverse Transcriptase(200u/ul)1ul，最终的容量为20ul。42℃孵育60分钟。70℃加热10分钟，停止反应，放在冰上。

实施例2：重叠延伸法合成单链抗体基因片段

2.1以cDNA为模板，PCR分别扩增单克隆抗体杂交瘤细胞株的轻、重链可变区

用PCR方法进行的基因扩增过程类似于体内DNA的复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的引物诱导下进行聚合反应。在反应温度为DNA聚合酶的最适温度时，在四种dNTP底物存在的条件下，DNA聚合酶将单核苷酸从引物3’端开始掺入，沿模板由5’端向3’端方向延伸，合成DNA新链。经25-30次循环后(变性，复性，引物延伸三个步骤为一个循环)，可指数扩增目的基因。具体步骤为，在一只0.2mlPCR管内加入下列试剂进行轻链可变区扩增：杂交瘤细胞cDNA 4ul；10×PCR buffer 5ul；dNTP(10mM)5ul；BSA(10mg/ml)0.5ul；轻链引物混合液1ul；灭菌去离子水34ul。另一只PCR反应管内加入以下试剂进行重链可变区扩增：杂交瘤细胞cDNA 4ul；10×PCR buffer5ul；dNTP(10mM)5ul；BSA(10mg/ml)0.5ul；重链引物1 1ul；重链引物2 1ul；灭菌去离子水33ul。缓慢用微枪头混合上述液体并短暂地离心。离心放入PCR仪经95℃，5分钟后，加入0.5ul r-Taq酶，混匀。离心管重放入PCR仪，经(30循环：94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟)，延伸72℃10分钟，保存在10℃。扩增出的目的条带进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏/40分钟，Marker为DNA Marker I，可见扩增的重链可变区大小约340bp，轻链可变区大小约320bp，与预期一致，电泳图见附图5。

2.2符合预期的条带进行切胶纯化。步骤按离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

2.3纯化后条带再次取2微升进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏/40分钟，Marker为DNA Marker I，对照Marker，估计目的条带的浓度。

2.4用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端加入Sfi I和Not I酶切位点

通过重叠延伸PCR法用Linker混合引物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区基因进行连接，连接产物再次在RS Primers(酶切位点引物)作用下在重链的5’末端加上Sfi I限制性位点或轻链的3’末端加上Not I酶切位点，备用于与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E的连接转化实验。具体步骤为，在200ul PCR反应管内加入纯化后重链可变区片段50ng；纯化后轻链可变区片段50ng；Linker混合引物2μl；10×PCR Buffer 2.5μl；dNTP Mix(2.5mM)16μl；r-Taq酶0.5μl；灭菌去离子水补足为25μl。混合并简短离心。放入PCR仪经(7循环：94℃1分；63℃4分钟)。在上一实验的PCR反应管内加入r-Taq酶0.5μl；10X PCR Buffer 2.5μl；dNTP Mix(2.5mM)4μl；RS混合引物2μl；灭菌去离子水16μl。混匀并短暂离心后放PCR仪内运行(预变性94℃4分钟，30循环：94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟。72℃延伸7分钟，10℃保存)。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏/40分钟，Marker为DL2000，可见单链抗体条带大小约750bp，与预期一致，条带集中，清晰无杂带，电泳图见附图6。目的条带同样进行切胶纯化及纯化后浓度定量步骤。共进行了五株单克隆杂交瘤细胞株的单链抗体构建，分别命名为：KGH-R1-ScFv、KGH-R2-ScFv、KGH R3-ScFv、KGH-R4-ScFv、KGH-R5ScFv。

实施例3：单链抗体基因片段与pMD19-T载体进行连接并转化感受态大肠杆菌DH5α扩增目的单链抗体基因片段并备用于DNA测序

3.1单链抗体基因片段与pMD19-T载体的连接反应

PCR产物克隆专用载体pMD19-T由pUC19改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的XbaI识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。而大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在产物的3’末端添加一个“A”的特性，A与T配对完成PCR产物与载体的连接，提高连接克隆效率。具体步骤为：在微量离心管中配制下列DNA连接溶液，全量为5ul。实验组：(T-A载体1ul；目的片段DNA0.1pmol-0.3pmol；双蒸水补足5ul)。阳性对照组：(T-A载体1ul；阳性对照DNA 1ul；双蒸水3ul)。阴性对照组：(T-A载体1ul；双蒸水补足5ul)。各管加入5ul Solution I。放PCR仪内16℃反应30分钟。全部产物加入100ul感受态DH5α细菌中，冰中放置30分钟。142℃热激45秒后放冰上1分钟。加入890ul SOC培养液，37℃，140rpm，振荡培养60分钟。取100ul铺在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-琼脂平板培养基上培养过夜。其中的白斑为可能的阳性重组连接克隆，克隆重组率约为80％，蓝白斑数码相机图见附图7。

3.2菌液PCR法进一步鉴定克隆正确重组率

用T载体上的通用引物进行PCR扩增，可以扩增出阳性克隆中目的插入片段与周围155bp相加的片段，出现该片段则进一步证实克隆可能成功。具体步骤为：将培养平板上的隔离良好的单个菌落用无菌牙签(或灭菌枪头)挑取，加入到合适的含有筛选抗生素的培养液内进行扩增培养。待细菌生长达对数期时取5微升作为模板进行PCR扩增。在200微升PCR扩增管内加入10×扩增缓冲液5ul；dNTP混合液(2.5mM each)2ul；正向引物(5uM)2ul；反向引物(5uM)2ul；菌液5ul；r-Taq酶0.25ul；灭菌去离子水补足为25ul。将上述试剂混合均匀，放PCR仪内进行反应。退火温度为载体上通用引物的最佳退火温度。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后条带对照合适的Marker估计分子量大小。可见在预期的900bp处出现条带，初步确定为阳性重组克隆，电泳后条带图见附图8

3.3鉴定正确的T克隆提取质粒

提取步骤按质粒小提试剂盒说明书进行。

实施例4：顺序双酶切单链抗体基因片段质粒及噬菌粒表达载体pCANTAB-5E并立即用T4 DNA酶连接两者，转化感受态大肠杆菌TG1准备进行融合性目的单链抗体的表达

4.1顺序双酶切单链抗体基因片段及表达载体质粒先进行Sfi I酶切，在200ul PCR反应管内加入表达载体质粒/ScFv片段32ul；Sfi I酶(10U/ul)4ul；10×Buffer G4ul。混匀并短暂离心后放PCR仪内45℃，3小时。3小时后加入4ul Not I酶，4ul 10×Buffer 0。放37℃恒温孵箱内继续酶切3小时。酶切过程中最好间隔半小时左右将酶切管拿出，轻轻敲击混匀再放回，以利于酶切充分。酶切后产物全部加样进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，90伏，电泳40分钟。Marker为DL2000。顺序双酶切后电泳条带图见附图9、10。可见阳性T载体克隆质粒双酶切后在750bp处出现目的条带，表达载体质粒双酶切后在3.5Kb处出现目的条带。目的条带分别进行切胶纯化，步骤按离心柱型纯化试剂盒说明书进行。

4.2目的单链抗体片段与纯化后的空表达载体进行连接，构建重组噬菌体质粒并转化感受态大肠杆菌TG1

按下表所列进行实验组、载体自连组、空白对照组连接反应。目的片段与空表达载体的含量比例按3∶1进行连接，两者总体积为17ul。①实验组单链抗体片段30ng；空表达载体10ng；10×连接缓冲液2ul；T4DNA连接酶1ul。②载体自连组灭菌去离子水10ul；空表达载体7ul；10×连接缓冲液2ul；10×连接缓冲液2ul；T4DNA连接酶1ul。③空白组灭菌去离子水17ul；10×连接缓冲液2ul；T4DNA连接酶1ul。放PCR仪内22℃，1小时。1小时后65℃，10分钟灭活。从-80℃冰箱中取出感受态大肠菌菌TG1放冰上备用。取100ul菌液加入冰上预冷的1.5毫升离心管内，将全部三组连接液分别加入菌液内，用枪头缓慢混匀后在冰上放置40分钟。42℃热激90秒后放冰上2分钟。加入890ul SOC培养液后放恒温振荡器内，30℃，140rpm培养1小时。分别取100ul液体铺SOBAG平板，放30℃恒温孵箱内过夜培养。平皿先平放30分钟，待表面液体渗透入琼脂后倒置平板，继续过夜培养。

实施例5：菌液PCR法鉴定重组噬菌体质粒的连接转化效率，初步鉴定阳性的克隆进行辅助噬菌体M13KO7挽救，间接ELISA鉴定融合表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的结合特异性

5.1菌液PCR法初步鉴定克隆重组率

取SOBAG平板上分离良好的单个菌落，放入2毫升2×YTAG培养液内扩增培养，取5ul扩增后菌液作为模板，用表达载体上的S1/S6引物进行PCR鉴定。具体步骤参见实施例3.2。扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条带显示在950bp处出现目的条带，为可能的阳性克隆，电泳图见附图11。

5.2菌液PCR鉴定阳性的克隆进行辅助噬菌体挽救

按细菌数量与辅助噬菌体数量1∶20的比例加入辅助噬菌体M13K07于初步鉴定阳性的细菌菌液内，放恒温振荡器内37℃，150rpm，培养2小时，应看到液体变浑浊。放低温离心机内，室温下1500g离心25分钟，小心吸除上清液。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，250rpm，过夜震荡培养。再次1500g，室温下离心25分钟，吸取上清，上清内加入1/5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。孔内的重组噬菌体抗体液可以进行ELISA检测了。

5.3间接ELISA法鉴定融合表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的特异性结合情况

用PH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将p21ras-H、N、K蛋白分别稀释至5ug/ml，在每个酶标板孔内加入100ul稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300ul，置震荡摇床上，200rpm，振摇3分钟，弃孔内液体，吸水纸拍干，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100ul，置37℃恒温恒湿细菌培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100ul适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1∶2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗M13g8p蛋白)100ul，置湿盒内37℃孵育40分钟后洗板三次。用重蒸馏水重复洗涤2次后每孔加入100ul新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H₂SO4 50ul终止反应。放酶标仪内读取OD450值，凡待测孔值/阴性对照孔值≥2即为阳性。酶标板结果数码相机拍照图见附图12。

实施例6：单链抗体的可溶性表达及鉴定

6.1单链抗体的可溶性表达

噬菌体载体pCANTAB-5E在gIII基因和scFv基因之间有琥珀终止密码，在抑制型菌株TG1中，此终止密码被通读成谷氨酸，gIII和scFv基因可形成融合表达，而在非抑制型菌株BL21(DE3)等细菌内中，此琥珀突变子被读成终止密码致使gIII不能表达而形成scFv与E-tag连接的可溶性表达。具体步骤为，ELISA筛选阳性的各个重组噬菌体克隆(2H7-4-2，2H5-3-1，2E3-50-5，3F1-12-11，1C9-25-10)的冻存菌液各50ul加入5ml 2×YTAK培养液中，37℃，250rpm，过夜培养。菌液提取质粒，步骤按质粒小提试剂盒说明书进行。将5ul各个质粒分别加入100ul感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，放冰上40分钟后，42摄氏度准确热激90秒，加入890ul SOC培养液。放恒温振荡摇床上140rpm，37摄氏度培养1小时后取200ul培养物用细菌涂布棒铺2×YTA平板，放恒温孵箱内过夜培养(30摄氏度)。第二天上午取单菌落于2×YTA培养液2ml中，30℃，250rpm培养6小时后，取培养菌液按1∶100比例加入新鲜配制的2×YTAG培养液中，30℃，250rpm培养至OD600＝0.8，2000g，室温下离心5分钟，小心弃去上清，加入新鲜制备的2×YTAI(含氨苄青霉素和1mmol/L IPTG)，30℃，250rpm过夜震荡培养。培养后菌液4000rpm，低温离心机内离心10分钟，取各离心管上清标以各个克隆号放-20℃冰箱保存。菌体沉淀加入100U/ul溶菌酶及灭菌PBS缓冲液使溶菌酶终浓度为1U/ul，震荡混匀后室温放置10分钟后，4℃，12000rpm，离心30分钟后取上清。

6.2可溶性表达的单链抗体的鉴定

6.2.1聚丙基酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定可溶性表达的单链抗体的相对分子量

SDS-PAGE是根据分子质量的不同对蛋白质进行分离的电泳方法，常用于蛋白质的比较和特性鉴定。聚丙烯酰胺凝胶具有电渗作用小、分辨率高、惰性材料不与样品相互作用、韧性好不易断裂、无色透明易于观察和人工合成可以控制凝胶浓度和孔径等优点。SDS带有大量负电荷可掩盖不同蛋白质间原有的电荷差异，同时还可使蛋白质构象发生改变。不连续SDS-PAGE存在三个不连续系统：凝胶孔径的不连续、缓冲液组成的不连续、缓冲液PH的不连续，因而决定了其三个效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，这是不连续SDS-PAGE具有较高分辨率的主要原因。具体步骤为，准备步骤1)将电泳玻板依次用水、10％SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。2)试样格(梳子)临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。3)灭菌枪头、eppendorf管。制备凝胶1)安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。2)配制10％的分离胶(10ml)：依次将4ml蒸馏水，3.35ml 30％丙烯酰胺贮存液，2.5ml 1.5mol/L Tris(pH8.8)溶液，0.1ml 10％SDS溶液，0.1ml 10％过硫酸铵，0.004mlTEMED混合，立即灌胶。3)迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶(勿产生气泡)，直至剩余的板宽比梳子长度多0.5-1cm。小心在胶上覆盖一薄层去离子水。4)在分离胶聚合的过程(约40分钟)中，配制5％的积层胶(4ml)：依次混合2.75ml蒸馏水，0.65ml 30％丙烯酰胺贮存液，0.5ml 1.0mol/L Tris(pH6.8)溶液，0.04ml 10％SDS溶液，0.04ml 10％过硫酸铵，0.004mlTEMED。TEMED应在灌胶前才加入。实际操作过程试剂加入量：依次混合3.4ml蒸馏水，0.83ml 30％丙烯酰胺贮存液，0.63ml 1.0mol/L Tris(pH6.8)溶液，0.05ml10％SDS溶液，0.05ml 10％过硫酸铵，0.005mlTEMED。TEMED应在灌胶前才加入。5)分离胶聚合完全后，倒去蒸馏水，用滤纸吸干胶面上的残余水。6)快速灌注积层胶，灌满后立即插入干净的梳子，避免产生气泡。7)积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。8)在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。

样品的制备：在蛋白溶液中加入等体积的2×SDS电泳上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热5分钟，冷却后即可上样。上样用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的2×SDS电泳上样缓冲液，同时设立Marker作对照。上样完毕，接通电源，初始电压为70-80V，当染料进入分离胶(这段时间约为20min)后，将电压提高到100V左右，继续电泳直至染料到达分离胶底部1cm处，大约1小时。

考马斯亮蓝快速染色1)电泳完毕，从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开将分离胶移入容器中，50ml双蒸水或去离子水，加热沸腾后(可选：继续在脱色摇床上摇5分钟)，弃去水溶液。2)加入20-25ml快速染色液(按容器大小而定，浸没胶为准)，加热沸腾30-60秒，停止加热继续在脱色摇床上摇5-10分钟，弃染色液(蛋白条带应已可见)。3)加入约50ml的水，加热沸腾30-60秒，停止加热继续在脱色摇床上摇5-10分钟，换水即可完成脱色，观察结果。结果可见在30KDa处出现目的条带，与预期一致，电泳后数码相机图见附图13。

6.2.2间接ELISA鉴定可溶性表达的单链抗体与三种p21ras蛋白的结合特异性

基本步骤同实施例5.3，不同之处在于实验用一抗为可溶性表达的单链抗体悬液，二抗为抗E-tag抗体(1∶2000稀释)。实验后酶标板数码相机图见附图14。

6.2.3免疫细胞/组织化学SP法鉴定可溶性表达的单链抗体与肿瘤细胞株/肿瘤组织的结合特异性及敏感性

免疫细胞化学检测：

采用人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人白血病细胞株THP-1，人白血病细胞株K562，人白血病细胞株MT4 CD4+，人白血病细胞株Daud I，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人膀胱移行细胞癌细胞株T-24，人肝癌细胞株SMMC-7721，人喉鳞癌细胞株Hep2，人胃癌细胞株MKN-28，人肝癌细胞株HepG2，人卵巢癌细胞株SKOV3，人白血病细胞株C8166 CD4+，人白血病细胞株HL60，人宫颈癌细胞株HeLa，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF7共19种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的19种肿瘤细胞株收集于刻度离心管内，离心弃上清，细胞沉淀用生理盐水洗一遍，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入本申请人制备的广谱抗p21ras蛋白的杂交瘤细胞上清作为一抗，抗E-tag抗体为二抗(Abcam公司)，免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测肿瘤细胞表达p21ras蛋白的情况。结果显示本室制备的单链抗体可与除白血病细胞株外的所有癌细胞株均呈不同程度的阳性反应，显示了良好的抗肿瘤细胞株谱系。见附图15

免疫组织化学检测(SP法)

选取人体常见的胃癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌病例进行免疫组化检测。所用试剂盒同免疫细胞化学检测试剂盒。首先镜下重新审阅各病例的苏木素伊红(HE)染色切片，选取病变完整且无明显的出血、坏死的肿瘤蜡块进行厚度为4um切片。用防脱片载玻片捞取组织后，按常规脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入3％过氧化氢(H₂O₂)阻断内源性过氧化物酶，15分钟后加入本室制备的可溶性表达单链抗体悬液作为一抗过夜孵育，加入抗E-tag抗体作为二抗，室温作用30分钟后用DAB(3，3’-二氨基联苯胺)进行显色，显色时间控制在目的标记细胞或组织着色而背景不着色为准。切片经苏木素复染，常规中性树胶封片后进行镜下观察。每次实验均设立严格的阳性及阴性对照。

实验结果判定按染色强度及染色细胞百分数进行记分及统计分析。结果显示本申请人制备的单链抗体与所选的肿瘤呈明显阳性反应，阳性表达部位为细胞膜及细胞质，可以呈细颗粒、环胞膜深染状及胞质内点彩状染色，见附图16。正常组织表达阳性细胞数一般均少于5％，染色强度亦为弱阳性。所有病变中的纤维间质、血管等均呈阴性。结果证实本申请构建的单链抗体具有良好的特异性及敏感性。

实施例7：经融合及可溶性表达鉴定正确的T克隆菌液送测序公司测序，ScFv DNA测序结果表明序列排列方式为VH-Linker-VL，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现所有序列均符合小鼠轻重链可变区基因结构。五株单链抗体的测序结果见附图17、18、19、20、21。

Claims (2)

1.一种广谱抗p21ras蛋白的单链抗体及其制备方法，其特征在于：这是一种抗ras基因全蛋白序列的单链抗体，能广谱拮抗H-ras、K-ras、N-ras三种p21Ras蛋白；该单链抗体作为制备双价或多价单链抗体、细胞内抗体及其他小分子抗体研究的基础材料，用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

2.如权利要求1所述的单链抗体的制备方法，其特征是步骤如下：

(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从广谱抗p21Ras蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株中扩增获得其轻、重链可变区基因片段，通过柔性寡核苷酸链(Linker)将所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段；

(2)通过重叠延伸聚合酶链式反应，在单链抗体的基因片段两端引入Sfi I和Not I双酶切位点并与同样双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒，利用表达载体pCANTAB-5E上的通用引物进行菌液PCR鉴定，筛选出插入片段大小及方向正确的重组噬菌粒；

(3)将上述鉴定正确的重组噬菌粒转化琥珀抑制型大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13KO7进行挽救，目的单链抗体基因片段与表达载体中的基因3融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出对应的阳性重组噬菌粒；

(4)将筛选获得的阳性重组噬菌粒转化至非琥珀抑制型大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶表达，从而获得广谱抗p21ras蛋白的可溶性单链抗体，该可溶性单链抗体是目的单链抗体基因片段与表达载体上的E-tag标签融合表达的产物，以该单链抗体为一抗，以抗E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA和免疫组化技术检测目的单链抗体，证实该单链抗体可特异性识别细胞和组织中的H-ras、K-ras、N-ras三种p21Ras蛋白。

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