JP2829405B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ポリペプチドに関
し、更に詳しくはヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメ
インポリペプチドと、ヒト線維芽細胞成長因子とが共有
結合した新規な機能性ポリペプチド、並びにそれらをコ
ードする遺伝子、及び該遺伝子を用いた該機能性ポリペ
プチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブロネクチン（以下、ＦＮと表示す
る）は、血漿や細胞外マトリックスに存在する糖タンパ
ク質で、多彩な機能を持つことが知られている〔アニュ
アルレビュー オブ バイオケミストリー( Annual Rev
iew of Biochemistry ) 、第５７巻、第３７５〜４１３
頁（１９８８）〕。天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の
医薬品や化粧品に利用する試みがなされているが、血液
から採取するために、供給に制限があること、コスト高
であること、また、病原性の細菌やウイルス等による汚
染の可能性があるなどの理由により、実用化されていな
い。また、天然のＦＮの機能ドメインを取出して利用す
ることも同様の理由から実用化されていない。そこで本
発明者らは、ヒトＦＮの細胞接着ドメインをコードする
ｃＤＮＡ断片を発現ベクターに接続して大腸菌に導入す
ることにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその製造
方法を開発し、特許出願した（特開平１−１８０９００
号、同１−２０６９９８号、同２−９７３９７号、同２
−１５２９９０号）。一方、線維芽細胞成長因子（以
下、ＦＧＦと表示する）は、中胚葉、神経外胚葉由来の
様々な細胞の増殖と分化の促進作用、内皮細胞、線維芽
細胞、アストログリア細胞に対する細胞走化作用、血管
新生作用など多彩な生物作用を有するポリペプチドであ
り〔蛋白質、核酸、酵素、第３６巻、第１２３７〜１２
４６頁（１９９１）〕、培養細胞の増殖因子として広く
利用されており、また、その細胞増殖作用、細胞走化作
用、血管新生作用から、創傷治癒剤等の医用材料として
の用途が期待されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前記したごとく、ＦＧ
Ｆはその細胞増殖促進作用、細胞走化作用、血管新生作
用から、創傷治癒効果が期待されるが、これに細胞接着
活性を合せ持たせれば、各種細胞への親和性を高めるこ
とができ、ＦＧＦの効果を持続的かつ最大限に発揮する
ことが可能になり、ドラッグデリバリーシステムや徐放
性薬剤の開発等、ＦＧＦの利用上非常に有効である。例
えば、生化学的研究に有効な増殖促進試薬が提供され、
表皮細胞の増殖を高め、皮膚の老化を防ぐ有用な化粧品
が提供され、更に外傷や外科手術後の創傷治癒を促進す
る経皮薬及び治療薬が提供される。すなわち本発明の目
的は、細胞接着活性と、細胞増殖促進活性とを同時に兼
ね備えた新規なポリペプチドを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は人工の機能性ポリペプチドに関する
発明であって、下記一般式（化１）：

【０００５】

【化１】Ｘ−（Ｙ）_m −Ｚ

【０００６】（式中、ＸはヒトＦＮの細胞接着ドメイン
ポリペプチド、Ｙはスペーサー、ＺはヒトＦＧＦポリペ
プチド、ｍは１又は０である）で表されることを特徴と
する。本発明の第２の発明は、第１の発明の一般式（化
１）の人工の機能性ポリペプチドに関し、Ｘは配列表の
配列番号１に記載したアミノ酸配列で示されるヒトＦＮ
の細胞接着ドメインポリペプチド、Ｚは配列表の配列番
号２又は配列番号４に記載したアミノ酸配列で示される
ヒトＦＧＦポリペプチドで表されることを特徴とする。
また、本発明の第３の発明は第１の発明の人工の機能性
ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。そして、本
発明の第４の発明は第３の発明の人工の機能性ポリペプ
チドをコードする遺伝子を組込んだプラスミドに関し、
第５の発明は第１の発明の人工の機能性ポリペプチドの
製造方法に関し、第４の発明のプラスミドを導入した宿
主細胞を培養し、該培養物より第１の発明の人工の機能
性ポリペプチドを採取することを特徴とする。

【０００７】本発明者らは、ＦＮの細胞接着活性と、Ｆ
ＧＦの細胞増殖促進活性を兼ね備えた新規ポリペプチド
の構築、及びその製造方法について研究し、ヒトＦＮの
細胞接着ドメインと、ヒトＦＧＦが結合した新規な機能
性ポリペプチドを遺伝子工学的に作製した。この新規な
機能性ポリペプチドの生物活性を調べた結果、細胞接着
活性と細胞増殖促進活性の両方の活性を有することを見
出して、本発明を完成した。

【０００８】以下、本発明を具体的に説明する。ヒトＦ
Ｎのタンパク質の一次構造については、ジ エンボ ジ
ャーナル( TheEMBO Journal) 、第４巻、第１７５５〜
１７５９頁（１９８５）に記載されている。また、その
細胞接着ドメインをコードするｃＤＮＡクローン( ｐＬ
Ｆ５）についてはバイオケミストリー( Biochemistry
)、第２５巻、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）に
記載されている。本発明者らは、ｐＬＦ５から、細胞接
着ドメインに対するｃＤＮＡ断片を取出し、これを発現
ベクターに接続して大腸菌に導入することにより、細胞
接着活性ポリペプチド及びその製造方法を開発し特許出
願した（前出各公報）。本発明で必要とされる細胞接着
ドメインのｃＤＮＡとしては、特開平１−２０６９９８
号公報に記載されている組換体プラスミドｐＴＦ７０２
１を用いることができる。ｐＴＦ７０２１はＦＮのＰｒ
ｏ¹²³⁹−Ｍｅｔ¹⁵¹⁷（２７９アミノ酸残基）を発現する
プラスミドである。ｐＴＦ７０２１の翻訳領域のＣ末端
の終止コドンの直前にクローニングサイト、例えばＮｃ
ｏＩサイトを導入することにより、細胞接着ドメインの
ｃＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡを連結
させることができる。

【０００９】ＦＧＦには酸性ＦＧＦ（以下ａＦＧＦと略
す）、塩基性ＦＧＦ（以下ｂＦＧＦと略す）等があり、
本発明のポリペプチドは上記細胞接着ドメインのｃＤＮ
Ａと、ＦＧＦをコードするＤＮＡを連結し、次に遺伝子
工学的に発現させることにより得ることができる。

【００１０】この本発明による新規な機能性ポリペプチ
ドとしては、例えば配列表の配列番号１で表される、ヒ
トＦＮの細胞接着ドメインのＰｒｏ¹²³⁹−Ｓｅｒ¹⁵¹⁵に
相当する２７７アミノ酸残基ポリペプチドが配列表の配
列番号２で表されるヒトｂＦＧＦと結合した人工の機能
性ポリペプチドがある。

【００１１】なお、本明細書において、アミノ酸に付さ
れた肩数字は、ＥＭＢＬ データバンク（ EMBL DATA B
ANK ) 中のＦＮのｃＤＮＡ配列を翻訳して得られるアミ
ノ酸配列に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。

【００１２】ヒトｂＦＧＦについては、その遺伝子構造
が明らかとなっており、３つのエクソンからなることが
知られている（ジ エンボ ジャーナル、第５巻、第２
５２３〜２５２８頁（１９８６）〕。それぞれのエクソ
ンに対応するＤＮＡ断片をヒトジエノミックＤＮＡから
ＰＣＲ〔 Polymerase chain reaction :サイキ（Saiki)
ら、サイエンス（Science)、第２３０巻、第１３５０〜
１３５４頁（１９８５）〕により増幅することができ
る。この時、ＰＣＲプライマーの５′側に隣接するエク
ソンの末端の配列を導入することにより、別々に増幅し
たエクソン断片をＰＣＲにより連結することができる。
すなわち、第１エクソン増幅のためのアンチセンスプラ
イマーの５′側に第２エクソンのＮ末端をコードするＤ
ＮＡのアンチセンス配列を導入する。このプライマーと
第１エクソン増幅のためのセンスプライマーを用いてＰ
ＣＲを行うと、センス鎖の３′末端に第２エクソンのＮ
末端配列が付加した第１エクソンＤＮＡ断片が得られ
る。同様に、第２エクソン増幅のためのセンスプライマ
ーの５′側に第１エクソンのＣ末端をコードするＤＮＡ
のセンス配列を導入し、これと第２エクソン増幅のため
のアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うと、セ
ンス鎖の５′末端に第１エクソンのＣ末端配列の付加し
た第２エクソンＤＮＡ断片が得られる。次に以上のよう
にして得られた２つのＤＮＡ断片を混合し、第１エクソ
ン増幅のためのセンスプライマー、第２エクソン増幅の
ためのアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行うこ
とによって、第１エクソンと第２エクソンの連結したＤ
ＮＡ断片を得ることができる。同様の手法を用いて第
１、第２エクソンをコードするＤＮＡ断片と、第３エク
ソンＤＮＡ断片を連結し、ヒトｂＦＧＦの全長をコード
するＤＮＡ断片を得ることができる。

【００１３】このようにして得られたヒトｂＦＧＦをコ
ードするＤＮＡのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIII 断片を調製
し、前記ｐＴＦ７０２１から誘導されたプラスミドｐＴ
Ｆ７５２０の翻訳領域の３′末端ＮｃｏＩサイトに接続
することにより、ヒトＦＮの細胞接着ドメインとヒトｂ
ＦＧＦとが連結した配列表の配列番号３で表されるポリ
ペプチドを発現する組換体プラスミドｐＹＭＨ−ＣＦ・
Ａが得られる（図１参照）。なお図１中ＡはヒトｂＦＧ
ＦポリペプチドをコードするＤＮＡ断片部位、Ｂはヒト
ＦＮの細胞接着ドメインポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ断片部位をそれぞれ示す。この両ＤＮＡ断片の連結部
位にリンカーＤＮＡを挿入し、スペーサーポリペプチド
として発現させることにより、ヒトＦＮの細胞接着ドメ
インポリペプチドと、ヒトｂＦＧＦポリペプチドの分子
間距離を調製することができる。スペーサーとしてはア
ミノ酸が分子間に挿入されていてもよく、また、ポリペ
プチドが挿入されていてもよい。スペーサーとしてのア
ミノ酸の種類、ポリペプチドの配列は目的に応じ選択す
ればよい。

【００１４】また、ＰＣＲによって調製されたヒトｂＦ
ＧＦをコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅物中には、例えば
配列表の配列番号４で表されるポリペプチド、すなわち
ヒトＦＧＦの点変異体をコードするＤＮＡも含まれてお
り、該ＤＮＡを用いることにより、配列表の配列番号５
で表されるポリペプチドを発現する組換えプラスミドｐ
ＹＭＨ−ＣＦも得られる。

【００１５】得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適
当な条件下に培養することにより、目的ポリペプチドが
大腸菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノプロッテ
ィングが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した
後、泳動パターンをニトロセルロース膜に移し取る。ヒ
トＦＮの細胞接着ドメインを確認するモノクローナル抗
体（ＦＮ１２−８、宝酒造）及びヒトｂＦＧＦを認識す
るモノクローナル抗体で検出されるバンドが目的のポリ
ペプチドである。

【００１６】目的ポリペプチドの精製は、例えば次のよ
うに行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養
し、集菌した後、超音波処理により菌体破砕液を得る。
この菌体破砕液を遠心分離した上清を、例えばセファデ
ックスＧ−１００ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、
ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー等に
より精製する。これらの操作により、目的のポリペプチ
ドを精製することができる。

【００１７】得られたポリペプチドは、スイスマウス３
Ｔ３やＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対する細胞接着活性の
測定に用いられる。細胞接着活性の測定は、例えばルオ
スラティ（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー (Methods inEnzymology ）、第８２
巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕に準じて行う。
すなわち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキング
したマイクロタイタープレートに、スイスマウス３Ｔ３
又はＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の懸濁液を添加し、３７℃
で約１時間インキュベートした後、未吸着の細胞を洗浄
した後、トリプシン処理によって吸着細胞を回収し、ク
ールターカウンターで細胞数を測定することにより、細
胞接着の強さを測定することができる。

【００１８】一方、ＦＧＦ活性は、細胞増殖促進の指標
となる ³Ｈ−チミジンの取り込み活性を測定することに
より測定可能であり、例えば、西川らの方法〔メソッズ
イン エンザイモロジー、第１４６巻、第１１〜２３
頁（１９８７）〕に準じて測定することができる。すな
わち、試料を添加した培地中で、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞を１６時間培養した後、 ³Ｈ−チミジンを加え、更に
３時間培養する。細胞をトリクロロ酢酸で固定した後、
アルカリで可溶化し、液体シンチレーションカウンター
により細胞に取り込まれた ³Ｈ−チミジンを測定し、Ｆ
ＧＦとしての細胞増殖活性を測定することができる。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００２０】実施例１ ヒトＦＮ細胞接着ドメインポリペプチドとヒトｂＦＧＦ
ポリペプチドの融合ポリペプチドのクローニング （１−１）ヒトｂＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの調製 ヒト脳ジェノミックＤＮＡをテンプレートとして下記に
示す３組のプライマーをＤＮＡ合成機で合成、精製し、
これを用いてＰＣＲを行った。

【００２１】（ｉ）プライマー、 プライマー、でヒトｂＦＧＦエクソン１を増幅させ
ることができる。配列表の配列番号６で表されるプライ
マーの塩基番号８〜２６はエクソン１に対応するＤＮ
Ａ配列であり、塩基番号６〜１１はクローニング用のＮ
ｃｏＩサイト、塩基番号８〜１０はｂＦＧＦのＮ末端の
ＭｅｔをコードするＤＮＡ配列である。また、配列表の
配列番号７で表されるプライマーの塩基番号８〜２４
はエクソン１のアンチセンスＤＮＡ配列、塩基番号１〜
７はエクソン２のアンチセンスＤＮＡ配列、塩基番号８
〜１４は後述のプライマーとオーバーラップするＤＮ
Ａ配列である。

【００２２】（ii) プライマー、 プライマー、でヒトｂＦＧＦエクソン２を増幅させ
ることができる。配列表の配列番号８で表されるプライ
マーの塩基番号８〜２８はエクソン２のＤＮＡ配列、
塩基番号１〜７はエクソン１のＤＮＡ配列、塩基番号８
〜１４はプライマーとオーバーラップするＤＮＡ配列
である。配列表の配列番号９で表されるプライマーの
塩基番号８〜２８はエクソン２のアンチセンスＤＮＡ配
列、塩基番号１〜７はエクソン３のアンチセンスＤＮＡ
配列、塩基番号８〜１４は後述のプライマーとオーバ
ーラップするＤＮＡ配列である。

【００２３】（iii) プライマー、 プライマー、でヒトｂＦＧＦエクソン３を増幅させ
ることができる。配列表の配列番号１０で表されるプラ
イマーの塩基番号８〜２８はエクソン３のＤＮＡ配
列、塩基番号１〜７はエクソン２のＤＮＡ配列、塩基番
号８〜１４はプライマーとオーバーラップするＤＮＡ
配列である。配列表の配列番号１１で表されるプライマ
ーはエクソン３のアンチセンスＤＮＡ配列であるが、
塩基番号８〜１３をクローニング用のＨｉｎｄ IIIサイ
トとするために、塩基番号８及び１１をそれぞれＧから
Ａ、ＡからＣに改変したＤＮＡ配列である。

【００２４】ＰＣＲは宝酒造社ジーンアンプキット（Ge
neAmp Kit)を用い、テンプレートＤＮＡは１μｇ、反応
液量は１００μｌ、温度サイクル９４℃３０秒→５５℃
１分→７２℃２分で３０サイクル行った。反応液の１／
２０量をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、プ
ライマー、で増幅した場合は１９２ｂｐ、プライマ
ー、の場合は１１８ｂｐ、プライマー、の場合
は２２３ｂｐのＤＮＡ断片が認められた。これらはそれ
ぞれヒトｂＦＧＦエクソン１、２、３に相当するサイズ
である。

【００２５】エクソン１及びエクソン２のＰＣＲ産物そ
れぞれ１μｌずつを混合し、これをテンプレートにして
プライマー及びを用いて、温度サイクル９４℃３０
秒→５５℃１分→７２℃１分で３０サイクルのＰＣＲを
行った。その結果、エクソン１、２が連結した２９６ｂ
ｐのＤＮＡ断片が得られた。これの１μｌと前述のエク
ソン３ＰＣＲ産物１μｌを混合し、プライマー及び
を用いて温度サイクル９４℃３０秒→５５℃１分→７２
℃１分で３０サイクルのＰＣＲを行った。その結果、エ
クソン１〜３の全コード領域を含む５０５ｂｐの増幅Ｄ
ＮＡ断片が得られた。続いて、該ＤＮＡ断片をＮｃｏ
Ｉ、ＨｉｎｄIII で処理し、これをプラスミドｐＵＣ１
１９ＮのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIII サイトに１６℃、３０
分ライゲーションした（宝酒造社製ライゲーションキッ
トを使用）。次に調製したプラスミドのクローン化、Ｄ
ＮＡ解析を行い、配列表の配列番号１２で表されるＤＮ
Ａが組込まれたプラスミドをｐＹＭＨ−ｂＦ・Ａ、該Ｄ
ＮＡの点変異体の配列番号１３で表されるＤＮＡが組込
まれたプラスミドをｐＹＭＨ−ｂＦと命名した。またこ
れらのプラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（宝
酒造社製コンピテントセルＪＭ１０９使用）を、それぞ
れEscherichia coli ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ｂＦ・
Ａ、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ｂＦと
命名した。

【００２６】（１−２）ヒトＦＮ細胞接着ドメインポリ
ペプチドとヒトｂＦＧＦポリペプチドの融合ポリペプチ
ドのクローニング （１−１）で得たプラスミドｐＹＭＨ−ｂＦ・ＡをＮｃ
ｏＩ、Ｈｉｎｄ IIIで処理して挿入されたＤＮＡ断片を
切り出し、これを前述のｐＴＦ７５２０のＮｃｏＩ、Ｈ
ｉｎｄ IIIサイトに１６℃、３０分ライゲーションし
た。これにより構築されたプラスミドをｐＹＭＨ−ＣＦ
・Ａと命名し、これで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し
た。このプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ109 を、Esch
erichia coliＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａと命名し
た。

【００２７】本菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１
ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクト
シド）を含むＬ−培地中で培養し、菌株を４／２０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。その結果、分子量４
７ｋｄにポリペプチドの発現を確認した。更に、泳動パ
ターンをニトロセルロースメンブランに転写した後、ヒ
トＦＮ細胞接着ドメインを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体ＦＮ１２−８、又はｂＦＧＦを特異的に認識す
るモノクローナル抗体ｂＦＭ−２を作用させ、いずれの
抗体も４７ｋｄポリペプチドと反応することを確認し
た。

【００２８】ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを保持する大腸菌ＪＭ
１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０
９／ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａと表示し、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５２７８
として寄託した。

【００２９】一方、プラスミドｐＹＭＨ−ｂＦをＮｃｏ
Ｉ、ＨｉｎｄIII で処理して挿入されたＤＮＡ断片を切
り出し、これをｐＴＦ７５２０のＮｃｏＩ、ＨｉｎｄII
I サイトに１６℃、３０分ライゲーションし、これによ
って構築されたプラスミドをｐＹＭＨ−ＣＦと命名し、
これで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転
換体中のプラスミドの解析を、上記の方法に準じて行
い、目的の配列を含むプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ
１０９を、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−
ＣＦと命名した。

【００３０】次に本菌株の目的ポリペプチドの発現性を
上記の方法に準じ確認し、本菌株を、Escherichia coli
ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ＣＦと表示し、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５５９号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２５５９）として寄託した。

【００３１】（１−３）発現ポリペプチドの精製 （１−２）で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
２７８）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−培
地１０ｍｌで一夜３７℃で培養した。この前培養液０．
２ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰ
ＴＧを含むＬ−培地１００ｍｌに接種し、３７℃で一夜
培養した後集菌した。得られた菌体を緩衝液〔２０ｍＭ
トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌｐＨ７．６、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．１％ ＣＨＡＰＳ〔３−｛（３−コルアミ
ドプロピル）−ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン硫
酸〕、８Ｍ 尿素、１００μｇ／ｍｌアプロチニン、１
００μｇ／ｍｌロイペプチン、１００ｍＭ ＰＭＳＦ
（フェニルメタンスルホニルフルオリド）５ｍｌに懸濁
し、超音波処理を２分行って菌体を破砕した。この菌体
破砕液を緩衝液〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＣＨＡＰＳ〕で平衡
化したセファデックスＧ−１００ゲルろ過カラムにかけ
た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
目的の４７ｋｄポリペプチドを含む画分を同定した。こ
の画分を同緩衝液で平衡化したヘパリン−５ＰＷ ＨＰ
ＬＣカラム（東ソー）にかけ、緩衝液〔５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ ＣＨＡＰＳ〕で溶出した。こ
の溶出液について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行ったところ、単一な４７ｋｄの目的ポリペプ
チドが確認された。このようにして精製された目的ポリ
ペプチドをＣ−ＦＧＦ・Ａと命名した。

【００３２】同様の方法でEscherichid coli ＪＭ１０
９／ｐＹＭＨ−ＣＦ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５５９）の培
養を行い、培養物中より目的のポリペプチドを精製し、
該ポリペプチドをＣ−ＦＧＦと命名した。

【００３３】実施例２ 生物活性の測定 前記実施例１で得られたポリペプチドＣ−ＦＧＦ・Ａ及
びＣ−ＦＧＦを用いて、細胞接着活性及び細胞増殖促進
活性を測定した。 （２−１）細胞接着活性の測定 細胞接着活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イ
ン エンザイモロジー、第８２巻、第８０３〜８３１頁
（１９８１）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、ＰＢ
Ｓ（リン酸緩衝化生理食塩水）等に溶かし、２４穴マイ
クロプレートに注入した。室温、２時間インキュベート
して、試料をプレート上に吸着させた（４００μｌ／ウ
エル）。２％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ
溶液を５００μｌ／ウエル加え、３７℃、２時間インキ
ュベートしてプレートをブロックした。ＰＢＳでプレー
トを洗浄後、あらかじめダルベッコ（Dulbecco'S) イー
グル最小栄養培地（ＤＭＥＭ）に懸濁させたスイスマウ
ス３Ｔ３細胞を１×１０⁵ 細胞／ウエル分注し、３７
℃、１時間インキュベートした。なお、使用したスイス
マウス３Ｔ３細胞は、凍結保存した株を継代培養後、ト
リプシン処理（３７℃、５分）したものを用いた。ＰＢ
Ｓでプレートを洗浄後、トリプシン処理にて吸着細胞を
回収し、クールターカウンターにて細胞数を測定した。
その結果、Ｃ−ＦＧＦ・Ａ及びＣ−ＦＧＦは、配列表の
配列番号１４で表す特開平２−９７３９７号公報に記載
の細胞接着活性ポリペプチド・Ｃ２７４と同等の細胞接
着活性を示した。

【００３４】（２−２）細胞増殖促進活性の測定 （２−１）で細胞接着活性を示したＣ−ＦＧＦ・Ａ及び
Ｃ−ＦＧＦの細胞増殖促進活性を検討した。 ３％仔牛血清を含むダルベッコイーグル最小栄養培地
（３％ＣＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁したマウスの線維芽細胞
ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３／３Ｋ細胞を２４穴マイクロプレー
トに６．２５×１０³ 細胞／ウエル分注し、５％ＣＯ₂
存在下、３７℃で５時間培養した。その後、培地を０．
２％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地（０．２％ＣＳ−ＤＭ
ＥＭ）に変え、更に３７℃で２４時間培養した。次にＣ
−ＦＧＦ・Ａ又はＣ−ＦＧＦを加え、３７℃で１６時間
培養した後、 ³Ｈ−チミジンを０．２μＣｉ／ウエル加
え、更に３７℃にて３時間培養した。培地を除去し、５
％ＴＣＡを５００μｌ／ウエル加え、４℃にて４時間静
置して、細胞を固定した。ＴＣＡを除去した後、２％Ｎ
ａ₂ ＣＯ₃ を含む０．１Ｎ ＮａＯＨ ４００μｌ／ウ
エルを加えて固定化した細胞を溶解し、液体シンチレー
ションカウンターにより ³Ｈ−チミジンの取り込みを測
定した。表１に示すように、Ｃ−ＦＧＦ・Ａ及びＣ−Ｆ
ＧＦを使用した場合、高い ³Ｈ−チミジンの取り込み、
すなわち細胞増殖促進活性を示した。

【００３５】

【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 試料（１００ｎＭ） ³Ｈ−チミジンの取り込み（×１０³ ｃｐｍ） ─────────────────────────────────── Ｃ−ＦＧＦ・Ａ ２．４ Ｃ−ＦＧＦ １．８ Ｃ２７４ ０．５ ───────────────────────────────────

【００３６】

【発明の効果】以上述べてきたごとく、本発明により、
細胞接着活性と細胞増殖促進活性の両活性を合せ持つ機
能性ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝子、
及び該遺伝子を用いた該機能性ポリペプチドの遺伝子工
学的な製造方法が提供された。上記ポリペプチドは、Ｆ
ＧＦと細胞との親和性を高めることができ、創傷治癒な
どの用途において特に有用である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２７７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：２ 配列の長さ：１５５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：３ 配列の長さ：４３２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：４ 配列の長さ：１５５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：５ 配列の長さ：４３２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴：１−２６ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴：１−２４ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：８ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴：１−２８ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴：１−２８ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：１０ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴：１−２８ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴：１−２０ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： 配列番号：１２ 配列の長さ：４９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： 配列番号：１３ 配列の長さ：４９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： 配列番号：１４ 配列の長さ：２７４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａの構造を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＴ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 矢追 義人 神奈川県横浜市港北区箕輪町１−30−１ −212 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 19/00 ZNA C12N 15/00 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（化１）： 【化１】Ｘ−（Ｙ）_ｍ−Ｚ （式中、Ｘはヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメイン
   ポリペプチド、Ｙはスペーサー、Ｚはヒト線維芽細胞成
   長因子ポリペプチド、ｍは１又は０である）で表される
   ことを特徴とする人工の機能性ポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載の一般式（化１）におい
   て、Ｘは配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列で
   示されるヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリ
   ペプチド、Ｚは配列表の配列番号２又は配列番号４に記
   載したアミノ酸配列で示されるヒト線維芽細胞成長因子
   ポリペプチドで表されることを特徴とする請求項１記載
   の人工の機能性ポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載の人工の機能性ポリペプチ
   ドをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３記載の人工の機能性ポリペプチ
   ドをコードする遺伝子を組込んだプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項４記載のプラスミドを導入した宿
   主細胞を培養し、該培養物より請求項１記載の人工の機
   能性ポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１
   記載の人工の機能性ポリペプチドの製造方法。