JPH0597698A - 機能性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 インスリン結合担体として有用なヒトコラー
ゲンＶ型に相当する人工の新規なポリペプチドを提供す
る。 【構成】 一般式 （Ｘ）_m −（Ｙ）_n −（Ｚ） （式
中Ｘはヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインペプチ
ド、Ｙはスペーサー、Ｚはその配列中に配列表の配列番
号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、
ｍ及びｎは１又は０である）で表される人工の機能性ポ
リペプチド。ＺはヒトコラーゲンＶ型のα１鎖中のポリ
ペプチドの６、９、３３番目のＨｙｐがＰｒｏに置換さ
れたものである。 【効果】 インスリンを利用する分野での新ポリペプチ
ドとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規ポリペプチドに関
し、更に詳細にはインスリン結合活性を有する人工のポ
リペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトコラーゲンＶ型（以下、ｈ−ＣolＶ
と表示する）は、様々な組織に広く存在する細胞外マト
リクスであり、トロンボスポンジン、ＤＮＡ、ヘパリン
と結合性を示し、また、創傷部位で移動している表皮細
胞によって合成されることが知られている。本発明者ら
は先にこのｈ−ＣolＶが強いインスリン結合活性を有す
ることを見出している（特開平２−２０９８９９号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ｈ−ＣolＶはインスリ
ン結合担体として有用であり、成長因子活性、及びホル
モン活性を有するインスリンの新しいドラグデリバリー
システムを構築することができる。しかし、ｈ−ＣolＶ
は生体内物質であり、大量に調製することは困難であ
る。また、生体由来の夾雑物の混入も避けられない。本
発明の目的は、上記インスリン結合担体として有用なｈ
−ＣolＶに相当する人工のポリペプチドを創製すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば本発
明は人工の機能性ポリペプチドに関し、下記一般式（化
１）で表されることを特徴とする。

【０００５】

【化１】（Ｘ）_m −（Ｙ）_n −Ｚ

【０００６】（式中Ｘはヒトフィブロネクチンの細胞接
着ドメインポリペプチド、Ｙはスペーサー、Ｚはその配
列中に配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチド、ｍ及びｎは１又は０である）

【０００７】本発明のインスリン結合活性ポリペプチド
とは、そのアミノ酸配列中に配列表の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を含有するものであればよい。

【０００８】なお配列表の配列番号１で表されるアミノ
酸配列は、特開平２−２０９８９９号公報、ビオキミカ
エ ビオフィジカ アクタ（ Biochimica et Biophys
icaActa )、第１０３５巻、第１３９〜１５４頁（１９
９０）にそれぞれ記載の配列表の配列番号２で表され
る、ｈ−ＣolＶのα１鎖中のインスリン及びヘパリン結
合部位ポリペプチドの第６、９、３３番目のＨｙｐがＰ
ｒｏに置換されたものである。

【０００９】配列表の配列番号１で表されるポリペプチ
ドは、例えば化学的に合成できる。また該ポリペプチド
をその配列中に含有するポリペプチドとしては、配列表
の配列番号３で表されるポリペプチド（以下ＣolＶ−Ｉ
ｎと略す）があり、該ポリペプチドは例えば遺伝子工学
的に作成することができる。

【００１０】ｈ−ＣolＶのα１鎖の遺伝子配列は、先に
本発明者らが解明しており〔ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（ TheJournal of Biologi
calChemistry ) 、第２６６巻、第１３１２４〜１３１
２９頁（１９９１）〕、配列表の配列番号３で表される
ＣolＶ−Ｉｎのアミノ酸配列は、該文献に記載の第７９
９番から第９８４番までのアミノ酸配列と同一である。

【００１１】この部位に対応するＤＮＡ断片は、例えば
ヒト胎盤ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡよりＰＣＲ〔 P
olymerase Chain Reaction：サイキ（ Saiki )ら、サイ
エンス（ Science )、第２３０巻、第１３５０〜１３５
４頁（１９８５）〕により増幅し、得ることができる。
次に増幅されたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処
理し、例えばｐＴＶ１１８Ｎ〔フェブス レターズ（Ｆ
ＥＢＳ Letters )、第２２３巻、第１７４頁（１９８
５）〕の同サイトにライゲーションすることにより、該
ＤＮＡ断片を含有するプラスミドｐＴＶＣolＶを作成す
ることができる。

【００１２】目的ポリペプチドの高発現性プラスミドを
得るためには、例えばｐＴＶＣolＶより、目的ポリペプ
チドをコードするＤＮＡをＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで切り
出し、次いで、高発現性プラスミド、例えばｐＥＴ８ｃ
の同サイトに導入し、プラスミドｐＥＴＣolＶを作成す
る。該プラスミドを図１に示す。なお図１中ＡはＣolＶ
−ＩｎをコードするＤＮＡ断片部位を示す。

【００１３】ｐＥＴ系プラスミドはスタディー（ Studi
e ) らが作成したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ プロモータ
ーを有するプラスミドで、これをＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼを発現する大腸菌ＢＬ−２１株に導入することで効果
的にタンパク質を発現することができる。ｐＥＴＣolＶ
で大腸菌ＢＬ−２１株を形質転換し、該形質転換株を培
養することにより、配列表の配列番号３で表されるＣol
Ｖ−Ｉｎを発現させることができ、培養菌体のＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、分子量約１８ｋｄのポリペプチドにイ
ンスリン結合活性が確認される。

【００１４】インスリン結合活性を有するポリペプチド
に細胞接着活性を合せもたせれば、各種細胞への親和性
を更に高めることができ、インスリン結合担体の機能が
増加する。

【００１５】この様なポリペプチドは例えば前記ＣolＶ
−Ｉｎと細胞接着活性ポリペプチドをタンパク質工学的
手法や遺伝子工学的手法で結合させることによって作成
することができる。また例えばＣolＶ−Ｉｎの配列中
に、細胞接着活性ポリペプチドを移植することによって
も作成することができる。

【００１６】細胞接着活性ポリペプチドとしては、細胞
接着性を付与できるものであれば何でもよいが、例えば
ヒトフィブロネクチン（以下ｈ−ＦＮと略す）の細胞接
着ドメインポリペプチドを用いることができる。

【００１７】ｈ−ＦＮのタンパク質の一次構造について
は、ジ エンボ ジャーナル（ TheＥＭＢＯ Journal
)、第４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）に記
載されている。また、その細胞接着ドメインをコードす
るｃＤＮＡクローン（ｐＬＦ５）についてはバイオケミ
ストリー（ Biochemistry ) 、第２５巻、第４９３６〜
４９４１頁（１９８６）に記載されている。本発明者ら
は、ｐＬＦ５から、細胞接着ドメインに対するｃＤＮＡ
断片を取出し、これを発現ベクターに接続して大腸菌に
導入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及びそ
の製造方法を開発し特許出願した（特開平１−２０６９
９８号）。本発明で必要とされる細胞接着ドメインのｃ
ＤＮＡは、例えば特開平１−２０６９９８号公報に記載
されている組換え体プラスミドｐＴＦ７０２１を用い調
製することができる。なお、ｐＴＦ７０２１はＦＮのＰ
ｒｏ¹²³⁹−Ｍｅｔ¹⁵¹⁷（２７９アミノ酸残基：配列表の
配列番号４で表されるポリペプチド）を発現するプラス
ミドである。ｐＴＦ７０２１の翻訳領域のＣ末端のスト
ップコドンの直前にクローニングサイト、例えばＮｃｏ
Ｉサイトを導入することにより、細胞接着ドメインのｃ
ＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡを連結さ
せることができる。

【００１８】なお、本明細書において、細胞接着活性ポ
リペプチドのアミノ酸に付された肩数字は、ＥＭＢＬ
データバンク（ EMBL DATA BANK ) 中のＦＮのｃＤＮＡ
配列を翻訳して得られるアミノ酸配列に付されたＮ末か
らのアミノ酸残基数を示す。

【００１９】前出のｐＴＶＣolＶをＮｃｏＩ、Ｈind II
I で処理し、ＣolＶ−ＩｎをコードするＤＮＡ断片を調
製し、次に前記ｐＴＦ７０２１から誘導されたプラスミ
ドｐＴＦ７５２０の翻訳領域の３′末端ＮｃｏＩ、Ｈin
d III サイトに接続することにより、ｈ−ＦＮの細胞接
着ドメインとインスリン結合活性ポリペプチドが連結し
た配列表の配列番号５で表されるポリペプチド（以下、
Ｃ２７７−ＣolＶと略す）を発現する組換体プラスミド
ｐＴＦ７５２０ＣolＶが得られる。該プラスミドを図２
に示す。なお、図２中ＡはＣolＶ−ＩｎをコードするＤ
ＮＡ断片部位、Ｂは細胞接着ドメインをコードするＤＮ
Ａ断片部位を示す。

【００２０】ｐＴＦ７５２０ＣolＶにおける連結部には
スペーサーのＭｅｔをコードするＤＮＡがリンカーとし
て含まれる。リンカーの有無は、本発明の効果を左右す
るものではないが、必要とあれば部位特異的変異の手法
により、容易に除去することができる。すなわち前出の
式（化１）中におけるスペーサーは、細胞接着活性ポリ
ペプチドとインスリン結合活性ポリペプチドの分子間距
離を調節するための挿入配列でもあり、任意のアミノ酸
又はポリペプチドを用いることができ、また必要に応じ
除去することもできる。またこのスペーサーのアミノ酸
配列を細胞接着活性ポリペプチドのＣ末端、インスリン
結合活性ポリペプチドのＮ末端にそれぞれ目的に応じ付
加することができ、また除去することもできる。

【００２１】得られたプラスミドｐＴＦ７５２０ＣolＶ
を大腸菌に導入し、適当な条件下に培養することによ
り、目的ポリペプチドが大腸菌内に蓄積される。発現の
確認にはイムノブロッティングが用いられる。組換え大
腸菌の全菌体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した
後、泳動パターンをニトロセルロース膜に移し取る。ｈ
−ＦＮの細胞接着ドメインを認識するモノクローナル抗
体（ＦＮ−１０、宝酒造）及びインスリン結合活性測定
方法で検出されるバンドが目的のポリペプチドである。

【００２２】目的ポリペプチドの精製は、例えば次のよ
うに行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養
し、集菌した後、超音波処理により、菌体破砕液を得、
これを遠心分離して上清を得る。上清を透析後、ヘパリ
ン−アガロース等のアフィニティクロマトを行う。以上
の操作により、目的のポリペプチドを精製することがで
きる。

【００２３】本発明のポリペプチドのインスリン結合活
性は以下の方法で検出される。すなわち、本発明のポリ
ペプチドを適当な濃度のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、これをニトロ
セルロース膜ヘブロッティングする。これにパーオキシ
ダーゼ標識したインスリンをＰＢＳ中で反応させ、充分
に洗浄した後に、４−クロロ−１−ナフトールと過酸化
水素を基質として標識パーオキシダーゼ活性を検出す
る。

【００２４】また細胞接着活性の測定は、例えばルオス
ラティ（ Ruoslahti )等の方法（メソッズ イン エン
ザイモロジー（ Methods in Enzymology )、第８２巻、
第８０３〜８３１頁（１９８１）〕に準じて行う。すな
わち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキングした
マイクロタイタープレートに、スイスマウス３Ｔ３又は
Ｂ１６−Ｆ１０又はＭＴＤ細胞の懸濁液を添加し、３７
℃で約１時間インキュベートした後、未吸着の細胞を洗
浄した後、吸着した細胞をトリプシン処理により回収
し、クールターカウンターにて細胞数を測定することに
より、細胞接着の強さを測定することができる。

【００２５】表１に本発明で作成したポリペプチドのイ
ンスリン結合活性、細胞接着活性を示す。

【００２６】

【表１】 表 １ ────────────────────────────────── インスリン結合活性 細胞接着活性 ────────────────────────────────── ＣolＶ−Ｉｎ ＋＋ − Ｃ２７７−ＣolＶ ＋＋ ＋＋ ────────────────────────────────── （＋＋：強い結合活性、−：活性無し）

【００２７】表１に示す様に、本発明の配列表の配列番
号１で表すポリペプチドを分子中に有するポリペプチド
は、天然のｈ−ＣolＶのα１鎖と構造は異なるが、強い
インスリン結合活性を示す。

【００２８】このインスリン結合担体、及び細胞接着活
性を合せ持つインスリン結合担体は、成長因子活性、及
びホルモン活性を有するインスリンのホメオスタシスを
調節することが可能であり、糖尿病患者に代表される種
々の疾患々者にインスリンを投与する時、インスリンの
作用部位へのターゲッティングに優れた、持続時間の長
い、安全で、免疫原性のない医薬品を作ることができ、
インスリンの効果を最大限に発揮させ、かつ、副作用の
ない新しい製剤及びドラグデリバリーシステムを構築す
ることが可能となる。例えば、生化学的研究に有効な増
殖促進試薬が提供され、表皮細胞の増殖を高め、皮膚の
老化を防ぐ有用な化粧品が提供され、更に外傷や外科手
術後の創傷治癒を促進する経皮薬及び治療薬が提供さ
れ、糖尿病の治療に用いる持続性の高い、副作用のない
インスリン製剤が提供される。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００３０】実施例１ ＣolＶ−Ｉｎの作成 （１−１）インスリン結合部位をコードするＤＮＡのク
ローニング及び発現ヒト胎盤ｍ−ＲＮＡ（クローンテッ
ク社）よりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖のｃＤ
ＮＡを合成した〔メソッズ イン エンザイモロジー
第１５２巻、第３１６〜３２４頁（１９８７）〕。すな
わち、反応液２５ｍＭトリス( Tris)−ＨＣｌ、ｐＨ
８．３、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
５００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ）オリゴｄ（Ｔ）_12-18 ０．５μｇ（計２０
μｌ）を９５℃、５分間加熱し、その後、０．５μｇ
ｍ−ＲＮＡを加えた。更に９５℃、３分間加熱し、氷中
で急冷した。これに終濃度５．７６μＭのβ−メルカプ
トエタノールを加え、更に２５ユニットの逆転写酵素
（宝酒造社製：ＲＡＶ−２）を加え（計２５μｌ）４２
℃、６０分反応させた。この産物を以下の条件でＰＣＲ
にかけた。すなわち、配列表の配列番号６、７でそれぞ
れ表されるプライマー，をＤＮＡ合成機で合成し、
精製し用いた。プライマーの塩基番号９〜２７は前出
ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
に記載のｈ−ＣolＶの第７９９〜８０４番目のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列、塩基番号４〜９はクロー
ニング用に末端に導入したＮｃｏＩ制限酵素サイトであ
り、プライマーの塩基番号１４〜３１は同第９７９〜
９８４番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのアンチ
センス配列、塩基番号５〜１０はクローニング用に末端
に導入したＢａｍＨＩ制限酵素サイト、塩基番号１１〜
１３は新たに導入したストップコドンである。ＰＣＲは
宝酒造社製 ジーンアンプキットを用い、テンプレート
は前述のｃＤＮＡ産物０．１μｌ、温度サイクル９４
℃、３０秒→５５℃、１分→７２℃、１分で３０サイク
ル行った。反応液の１／１０量を４％アガロースゲル電
気泳動にかけ、その結果５８０ｂｐの目的ＤＮＡ断片の
増幅を確認した。この産物をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処
理し、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎの同サイトに１６℃、
３０分ライゲーションした（宝酒造社製ライゲーション
キットを使用）。これにより構築されたプラスミドをｐ
ＴＶＣolＶと命名し、これを更にＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ
処理し、約５８０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動を用いて回収した。次に本ＤＮＡ断片を前述のプ
ラスミドｐＥＴ８ｃの同サイトに前述の条件でライゲー
ションした。これによって構築されたプラスミドをｐＥ
ＴＣolＶと命名して、前述の大腸菌ＢＬ−２１株へ導入
し形質転換体を得た。次に、得られた形質転換体中１８
クローンについてプラスミドの分析を行った。すなわ
ち、ラピッド法で調製したプラスミドをＮｃｏＩ及びＢ
ａｍＨＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予
想されるＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（０．５８ｋｂ）の
バンドの生成を調べた。その結果、１クローンに目的の
バンドが認められた。また、ダイデオキシ法により塩基
配列を決定し、目的の配列を含むことを確認した。この
プラスミドを保持する大腸菌ＢＬ−２１は Escherichia
coli ＢＬ−２１／ｐＥＴＣolＶと命名、表示して、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５５
８号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５５８）として寄託した。本
菌株を５０μｇ／mlアンピシリンを含むＬ−培地中でＯ
Ｄ₆₀₀ ≒０．５まで培養し、更に１ｍＭ ＩＰＴＧを加
え一晩培養した。培養菌体を４→２０％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分析したところ、分子量約１８ｋｄにポリペ
プチドの発現を確認した。更に前述のウエスタンブロッ
ト法でインスリン結合性をチェックしたところ、本ポリ
ペプチドにインスリン結合活性を認めた。

【００３１】（１−２）発現ポリペプチドの精製 （１−１）で得た Escherichia coli ＢＬ−２１／ｐＥ
ＴＣolＶを５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−培地
１０mlで一夜培養した。この前培養液０．２mlを５０μ
ｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−培地１００mlに接種し
３７℃で培養した。６００ｎｍの吸光度が０．４の時点
で、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド）を１ｍＭになるように添加し、一晩培養した後集菌
した。得られた菌体を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％
ノリデット（ Noridet )Ｐ−４０、１０μｇ／mlアプロ
チニン ( aprotinin )、１０μｇ／mlロイペプチン（ l
eupeptin )、２ｍＭ ＰＭＳＦを含むＰＢＳ（−）５ml
に懸濁し、超音波処理を２分行って菌体を破砕した。こ
の菌体破砕液を遠心して得た上清をＰＢＳ（−）にて平
衡化してヘパリン−５ＰＷ ＨＰＬＣカラム（東ソー）
にかけ、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ（−）で溶出
した。この溶出画分についてＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ったところ、ほぼ単一な１８ｋｄの
目的ポリペプチドが確認された。

【００３２】（１−３）発現ポリペプチドへのヘパリン
の作用 ｈ−ＣolＶのα１鎖のインスリン結合部位はヘパリン結
合活性も示すことから、（１−２）で得た本ポリペプチ
ドに対するヘパリンとインスリンの結合性について検討
した。すなわち、前述のウエスタンブロット法におい
て、ブロッティングの後、０．５μｇ／mlのパーオキシ
ダーゼ標識インスリンを反応させる際に０．１μｇ、
１．０μｇ、１０μｇ、１００μｇ、及び１mgのヘパリ
ンを共存させパーオキシダーゼ発色の変化をみた。その
結果、本ポリペプチドのインスリン結合性は加えるヘパ
リンによって強く阻害されることが示された（表２）。

【００３３】

【表２】 表 ２ ────────────────────────────────── ヘパリン添加量（μｇ／ml） パーオキシダーゼ発色性 ────────────────────────────────── ０．１ ＋＋ １ ＋ １０ − １００ − １０００ − ────────────────────────────────── （＋＋：強い発色、＋：弱い発色、−：発色を認めず）

【００３４】実施例２ Ｃ２７７−ＣolＶの作成 （２−１）融合ポリペプチドをコードするＤＮＡのクロ
ーニング （１−１）のｐＴＶＣolＶをＮｃｏＩ、Ｈind III で処
理し、これを前述ｐＴＦ７５２０のＮｃｏＩ、Ｈind II
I サイトに前述の条件でライゲーションした。これによ
って構築されたプラスミドをｐＴＦ７５２０ＣolＶと命
名し、次いで該プラスミドを用い、大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換した。得られた形質転換体中１８クローンにつ
いてプラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法
で調製したプラスミドをＨind III 及びＮｃｏＩで分解
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予想されるＮｃｏ
Ｉ−Ｈind III 断片（０．５８ｋｂ）のバンドの生成を
調べた。その結果、１クローンに目的のバンドが認めら
れた。また、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、
目的の配列を含むことを確認した。このプラスミドを保
持する大腸菌ＪＭ１０９を Escherichia coli ＪＭ１０
９／ｐＴＦ７５２０ＣolＶと命名、表示して、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５６０号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５６０）として寄託した。上記菌
株を５０μｇ／mlアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧを含
むＬ−培地中で培養し、次いで培養菌体タンパク質を４
→２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量４
８ｋｄにポリペプチドの発現を確認した。更に、このポ
リペプチドのインスリン及びＦＮ−１０への結合性を確
認した。

【００３５】（２−２）発現ポリペプチドの精製 （２−１）で得た Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴ
Ｆ７５２０ＣolＶを５０μｇ／mlのアンピシリンを含む
Ｌ−培地１０mlで一夜培養した。この前培養液０．２ml
を５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−培地１００ml
に接種し３７℃で培養した。６００ｎｍの吸光度が０．
４の時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、一
晩培養した後集菌した。得られた菌体を１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．０５％ノリデットＰ−４０、１０μｇ／mlアプ
ロチニン、１０μｇ／mlロイペプチン、２ｍＭ ＰＭＳ
Ｆを含むＰＢＳ（−）５mlに懸濁し、超音波処理を２分
行って菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心して得た
上清を、ＰＢＳ（−）にて平衡化してヘパリン−５ＰＷ
ＨＰＬＣカラム（東ソー）にかけ、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含むＰＢＳ（−）で溶出した。この溶出画分につい
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったと
ころ、ほぼ単一な４８ｋｄの目的ポリペプチドが確認さ
れた。

【００３６】実施例３ 前記実施例１及び２で得られたポリペプチドを用いて、
インスリン結合活性、細胞接着活性及び細胞増殖促進活
性を測定した。

【００３７】（３−１）インスリン結合活性の測定 ＣolＶ−Ｉｎ及びＣ２７７−ＣolＶを、それぞれＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
で分離し、ウェスタンブロット法によりニトロセルロー
ス膜に転写した後、１０μｇ／mlパーオキシダーゼ標識
インスリン（シグマ社製）を添加した０．０５％ツィー
ン（ Tween )２０−ＰＢＳ（−）溶液中で、室温、２時
間反応させた。このニトロセルロース膜を０．０５％ツ
ィーン２０−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、ニトロセ
ルロース膜に結合したパーオキシダーゼ活性を０．３mg
／mlでＰＢＳ（−）に溶解した４−クロロ−１−ナフト
ールと０．０１５％過酸化水素を基質として検出した。
この結果、パーオキシダーゼ標識インスリンは、分子量
１８ｋｄのＣolＶ−Ｉｎ及び分子量４８ｋｄのＣ２７７
−ＣolＶにそれぞれ結合した。

【００３８】（３−２）細胞接着活性の測定 細胞接着活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イ
ン エンザイモロジー、第８２巻、第８０３〜８３１頁
（１９８１）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、ＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝化生理食塩水）等に溶かし、２４穴マイ
クロプレートに注入した。室温、２時間インキュベート
して、試料をプレート上に吸着させた（４００μｌ／ウ
エル）。２％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ
溶液を５００μｌ／ウエル加え、３７℃、２時間インキ
ュベートしてプレートをブロックした。ＰＢＳでプレー
トを洗浄後、あらかじめダルベッコ( Dulbecco^, S ) イ
ーグル最小栄養培地（ＤＭＥＭ）に懸濁したスイスマウ
ス３Ｔ３又はＢ１６−Ｆ１０又はＭＴＤ細胞を１×１０
⁵ 細胞／ウエル分注し、３７℃、１時間インキュベート
した。なお使用した細胞は、凍結保存した株を継代培養
後、トリプシン処理（３７℃、５分）したものを用い
た。ＰＢＳでプレートを洗浄後、トリプシン処理にて吸
着細胞を回収し、クールターカウンターにて細胞数を測
定することにより細胞接着活性を測定した。Ｃ２７７−
ＣolＶ及びＣolＶ−Ｉｎの結果を表３に示す。

【００３９】

【表３】 表 ３ ───────────────────────────── 試 料（０．５μＭ） 細胞接着活性 ───────────────────────────── Ｃ２７７−ＣolＶ ＋＋ ＣolＶ−Ｉｎ − ───────────────────────────── （＋＋：強い活性、−：活性無し）

【００４０】数値は試料をプレートに吸着させた際の濃
度を示す。Ｃ２７７−ＣolＶはいずれの細胞でも接着活
性を示した。

【００４１】（３−３）細胞増殖促進活性の測定 （３−２）で細胞接着活性を示したＣ２７７−ＣolＶの
細胞増殖促進活性を検討した。ＰＢＳに溶解したＣ２７
７−ＣolＶを、２４穴マイクロプレートに４００μｌ／
ウエル入れ、３７℃、２時間インキュベートして、試料
をプレート上に吸着させた。ＰＢＳでプレートを洗浄
後、インスリン溶液を４００μｌ／ウエル加え、室温で
一晩インキュベートし、インスリンを吸着させた。プレ
ートをＰＢＳで洗浄した後、１０μｇ／mlトランスフェ
リン、５mg／mlＢＳＡを含むダルベッコ最小栄養培地
（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）１対１
混合培地に懸濁したＭＴＤ細胞５×１０⁴ 細胞／ウエル
及び ³Ｈ−チミジン０．１μCi／ウエルを加えた。５％
ＣＯ₂ 存在下、３７℃４８時間培養した後、プレートを
ＰＢＳで洗浄し、５％ＴＣＡを５００μｌ／ウエル加
え、４℃、４時間静置して細胞を固定した。ＴＣＡを除
去した後、２％Ｎａ₂ ＣＯ₃ を含む０．１Ｎ ＮａＯＨ
４００μｌ／ウエルを加えて固定化した細胞を溶解し、
液体シンチレーションカウンターにより ³Ｈ−チミジン
の取込みを測定した。なお対照として特開平１−２０６
９９８号公報に記載の配列表の配列番号８で表される細
胞接着性ポリペプチド（Ｃ−２７４と略す）を使用し
た。表４に示す様にＣ２７７−ＣolＶを使用した場合、
Ｃ−２７４に比べ、高い ³Ｈ−チミジンの取込み、すな
わち細胞増殖促進活性を示した。

【００４２】

【表４】 表 ４ ────────────────────────────────── 試 料 ³Ｈ−チミジンの取込み（×１０³ cpm ） ────────────────────────────────── Ｃ２７７−ＣolＶ １０．５ Ｃ−２７４ ６．６ ──────────────────────────────────

【００４３】次に細胞数の測定により細胞増殖促進活性
を調べた。前述のように、各試料を吸着させ、更にイン
スリンを吸着させたプレートにＭＴＤ細胞を加えた。５
％ＣＯ₂ 存在下で４８時間培養した後、細胞数を測定し
た。その結果、本ポリペプチドを吸着させた場合対照と
したＣ−２７４に比べ、多くの細胞の増殖が認められた
（表５）。

【００４４】

【表５】 表 ５ ────────────────────────────── 試 料 細 胞 数 （×１０⁵ ） ────────────────────────────── Ｃ２７７−ＣolＶ １．７ Ｃ−２７４ １．１ ──────────────────────────────

【００４５】

【発明の効果】以上、述べたごとく、本発明により、イ
ンスリン結合活性を有する新規ポリペプチド及び細胞接
着活性とインスリン結合活性を合せ持つ新規ポリペプチ
ドが提供される。これらのポリペプチドはインスリンと
細胞との親和性を高めることができ、インスリンを用い
ることに生化学的ないし医学的意義が見出せる分野に有
用な作用、効果を示すものであり、特にインスリンの新
しい製剤及びドラグデリバリーシステムに応用されるも
のである。

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：35 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg 1 5 10 15 Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Lys Pro Gly Pro 35 配列番号：2 配列の長さ：35 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 6 4Hyp 9 4Hyp 33 4Hyp 配列： Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg 1 5 10 15 Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Lys Pro Gly Pro 35 配列番号：3 配列の長さ：186 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp 1 5 10 15 Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu 35 40 45 Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro 65 70 75 Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro 80 85 90 Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg 110 115 120 Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys 125 130 135 Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg 140 145 150 Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys 155 160 165 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro 170 175 180 Gly Gln Arg Gly Glu Thr 185 配列番号：4 配列の長さ：279 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met 275 配列番号：5 配列の長さ：464 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly 275 280 285 Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly 290 295 300 Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly 305 310 315 Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly 320 325 330 Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly 335 340 345 Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly 350 355 360 Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly 365 370 375 Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly 380 385 390 Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly 395 400 405 Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly 410 415 420 Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly 425 430 435 Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 440 445 450 Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Thr 455 460 配列番号：6 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴：1-27 S primer 配列： GATCCCATGG GCATCCGTGG TCTGAAG 27 配列番号：7 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴：1-31 S primer 配列： GATCGGATCC TTAAGTCTCG CCTCTCTGTC C 31 配列番号：8 配列の長さ：274 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＥＴＣolＶの構造を示す図であ
る。

【図２】プラスミドｐＴＦ７５２０ＣolＶの構造を示す
図である。

フロントページの続き (72)発明者 野田 晃弘 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 畑井 美香 東京都中央区入船１−９−10 (72)発明者 矢追 義人 神奈川県横浜市港北区箕輪町１−30−１− 212

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（化１）： 【化１】（Ｘ）_m −（Ｙ）_n −Ｚ （式中Ｘはヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポ
   リペプチド、Ｙはスペーサー、Ｚはその配列中に配列表
   の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
   プチド、ｍ及びｎは１又は０である）で表されることを
   特徴とする人工の機能性ポリペプチド。