KR970001684B1 - 트롬빈 결합성 물질 및 그의 제조방법 - Google Patents

트롬빈 결합성 물질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

트롬빈 결합성 물질 및 그의 제조방법
제1도는 본 발명의 발현 벡터, pCDM-GAG-UTM1과 pCDM-GAG-UTM2의 구조를 나타내는 설명도이다.
제2도는 본 발명의 발현 발현 벡터, pCDM-GAG-UTM1의 구조를 나타내는 설명도이다.
본 발명은 신규의 토롬빈 결합성 물질, 이 트롬빈 결합성 물질의 아미노산 배열을 코드하는 DNA단편, 이 DNA단편을 포함하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 보유하는 형질전환체 세포, 이 트롬빈 결합성 물질을 유효성분으로 하는 혈소판 응집 억제작용을 갖는 항응고제 및 이 트롬빈 결합성 물질의 제조방법에 관한 것이다.
혈액응고제중에서 단백 분해 효소로서 트롬빈이 하는 역할에 관해서는 많은 연구가 행해졌으며 응고계의 메카니즘에 관하여는 거의 해명되었다.
생체내에서 용선제 및 항응고계에 작용하는 것으로 알려진 프로테인 C를 활성화하는 것, 및 이 기구에 보효소로 작용하는 인자가 토끼의 폐조직 추출물 중에 존재하는 것이 보고되었으며, 이 인자는 트롬보모듈린 명명되고 있다[N.L. Esmon et al. J. Biological Chemistry, 257, (2), 859-864(1982)].
또한, 아오끼 등은 사람 태반으로부터 분리한 비환원 상태하에서 분자량이 약 71,000인 사람 트롬보모듈린이 에스몬(Esmon)등에 보고된 트롬보모듈린과 유사한 성질을 갖는다는 것을 보고했다[Thromb. Res., 37, 353-364(1985)].
또한, 마루야마(I. Maruyama)등은 사람 태반으로부터 분리한 분자량 약 75,000인 사람 트롬보모듈린과, 상기 토끼 트롬보모듈린의 활성과 비교하고, 양자의 활성이 같다고 보고했다[J. Clin. Invest., 75, 987-991(1985)].
또한, 이시이(H. Ishii)등은 사람 혈장과 사람 뇨중에 트롬보모듈린과 동일한 활성을 갖는 물질이 존재한다는 것과 혈장중의 당해 물질의 분자량이 약 63,000과 약 54,000이라는 것을 보고했다[J. Clin. Invest., 76, 2178-2181(1985)].
더욱이, 본 발명자들은 사람 뇨중에 상기 물질과 다른 분자량이 적은 2종의 트롬빈 결합성 물질(비환원 상태의 분자량 약 39,000 및 약 31,000)을 발견하고, 특허출원했다(일본국 특허공개 제88-146898호).
더욱이, 본 발명자들은 사람 뇨 및 사람 조직 유래 세포의 조직배양액으로부터 상기 물질과 다른 2종의 트롬빈 결합성 물질(A) 및 (B)를 분리하고, 먼저 특허출원하고, 또한 이것을 안정하고도 대량으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고 특허출원했다(유럽 특허공개 제455681호).
본 발명자들은 재조합 DNA기술을 사용하여 사람 뇨 유래 트롬빈 결합성 물질(r-UTM)을 얻고, 이 방법에 대해 특허출원했다(일본국 특허출원 제91-54446호).
한편, 토끼 폐의 트롬보모듈인은 안티트롬빈 Ⅲ의 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다[K.T. Preissner et al. J. Biological Chemistry, 265,4915-4922(1990)]. 그러나, 이와 같은 작용은 소외 트롬보모듈린에는 없고[H. V. Jakubowski et al, J. Biological Chemistry, 261, 3876(1986)], 또한 사람 태반의 트롬보모듈린은 안티트롬빈 Ⅲ의 활성을 저해한다[K. Hirahara et al, Thrombo. Res., 57, 117-126(1990)].
또한, 유전자 공학기술에 의해 생산된 가용성 트롬보모듈린은 2종류이며, 한쪽은 안티트롬빈 Ⅲ증가 활성이 있으며, 다른 쪽은 없는 것이 알려져 있다[K. Nawa et al, Beochem. Biophqs. Res., 171, 729-737(1990)]. 그러나, 이들 트롬보모듈린은 혈액응고계 중에서 중요한 역할을 하고 있는 혈소판에 대하여 트롬빈응집을 억제하나, ADP 응집을 억제하지 않는 것이 알려져 있다[N.L. Esmon, J. Biological Chemistry, 258,12238-12242(1983)].
따라서, 사람 트롬보모듈린과 다른 트롬빈 결합성 물질에 안티트롬빈 Ⅲ활성을 증강하는 작용 및 혈소판응집 억제 작용을 부가하는 것이 요망되어 왔다. 이러한 실정에 있어서, 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 사람 뇨 유래 트롬빈 결합성 물질을 코드하는 DNA 단편의 3'-말단에 특정의 DNA 단편을 결합시키고, 얻어진 DNA 단편이 결합되어 있는 재조합 벡터로 사용하여 숙주 세포를 형질전환하고, 이 DNA를 발현시킴으로서 안티트롬빈 Ⅲ의 활성의 증강작용 및 혈소판 응집 억제 작용을 갖는 사람 뇨 유래 트롬빈 결합성 물질을 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 하기 아미노한 배열(이하, 배열 A)을 갖는 신규의 트롬빈 결합성 물질, 배열 A를 코드하는 염기배열을 갖는 DNA단편, 그 DNA단편을 포함하고 있는 재조합 벡터와 복제 가능한 벡터, 상기 재조합 벡터를 보유하고 있는 형질전환체 세포를 제공하는 것이다.
＜배열 A＞
여기서, X1과 X2는 산성 아미노산을, Y1과 Y2는 임의의 아미노산을 나타낸다.
본 발명의 다른 목적은 상기 트롬빈 결합성 물질을 함유하고, 혈소판 응집 억제작용을 나타내는 항응고 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 트롬빈 결합성 물질의 제조방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 또 다른 목적, 특징과 잇점은 하기 설명에서 더욱 명백해질 것이다.
본 발명의 트롬빈 결합성 물질은 예를 들면, 하기와 같이 제조될 수 있다.
우선 사람 태반 게놈 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고 이를 주형 DNA로 한다. 이어서 공지의 사람 트롬보모듈린 유전자의 염기배열 [Shirai, T et al, J. Biochem, 103, 281-285(1988)]을 참고로 해서 합성한 DNA 프라이머를 프로우브로 하여 주형 DNA를 스크리닝한다. 얻어진 DNA를 적당한 제한결단효소로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 클로닝 벡터와 라이게이션하여 미생물을 형질전환한다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 제단절단효소로 처리하면, 사람 뇨 유래 트롬빈 결합성 물질을 코드하는 1404염기를 포함하는 DNA 단편을 얻는다. 이 DNA 단편에 아미노산 배열, X1X2Y1SerGlySerGlyY2를 코드할 수 있는 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 삽입하면 본 발명의 DNA 단편을 포함하는 DNA 단편을 얻는다. 본 발명의 DNA 단편이 전형적인 예는 배열번호 3과 배열번호 4의 염기 배열을 갖는 것이다. 그러나, 본 발명의 DNA 단편이 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 목적인 트롬빈 결합성 물질을 구성하는 아미노산 배열, 즉, 배열 A, 바람직하게는 배열번호 1과 배열번호 2를 코드할 수 있는 DNA 단편은 어느 것이라도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터를 구축하기 위하여는 본 발명의 DNA 단편에 복제 가능한 발현 벡터에 접속하면 좋다.
발현 벡터로서는 복제 가능하면 대장균을 비롯하여 원핵생물 유래, 효모 유래, 곤충 바이러스 유래, 척추동물 바이러스 유래 등, 어느 것의 벡터이어도 좋다.
그러나, 트롬빈 결합성 물질을 효율적으로 제조하기 위해서는 전사의 하류 방향으로 순서로 하기 (1)~(7)의 염기배열
(1) 프로모터로 작용하는 염기배열.
(2) 리보솜 결합 부위로 기능하는 염기배열.
(3) 개시 코돈으로 작용하는 염기배열.
(4) 시그널 펩티드를 코드하는 염기배열.
(5) 배열(A)의 아미노산 배열을 코드하는 염기배열.
(6) 종지 코돈으로 작용하는 염기배열.
(7) 폴리A부가 시그널로 작용하는 염기배열
을 함유하는 발현 벡터를 구축하는 것이 바람직하다.
벡터로 이용하는 DNA는 플라스미드가 바람직하다. 예를 들면, 대장균을 숙주로서 증폭 가능하며, 포유동물세포를 형질전환함으로써 삽입 유전자의 발현이 가능한 플라스미드가 바람직하다. 이와 같은 플라스미드 DNA는 대장균 세포 중에서 플라스미드가 증식하기 위하여 필요한 염기배열, 예를 들면 ColEl계 플라스미드의 복제기점의 염기배열을 가지며, 더욱이 포유동물세포중에서 프로모터로서 작용하는 염기배열, 형질전환 대장균의 선택 마커로 되는 유전자, 형질전환 포유동물세포의 선택 마커로 되는 유전자를 함유하고, 더욱 바람직하기로는 포유동물세포중에서 기증하는 SV40 ori, 폴리오마 ori, 또는 HSV ori 등의 복제기점 염기 배열을 포함한다. 프로모터로서는 예를 들면, 사이토메갈로바이러스, SV40, 폴리오마 바이럿, 소의 파필로마 바이러스, 아데노바이러스 등 ; 레트로바이러스 LTR, 예컨대, MMTV ; 메탈로티오네인 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다. 대장균 선택마커로서는 예를 들면, 앰피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등을 들 수 있다. 포유동물세포 선택 마커의 예로는 네오마이신 내성 유전자, 히그로마이신 B 내성 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 유전자 등을 들 수 있다. 이들 유전자는 단독 또는 2종 이상이 사용될 수 있다.
상기 벡터에 본 발명의 DNA단편을 결합하기 위하여는 이를 함유하는 DNA를 적당한 제한효소로 절단하고, 필요하면 적당한 링커를 부가한 후, 적당한 제한효소로 절단한 벡터와 결합함으로써 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 제한효소는, 예를 들면, EcoRⅠ, SphⅠ, PstⅠ, HindⅢ, XhoⅠ, XbaⅠ, BanⅢ, SmaⅠ, NcoⅠ등이다. 또한, 엑소뉴클레아제 Ⅲ, Bal31, S1 뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 Ⅶ, 뭉빈 뉴클레아제, DNA 폴리머라제 등과 같은 핵산 수식 효소도 이용될 수 있다. 사용될 수 있는 링커로는 EcoRⅠ 링커, SmaⅠ링커, NcoⅠ링커, BamHⅠ링커, XhoⅠ링커, HindⅢ 링커, PstⅠ링커, SphⅠ링커, XBalⅠ링커 등이 이용될 수 있다.
얻어진 발현용 재조합 벡터를 콤피턴트 세포법, 프로터프라스트법, 인산칼슘 공침법, 전기 천공법, DEAE 덱스트란법, 리포렉틴법 등을 사용하여 숙주세포에 삽입하면, 본 발명의 재조합 벡터 및/또는 트롬빈 결합성 물질을 효율적으로 생산하는 능력을 갖는 형질전환 세포가 얻어진다. 이와 같은 형질전환체 세포를 얻기 위한 숙주세포로서는 박테리아, 효모와 같은 단세포 미생물, 배양곤충세포, 배양척추동물세포 등이 바람직하게 사용된다. 대장균을 숙주로 한 경우에는 E.coli K12주의 각종 변이주, 예를 들면, HB101,C600K, JM101, JM103, JM105, JM109, MV1034, MV1184, MC1061/P3등이 이용될 수 있다. 포유동물세포의 바람직한 예로는 COS세포, CHO세포, L세포, C127세포, NIH3T3세포, HeLa세포 등을 들 수 있다.
트롬빈 결합성 물질은 얻어진 형질전환체 세포를 배양하고, 이 배양세포 및 /또는 배양액으로부터 추출, 분리하여 제조할 수 있다.
형진전환체 세포의 배양을 위해 각종 천연배지, 합성배지가 사용될 수 있다. 배지는 단류, 알코올류, 유기산염류와 같은 탄소원; 단백질 혼합물, 아미노산류, 암모늄염류와 같은 질소원 ; 무기염류를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 더욱이, 비타민류, 선잭마커 유전자에 대응하는 항생물질류를 첨가하는 것이 바람직하다. 발현의 제어가 가능한 벡터이면, 배양 도중에 유전자 발현을 유도하는 조작을 부가할 필요가 있다. 배양 후에 원심분리하여 배양액과 배양세포로 분별한다. 트롬빈 결합성 물질이 배양세포중에 축적된 경우에는 예를 들면, 동결융해, 초음파처리, 프렌치 프레스, 효소처리, 호모게나이징 등을 사용하여 세포를 파괴한 후, 예컨대, EDTA, 계면활성제, 요소, 염산 구아니딘 등을 사용하여 트롬빈 결합성 물질을 가용화할 필요가 있다.
얻어진 트롬빈 결합성 물질을 함유하고 있는 배양액 또는 세포추출물을 각종 칼럼크로마토그래피에 의해 정제도니 트롬빈 경합성 물질을 얻을 수 있다. 칼럼크로마토그래피로서는 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 일본국 특허공개 제89-45398호에 기재된 모노클로날 항체를 사용), 겔 여과 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 사용될 수 있다.
이리하여 얻어진 트롬빈 결합성 물질 중에서 배열번호 1과 배열번호 2의 아미노산 배열을 갖는 물질은 하기 성질을 갖는다.
(1) 아미노산 배열 :
DNA 단편의 염기배열로부터 아미노산 배열이 배열번호 1과 2에 나타난 것과 같다.
(2) 분자량 :
비환원 상태하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 55000-100000으로 측정.
(3) 등전점 : (알포라이트를 사용한 등전점 전기영동법)
pH 3-4로 측정되었다.
(4) 당분석 :
분자량으로부터 복수의 당류가 부가되어 있는 것으로 판단되나, 그 중, 하나는 아미노산 배열로부터 Ser(474)에 산성 다당이 부가되어 있는 것으로 판단된다.
a. 안티트롬빈 Ⅲ 작용을 갖는다.
b. 안티트롬빈 Ⅲ의 활성을 증강시킨다.
c. 혈소판 응집 억제작용을 갖는다.
본 발명 트롬빈 결합성 물질을 항혈액응고제의 유효성분으로서 사용하는 경우의 제형으로서는 예를 들면 주사제를 들 수 있다. 주사제로서는 동결 건조 분말을 사용할 때, 주사용 증류수, 생리식염수 등에 용해하여 투여하는 형태가 바람직하다. 투여부위는 정맥내가 적당하다.
투여량은 환자의 증상, 체중 등에 따라 다르나, 통상 10㎍/㎏ 내지 10㎎/㎏/day 인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 트롬빈 결합성 물질은 상기 투여량의 범위내에서는 전혀 이상이 발견되지 않고, 안전하다.
[실시예]
본 발명의 다른 특징들은 본 발명의 설명을 위한 하기 구체예에서 명백해질 것이지만, 본 발명이 그들 구체예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
＜트롬빈 결합성 물질 유전자의 클로닝＞
사람 트롬보모듈린 유전자의 염기배열[Shirai, T et al, J. Biochem, 103, 281-285(1988)]을 참고로 해서 DNA 합성장치(ABI model 381A)를 사용하여 배열표 5의 배열을 갖는 프라이머 #1과 배열표 6의 배열을 갖는 프라이머 #2를 합성했다.
이어서, 사람 태반 게놈 DNA(Clonetech사 제품)를 BamHⅠ으로 절단하여 주형 DNA를 얻었다. 유전자 증폭은 30회 반복 배양(1회는 94℃에서 2분간, 50℃에서 3분간, 72℃에서 4분간 배양으로 구성됨)함으로써 퀵 터모 시스템[Quick Thermo System(Model QTS-10M : 일본 제네틱사제)]을 사용하여 하기 조성의 반응액에서 수행되었다. 반응 후, 반응 생성물의 일부를 채취하여 아가로즈 겔 전기영동에 의해 목적 DNA밴드의 증폭을 확인하였다.
＜반응액＞
증류수 71㎕
완충액*10㎕
dNTP혼합액(2.5mM) 8㎕
프라이머 #1(20μM) 5㎕
프라이머 #2(20μM) 5㎕
주형 DNA(㎍/㎕) 1㎕
AmpliTag(5units/㎕) 0.5㎕
* 완충액 : 0.1M 염화칼슘
0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.3)
0.1% 젤라틴
15mM 염화마그네슘
반응액으로부터 에탄올 침전으로부터 DNA를 회수하고 XhoⅠ과 KpnⅠ으로 절단하여 아가로즈 겔 전기영동에 걸어 1.57kb XhoⅠ-KpnⅠ 단편을 얻었다. 이와는 별개로 클로닝용 벡터 pUC118[Vieira, J and Messing, J., Methods Enzymol., 153, 3-11(1987)]을 HindⅡ로 절단해서 XhoⅠ링커로 접속시킨 후, 다시 XhoⅠ-KpnⅠ로 절단하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 벡터 단편을 얻었다. 벡터 단편과 1.57kb XhoⅠ-KpnⅠ 단편은 라이게이션(ligation)되고, 이 라이게이션 DNA로 E. coli MV1034[Vieira, J. and Messing, J., Methods Enznmol., 153, 3-11(1987)]를 형질전환했다.
얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소로 절단했다. 이와 같은 방법으로, 사람 트롬보모듈린 유전자 유래 1.57kb XhoⅠ-KpnⅠ 단편이 삽입된 플라스미드를 보유하고 있는 6개의 클론을 선택했다.
얻어진 클론의 삽입 단편의 뉴클레오티드 배열은 각 단편에 1 내지 3의 변이 위치를 나타내었다. 그리고 나서, 클론 2의 0.3kb XhoⅠ-SmaⅠ 단편, 클론 1의 0.65kb SmaⅠ-MluⅠ단편, 클론4의 0.62kb MulⅠ-KpnⅠ 단편들 변이 장소가 없는 모든 단편을 상기 벡텨 단편과 재결합시켜 정확한 배열의 사람 트롬부모듈린 유전자의 삽입 단편을 함유하고 있는 플라스미드 pUCTM/XHO-KPN을 얻었다.
[실시예 2]
＜트롬빈 결합성 물질 발현을 벡터의 구축＞
사람 뇨 유래 트롬빈 결합성 물질의 아미노산 배열의 C-말단 Asp에 글리코스아미노글리칸 부가 장소를 결합하기 위하여 배열표 7-10의 뉴클레오티드 배열을 가진 링커 $1 내지 $6을 합성해서 각 5'-말단을 인산화시켰다.
pUCTM/XHO-KPN을 XhoⅠ과 KpnⅠ으로 절단하여 사람 트롬보모듈린 유전자 유래 1.57kb XhoⅠ-KpnⅠ단편을 준비했다. XhoⅠ으로 절단하고 링커 $1,$2,$3,%4 또는 $1, $2, $5, $6와 함께 탈인산화한 포유동물세포 발현 벡터 CKM8(Invitrogen사 제품)으로 이 1.57kb 단편을 라이게이션하여, 이 라이게이션 DNA로 E.coli MC1061/P3[Seed, B. and Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 3365-3369(1987)]를 형질전환했다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 제한절단효소로 절단하여 삽입방향과 위치를 확인했다. 정확한 삽입방향과 정확한 제한절단효소 지도를 나탄는 8개의 클론으로부터 XhoⅠ 절단에 의해 본 발명의 DNA 단편을 함유하고 있는 1.68kb단편을 얻었다. 모든 클론의 뉴클레오티드 배열이 배열번호 13 또는 14의 배열인 것으로 밝혀지고, 발현 벡터가 정확하게 구축되었음을 확인했다. 얻어진 본 발명의 발현 벡터는 pCDM-GAG-UTM1과 pCDM-GAG-UTM2(제1도)로 명명되고 있고, 벡터를 보유한 형질전환체는 E.coli MC1061/P3(pCDM-GAG-UTM1)와 E.coli MC1061/P3(pCDM-GAG-UTM2)로 명명되고 있다.
[실시예 3]
＜배양동물세포에 의한 트롬빈 결합성 물질의 발현＞
DEAE-덱스트란법[Seed, B. and Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 3365-3369(1987)]에 의해 pCDM-GAG-UTM1 또는 pCDM-GAG-UTM2로 COS7 세포를 트랜스팩션했다. 5×105세포를 60㎜배양접시에 접종하고, 다음날, 배양배지를 흡입해 내고, 10% Nu-혈청을 함유한 둘베코 수정필수배지(DMEM) 2ml로 교환했다. PBS에서 10㎎/ml DEAE-덱스트란 용액(평균분자량 : 5×105, Pharmacia 제품) 100μl에 pCDM-GAG-UTM1과 pCDM-GAG-UTM2 10㎍(1㎍/㎕)을 첨가하고, 세포배양액에 20mM 클로로킨 10㎕와 함께 결과의 혼합물을 첨가했다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 배양배지를 흡입해 내고 PBS에 용해된 10% DMSO 2㎖를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 2분동안 정치했다. 흡입으로 DMSO용액을 제거한 후, 10% FCS를 함유한 DMEM 3㎖를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 48시간 동안 배양했다. 배양배지를 FCS를 함유하지 않은 DMEM으로 교환하고 계속해서 48시간 동안 더 배양한 후, 배양상청액을 회수했다.
이상의 과정에서 얻은 배양배지를 모노클로날 항체 A-73(일본국 특허공개 제89-45398호 : 2㎎ IgG/ml 수지)이 결합되어 있는 1ml 스파로즈 4B(2㎎ IgG/ml 수지)컬럼을 통과시켰다. 칼럼을 (1) 0.1M 염화나트륨을 함유한 0.02M 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 2ml, (2) 1M 염화나트륨과 0.05% Tween 20함유한 0.02M 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 20ml, (3) 1M 염화나트륨을 함유한 0.02M 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 5ml로 세척한 후, 2M 티오시안산 나트륨, 5mM EDTA, 1M 염화나트륨을 함유한 0.02M 트리스-염산 완충액(pH 7.4) 5ml로 용출했다. 용출액을 0.1M 염화나트륨을 함유한 0.02M 트리스-염산 완충액에 대하여 투석하여 정제된 트롬빈 결합성 물질(r-GAG-UTM1과 r-GAG-UTM2)을 얻었다.
[실시예 4]
＜배양포유동물세포에 의한 트롬빈 결합성 물질의 발현＞
인산칼슘법[Gormam, C., DNA cloning IRL Press, England, vol. 2, 143-190(1985)]에 의해 pCDM-GAG-UTM1으로 CHO·K1을 트랜스팩션했다.
5×105CHO·K1 세포를 10㎝ 페트리 디쉬에 접종하고 다음날, 배양배지(10% FCS를 함유한 Ham F12배지, 이하, 배지로 언급됨)를 교환했다. 그로부터 4시간 후, DNA와 칼슘의 공침물을 첨가했다. 사용된 공침물은 하기 방법에 따라 만들어졌다. pCDM-GAG-UTM1 20㎍과 네오마이신 내성 유전자 100㎎을 1mM트리스-염산 완충액(pH8.0)-0.1mM EDTA 450㎕에 용해해서 2.5M 염화칼슘과 혼합했다. 혼합물을 50mM HEPES(pH 7.12)-280mM 염화나트륨-1.5mM 인산수소나트륨 용액 500㎕에 적하하고 정치한 후, 용액을 세포배양배지에 첨가하고 24시간 동안 배양했다. 배지를 신선한 배지로 교환하고 24시간 더 배양한 후, 400㎍/㎖ G418을 함유한 선택배지로 교환했다. 2주 후, 생성된 콜로니를 24-웰 플레이트로 옮기고, 각 콜로니가 겹칠때까지 계속 배양한다. 배양상청액을 배양액으로부터 회수하고 분비된 트롬빈 결합성 물질(r-GAG-UTM1)을 정량분석해서 고생산성 클론을 선택했다. 선택된 클론에 한계희석법으로 다시 클로닝을 수행했다. 얻어진 형질전환체 세포는 CHO-GUTM으로 명명되어, 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술 연구소에 기탁되었다(FERM P-3260호).
형질전환체 세포 CHO-GUTM1-8을 225㎠ 플라스크에서 1% FCS을 함유한 UC202(Nissui Pharmaceutical사 제품)로 각 콜로니가 겹칠 때까지 배양한 후 FCS를 함유하지 않은 UC202 배지 50㎖로 배지를 교환했다. 1주일 후, 배양상청액을 회수하고, FCS를 함유하지 않은 신선한 배지를 같은 양 첨가했다. 1주일 더 배양한 후, 배양상청액을 회수해서 분비된 트롬빈 결합성 물질 3-4㎍/㎖를 함유하고 있음을 확인했다.
이하, 실시예 3의 후반부와 동일한 과정으로 수행하여 정제된 트롬빈 결합성 물질을 얻었다.
[실시예 4-b]
＜트롬빈 결합물질의 발현 벡터의 구축 및 배양 포유동물세포에 의한 물질의 발현＞
pCDM-GAG-UTM1을 XhoⅠ로 절단하여 글리코사미노글리칸이 결합된 부위를 함유하는 용성 사람 변형트롬보모듈린 cDNA의 1.7Kb단편을 제조하였다. 별도로 포유동물 세포 발현 벡터 pBPVPharmacia사제)를 XhoⅠ로 절단하고, 탈인산화(dephosphorylated)하고, E. Coli HB101(TAKARA SHUZO사제)를 형질변환시키는 T4 DNA 리가제를 사용하여 cDNA 단편을 결합하였다. DNAs를 상기에서 얻은 형질전환체로 추출하고 엔도뉴클레아제로 절단하여 삽입편의 방향과 위치를 확인하였다. 우측방향과 위치를 가르키는 클론을 선택했다. 이렇게 구축된 본 발명의 발현 벡터를 pBPV-GAG-UTM1(제2도)로 명명하고, 이 벡터를 수확하는 형질전환체를 E. coli HB101(pBPV-GAG-UTM1)로 명명하였다.
실시예 4에 기재된 방법과 유사한 방법으로 마우스 C127 세포를 인산 칼슘법에 의해 pBPV-GAG-UTM1으로 트랜스팩션시켰다. 8×105C127세포를 10㎝ 페트리디쉬에 접종하고, 다음날, 배양배지(10% FCS를 함유하는 둘베코 수정 Ealge최소배지(DMEM배지)로 교환했다. 4시간후, DNA와 인산칼슘의 공침물을 첨가했다. 사용된 공침물은 다음 방법에 따라 제조하였다. pBPV-GAG-UTM1 20㎍과 네오마이신 내성 유전자 100㎍을 함유하는 플라스미드를 1mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-0.1mM EDTA의 45㎕에 녹이고, 2.5M 염화칼슘 50㎕와 혼합한다. 이 혼합물을 50mM HEPES(pH 7.12)-280mM NaCl-1.5mM인산수소나트륨의 500㎕에 적하하고 실온에서 30분간 방치한 후, 이 용액을 세포배양배지에 첨가하고 24시같 배양한다. 이 배지를 신선한 DMEM 배지로 교환하고 다시 24시간 배양한 다음, 배지를 5% FCS가 첨가되고, 400㎍/㎖ G418을 함유하는 DMEM 배지로 교환한다. 10일 후, 생산된 콜로니를 24-웰 플레이트로 옮기고 융합할 때까지 계속 배양했다. 상층을 배양 브로쓰로부터 수집했다. 분비된 트롬빈 결합성물질을 정량적으로 분석하여 고생산 클론을 선택했다. 한계희석법으로 선택된 클론에 다시 클로닝했다.
선택된 형질전환 C127 세포를 1750㎠의 롤러 보틀(roller bottle)중의 5% FCS-첨가 DMEM 배지에서 배양하여 융합시키고, 이어서 배지를 1% FCS-첨가 DMEM 배지 500㎖로 교환했다. 1주일 후, 배양상청을 수집하고, 그 안에 분비된 트롬빈-결합물질 2㎍/㎖가 함유된 것을 확인하였다.
약 800㎍의 정제 트롬빈 결합물질(r-GAG-UTM1)이 실시예 3의 후반부와 동일한 방법으로 얻어졌다.
[실시예 5]
＜트롬빈 결합성 물질의 물성＞
래믈리(Laemmli)의 방법(Nature, 227,680-685)에 따라 정제된 트롬빈 결함성 물질에 SDS-PAGE를 수행했다. 단백질을 마쯔다이라(Matsudaira)의 방법[J. Biol. Chem., 262(21), 10035-100338]에 따라 PVDF막 위로 옮겼다. PVDF막을 0.1% 소의 혈청 알부민과 0.1M 염화나트륨을 함유한 0.05M 트리스-염산 완충액(TRS)속에서 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 용액을 제거하고, 잔사를 0.05% Tween20-TBS로 완전히 세척하고 3-아미노-9-에틸 카르바졸 5㎎과 30% 과산화수소 25㎕를 함유한 아세트산 완충액(pH 5.0) 50㎖에 담궈 발색시켜 글리코스아미노글리칸 부가세 특유의 넓은 밴드를 확인했다.
[실시예 6]
r-UTM과 본 발명의 트롬빈 결합성 물질 r-GAG-UTM1과 2, 각 0.1㎍/㎕씩을 콘드로이티나제(10mU, 생화학공업사 제품) 5㎕로 37℃에서 40분간 동안 처리했다. 실시예 5와 동일한 방법으로 임뮤노블로팅을 수행하여, 본 발명의 트롬빈 결합성 물질에서 콘드로이틴 황산 타입의 글리코스아미노 글리칸 공유결합의 존재를 확인했다.
[실시예 7]
＜항응고활성＞
r-UTM과 본 발명의 트롬빈 결합성 물질 r-GAG-UTM1과 2, 각 2.5㎍/㎕씩을 사람 피브리노겐(2.5㎎/㎖)과 사람 안티트롬빈 Ⅲ(0 또는 250㎍/㎖)와 혼합해서 5mM 염화칼슘 용액에 용해했다. 이 용액에 소의 트롬빈(0.5U/㎖)을 첨가해서 응고시간을 측정했다.
그 결과를 표 1에 나타냈다.
표 1은 본 발명의 트롬빈 결합성 물질이 트롬빈과 결합하여 혈액응고를 저해함을 증명한다. 또한 안티트롬빈 Ⅲ의 존재에 의한 트롬빈 결합성 물질의 항응고 작용의 명백한 증강을 보여준다.
[실시예 8]
＜항응고활성＞
r-UTM(9-90mM)과 본 발명의 트롬빈 결합성 물질, r-GAG-UTM1과 또는 r-GAG-UTM2(9-90mM)을 0.15mM 염화나트륨을 함유한 20mM 트리스-염화 완충액에서 소외 피브리노겐 용액(1㎎/㎖)에 용해해서 소의 트롬빈(18nM)과 혼합하여 응고시간을 측정했다. 50% 저해농도(IC)는 각종 농도의 소의 트롬빈을 사용하여 얻은 검량곡선으로부터 구했다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.
[실시예 9]
＜항응고활성＞
본 발명의 물질들(17nM) 또는 r-UTM을 0.15mM 염화나트륨을 함유한 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4)에서 소의 피브리노겐 용액(1㎎/㎖)에 용해해서 소의 트롬빈(18nM)과 혼합하여 응고시간을 측정했다.
그 결과를 표 3에 나타냈다.
[실시예 10]
＜혈소판 응집 억제 작용＞
본 발명 물질의 용액 8㎕와 토끼의 귀동맥으로부터 채취한 혈액으로부터 얻은 다혈소판혈장(P게) 200㎕에 2μM 아데노신이인산(ADP)을 첨가해서 혈소판 응집을 측정했다. 각종 농도와 ADP를 사용하여 구한 검량곡선에 의해 측정된 50% 저해농도, 즉, ADP응집을 억제하는 본 발명 화합물의 농도는 r-GAG-UTM1은 2×10 M, r-GAG-UTM2은 2.1×10 M이었다. r-UTM은 피험농도범위(10 -10 M)내에서는 응집억제작용을 나타내지 않았다.
[실시예 11]
＜혈액농도의 변화＞
마취하에서 위스터 랫트(숫컷)의 오른쪽 대퇴골정맥에 도뇨관을 삽입하고, 도뇨관을 통해 피험화합물 GAG-UTM1과 GAG-UTM2, 1㎎/㎖/㎏을 재빨리 투여했다. 투여 전과 투여 후 1, 3, 6, 10, 20, 30, 60, 120분에 채취한 혈액 표본 각 0.1㎖씩을 헤파린과 혼합해서 혈액농도를 결정하기 위한 혈장표본으로 사용했다. 혈액농도의 측정은 안티 사람 트롬빈 결합성 모노클로닝 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA법에 의해 수행되었다. 양 피험화합물은 원-콤파트먼트 모델로 분석할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
상기와 같이 본 발명의 트롬빈 결합성 물질은 안티트롬빈 Ⅲ의 활성을 증강시키고 혈소판 응집을 억제하며, 단독으로 안티트롬빈 활성을 가진다. 따라서, 그것들은 항응고제의 유효성분으로 유용하다. 더욱이 본 발명의 안티트롬빈 물질은 적은 비용으로 대량 생산될 수 있다.
본 발명의 무수한 변경과 수정이 상기 서술에 의해 가능함은 명백하다. 첨부된 청구의 범위를 벗어나지 않는 한, 본 발명은 상기 구체예에 국한되는 것은 아니다.
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Claims (8)

  1. 하기 아미노산 배열을 갖는 트롬빈 결합성 물질.
    여기서, X1, X2는 글루타민산(Glu) 또는 아스파라긴산(Asp)을 나타내고, Y1, Y2는 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 아스파라긴산(Asp) 또는 글루타민산(Glu)을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, X1은 Glu, X2는 Asp, Y1은 Tyr, Y2는 Glu임이 특징인 트롬빈 결합성 물질.
  3. 제1항에 있어서, X1은 Asp, X2는 Glu, Y1은 Ala, Y2는 Asp임이 특징인 트롬빈 결합성 물질.
  4. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 글리코실화됨이 특징인 트롬빈 결합성 물질.
  5. 하기 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA 단편과 복제 가능한 벡터로 구성 재조합 벡터를 보유한 형질전환체 세포.
    여기서, X1, X2는 글루타민산(Glu) 또는 아스파라긴산(Asp)을 나타내고, Y1, Y2는 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 아스파라긴산(Asp) 또는 글루타민산(Glu)을 나타낸다.
  6. 하기 아미노산 배열을 갖는 트롬빈 결합성 물질을 유효성분으로 하는 항응고 조성물.
    여기서, X1, X2는 글루타민산(Glu) 또는 아스파라긴산(Asp)을 나타내고, Y1, Y2는 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 아스파라긴산(Asp) 또는 글루타민산(Glu)을 나타낸다.
  7. 하기 아미노산 배열을 갖는 트로빈 결합성 물질로 구성된 혈소판 응집 억제제.
    여기서, X1, X2는 글루타민산(Glu) 또는 아스파라긴산(Asp)을 나타내고, Y1, Y2는 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 아스파라긴산(Asp) 또는 글루타민산(Glu)을 나타낸다.
  8. 하기 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA 단편과 복제 가능한 벡터를 포함한 재조합 벡터를 보유한 형질전환체 세포를 배양하고 배양 세포에 의해 생산된 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 하기 아미노산 배열을 갖는 트롬빈 결합성 물질의 제조방법.
    여기서, X1, X2는 글루타민산(Glu) 또는 아스파라긴산(Asp)을 나타내고, Y1, Y2는 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 아스파라긴산(Asp) 또는 글루타민산(Glu)을 나타낸다.
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