CN117603343B - 阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用，涉及多肽合成技术领域，其技术要点为：该天然短肽来源于Type V胶原蛋白，为截短型Type V胶原蛋白；其为基于HEPV核心结构域的小多肽分子HBS‑P1和HBS‑P3，HBS‑P1和HBS‑P3的序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；HBS‑P1和HBS‑P3在原核表达体系中表达的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。HBS‑P1由45个氨基酸组成，分子量为4.3kDa。HBS‑P3由68个氨基酸组成，分子量为6.4kDa。该小多肽分子HBS‑P1和HBS‑P3用于制备抑制FGF诱导的体内外血管生成的药物的制备以及抗上皮样肿瘤细胞的增殖的药物的制备。本发明的新型的短肽HBS‑P1只有45个氨基酸，其具备更高的安全性及临床应用价值，且其存在可能对细胞、组织的穿透力更强的效果。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用。
背景技术
本申请发明人前期报道了源自胶原蛋白片段分子的大多肽HEPV，其是首次文献报道的第一个依赖于肝素结合位点(HBS)阻断FGF的天然基质胶原多肽分子(Matrix Biol2020；94：18-30.)。该多肽HEPV源自胶原蛋白Collagen Vα1的天然肽(HEPV，该肽是由MMP2或MMP9蛋白酶降解胶原蛋白V衍生而来的)，通过其肝素结合位点(heparin-bindingsite)，能够特异地抑制bFGF而非VEGF165a诱导的血管生成。
bFGF介导其受体FGFR(成纤维细胞生长因子受体)信号通路广泛参与生理、病理作用，包括肿瘤。阻断bFGF-FGFR是重要的治疗“泛癌(多种固体肿瘤)”的途径。然而目前，临床使用阻断的bFGF-FGFR信号通抑制剂仅仅是FGFR小分子激酶抑制剂，其毒性大是限制其抗肿瘤更多适应症应用“卡脖子”的问题之一。
小分子抑制剂对“靶点的高选择性”不等同于其对“肿瘤病灶/组织/器官的高选择性”，其毒性更多源于“on-target”效应作用非病灶外的正常细胞、组织和器官，这可以解释为正常(非突变)的FGFR家族成员在生理和病理环境中的多样功能。临床试验中，使用FGFR选择性激酶抑制剂治疗LSCC患者，已经被广泛报道的药物毒性包括：乏力、脱发、口腔炎、指甲和皮肤毒性等，以及腹泻和其他胃肠道不良事件，特别是FGFR小分子抑制剂破坏了bFGF3(从骨骼分泌并作用于肾脏)生理维持的磷酸盐稳态，引发FGFR抑制剂非常常见(≥20％患者)的高磷血症不良反应。
本申请发明人研究证明，HEPV保留肝素结合位点结构域(HBS)，显示和FGF体内、体外特异的高亲和力，并能显著抑制体内外FGF诱导的血管生成。小鼠动物实验室没有显示出毒性。但是本申请发明人前期报道的这个多肽HEPV的分子量为12KDa，有144个氨基酸，其分子量过大，极大的限制了它的使用和临床转化价值。
为此，本发明旨在提供阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了阻断bFGF的胶原来源天然短肽，所述天然短肽来源于Type V胶原蛋白，为截短型Type V胶原蛋白；所述天然短肽为基于HEPV核心结构域的小多肽分子HBS-P1和HBS-P3，所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3的序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3在原核表达体系中表达的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述小多肽分子HBS-P1由45个氨基酸组成，分子量为4.3kDa。
进一步地，所述小多肽分子HBS-P3由68个氨基酸组成，分子量为6.4kDa。
进一步地，所述小多肽分子HBS-P1或小多肽分子HBS-P3的氨基酸序列与His-SUMO融合标签的C末端融合，得His-SUMO-P1融合蛋白或His-SUMO-P3融合蛋白；所述His-SUMO-P1融合蛋白和所述His-SUMO-P3融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述His-SUMO-P1融合蛋白和所述His-SUMO-P3融合蛋白经密码子优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了上述所述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽的应用，将所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3用于在抑制体内外血管生成的药物的制备。
进一步地，所述药物为FGF新型阻断剂。
本发明还提供了上述所述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽的另一应用，将所述多肽HBS-P1在制备抗肺鳞癌细胞的增殖的药物中的应用。
在本发明方案中，涉及的序列为：
SEQ ID NO.1(小多肽分子HBS-P1)：
ANGEKGGRGTPGKPGPRGQRGPTGPRGERG PRGITGKPGP KGNSGSEQ ID NO.2(小多肽分子HBS-P3)：
GSIGFPGFPGANGEKGGRGTPGKPGPRGQRGPTGPRGERGPRGITGKPGP KGNSGGDGPAGPPGERGP
SEQ ID NO.3(小多肽分子HBS-P1)：
GCTAACGGCGAAAAAGGTGGTCGTGGTACCCCGGGTAAACCGGGTCCGCGCGGTCAGCGTGGTCCAACTGGTCCGCGCGGCGAACGCGGTCCGCGCGGTATCACCGGTAAACCGGGCCCGAAAGGCAACTCTGGC
SEQ ID NO.4(小多肽分子HBS-P3)：
GGTTCTATCGGCTTCCCGGGTTTTCCGGGCGCGAATGGCGAGAAAGGCGGTCGTGGCACGCCGGGTAAACCGGGTCCACGTGGTCAGCGTGGTCCGACCGGCCCGCGTGGTGAGCGTGGTCCACGCGGTATCACTGGCAAACCGGGTCCGAAGGGTAACTCCGGCGGTGACGGCCCGGCCGGTCCGCCGGGTGAGCGTGGTCCG
SEQ ID NO.5(His-SUMO-P1融合蛋白)：
HHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGANGEKGGRGTPGKPGPRGQRGPTGPRGERGPRGITGKPGPKGNSG
SEQ ID NO.6(His-SUMO-P3融合蛋白)：
HHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSIGFPGFPGANGEKGGRGTPGKPGPRGQRGPTGPRGERGPRGITGKPGP KGNSGGDGPAGPPGERGP
SEQ ID NO.7(His-SUMO-P1融合蛋白)：
CACCACCACCATCATCACATGTCTGATTCTGAAGTTAACCAAGAAGCTAAACCGGAGGTAAAGCCGGAAGTTAAACCGGAAACCCATATTAACCTGAAGGTCTCCGACGGCTCTAGCGAAATCTTCTTCAAAATCAAAAAAACTACGCCGCTGCGCCGTCTGATGGAGGCATTCGCAAAACGTCAGGGTAAAGAAATGGATAGCCTGCGTTTCCTGTACGACGGTATCCGCATTCAGGCCGACCAGACTCCGGAAGATCTGGATATGGAAGATAACGACATCATCGAAGCGCATCGCGAACAGATTGGCGGCGCTAACGGCGAAAAAGGTGGTCGTGGTACCCCGGGTAAACCGGGTCCGCGCGGTCAGCGTGGTCCAACTGGTCCGCGCGGCGAACGCGGTCCGCGCGGTATCACCGGTAAACCGGGCCCGAAAGGCAACTCTGGC
SEQ ID NO.8(His-SUMO-P3融合蛋白)：
CACCACCATCACCACCACATGTCCGATTCTGAAGTGAACCAGGAAGCGAAACCGGAAGTTAAGCCGGAAGTGAAACCGGAAACTCACATCAACCTGAAAGTTTCCGATGGCTCTAGCGAAATTTTCTTCAAAATCAAAAAAACTACCCCGCTGCGTCGCCTGATGGAAGCGTTCGCGAAACGCCAAGGTAAGGAAATGGATAGCCTGCGTTTCCTGTACGATGGTATCCGTATTCAGGCAGACCAGACCCCTGAAGATCTGGATATGGAGGACAATGACATCATTGAGGCACACCGCGAACAGATTGGTGGTGGTTCTATCGGCTTCCCGGGTTTTCCGGGCGCGAATGGCGAGAAAGGCGGTCGTGGCACGCCGGGTAAACCGGGTCCACGTGGTCAGCGTGGTCCGACCGGCCCGCGTGGTGAGCGTGGTCCACGCGGTATCACTGGCAAACCGGGTCCGAAGGGTAACTCCGGCGGTGACGGCCCGGCCGGTCCGCCGGGTGAGCGTGGTCCG
本发明方案解决技术问题的难度及意义在于：
本申请发明人前期报道的这个多肽HEPV的分子量为12KDa，有144个氨基酸，其分子量过大，极大的限制了它的使用和临床转化价值。本申请发明人从细胞外基质(ECM)胶原蛋白分子中寻找特异性阻断bFGF的天然多肽类药物，相比较小分子抑制剂，前者治疗可能更具有“成药”的潜力，尤其是规避毒性的可能性。相比较申请人首次报道的阻断bFGF天然基质来源的多肽HEPV(126AA，已发表)，本发明方案旨在提供胶原来源天然短肽，基于对大分子肽优化改进的小分子短肽，使可能具有更强的细胞、组织穿透力，提高其安全性以及其的使用和临床转化价值。
与现有技术相比，本发明具体以下有益效果：
1、相比现有技术中报道的首个源自胶原蛋白CollagenVα1的天然肽HEPV(120个氨基酸)，本发明方案提供的新型的短肽HBS-P1只有45个氨基酸，其具备更高的临床应用价值，且短肽HBS-P1的细胞、组织穿透力更强；
2、本发明方案提供的短肽本身来自于哺乳动物包括的基质胶原蛋白，相比较现有临床使用的FDA批准的FGFR小分子抑制剂，本发明提方案的为天然多肽，其毒性更小；同时，由于本发明的HBS-P1肽的母肽HEPV特异靶点是bFGF，因此其只抑制bFGF诱导的FGFR激活，靶向性更好。
3、目前临床使用的FGFR1/2/3/4小分子抑制剂可以阻断所有FGF激活FGFR1/2/3/4受体，特别是FGFR小分子抑制剂破坏了FGF配体bFGF3(从骨骼分泌并作用于肾脏)生理维持的磷酸盐稳态，引发FGFR抑制剂非常常见(≥20％患者)的高磷血症不良反应，因此，本发明的短肽较现有的FGFR1/2/3/4小分子抑制剂更安全。
附图说明
图1是本发明实施例中His-SUMO-HBS-P1和His-SUMO-HBS-P3诱导表达及酶切前亲和层析纯化；
图2是本发明实施例中酶切条件优化；
图3是本发明实施例中酶切后亲和层析纯化(重力柱，Ni填料)；
图4是本发明实施例中纯化后多肽高分辨质谱分子量鉴定；
图5是本发明实施例中荧光共振能量转移测定bFGF与多肽或抗体的结合亲和力的新方法；
图6是本发明实施例中使用血管内皮细胞活力(CCK8)检测HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞增殖的能力；
图7是本发明实施例中使用血管内皮细胞(血管网络体外形成实验)检测HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管网格的能力；
图8是本发明实施例中使用血管芯片考察2微摩尔浓度的多肽HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管腔能力考察；
图9是本发明实施例中使用血管芯片考察2微摩尔浓度的多肽HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管腔能力考察；
图10是本发明实施例中使用2种上皮样肿瘤(鳞癌)裸鼠移植瘤模型考察多肽HBS-P1，HBS-P3抗肿瘤的能力；
图11是本发明实施例中His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白在大肠杆菌中的表达鉴定；
图12是本发明实施例中His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白Ni-NTA亲和层析纯化与鉴定；
图13是本发明实施例中His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白Ulp1酶切后Ni-NTA亲和层析纯化(流传模式)与鉴定。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：HEPV：源自胶原蛋白Collagen Vα1的天然肽(HEPV，该肽是由MMP2或MMP9蛋白酶降解胶原蛋白V衍生而来的)，通过其肝素结合位点(heparin-binding site)，能够特异地抑制bFGF而非VEGF165a诱导的血管生成；FGF：成纤维细胞生长因子；bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，又称FGF2，是FGF家族成员，广泛报道参与血管内皮细胞和上皮(肿瘤)细胞，有促增值，抗凋亡等功能。胶原：细胞外基质中的主要成分。
实施例：
本发明实施例提供的方案为：阻断bFGF的胶原来源天然短肽，本实施例方案的天然短肽为基于HEPV核心结构域的小多肽分子HBS-P1和HBS-P3，该小多肽分子HBS-P1和HBS-P3的序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。小多肽分子HBS-P1由45个氨基酸组成，分子量为4.3kDa。小多肽分子HBS-P3由68个氨基酸组成，分子量为6.4kDa。
上述阻断bFGF的胶原来源天然短肽应用于制备抑制FGF诱导的体内外血管生成的药物中，如FGF新型阻断剂等。上述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽还应用于制备抗上皮样肿瘤细胞的增殖的药物中。
在本实施例中，本申请发明人通过分子对接、结构预测、密码子优化、计算机蛋白分子互作考察等技术，构建了基于SUMO融合表达的pET-30a-His-SUMO-HBS-P1和pET-30a-His-SUMO-HBS-P3表达质粒，并在原核表达体系(E.coli BL21)中成功实现可溶表达。然后使用成功表达基于HEPV核心结构域的小多肽分子HBS-P1，HBS-P3，开展了体内、外亲和力，以及抗血管生成，抗上皮样细胞肿瘤的实验，显示出小多肽HBS-P1(45氨基酸)和FGF有高亲和力，组织/细胞穿透能力，显著抑制了FGF诱导的体内外血管生成，以及抑制了多种上皮样肿瘤的体内、外增殖。显示出抗上皮样来源肿瘤(鳞癌)的应用价值。
在本实施例中，His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白在大肠杆菌中的表达鉴定过程如下：
His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白的核苷酸序列首先经NdeI和XhoI酶切位点与pET-30a质粒拼接，构建His-SUMO-P1-pET30a和His-SUMO-P3-pET30a质粒，将质粒转入大肠杆菌感受态细胞后，通过带有卡那霉素抗性的LB+琼脂糖培养基平板进行阳性克隆菌落筛选，挑选阳性克隆细菌接种与带有卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃培养过夜，将活化细菌液以10％的接种比例接种至2LLB培养基中培养，待细菌浓度OD600达到2.0-3.0时，加入终浓度0.5mM IPTG进行蛋白诱导表达，诱导过程中培养温度降至22℃，诱导时间16小时，诱导结束后，收集细菌菌体，并采样使用SDS-PAGE进行蛋白表达鉴定(如图11所示)。
细菌破碎与His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白纯化：
将菌体沉淀与破菌缓冲液(20mM PB,0.5M NaCl,pH 6.5)按1:7.5(m/v)的比例充分混合、重悬。先用细胞超声破碎仪，以300w功率超声破碎3min，再将菌液转移至高压均质机，以4℃、400～600bar压力破碎5个循环，直至菌液澄清。将均质后悬液于12000r/min离心30min，分别取样破菌后上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定。以填料Ni-NTA 6FF(NTA)为层析填料，纯化BufferA(20mmol/L PB、500mmol/L NaCl，pH6.5)、纯化Buffer B2(20mmol/L PB、500mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH 6.5)为流动相，使用pure纯化仪采用镍柱亲和层析方法纯化进行纯化。依次设置梯度参数为20％B、60％B、100％B进行洗杂及洗脱。对纯化各阶段收集的样品进行电泳样品制样操作，后经SDS-PAGE鉴定纯化效果。结果显示His-SUMO-P1肽在100％B被大量洗脱，纯度约95％。His-SUMO-P3肽在60％B被大量洗脱，纯度约90％(如图12所示)。
His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白标签切除及P1与P3肽的纯化过程为：
将Ni亲和层析纯化所得的His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白进行缓冲液置换(20mmol/L PB、0.1mmol/LNaCl，pH 6.5)，SUMO蛋白酶(Ulp1)，以Ulp1酶与蛋白量比为1：20～1000的比例对His-SUMO-P1和His-SUMO-P3融合蛋白进行4℃过夜酶切(16小时)。然后进行Ni-NTA亲和层析纯化(流穿模式)，层析缓冲液A：20mmol/LPB、500mmol/L NaCl，pH 6.5；缓冲液B：20mmol/L PB、500mmol/LNaCl、500mmol/L咪唑，pH 6.5。采用镍柱亲和层析方法进行纯化，待样品流穿完全后，设置梯度参数为100％B进行His-SUMO挂柱蛋白的洗脱。对纯化各阶段收集的样品进行电泳样品制样操作，后经SDS-PAGE鉴定纯化效果，结果显示P1多肽和P3多肽以流穿的形式通过Ni-NTA柱，纯度约90％(如图13所示)。
以下为发明实施例方案的实验：
1.FGF新型阻断剂HBS-P1和HBS-P3表达和纯化
本申请发明人前期研究工作中已经成功制备获得HBS-P1(45aa，4.3kDa)和HBS-P3(68aa，6.4kDa)两个多肽。本申请发明人基于SUMO融合表达的策略，构建了pET-30a-His-SUMO-HBS-P1和pET-30a-His-SUMO-HBS-P3表达质粒，将两种质粒转入大肠杆菌，并在原核表达体系(E.coli BL21)中成功实现可溶表达(如图1中的A所示)。图1中的B和图2分别显示了SUMO融合多肽(酶切去除标签前)亲和层析纯化过程和酶切条件优化。图3显示经酶切去除His-SUMO融合标签后的HBS-P1和HBS-P3通过二次亲和层析(Flow-through模式)纯化后可获得较高纯度的多肽，均达到95％以上。
由于HBS-P1和P3肽的理论等电点高达12.01和11.61，因此在SDS-PAGE分析中，蛋白条带在电场中的泳动迁移速度显著低于正常对应分子量的蛋白maker的迁移速度。所以本申请发明人使用质谱分子量鉴定，准确考察目标多肽的信息，MALDI-TOF-MS质谱分子量鉴定的结果提示经酶切去除His-SUMO融合标签后的HBS-P1和HBS-P3通过二次镊金属亲和层析(Flow-through模式)纯化后可获得较高纯度的多肽，获取的目标多肽HBS-P1和HBS-P3分子量正确(如图4所示)。
2.新型多肽HBS-P1，HBS-P3和FGF亲和力测试
本申请发明人利用荧光共振能量转移技术(resonance energytransfer，FRET)评估HBS-P1或P3与bFGF的结合亲和力，并与bFGF的单克隆抗体FB-8进行比较。实验原理如图1中的A所示，Cy3标记的HBS-P1，HBS-P3或FB-8被用作FRET供体，Cy5标记的bFGF被用作FRET受体，供体染料Cy3的发射光谱与受体染料Cy5的吸收光谱有较好的光谱重叠，且Cy3和Cy5的发射光谱有较少的光谱串扰，可作为FRET对(如图1中的B所示)。HBS-P1，HBS-P3或FB-8与bFGF的特异性结合可以拉近Cy3和Cy5的距离，使得Cy3的能量通过共振转移到Cy5，本申请发明人能够观测到Cy3的荧光降低，Cy5的荧光增强，FRET信号变化通过FRET ratio或relative FR反映，FRET ratio为受体Cy5在最大发射波长673nm处的信号强度与供体Cy3在最大发射波长573nm处的信号强度之比，relative FR为FRET ratio与只有供体存在时的FRET ratio的相对变化值。
HBS-P1，HBS-P3和FB-8与Cy3的标记比分别为2.7，1.2和1.5，bFGF与Cy5的标记比为1.1。如图1中的G所示，随着bFGF-Cy5的浓度增加，HBS-P1-Cy3，HBS-P3-Cy3和FB-8-Cy3的relative FR均呈现出与bFGF-Cy5的浓度依赖性。随bFGF浓度进一步增加，relative FR值逐渐趋于稳定，表明多肽或抗体与bFGF的结合达到饱和。HBS-P1-Cy3，HBS-P3-Cy3和FB-8-Cy3体系中，bFGF-Cy5分别在10nM,30nM和60nM达到平台。
结合亲和力越强的多肽或抗体，其结合速率越快，relative FR的上升速率越大，因此可通过分析工作曲线斜率确定多肽与bFGF之间的结合亲和力。与FB-8阳性对照相比，我们观察到HBS-P1工作曲线的斜率几乎与其相当，这表明HBS-P1与bFGF结合的能力与FB-8相当。HBS-P1能够与bFGF形成稳定的复合物，其亲和力可与已知的FB-8一致。考察HBS-P3时，本申请发明人观察到其工作曲线的斜率与FB-8相比显著升高，且在达到最大平台值时，relative FR值也更高。这表明HBS-P3对bFGF表现出更高的亲和力。如图5所示，其提示：HSB-P3和HSB-P1与bFGF均有高的亲和力。其中HSB-P3亲和力更高(图5)。图5为荧光共振能量转移测定bFGF与多肽或抗体的结合亲和力的新方法。图5的A中：FRET测定多肽与bFGF结合亲和力实验原理；图5的B：Cy3(绿)和Cy5(红)的吸收光谱(虚线)和发射光谱图(实线)；C/D/E/F：bFGF-Cy5/P1-Cy3/P3-Cy3/FB-8-Cy3紫外吸收光谱表征；图5的G：P1/P3/FB-8与bFGF结合亲和力曲线。
3.体外使用血管内皮细胞考察多肽HSB-P1，HBS-P3抗FGF诱导血管生成的能力
使用细胞活力CCK8实验，显示多肽HSB-P1或HBS-P3在5微摩尔浓度下均能显著抑制FGF诱导的血管内皮细胞HUVEC增殖(如图6所示)，显著抑制FGF诱导血管内皮细胞血管网络的数目(如图7所示)；HBS-P1和HBS-P3在2微摩尔浓度下均能显著抑制了FGF诱导血管内皮细胞体外形成血管腔的面积和血管直径(如图8所示)。
其中，图6为使用血管内皮细胞活力(CCK8)检测HSB-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞增殖的能力。阳性对照FGFR激酶抑制剂(Erdafitinib)。
图7为使用血管内皮细胞(血管网络体外形成实验)检测HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管网格的能力。(UT，对照组)。
图8为使用血管芯片考察2微摩尔浓度的多肽HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管腔能力考察。(control，对照组)。
4.体外考察使用多种上皮来源肿瘤(鳞癌)细胞考察多肽HBS-P1，HBS-P3抗FGF诱导细胞增殖的能力
使用CCK8细胞活力测试，分别考察了多肽HBS-P1，和BS-P3抑制FGF诱导鳞状细胞癌(H1703和H226细胞)增殖的能力。在H1703鳞状癌细胞，FGF显著诱导了该细胞增殖，多肽HBS-P1使用10微摩尔显著拮抗了FGF促H1703增殖的作用。多肽HBS-P3的拮抗FGF诱导细胞H1703增殖的能力不显著(如图9的左图所示)。
在H226鳞状癌细胞，FGF显著诱导了该细胞增殖，多肽HBS-P1使用10微摩尔显著拮抗了FGF促H226细胞增殖的作用，多肽HBS-P3拮抗作用不显著。阳性对照FGFR激酶抑制剂(Erdafitinib)显著抑制了细胞增殖(如图9右图所示)。
图9为使用血管芯片考察2微摩尔浓度的多肽HBS-P1，HBS-P3抑制FGF诱导血管内皮细胞形成血管腔能力考察。(UT，对照组)。
5.体内使用考察多种上皮来源肿瘤(鳞癌)细胞裸鼠移植瘤模型，考察多肽HBS-P1，P3抗肿瘤细胞增殖的能力以及毒性的初步考察。
体内水平，在模型鼠H1703观察到多肽HBS-P1和HBS-P3有显著的抗肿瘤作用；在模型鼠H226，仅观察到HBS-P1有显著统计学意义的抗肿瘤作用。多肽注射后小鼠后，体重变化不超过10％，没有观察到显著的毒性。
图10为使用2种上皮样肿瘤(鳞癌)裸鼠移植瘤模型考察多肽HBS-P1，HBS-P3抗肿瘤的能力。分别设置UT(对照组)，HBS-P1多肽组，HBS-P3多肽组，每组10只裸鼠。
通过本发明的上述实施例，本申请发明人基于前期已经取得的研究工作基础对HEPV多肽结构与功能的认知和AlphaFold对结构的预测结果，发明方案设计优化了HBS-P1(45aa，4.3kDa)和HBS-P3(68aa，6.4kDa)两个序列肽，并构建了基于SUMO融合表达的pET-30a-His-SUMO-HBS-P1和pET-30a-His-SUMO-HBS-P3表达质粒，并在原核表达体系(E.coliBL21)中成功实现可溶表达，通过Ni-Sepharsoe柱纯化后，再经过SUMO蛋白酶(Ulp1)酶切后，成功制备获得HBS-P1和HBS-P3两个多肽。本发明的天然多肽已经缩短到45个氨基酸，其体内、外展示出和FGF高亲合力，以及抑制FGF诱导的血管生成和上皮样肿瘤细胞的增殖。较现有技术，其具备更高的安全性及临床应用价值，且其对细胞、组织穿透力更强。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (5)
1.阻断bFGF的胶原来源天然短肽，其特征是：所述天然短肽来源于Type V胶原蛋白，为截短型Type V胶原蛋白；所述天然短肽为基于HEPV核心结构域的小多肽分子HBS-P1或HBS-P3，所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3的序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3在原核表达体系中表达的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽的融合蛋白，其特征是：所述小多肽分子HBS-P1或小多肽分子HBS-P3的氨基酸序列与His-SUMO融合标签的C末端融合，得His-SUMO-P1融合蛋白或His-SUMO-P3融合蛋白；所述His-SUMO-P1融合蛋白和所述His-SUMO-P3融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述His-SUMO-P1融合蛋白和所述His-SUMO-P3融合蛋白经密码子优化后的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求1任一项所述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽的应用，其特征是：所述小多肽分子HBS-P1和HBS-P3在抑制体内外血管生成的药物制备中的应用。
4.如权利要求3所述的阻断bFGF的胶原来源天然短肽的应用，其特征是：所述药物为bFGF阻断剂。
5.如权利要求1中所述的小多肽分子HBS-P1在制备抗肺鳞癌细胞的增殖的药物中的应用。
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