HU215532B - Eljárás trombinkötő anyag előállítására - Google Patents
Eljárás trombinkötő anyag előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU215532B HU215532B HU913737A HU373791A HU215532B HU 215532 B HU215532 B HU 215532B HU 913737 A HU913737 A HU 913737A HU 373791 A HU373791 A HU 373791A HU 215532 B HU215532 B HU 215532B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gly
- cys
- asp
- amino acid
- pro
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/7455—Thrombomodulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Reinforced Plastic Materials (AREA)
- Liquid Developers In Electrophotography (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
- Portable Nailing Machines And Staplers (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
Abstract
A találmány az antitrőmbin III aktivitás növelésére és a vérlemez-aggregáció gátlására alkalmas trőmbinkötő anyagők előállításieljárására vőnatkőzik, amely trőmbinkötő anyagők az előbbiek eedményeképpen antitrőmbin aktivitással rendelkeznek. A trőmbinkötőanyagők antikőagűláns készítmények, hatásős kőmpőnensekéntalkalmazhatók, s nagy mennyiségben, alacsőny költséggel előállíthatók. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás egy új trombinkötő anyag, a trombinkötő anyag aminosavszekvenciáját kódoló DNS-firagmentum, a DNS-fragmentumot magában foglaló rekombináns vektor, a rekombináns vektort befogadó transzformált sejt, valamint a trombinkötő anyagot tartalmazó antikoaguláns készítmény - amely trombocitaaggregációt gátló aktivitással rendelkezik — előállítására.
A korábbiakban végzett vizsgálatok legnagyobbrészt a trombinnak mint proteolitikus enzimnek a véralvadás-szabályozó rendszerben játszott szerepére, valamint a véralvadás mechanizmusának magyarázatára vonatkozik.
Egy közlemény beszámol arról, hogy a trombin aktiválja Protein C-t, amely hatással van a fibrinolitikus és antikoaguláns rendszerre, továbbá a nyúltüdőszövetek extraktumaiban van egy bizonyos anyag, amely az aktivációs mechanizmusban koenzimként funkcionál. Ezt az anyagot thrombomodulinnak nevezték el N. L. Esmon et al., J. Biological Chemistry, 257, (2), 859-864 (1982).
N. Aoki és munkatársai arról számoltak be, hogy humán placentából egy, a nemredukáló körülmények között körülbelül 71000 molekulatömegű humán thrombomodulint szeparáltak, amelynek jellemzői hasonlóak voltak az Esmon és munkatársai által leírt thrombomodulinéval Thromb. Rés., 37, 353-364 (1985).
I. Maruyama és munkatársai összehasonlító vizsgálatokat végeztek a humán placentából elkülönített, körülbelül 75 000-es molekulatömegű humán thrombomodulin, és az előbbiekben említett nyúl thrombomodulin aktivitása között. Leírták, hogy a két thrombomodulin az aktivitás tekintetében azonos volt [J. Clin. Invest., 75, 987-991 (1985)].
H. Ishii és munkatársai beszámoltak arról, hogy a humán plazma és vizelet a thrombomodulinéval azonos aktivitású anyagokat tartalmaz, amelynek molekulatömege a plazmában 63 000 és 54000 [J. Clin. Invest., 76, 2178-2181 (1985)].
A jelen feltalálók korábban két különböző típusú trombinkötő anyagot ismertek fel a vizeletben, amelyek eltérnek a fentiekben említett anyagoktól. Molekulatömegük kisebb, körülbelül 39 000 és 31000, nemredukáló körülmények között. A jelen feltalálók ezekre az anyagokra szabadalmi bejelentést tettek [Jaspanese Patent Laid-open (kokai) No. 146898/1988].
Továbbmenve, a jelen feltalálók a humán vizeletből és humán szövetekből származó sejttenyészetekből elkülönítették a trombinkötő anyagok két típusát [(A) és (B)], és kidolgoztak egy eljárást ezeknek a trombinkötő anyagoknak a nagy mennyiségben, stabil úton történő előállítására. A jelen feltalálók a trombinkötő anyagokra és az eljárásra korábban szabadalmi kérelmet nyújtottak be (445,681. számú, közzétett európai szabadalmi bejelentés).
A jelen feltalálók rekombináns DNS-technika (rUTM) alkalmazásával nyertek egy humán vizeletből származó trombinkötő anyagot, s az eljárásra vonatkozóan szabadalmi bejelentést tettek (54446/1991. számú japán szabadalmi bejelentés).
A nyúltüdőből származó thrombomodulinról ismert, hogy az antitrombin ΙΠ aktivitását megnöveli [K. T. Preissner et al., J. Biological Chemistry, 265, 4915-4922 (1990)]. A boqúból származó thrombomodulinnak azonban nincs hatása [Η. V. Jakubowski et al., J. Biological Chemistry, 261, 3876 (1986)], míg a humán placentából nyert thrombomodulin gátolja az antitrombin III aktivitását [K. Hirahara et al., Thrombo. Rés., 57. 117-126(1990)].
A szakterületen tehát két génmanipulációs technikával előállított, oldható thrombomodulin ismert. Az egyikről tudott, hogy megnöveli az antitrombin III aktivitását, míg a másik esetében ismert, hogy ilyen képességgel nem rendelkezik [K. Nawa et al., Biochem. Biophys. Rés., 171, 729-737 (1990)]. Ezekről a thrombomodulinokról azonban ismert, hogy gátolják a vérlemezekben a trombinkoagulációt, ami fontos szerepet játszik a véralvadási rendszerben, de ugyanakkor nincs ADP-koagulációs hatásuk [N. L. Esmon, J. Biological Chemistry, 258, 12238-12 242 (1983)].
A humán thrombomodulinokban és más trombinkötő anyagokban az antitrombin III aktivitás és a vérlemezaggregációt inhibiáló aktivitás fokozása ezért is kívánatos.
A fentieket figyelembe véve a jelen feltalálók széles körű vizsgálatokat kezdtek és azt találták, hogy egy transzformált sejt - amelyet egy gazdasejtnek egy olyan rekombináns vektorral történő transzformálásával állítanak elő, amely rekombináns vektor egy olyan DNS-fragmentumot foglal magában, amely DNS-fragmentumot egy, a humán vizeletből származó trombinkötő anyagot kódoló DNS-fragmentum 3'-végének egy specifikus DNS-fragmentummal való kapcsolásával nyernek - képes olyan, humán vizeletből származó trombinkötő anyag termelésére, amely alkalmas az antitrombin III aktivitás növelésére és a vérlemez-aggregáció gátlására.
Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya eljárás egy új trombinkötő anyag előállítására, amely az alábbi aminosavszekvenciával (a továbbiakban „A. szekvencia”) rendelkezik, eljárás egy DNS-fragmentum amelynek bázisszekvenciája az A. szekvenciát kódolja - előállítására, eljárás egy rekombináns vektor - amely az említett DNS-fragmentumot és egy replikálódó vektort tartalmazza - előállítására, valamint eljárás egy transzformált sejt előállítására, amely magában foglalja az említett rekombináns vektort.
HU 215 532 Β
A. szekvencia
AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu
TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnÁlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis
LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspVaUleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp \
GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpI leGlyLeuG’InLeuProProGlyCysGlyAsp ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu
AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerileThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAIaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProPro'GlyA'laValGInGlyHisTrpAlaArgGIu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGIyCysGluHisAlaCysAsnAla I leProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGIySerTyrSerCysMetCysGluThrGIyTyrArgLeuAlaAla AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal
V *
AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGInThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProI lePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPtíeCysSerGIyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, amelyben X, és X2 savas aminosavakat jelent, és Y( és Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav.
A találmány további tárgya eljárás antikoaguláns készítmény előállítására, amely a fent említett trombinkötő anyagot tartalmazza, és amely vérlemezkeaggregációt gátló aktivitást mutat.
A találmány egyéb részletei, jellemzői és előnyei i leírás következő részeiből egyértelműen kitűnnek.
Az 1. ábra a jelen találmány szerinti pCDM-GAG UTM1 és pCDM-GAG-UTM2 expressziós vektor szer kezetét ábrázolja.
HU 215 532 Β
A 2. ábra a találmány szerinti pBPV-GAGUTM1 expressziós vektor szerkezetét mutatja.
A jelen találmány szerinti trombinkötő anyag előállítható a következő eljárással összhangban. Egy humán placenta genom DNS-nek egy alkalmas restrikciós endonukleázzal végzett hasításával először egy templát DNS-t állítunk elő. Egy ismert humán thrombomodulin gén [Shirai, T. et al., J. Biochem., 103, 281-285 (1988)] bázisszekvenciájára vonatkozó elsődlegesen szintetizált DNS-t próbaként alkalmazva a templát DNS-t szkrineljük. Az így előállított DNS-t egy alkalmas restrikciós endonukleázzal fragmentáljuk, majd az így kapott DNS-fragmentumokat egy klónozó vektorba ligáljuk egy mikroorganizmus transzformálása céljából. A plazmid DNS-t a transzformált mikroorganizmusból extraháljuk, majd egy restrikciós endonukleázzal kezeljük, s így egy 1404 bázist tartalmazó DNS-fragmentumot nyerünk, amely a humán vizeletből származó trombinkötő anyagot kódolja. Egy XlX2Y1SerGlySerGlyY2 aminosavszekvenciát kódoló nuleotidszekvenciával rendelkező oligonukleotidot beépítünk a DNS-fragmentumba, s így egy olyan DNSfragmentumot kapunk, amely a jelen találmány szerinti DNS-fragmentumot tartalmazza. A jelen találmány szerinti DNS-fragmentumok jellegzetes példái azok, amelyek SEQID No. 3 és SEQID No. 4 bázisszekvenciával rendelkeznek. A jelen találmány szerinti DNSfragmentumok ugyanakkor nem korlátozódnak ezekre. Bármely olyan DNS-fragmentum, amely a találmány szerinti trombinkötő anyag felépítésére alkalmas aminosavszekvencia, így az A. szekvencia, előnyösen a SEQ ID No. 1 és SEQ ID No. 2 kódolására alkalmas, a jelen találmány körébe tartozik.
A jelen találmány szerinti DNS-fragmentumot tartalmazó rekombináns vektor felépítését a találmány szerinti DNS-fragmentum és egy replikálható expressziós vektor kapcsolásával valósíthatjuk meg.
Expressziós vektorként bármely forrásból, így prokariótákból (jellegzetesen E. coli), élesztőkből, rovarvírusokból, gerinces vírusokból stb. származó expressziós vektorok alkalmazhatók addig, amíg azok replikálhatók.
A trombinkötő anyag hatékony termelésének biztosítása céljából kívánatos, hogy a rekombináns expressziós vektort a következő (1)-(7) bázisszekvenciákból építsük fel, ebben a sorrendben a transzkripció folyamatának megfelelően:
(1) egy promoterként ható nukleotidszekvencia, (2) egy riboszóma kötőhelyként működő nukleotidszekvencia, (3) egy iniciáló kódonként ható nukloetidszekvencia, (4) egy szignál pepiidet kódoló nukleotidszekvencia, (5) az A. szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia, (6) egy befejező kódonként ható nukleotidszekvencia, (7) egy poli A addíciós szignálként ható nukleotidszekvencia.
Egy vektorként előnyösen alkalmazható plazmid DNS lehet egy önmagát például az E. coliban mint gazda mikroorganizmusban megsokszorozni képes plazmid és a beépített gént kifejezésre juttathatja emlőssejtek transzformációjával. Egy ilyen plazmid DNS magában foglalja az E. coliban történő sokszorozódáshoz a plazmid számára szükséges nukleotidszekvenciákat, úgymint a ColEI plazmid szériák replikátoraként ható nukleotidszekvenciát, az emlőssejtekben promotorként ható nukleotidszekvenciát, a transzformált E. coli szelekciós markereként működő gént, valamint a transzformáit emlőssejtek szelekciós markereként működő gént. Egy előnyös megoldás szerint tartalmaz még egy replikátor nukleotidszekvenciát, ilyen az SV40 őri, polioma őri vagy az emlőssejtekben működő HSV őri. A promotorok előnyös példáiként megadható promotorok példáuk a citomegalovírus, SV40, poliomavírus, boíjú papilloma vírus, adenovírus stb.; retrovírus LTR, így MMTV; a metallothionein gén promotora, és az ezekhez hasonlók. Az E. coli szelekciós markerek példái az ampicillin rezisztens gének, kanamicin rezisztens gének, tetraciklin rezisztens gének, klóramfenikol rezisztens gének, és az ezekhez hasonlók. Az emlőssejt szelekciós markerekre példák a neomicin rezisztens gének, higromicin B rezisztens gének, timidin kináz gének, dihidrofolát reduktáz gének, xantin-guanin foszforibozil transzferáz gének és az ezekhez hasonlók. Ezeket a géneket önmagukban, illetve kettő vagy több kombinációjaként is alkalmazhatjuk.
A jelen találmány szerinti DNS-fragmentum beépítését a fenti vektorokba úgy végezhetjük el, hogy egy, a DNS-fragmentumot tartalmazó DNS-t egy alkalmas restrikciós endonukleázzal hasítunk, adott esetben egy megfelelő linkért adunk hozzá, és kombináljuk a vektorral, amelyet egy alkalmas restrikciós endonukleázzal hasítunk. Alkalmazható restrikciós endonukleáz például az Eco Rí, Sph I, Pst I, Hind III, Bam Hl, Xho I, Xba I, Bán III, Sma I, Nco I, és az ezekhez hasonlóak. A nuleotidmódosító enzimek, úgymint az exonukleáz III, Bal31, Sí nukleáz, exonukleáz VII, mungbean (Phaseolus aureus) nukleáz, DNS-polimeráz, és az ezekhez hasonlók ugyancsak alkalmazhatók. Linkenként az Eco Rí linker, Sma I linker, Nco I linker, Bam Hl linker, Xho I linker, Hind III linker, Pst I linker, Sph I linker, Xbal I linker vagy más hasonlók használhatók.
A jelen találmány szerinti rekombináns vektor és/vagy trombinkötő anyag hatékony előállítására alkalmas transzformált sejteket úgy nyerhetjük, hogy a fenti módszerrel kapott expressziós rekombináns vektort beépítjük a gazdasejtekbe a kompetens sejt módszer, a protoplaszt módszer, a kalcium-foszfát ko-precipitációs módszer, az elektroporációs módszer, a DEAE dextrán módszer, a lipofektin módszer vagy más hasonló módszer segítségével. Az egysejtű szervezetek, úgymint baktériumok és élesztők, tenyésztett rovarsejtek, tenyésztett gerincessejtek és a hasonlók előnyösen alkalmazható gazdasejtek a transzformált sejtek előállítására. E. coli gazdasejtekként előnyösen alkalmazhatók az E. coli K12 vonal különféle mutánsai, például HB101, C600K, JM101, JM103, JM105, JM109,
HU 215 532 Β
MV1034m MV1184, MC1061/P3 és hasonlók. Az emlőssejtek előnyös példái a COS-sejtek, CHO-sejtek, Lsejtek, C127-sejtek, NIH3T3-sejtek, HeLa-sejtek és hasonlóak.
A trombinkötő anyagot az így nyert transzformált sejtek tenyésztésével, extrakciójával és a tenyésztett sejtektől vagy a kultúra táptalajától történő elválasztásával kaphatjuk meg. A transzformált sejtek tenyésztéséhez különféle természetes és mesterséges közeget alkalmazhatunk. A közegek előnyösen szénforrást, így cukrokat, alkoholokat és szerves savas sóit, nitrogénforrást, így proteinkeverékeket, aminosavakat és ammóniumsókat, valamint szervetlen sókat tartalmaznak. Továbbá előnyösen a szelekciós marker géneknek megfelelő vitaminokat és antibiotikumokat is magukban foglalnak. Ha a vektor kívül esik azon a típuson, amelyben az expresszió kontrollálható, szükség van egy olyan eljárásra, amely előidézi az expressziót a tenyésztés folyamatában. A tenyésztés után a tápközeget centrifugáljuk, így a tápfolyadékot elválasztjuk a sejtektől. Abban az esetben, ha a trombinkötő anyag a tenyésztett sejtekben akkumulálódik, a sejteket fagyasztva-felengedéssel, ultrahangos kezeléssel, (French) nyomással, enzimkezeléssel, homogenizálással vagy hasonló úton elroncsoljuk, és a trombinkötő anyagot EDTA, felületaktív anyagok, karbamid, guanidin-hidroklorid vagy hasonlók alkalmazásával feloldjuk.
Tisztított trombinkötő anyag nyerhető, ha az előállított trombinkötő anyagot tartalmazó tápfolyadékot vagy sejtextraktumot oszlopkromatográfiának vetjük alá. Ioncserélő kromatográfia, afifmitáskromatográfia (amelyet például monoklonális antitestek esetére a következő helyen írtak le: Japán Kokai No. 45398/1989), gélszűréses kromatográfia vagy hasonlók egymástól függetlenül vagy kombinációban is alkalmazhatók. Az így nyert trombinkötő anyagok között azok, amelyek SEQ ID No. 1 vagy SEQ ID No. 2 aminosavszekvenciával rendelkeznek, a következő jellemzőkkel írhatók le.
(1) Aminosavszekvencia
A DNS-fragmentumok nukleotidszekvenciája alapján az aminosavszekvencia valószínűleg olyan, mint ami a SEQ ID No. 1- és a SEQ ID No. 2-ben látszik.
(2) Molekulatömeg
SDS-poli(akril-amid)-gélelektroforézissel redukáló körülmények között meghatározva: 55 000-100 000.
(3) Izoelektromos pont
Izoelektromos elektroforetikus módszerrel, amfolit alkalmazásával meghatározva: pH 3-4.
(4) Cukoranalízis
A molekulatömegből arra lehet következtetni, hogy a trombinkötő anyagokhoz két vagy több cukor kapcsolódik. Az aminosavszekvencia alapján a cukrok egyike valószínűleg egy savas poliszacharid, amelynek a kapcsolódási helye a Ser (474).
(5) Hatások
Antitrombin aktivitással rendelkezik.
Növeli az antitrombin III aktivitását.
Vérlemez-aggregációt gátló aktivitással rendelkezik.
Antikoaguláns szerként a jelen találmány szerinti trombinkötő anyagot tartalmazó készítmények jellegzetes példái az injekciós preparátumok. Az ilyen injekciós preparátumok előnyös formája a fagyasztva-szárított (ffeeze-dried) por, amely desztillált vízben vagy fiziológiás sóoldatban oldható az alkalmazáskor. A készítmény beadására előnyös út az intravénás injekció.
Bár az alkalmazási mennyiség függ a beteg tüneteitől, testsúlyától és további tényezőktől, az előnyös dózis 10 pg/kg-tól 10 mg/kg-ig terjed. A találmány szerinti trombinkötő anyagnak az előbbi tartománynál nagyobb mennyiségű beadása nem vált ki semmilyen abnormis reakciót. Az anyag kellőképpen biztonságos.
A találmány egyéb jellemzői a következő, példaszerű leírásból egyértelműen megismerhetők. A példák a találmány illusztratív bemutatását szolgálják, azoknak semmiféle korlátozó jellegük nincs.
PÉLDÁK
1. Példa
A trombinkötő anyag génjének klónozása
DNS-szintetizátor (ABI Model 381 A) alkalmazásával egy SEQ ID No. 5-nek megfelelő szekvenciájú 1. számú primer mintát és egy SEQ ID No. 6-nak megfelelő szekvenciájú 2. számú primer mintát szintetizáltunk a humán thrombomodulin gén nukleotidszekvenciájának megfelelően [Shirai, T. et al., J. Biochem., 103, 281-285 (1988)]. Egy humán placenta genom DNS (a Clonetech Co. terméke) BAM ΗΙ-vel végzett hasításával egy templát DNS-t állítottunk elő. A génamplifikációt az alábbiakban megadott összetételű reakcióoldatban hajtottuk végre egy Quick Thermo System (Model QST-10M: védjegy; Japan Genetic Co. gyártmány) alkalmazásával, az inkubáció 30 ciklusos ismétlése mellett. Egy ciklus 2 perces időtartamú 94 °C hőmérsékletű, 3 perc időtartamú 50 °C hőmérsékletű és 4 perc időtartamú 72 °C hőmérsékletű inkubációból állt. A reakció után a reakciótermék mintáját agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk a cél DNS-kötés amplifikációjának igazolására.
Reakcióoldat
| Desztillált víz | 71 μΐ |
| pufferoldat* | 10 μΐ |
| dNTP kevert oldat (2,5 mM) | 8 μΐ |
| 1. számú primer minta (20 μΜ) | 5μ1 |
| 2. számú primer minta (20 μΜ) | 5 μΐ |
| templát DNS (pg/μΐ) | Ιμΐ |
| AmpliTaq (5 egység/μΐ) | 0,5 μΐ |
*pufferoldat: 0,1 M kálium-korid
0,1 M Tris-HCl puffer (pH 8.3)
0,1% zselatin 15 mM magnézium-klorid
A reakcióoldatból a DNS-t etanolos kicsapással nyertük ki, Xho I-gyel és Kpn I-gyel hasítottuk ki, majd agaróz gélelektroforézisnek alávetve 1,57 kb Xho IΚρη I fragmentumokat kaptunk. Elkülönítve a pUC118 klónozására szolgáló vektort [Vieira, J. és Messing, J., Methods Enzymol., 153, 3-11 (1987)] Hind II-vel hasítottuk, Xho I linkerrel kapcsoltuk, majd tovább hasítottuk Xho I-gyel és Kpn I-gyel, s az agaróz gélelektroforézissel vektorfragmentumokat kaptunk.
HU 215 532 Β
A vektorfragmentumokat és az 1,57 kb Xho Ι-Κρη I fragmentumokat ligáltuk, és a kapott DNS-sel E. coli MV1034-et [Vieira, J. és Messing, J., Methods Enzymol., 153, 3-11 (1987)] transzformáltunk.
Az így nyert transzformált sejtekből a plazmid DNS-t kiextraháltuk, és restrikciós endonukleázzal hasítottuk. Ily módon 6 olyan kiónt választottunk el, amely olyan plazmiddal rendelkezik, amelybe a humán thrombomodulin génből származó 1,57 kb Xho Ι-Κρη I került beépítésre.
Az így nyert kiónokba beépített fragmentumok nukleotidszekvenciájának a meghatározása valamennyi fragmentumban 1-3 mutáns helyet mutatott ki. Ezt követően a 2. számú klónból származó 0,31 kb Xho I-Sma I fragmentumot, az 1. számú klónból származó 0,62 kb Múl Ι-Κρη I fragmentumot (valamennyi mutáns hely nélküli) a fent említett vektorfragmentummal rekombináltuk, s így a pUCTM/XHO-KPN plazmidot kaptuk, amely a humán thrombomodulin gép beépített fragmentumát a korrekt szekvenciával tartalmazza.
2. Példa
A trombinkötő anyag expressziójára szolgáló vektor kialakítása
Abból a célból, hogy egy glikozil-amino-glikán addíciós helyet a humán vizeletből származó trombinkötő anyag aminosavszekvenciájának C-terminális végén lévő Asp-hoz kapcsoljunk, a SEQ ID No. 7-10 nukleotidszekvenciájú 1-6. számú linkereket állítottuk elő, és minden 5’-véget foszforileztünk.
A pUSTM/XHO-KPN-t Xho I-gyel és Kpn I-gyel hasítottuk a humán thrombomodulin génből származó 1,57 kb Xho I—Kpn I fragmentum előállítása céljából. Ezt az 1.57 kb fragmentumot egy előzetesen Xho I-gyel hasított és defoszforilált CDM8 emlőssejt expressziós vektorral (az Invitrogen Co. terméke) kötöttük le az 1., 2., 3. és 4. vagy az 1., 2., 5. és 6. számú linkerrel együttesen. Az 1.57 kb fragmentumot ugyancsak lekötöttük Xho I-gyel hasított és defoszforilált CDM8-cal és az 1., 2., 5. és 6. számú linkerrel. A lekötött DNS-ekkel E. coli MC1061/P3-at [Seed, B. és Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 3365-3369 (1987)] transzformáltunk. Az így előállított transzformált sejtekből a plazmid DNS-eket kiextraháltuk, majd a beépülés helyének és irányának alátámasztására restrikciós endonukleázzal hasítottuk. A jelen találmány szerinti DNSfragmentumot tartalmazó 1.68 kb fragmentumokat a beépülés megfelelő irányát és a korrekt restrikciós endonukleáz térképet mutató 8 klónból Xho I-gyel kivágtuk. Valamennyi klón nukleotidszekvenciájára azt találtuk, hogy azok a SEQ ID No. 13 és 14 szekvenciával rendelkeznek, s ez azt erősítette meg, hogy az expressziós vektorokat megfelelően építettük fel.
Az így nyert, találmány szerinti expressziós vektorokat pCDM-GAG-UTMl és pCDM-GAG-UTM2 névvel (1. ábra) láttuk el, és a vektorokat befogadó transzformáit sejteknek az E. coli MC1061/P3 (pCDM-GAGUTM1) és az. E. coli MC1061/P3 (pCDM-GAG-UTM2) nevet adtuk.
3. Példa
A trombinkötő anyagnak a tenyésztett emlőssejtekkel végzett expressziója
COS7 sejteket a pCDM-GAG-UTMl-gyel vagy pCDM-GAG-UTM2-vel a DEAE-dextrán módszer szerint [Seed, B. és Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 3365-3369 (1987)] transzferáltunk. 5xl05 sejtet izoláltunk egy 60 mm átmérőjű tenyésztőedénybe, és a következő nap a tápközeget leszívtuk, helyére 2 ml, 10% Nu-szérumot tartalmazó DMEM-et (Dulbecco’s-modified minimum essential médium) helyeztünk. pCDM-GAG-UTMl és pCDM-GAGUTM210 pg-ját (1 pg/μΐ) hozzáadtuk egy 10 mg/ml DEAE-dextrán (átlagos molekulatömeg 5xl05, Pharmacia termék) PBS-ben készült oldatának 100 μΐéhez, majd a kapott oldatot 10 μΐ 20 mM-os chloroquine-nel együtt a sejtkultúra-folyadékhoz adtuk. Négy órai 37 °C hőmérsékleten végzett tenyésztést követően a tápfolyadékot leszívtuk, és 2 ml 10%-os DMSO-t (PBS-ben oldva) adtunk hozzá. A keveréket szobahőmérsékleten 2 percig állni hagytuk. A DMSOoldat leszívatással történt eltávolítása után 3 ml, 10% FCS-t tartalmazó DMEM-t adtunk hozzá, és a keveréket 37 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül tenyésztettük. A tápfolyadékot FCS-mentes DMEM-re cseréltük, majd a tenyésztést további 48 órán keresztül folytattuk. A tenyésztés után a felülúszót összegyűjtöttük.
A fenti eljárással nyert médiumot egy monoklonális A-73 antitesttel [Japanese Patent Laid-open (kokai) No. 45398/1989; 2 mg IgG/ml gyanta] kombinált 1 ml-es Sehparose 4B (2 mg IgG/ml gyanta) oszlopon vezettük keresztül. Az oszlopot a következő összetételű keverékekkel eluáltuk: (1)2 ml, 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó, 0,02 M Tris-HCl puffer (pH 7,4), (2) 20 ml, 1 M nátrium-kloridot és 0,05% Tween 20-t tartalmazó, 0,02 M Tris-HCl puffer (pH 7,4), és (3) 5 ml, 1 M nátrium-kloridot tartalmazó, 0,02 M Tris-HCl puffer (pH 7,4), majd az elúciót 5 ml, 2 M nátrium-tiocianátot, 5 mM EDTA-t és 1 M nátrium-kloridot tartalmazó, 0,02 M Tris-HCl pufferrel folytattuk. Az eluátumot 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 M Tris-HCl pufferrel szemben dializálva a tisztított trombinkötő anyagokat kaptuk (r-GAG-UTMl és r-GAG-UTM2).
4/a Példa
A trombinkötő anyagoknak a tenyésztett emlőssejtekkel végzett expressziója
CHO - KI sejteket a pCDM-GAG-UTMl-gyel a kalcium-foszfát-módszer [Gorman, C„ „DNA Cloning” IRL Press, England, vol. 2, 143-190 (1985)] szerint transzfektáltunk. 5xl05 CHO-KI sejtet egy 10 cm átmérőjű Petri-csészébe inokuláltunk, majd a következő napon a tápfolyadékot (10% FCS-t tartalmazó Ham FI2 közeg /a továbbiakban Médium/) lecseréltük. Négy óra elteltével DNS és kalcium-foszfát együttes precipitátumát adtuk hozzá. Az itt alkalmazott ko-precipitátumot a következő eljárás szerint állítottuk elő. A 20 pg pCDM-GAG-UTMl-et és 100 ng neomicin rezisztens gént 1 mM Tris-HCl puffer (pH 8,0)-0,1 mM EDTA 450 μΐ-ében feloldottunk és összekevertünk
HU 215 532 Β μΐ 2,5 Μ kalcium-kloriddal. A keveréket cseppenként hozzáadtuk a következő összetételű oldat 500 μΐéhez: 50 mM HEPES (pH 7,12) - 280 mM nátriumklorid - 1,5 mM nátrum-hidrogén-foszfát. Miután a keveréket állni hagytuk, az oldatot hozzáadtuk a sejtkultúra tápfolyadékához, 24 órás tenyésztés céljából. A Médiumot frissre cseréltük, és további 24 órán át tenyésztettük, majd a médiumot egy 400 pg/ml G418-at tartalmazó szelektív médiumra cseréltük. Két hét elteltével a képződött telepeket 24 lyukú lemezre (24-well plate) helyeztük át, és a tenyésztést addig végeztük, míg a tenyészet konfluens lett. A tenyészközegről a felülúszót összegyűjtöttük. A kiválasztott trombinkötő anyagot (rGAG-UTM) a magas termelésű kiónok szelekciója céljából mennyiségileg analizáltuk. A klónozást a továbbiakban a kiválogatott kiónon a határhígítási módszerrel végeztük. Az így kapott transzformált sejteket CHOGUTM 1-8-nak neveztük el, és a Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology helyen tettük letétbe (FERM P-3260).
A transzformált CHO-GUTM 1-8 sejtet egy 225 cm2-es edényben 1% FCS-t tartalmazó UC202 médiumban tenyésztettük addig, míg konfluenssé nem vált, majd ezt követően a médiumot 50 ml FCS-mentes UC202 médiumra cseréltük le. Egy hét elteltével a tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, és azonos mennyiségű, FCS-mentes, friss médiumra cseréltük. További egyhetes tenyésztést követően a tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, s megállapítottuk, hogy abban kiválasztva 3-4 pg/ml trombinkötő anyag található.
A tisztított trombinkötő anyagot a 3. Példa utolsó részében leírtakkal azonos eljárás szerint nyertük ki.
4/b Példa
A trombinkötő anyag kifejezésére és a tenyésztett emlőssejt-szubsztancia kifejezésére szolgáló vektor konstruálása pCDM-GAG-UTMl -et Xho I-gyel emésztettünk emberi modifikált thrombomodulin cDNS 1,7 kb fragmentum előállítására, mely egy olyan részt tartalmaz, melyhez glükozaminoglican van kötve. Szeparáltan emlőssejt-kifejező pBPV-vektort (Pharmacia Co. terméke) emésztettünk Xho I-gyel, defoszforileztük és cDNS-fragmentummal ligáltuk, T4 DNS-ligázt használva az E. Coli HB101 (TAKARA SHUZO K. K. terméke) transzformálására. A DNS-t extraháltuk a transzformensből, így kinyertük és emésztettük endonukleázokkal, az inszertáció irányának és helyének igazolására. A megfelelő irányt és helyet mutató kiónokat kiválasztottuk. Az így konstruált, találmány szerinti expressziós vektort pBPV-GAG-UTMl-nek (lásd 2. ábra) nevezzük, és a transzformenst magában foglaló vektort E. coli HB 101-nek (pBPV-GAG-UTMl).
Hasonló módon, mint ahogyan azt a 4/a példában leírtuk, egér Cl27 sejteket transzfektáltunk pBPV-GAGUTMl-val, kalcium-foszfátos módszerrel. 8xl05 Cl27 sejtet inokuláltunk 10 cm átmérőjű Petri-csészében és a következő napon a tenyésztőközeget [Dulbecco’s Modifíed Eagle Minimál Médium (DMEM-médium) 10% FCS-tartalommal] lecseréltük. Ezután négy órával DNS és kalcium-foszfát ko-precipitátumát adtuk hozzá.
Az alkalmazott ko-precipitátumot a következők szerint állítottuk elő.
mikrogramm pBPV-GAG-ATMl-et és 100 ng neomicin rezisztens gént tartalmazó plazmidot 1 mM Tris-HCl puffer (pH 8)-0,1 mM EDTA 450 mikroliterében oldottunk és 50 mikroliter 2,5 M kalcium-kloriddal kevertük. Az elegyet cseppenként a következő, 500 mikroliter mennyiségű oldathoz adtuk: 50 mM HEPES (pH 7,12)-280 mM NaCl-1,5 mM nátriumhidrogén-foszfát. Miután a keveréket állni hagytuk szobahőmérsékleten 30 percen át, az oldatot a sejttenyészethez adtuk, 24 órás tenyészetre. A médiumot friss DMEM-tenyésztőközegre cseréltük, további 24 órán át tenyésztettük, majd 5% FCS-adalékolt és 400 pg/ml G418 tartalmú DMEM-médiumra cseréltük. 10 nap múlva a képződött telepeket 24 lyukú lemezre (24-well plate) helyeztük és folyamatosan tenyésztettük, amíg a tenyészet konfluens lett. A tenyészközegről a felülúszót összegyűjtöttük. A szelektált trombinkötő anyagot a nagy termelésű kiónok kiválasztására mennyiségileg analizáltuk. A klónozást a továbbiakban a kiválogatott kiónon a határhígítási módszerrel végeztük.
A szelektált, transzformált Cl27 sejteket 5% FCSadalékolt DMM-médiumban 1750 cm2-es edényben tenyésztettük, míg konfluenssé vált, ezt követően a médiumot 500 ml 1% FCS-t tartalmazó 500 ml DMEMmédiummal helyettesítettük. Egy hét után a tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük és megállapítottuk, hogy abban kiválasztva 2 pg/ml trombinkötő anyag van.
Körülbelül 800 pg tisztított trombinkötő anyagot (rGAG-UTMI) nyertünk ki ugyanolyan módon, mint amit a 3. példa utolsó részében írtunk le.
5. Példa
A trombinkötő anyagjellemzői
Az SDS-PAGE-t a Laemmli-féle módszerrel (Natúré, 227, 680-685) összhangban végeztük a tisztított trombinkötő anyagokon. A proteint a PVDF-membránra a Matsudaira-módszer [J. Bioi. Chem., 262 (21), 10035-10038] szerint vittük fel. A PVDF-membránt ezután 2 órán keresztül szobahőmérsékleten 0,1 M nátrium-kloridot és 0,1% boíjúszérum albumait tartalmazó 0,05 M Tris-HCl pufferben (TBS) reagáltattuk. Az oldat eltávolítása után a maradékot egy 0,05% Tween 20 tartalmú TBS-sel mostuk át, majd egy A-60 monoklonális antitesttel konjugált „horseradish” (torma) peroxidázzal TBS-0,05% Tween 20 oldatban szobahőmérsékleten 1 órán keresztül reagáltattuk. Az oldatot eltávolítottuk, és a maradékot előbb 0,05% Tween 20-TBS oldattal mostuk át, majd 5 mg 3-amino-9-etil-karbazolt és 25 μΐ 30%-os hidrogén-peroxidot tartalmazó ecetsav puffer (pH 5,0) 50 ml-ébe helyeztük. A színessé válás egy széles kötést valószínűsített, ami a glikozil-amino-glikán adduktokra j ellemző.
6. Példa
A jelen találmány szerinti trombinkötő anyagok, azaz az r-GAG-UTMl és 2, valamint r-UTM mindegyikének 0,1 pg/ml koncentrációjú oldatát 5 μΐ kondroitinázzal (10 mU, Seikagakn Kogyo K. K. termék) 37 °C
HU 215 532 Β hőmérsékleten 40 percen át kezeltük. Az immunszínezést (immunoblotting) az 5. példában leírtak szerint végezve megerősítést nyert, hogy a jelen találmány szerinti trombinkötő anyagokban a kondroitin-szulfát típusú glikóz-amino-glikán kovalens kötésekkel van jelen.
7. Példa
Antikoaguláns aktivitás
A jelen találmány szerint trombinkötő anyagok (rGAG-UTM1 és 2), valamint r-UTM mindegyikének 2,5 pg/ml koncentrációjú oldatát összekevertük 2,5 mg/ml humán fibrinogénnel és 0 vagy 250 pg/ml humán antitrombin III-mal, majd 5 mM kalcium-klorid-oldatban disszolváltuk. Az oldathoz 0,5 U/ml borjútrombint adtunk az alvadási idő mérése céljából. Az eredményeket az I. táblázatban mutatjuk be.
I. táblázat
| Kontroll mp | r-UTM mp | r-GAG- UTMl mp | r-GAG- UTM2 mp | |
| ATIII (-) | 43,3 | 61,8 | 77,2 | 80,1 |
| ATIII (+) | 49,5 | 80,8 | >400 | >400 |
Az I. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti trombinkötő anyagok trombinnal való kombinálása késlelteti a vér koagulációját. A trombinkötő anyagok antikoaguláns aktivitásának jelentős változása is látható antitrombin III jelenlétében.
8. Példa
Antikoaguláns aktivitás
A jelen találmány szerinti trombinkötő anyagot, rGAG-UTMl-et vagy r-GAG-UTM2-t (9-90 nM), valamint r-UTM-et (9-90 nM) feloldottunk 1 mg/ml borjú fibrinogén oldatban [0,15 mM nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM Tris-HCl pufferben (pH 7,4)], majd a koagulációhoz szükséges idő mérésére összekevertük 18 nM borjútrombinnal. A boíjútrombint különböző koncentrációkban alkalmazva kalibrációs görbét készítettünk, amelyből meghatároztuk az 50%-os gátláshoz szükséges koncentrációkat (IC50). Az eredményeket a II. táblázat mutatja be.
II. táblázat
| ICS0(nM) | |
| r-UTM | 80 |
| r-GAG-UTMl | 16 |
| r-GAG-UTM2 | 15 |
9. példa
Antikoaguláns aktivitás
A találmány szerinti anyagokat (17 nM) vagy rUIM-et (17 nM) feloldottuk 1 mg/ml boíjú fibrinogén oldatban [0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM Tris-HCl pufferben (pH 7,4)], majd a koagulációhoz szükséges idő méréséhez összekevertük 18 nM borjútrombinnal. Az eredményeket a III. Táblázat mutatja be.
III. táblázat
| Koagulációs idő (mp) | |
| Kontroll | 28,1 |
| r-UTM | 29,6 |
| r-GAG-UTMl | 300,0 |
| r-GAG-UTM2 | 295,3 |
10. Példa
Vérlemez-aggregációt gátló aktivitás
Egy jelen találmány szerinti anyag (10-6-101!M) és nyúlfülvénából nyert vérből készített vérlemezben gazdag plazma (PRP, 200 μΐ) oldatának 8 μΐ-éhez 2 μΜ adenozin-difoszfátot (ADP) adtunk a vérlemez-aggregáció mérése céljából. Az ADP különböző koncentrációkban történő alkalmazásával kimért kalibrációs görbéből számított 50%-os gátló koncentráció, azaz a találmány szerinti vegyület olyan koncentrációja, amely az ADP aggregációját 50%-ban gátolja, az r-GAGUTM1 esetében 2x 10 7 M és az r-GAG-UTM2 esetében 2,1 χ 10 7 M volt. Az r-UTM a teszt koncentrációtartományán belül (10 6-108 M) nem mutatott semmiféle aggregációt gátló aktivitást.
11. Példa
Változások a vérkoncentrációban
Érzéstelenítés alatt egy hím Wistar patkány jobb combcsonti vénájába katétert vezettünk be, a katéteren át a tesztvegyületek, GAG-UTM1 és GAGUTM2 1 mg/ml/kg mennyiségét juttattuk be rövid idő alatt. A kezelés előtt, majd a kezelést követő 1., 3., 6., 10., 20., 30., 60. és 120. percben vett vérminták 0,1 mles részletét heparinnal kevertük össze, s ezek a minták plazmamintaként szolgáltak a vérkoncentráció meghatározására. A vérkoncentráció mérését egy antihumán trombinkötő monoklonális antitest alkalmazásával, a szendvics ELISA-módszerrel összhangban végeztük. Az egykamrás modellel mindkét tesztvegyületet analizálhatónak találtuk. Az eredményeket a következő, IV. táblázat mutatja be.
IV. táblázat
| GAG-UTM1 (n=3) | r-UTM (n=5) | |
| Ti/2(perc) | 75,2 ±10,8 | 45,4±2,6 |
| AUC (perc pg/ml) | 1380±61 | 872±64 |
A fentiek szerint a jelen találmány szerinti trombinkötő anyagok fokozzák az antitrombin III aktivitást, és gátolják a vérlemez-aggregációt, s ezáltal antitrombin aktivitással rendelkeznek. így ezek az anyagok jól hasznosíthatók antikoaguláns szerek hatékony komponenseként. Ugyanakkor a jelen találmány szerinti trombinkötő anyag alacsony költséggel előállítható nagy mennyiségben.
HU 215 532 Β
A fenti kitanítás tükrében nyilvánvaló, hogy számos módosításra és változatatásra van lehetőség a találmány körében. Emiatt érthető, hogy a melléklet szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi körön belül a találmány más módon is megvalósítható, mint azt a fentiekben szereplő speciális példákon keresztül bemutattuk.
Szekvenciajegyzék
1. SEQIDNo. 1
2. A szekvencia hossza: 476
3. A szekvencia típusa: aminosav
4. A szekvencia topológiája: lineáris
5. Fajta: protein
6. Szekvencia
| Alá Pro Alá Glu Pro | Gin | Pro | Gly Gly Ser Gin Cys 10 | Val | Glu | His 15 | Asp | ||||||||
| 5 | |||||||||||||||
| Cys | Phe | Alá | Leu | Tyr | Pro | Gly | Pro | Alá | Thr | Phe | Leu | Asn | Alá | Ser | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| He | Cys Asp | Gly | Leu | Arg | Gly | Η T s | Leu | Met | Thr | Val | Arg | Ser | Ser | Val | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Alá | Alá Asp | Val | I le | Ser | Leu | Leu | Leu | Asn | Gly Asp Gly Gly | Val | Gly | ||||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Arg | Arg Arg | Leu | Trp | Ile | Gly | Leu | Gin | Leu | Pro | Pro | Gly Cys | Gly Asp | |||
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Pro | Lys | Arg | Leu | Gly | Pro | Leu | Arg | Gly | Phe | Gin | Trp | Val | Thr | Gly Asp | |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asn | Asn | Thr | Ser | Tyr | Ser | Arg Trp | Alá | Arg | Leu | Asp | Leu | Asn | Gly | Alá | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Cys Gly | Pro | Leu | Cys Val | Alá | Val | Ser | Alá | Alá | Glu | Alá | Thr | ||
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Val | Pro | Ser | Glu | Pro | Ile | Trp Qlu | Glu | Gin | Gin | Cys | Glu | Val | Lys | Alá | |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Phe | Leu | Cys | Glu | Phe | H is | Phe | Pro | Alá | Thr | Cys | Arg | Pro | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Alá | Val | Glu | Pro | Gly | Alá | Alá | Alá | Alá | Alá | Val | Ser | Ile | Thr | Tyr | Gly |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Phe | Alá | Alá | Arg | Gly | Alá | Asp | Phe | Gin | Alá | Leu | Pro | Val | Gly |
| 180 | 185 | 190 |
HU 215 532 Β
| Ser Ser Alá Alá | Val | Alá | Pro | Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys Thr Alá | |||||||||||
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Pro | Pro | Gly | Alá | Val | Gin | Gly His | Trp Alá Arg | Glu | Alá | Pro | Gly | Alá | |||
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Trp Asp Cys | Ser | Val | Glu | Asn | Gly Gly Cys | Glu | His | Alá | Cys | Asn | Alá | ||||
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| He | Pro | Gly | Alá | Pro | Arg | cys | Gin | Cys | Pro | Alá | Gly | Alá | Alá | Leu' | Gin |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Alá | Asp | Gly Arg | Ser | Cys | Thr | Alá | Ser | Alá | Thr | Gin | Ser | Cys | Asn | Asp | |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Cys | Glu | His | Phe | Cys | Val | Pro | Asn | Pro | Asp | Gin | Pro | Gly | Ser | Tyr |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Ser | Cys | Met | Cys | Glu | Thr | Gly Tyr Arg | Leu | Alá | Alá | Asp | Gin | His | Arg | ||
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Cys | Glu | Asp | Val | Asp Asp | Cys | Ile | Leu | Glu | Pro | Ser | Pro | Cys | Pro | Gin | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Arg | Cys | Val | Asn | Thr | Gin | Gly Gly | Phe | Glu | Cys | His | Cys | Tyr | Pro | Asn | |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Tyr Asp | Leu | Val | Asp Gly | Glu | Cys | Val | Glu | Pro | Val | Asp | Pro | Cys | Phe | ||
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Arg | Alá | Asn | Cys | Glu | Tyr | Gin | Cys | Gin | Pro | Leu | Asn | Gin | Thr | Ser | Tyr |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Leu | Cys | Val | Cys | Alá | Glu | Gly | Phe | Alá | Pro | Ile | Pro | His | Glu | Pro | His |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Arg | Cys | Gin | Met | Phe | Cys | Asn | Gin | Thr | Alá | Cys | Pro | Alá | Asp | Cys | Asp |
| 385 | 390 | 395 | 4Q0 | ||||||||||||
| Pro | Asn | Thr | Gin | Alá | Ser | Cys | Glu | Cys | Pro | Glu | Gly Tyr | Ile | Leu | Asp | |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Phe | Ile | Cys | Thr | Asp | Ile | Asp | Glu | Cys | Glu | Asn | Gly Gly | Phe | |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Gly | Val | cys | His | Asn | Leu | Pro | Gly | Thr | Phe | Glu | Cys | Ile | Cys |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Gly | Pro | Asp | Ser | Alá | Leu | Val | Arg | His | Ile | Gly | Thr | Asp Cys Asp | Ser | ||
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Gly Lys | Val | Asp | Glu | Asp | Tyr | Ser | Gly | Ser | Gly | Glu |
465 470 475 ίο
HU 215 532 Β
l.SEQ ID No. 2
2. A szekvencia hossza: 476
3. A szekvencia típusa: aminosav
4. A szekvencia topológiája: lineáris
5. Fajta: protein
6. Szekvencia
| Alá Pro | Alá | Glu | Pro 5 | Gin | Pro Gly Gly | Ser Gin Cys 10 | Val | Glu His 15 | Asp | ||||||
| Cys | Phe | Alá | Leu | Tyr | Pro | Gly | Pro | Alá | Thr | Phe | Leu | Asn | Alá | Ser | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| He | Cys | Asp | Gly | Leu | Arg | Gly | His | Leu | Met | Thr | Val | Arg | Ser | Ser | Val |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Alá | Alá | Asp | Val | I le | Ser | Leu | Leu | Leu | Asn | Gly Asp Gly Gly | Val | Gly | |||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Arg Arg | Arg | Leu | Trp | Ile | Gly | Leu | Gin | Leu | Pro | Pro | Gly Cys | Gly Asp | |||
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Pro | Lys | Arg | Leu | Gly | Pro | Leu | Arg | Gly | Phe | Gin | Trp | Val | Thr | Gly | Asp |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asn | Asn | Thr | Ser | Tyr | Ser | Arg | Trp | Alá | Arg | Leu | Asp | Leu | Asn | Gly | Alá |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Cys Gly | Pro | Leu | Cys | Val | Alá | Val | Ser | Alá | Alá | Glu | Alá | Thr | |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Val | Pro | Ser | Glu | Pro | Ile | Trp. | Glu | Glu | Gin | Gin | Cys | Glu | Val | Lys | Alá |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Asp Gly | Phe | Leu | Cys | Glu | Phe | His | Phe | Pro | Alá | Thr | Cys | Arg | Pro | Leu | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Alá | Val | Glu | Pro | Gly | Alá | Alá | Alá | Alá | Alá | Val | Ser | Ile | Thr | Tyr | Gly |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Phe | Alá | Alá | Arg | Gly | Alá | Asp | Phe | Gin | Alá | Leu | Pro | Val | Gly |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Alá | Alá | Val | Alá | Pro | Leu | Gly | Leu | Gin | Leu | Met | Cys | Thr | Alá |
| 195 | 200 | 205 |
HU 215 532 Β
| Pro Pro 210 | Gly Alá Val | Gin Gly His 215 | Trp Alá Arg | Glu Alá 220 | Pro Gly | Alá | |||||||||
| Trp | Asp | cys | Ser | Val | Glu | Asn | Gly Gly Cys | Glu | His | Alá | Cys | Asn | Alá | ||
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ile | Pro | Gly | Alá | Pro | Arg Cys | Gin | Cys | Pro | Alá | Gly | Alá | Alá | Leu | Gin | |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Alá | Asp Gly Arg | Ser | Cys | Thr | Alá | Ser | Alá | Thr | Gin | Ser | Cys | Asn | Asp | ||
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Leu | Cys | Glu | His | Phe | Cys | Val | Pro | Asn | Pro | Asp | Gin | Pro | Gly | Ser | Tyr |
| . ... | 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ser | Cys | Met | Cys | Glu | Thr | Gly Tyr | Arg | Leu | Alá | Alá | Asp | Gin | His | Arg | |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Cys | Glu | Asp | Val | Asp | Asp Cys | I le | Leu | Glu | Pro | Ser | Pro | Cys | Pro | Gin | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Arg | Cys | Val | Asn | Thr | Gin | Gly Gly | Phe | Glu | Cys | His | Cys | Tyr | Pro | Asn | |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Tyr Asp | Leu | Val | Asp | Gly | Glu | cys | Val | Glu | Pro | Val | Asp | Pro | Cys | Phe | |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Arg | Alá | Asn | Cys | Glu | Tyr | Gin | Cys | Gin | Pro | Leu | Asn | Gin | Thr | Ser | Tyr |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Leu | Cys | Val | Cys | Alá | Glu | Gly | Phe | Alá | Pro | Ile | Pro | His | Glu | Pro | His |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Arg | Cys | Gin | Met | Phe | Cys | Asn | Gin | Thr | Alá | Cys | Pro | Alá | Asp Cys Asp | ||
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Pro | Asn | Thr | Gin | Alá | Ser | Cys | Glu | Cys | Pro | Glu | Gly Tyr | Ile | Leu | Asp | |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Phe | He | Cys | Thr | Asp, | . 11 e | Asp | Glu | Cys | Glu | Asn | Gly Gly | Phe | |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Gly | Val | Cys | His | Asn | Leu | Pro | Gly | Thr | Phe | Glu | Cys | I le Cys | |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Gly | Pro | Asp | Ser | Alá | Leu | Val | Arg | His | He | Gly | Thr | Asp Cys Asp Ser | |||
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Gly Lys | Val | Asp Asp | Glu | Alá | Ser | Gly | Ser | Gly Asp |
465 470 475
HU 215 532 Β
1. SEQ ID No. 3 5. A szekvencia topológiája: lineáris
2. A szekvencia hossza: 1428 6. Fajta: cDNS—>mRNS
3. A szekvencia típusa: nukleinsav 7. Szekvencia
4. Szál: kettős szálú
| GCACCCGCAG | AGCCGCAGCC | GGGTGGCAGC | CAGTGCGTCG | AGCACGACTG | CTTCGCGCTC | 60 |
| TACCCGGGCC | CCGCGACCTT | CCTCAATGCC, AGTCAGATCT | GCGACGGACT | GCGGGGCCAC | 120 | |
| CTAATGACAG | TGCGCTCCTC | GGTGGCTGCC | GATGTCATTT | CCTTGCTACT | GAACGGCGAC | 180 |
| GGCGGCGTTG | GCCGCCGGCG | CCTCTGGATC | GGCCTGCAGC | TGCCACCCGG | CTGCGGCGAC | 240 |
| CCCAAGCGCC | TCGGGCCCCT | GCGCGGCTTC | CAGTGGGTTA | CGGGAGACAA | CAACACCAGC | 300 |
| TATAGCAGGT | GGGCACGGCT | CGACCTCAAT | GGGGCTCCCC | TCTGCGGCCC | GTTGTGCGTC | 360 |
| GCTGTCTCCG | CTGCTGAGGC | CACTGTGCCC | AGCGAGCCGA | TCTGGGAGGA | GCAGCAGTGC | 420 |
| GAAGTGAAGG | CCGATGGCTT | CCTCTGCGAG | TTCCACTTCC | CAGCCACCTG | CAGGCCACTG | 480 |
| GCTGTGGAGC | CCGGCGCCGC | GGCTGCCGCC | GTCTCGATCA | CCTACGGCAC | CCCGTTCGCG | 540 |
| GCCCGCGGAG | CGGACTTCCA | GGCGCTGCCG | GTGGGCAGCT | CCGCCGCGGT | GGCTCCCCTC | 600 |
| GGCTTACAGC | TAATGTGCAC | CGCGCCGCCC | GGAGCGGTCC | AGGGGCACTG | GGCCAGGGAG | 660 |
| GCGCCGGGCG | CTTGGGACTG | CAGCGTGGAG | AACGGCGGCT | GCGAGCACGC | GTGCAATGCG | 720 |
| ATCCCTGGGG | CTCCCCGCTG | CCAGTGCCCA | GCCGGCGCCG | CCCTGCAGGC | AGACGGGCGC | 780 |
| TCCTGCACCG | CATCCGCGAC | GCAGTCCTGC | AACGACCTCT | GCGAGCACTT | CTGCGTTCCC | 840 |
| AACCCCGACC | AGCCGGGÚTC | CTACTCGTGC | ATGTGCGAGA | CCGGCTACCG | GCTGGCGGCC | 900 |
| GACCAACACC | GGTGCGAGGA | CGTGGATGAC | TGCATACTGG | AGCCCAGTCC | GTGTCCGCAG | 960 |
| CGCTGTGTCA | ACACACAGGG | TGGCTTCGAG | TGCCACTGCT | ACCCTAACTA | CGACCTGGTG | 1020 |
| GACGGCGAGT | GTGTGGAGCC | CGTGGACCCG | TGCTTCAGAG | CCAACTGCGA | GTACCAGTGC | 1080 |
| CAGCCCCTGA | ACCAAACTAG | CTACCTCTGC | GTCTGCGCCG | AGGGCTTCGC | GCCCATTCCC | 1140 |
| CACGAGCCGC | ACAGGTGCCA | GATGTTTTGC | AACCAGACTG | CCTGTCCAGC | CGACTGCGAC | 1200 |
| CCCAACACCC | AGGCTAGCTG | TGAGTGCCCT | GAAGGCTACA | TCCTGGACGA | CGGTTTCATC | 1260 |
| TGCACGGACA | TCGACGAGTG | CGAAAACGGC | GGCTTCTGCT | CCGGGGTGTG | CCACAACCTC | 1320 |
| CCCGGTACCT | TCGAGTGCAT | CTGCGGGCCC | GACTCGGCCC | TTGTCCGCCA | CATTGGCACC | 1380 |
| GACTGTGACT | CCGGCAAGGT | GGACGAGGAC | TATAGCGGCT | CTGGCGAG | 1428 |
HU 215 532 Β
1. SEQ ID No. 4 5. A szekvencia topológiája: lineáris
2. A szekvencia hossza: 1428 6. Fajta: cDNS—>mRNS
3. A szekvencia típusa: nukleinsav 7. Szekvencia
4. Szál: kettős szálú
| GCACCCGCAG | AGCCGCAGCC | GGGTGGCAGC | CAGTGCGTCG | AGCACGACTG | CTTCGCGCTC | 60 |
| TACCCGGGCC | CCGCGACCTT | CCTCAATGCC | AGTCAGATCT | GCGACGGACT | GCGGGGCCAC | 120 |
| CTAATGACAG | TGCGCTCCTC | GGTGGCTGCC | GATGTCATTT | CCTTGCTACT | GAACGGCGAC | 180 |
| GGCGGCGTTG | GCCGCCGGCG | CCTCTGGATC | GGCCTGCAGC | TGCCACCCGG | CTGCGGCGAC | 240 |
| CCCAAGCGCC | TCGGGCCCCT | GCGCGGCTTC | CAGTGGGTTA | CGGGAGACAA | CAACACCAGC | 300 |
| TATAGCAGGT | GGGCACGGCT | CGACCTCAAT | GGGGCTCCCC | TCTGCGGCCC | GTTGTGCGTC | 360 |
| GCTGTCTCCG | CTGCTGAGGC | CACTGT.GCCC | AGCGAGCCGA | TCTGGGAGGA | GCAGCAGTGC | 420 |
| GAAGTGAAGG | CCGATGGCTT | CCTCTGCGAG | TTCCACTTCC | CAGCCACCTG | CAGGCCACTG | 480 |
| GCTGTGGAGC | CCGGCGCCGC | GGCTGCCGCC | GTCTCGATCA | CCTACGGCAC | CCCGTTCGCG | 540 |
| GCCCGCGGAG | CGGACTTCCA | GGCGCTGCCG | GTGGGCAGCT | CCGCCGCGGT | GGCTCCCCTC | 600 |
| 6GCTTACAGC | TAATGTGCAC | CGCGCCGCCC | GGAGCGGTCC | AGGGGCACTG | GGCCAGGGAG | 660 |
| GCGCCGGGCG | CTTGGGACTG | CAGCGTGGAG | AACGGCGGCT | GCGAGCACGC | GTGCAATGCG | 720 |
| ATCCCTGGGG | CTCCCCGCTG | CCAGTGCCCA | GCCGGCGCCG | CCCTGCAGGC | AGACGGGCGC | 780 |
| TCCTGCACCG | CATCCGCGAC | GCAGTCCTGC | AACGACCTCT | GCGAGCACTT | CTGCGTTCCC | 840 |
| AACCCCGACC | AGCCGGGCTG | CTACTCGTGC | ATGTGCGAGA | CCGGCTACCG | GCTGGCGGCC | 900 |
| GACCAACACC | GGTGCGAGGA | CGTGGATGAC | TGCATACTGG | AGCCCAGTCC | GTGTCCGCAG | 960 |
| CGCTGTGTCA | ACACACAGGG | TGGCTTCGAG | TGCCACTGCT | ACCCTAACTA | CGACCTGGTG | 1020 |
| GACGGCGAGT | GTGTGGAGCC | CGTGGACCCG | TGCTTCAGAG | CCAACTGCGA | GTACCAGTGC | 1080 |
| CAGCCCCTGA | ACCAAACTAG | CTACCTCTGC | GTCTGCGCCG | AGGGCTTCGC | GCCCATTCCC | 1140 |
| CACGAGCCGC | ACAGGTGCCA | GATGTTTTGC | AACCAGACTG | CCTGTCCAGC | CGACTGCGAC | 1200 |
| CCCAACACCC | AGGCTAGCTG | TGAGTGCCCT | GAAGGCTACA | TCCTGGACGA | CGGTTTCATC | 1260 |
| TGCACGGACA | TCGACGAG'-G | CGAAAACGGC | GGCTTCTGCT | CCGGGGTGTG | CCACAACCTC | 1320 |
| CCCGGTACCT | TCGAGTGCAT | CTGCGGGCCC | -GACTCGGCCC | TTGTCCGCCA | CATTGGCACC | 1380 |
| GACTGTGACT | CCGGCAAGGT | CGACGACGAG | GCCAGCGGCT | CTGGCGAC | 1428 |
HU 215 532 Β
l.SEQ IDNo. 5
2. A szekvencia hossza: 21
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
AGGGCCGGGC ACTTATAAAC T
l.SEQ ID No. 6
2. A szekvencia hossza: 21
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris 10 6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
CCCAGTGGTC CAGTGACGTC A
1. SEQ IDNo. 7
2. A szekvencia hossza: 39
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS 20 7. Szekvencia
CTTCGAGTGC ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGTCCG
l.SEQ ID No. 8
2. A szekvencia hossza: 49
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
ATGTGGCGGA CAAGGGCCGA GTCGGGCCCG CAGATGCACT CGAAGGTAC
l.SEQ IDNo. 9
2. A szekvencia hossza: 65
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGTGGACGAG GACTATAGCG GCTCTGGCGA GTGAC
1. SEQ IDNo. 10
2. A szekvencia hossza: 63
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
TCGAGTCACT CGCCAGAGCC GCTATAGTCC TCGTCCACCT
TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG CCA
HU 215 532 Β
1. SEQIDNo. 11
2. A szekvencia hossza: 65
3. A szekvencia típusa: nukleinsav
4. Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
CCACATTGGC ACCC-ACTGTG
ACTCCGGCAA ggcggacgac
GAGGCCAGCG GCTCTGGCGA CTGAC
1.
2.
3.
4.
SEQIDNo. 12
A szekvencia hossza: 63 A szekvencia típusa: nukleinsav Szál: egy szálú
5. A szekvencia topológiája: lineáris
6. Fajta: egyéb nukleinsav, szintetizált DNS
7. Szekvencia
TCGAGTCAGT CGCCAGAGCC
GCTGGCCTCG TCGTCGACCT
TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG CCA
2,
3.
4.
5. 6 7.
SEQIDNo. 13
A szekvencia hossza: 1680
A szekvencia típusa: nukleinsav
Szál: kettős szálú
A szekvencia topológiája: lineáris
Fajta: cDNS—»mRNS
A szekvencia jellemzői A kijelölt jellemző jele: sig peptid
CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG
AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA
TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG
Helyek: 190, 243
A jellemző meghatározására szolgáló módszer: S A kijelölt jellemző jele: mát peptid
Helyek: 244, 1671
A jellemző meghatározására szolgáló módszer: S
8. Szekvencia
GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60
GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120
CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180
CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Alá Leu Alá Leu Alá Gly -18 -15 -10 -5
| CTG Leu | GGG Gly | TTC CCC Phe Pro | GCA CCC | GCA GAG-CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC | 279 | |||||||||||
| Alá 1 | Pro | Alá Glu Pro 5 | Gin | Pro | Gly | Gly | Ser 10 | Gin Cys | ||||||||
| GTC | GAG | CAC | GAC | TGC | TTC | GCG | CTC | TAC | CCG | GGC | CCC | GCG | ACC | TTC | CTC | 327 |
| Val | Glu | His | Asp Cys | Phe | Alá | Leu | Tyr | Pro | Gly | Pro | Alá | Thr | Phe | Leu | ||
| 15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
| AAT | GCC | AGT | CAG | ATC | TGC | GAC | GGA | CTG | CGG | GGC | CAC | CTA | ATG | ACA | GTG | 375 |
| Asn | Alá | Ser | Gin | Ile | Cys | Asp | Gly | Leu | Arg | Gly | His | Leu | Met | Thr | Val | |
| 30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
| CGC | TCC | TCG | GTG | GCT | GCC | GAT | GTC | ATT | TCC | TTG | CTA | CTG | AAC | GGC | GAC | 423 |
| Arg | Ser | Ser | Val | Alá | Alá | Asp | Val | Ile | Ser | Leu | Leu | Leu | Asn | Gly Asp | ||
| 45 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| GGC | GGC | GTT | GGC | CGC | CGG | CGC | CTC | TGG | ATC | GGC | CTG | CAG | CTG | CCA | CCC | 471 |
| Gly Gly | Val | Gly Arg | Arg | Arg | Leu | Trp | Ile | Gly | Leu | Gin | Leu | Pro | Pro | |||
| 65 | 70 | 75 |
HU 215 532 Β
| 6GC | TGC | GGC | GAC | CCC | AAG | CGC | CTC | GGG | CCC | CTG | CGC | GGC | TTC | CAG | TGG | 519 |
| Gly | Cys | Gly | Asp | Prc | Lys | Arg | Leu | Gly | Pro | Leu | Arg | Gly | Phe | Gin | Trp | |
| 80 | 85 | 90 |
| GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC | 567 | |||||||||||||||
| Val Thr Gly Asp | Asn | Asn Thr | Ser 100 | Tyr | Ser | Arg | Trp | Alá 105 | Arg Leu | Asp | ||||||
| 95 | ||||||||||||||||
| CTC | AAT | GGG | GCT | CCC | CTC | TGC | GGC | CCG | TTG | TGC | GTC | GCT | GTC | TCC | GCT | 615 |
| Leu | Asn | Gly | Alá | Prc | Leu | Cys | Gly | Pro | Leu | cys | Val | Alá | Val | Ser | Alá | |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
| GCT | GAG | GCC | ACT | GTG | CCC | AGC | GAG | CCG | ATC | TGG | GAG | GAG | CAG | CAG | TGC | 663 |
| Alá | Glu | Alá | Thr | Val | Pro | Ser | Glu | Pro | Ile | Trp | Glu | Glu | Gin | Gin | Cys | |
| 125 | 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| GAA | GTG | AAG | GCC | GAT | GGC | TTC | CTC | TGC | GAG | TTC | CAC | TTC | CCA | GCC | ACC | 711 |
| Glu | Val | Lys | Alá | Asp | Gly | Phe | Leu | Cys | Glu | Phe | His | Phe | Pro | Alá | Thr | |
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| TGC | AGG | CCA | CTG | GCT | GTG | GAG | CCC | GGC | GCC | GCG | GCT | GCC | GCC | GTC | TCG | 759 |
| Cys | Arg | Pro | Leu | Alá | Val | Glu | Pro | Gly | Alá | Alá | Alá | Alá | Alá | Val | Ser | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| ATC | ACC | TAC | GGC | ACC | CCG | TTC | GCG | GCC | CGC | GGA | GCG | GAC | TTC | CAG | GCG | 807 |
| Ile | Thr | Tyr | Gly | Thr | Pro | Phe | Alá | Alá | Arg | Gly | Alá | Asp | Phe | Gin | Alá | |
| 175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
| CTG | CCG | GTG | GGC | AGC | TCC | GCC | GCG | GTG | GCT | CCC | CTC | GGC | TTA | CAG | CTA | 855 |
| Leu | Pro | Val | Gly | Ser | Ser | Alá | Alá | Val | Alá | Pro | Leu | Gly | Leu | Gin | Leu | |
| 190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| ATG | TGC | ACC | GCG | CCG | CCC | GGA | GCG | GTC | CAG | GGG | CAC | TGG | GCC | AGG | GAG | 903 |
| Met | Cys | Thr | Alá | Pro | Pro | Gly | Ali-Val | Gin | Gly | His | Trp | Alá | Arg | Glu | ||
| 205 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| GCG | CCG | GGC | GCT | TGG | GAC | TGC | AGC | GTG | GAG | AAC | GGC | GGC | TGC | GAG | CAC | 951 |
| Alá | Pro | Gly | Alá | Trp Asp | Cys | Ser | Val | Glu | Asn | Gly Gly Cys | Glu | His | ||||
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| GCG | TGC | AAT | GCG | ATC | CCT | GGG | GCT | CCC | CGC | TGC | CAG | TGC | CCA | GCC | GGC | 999 |
| Alá | Cys | Asn | Alá | Ile | Pro | Gly | Alá | Pro | Arg | Cys | Gin | Cys | Pro | Alá | Gly | |
| 240 | 2?§ | 250 | ||||||||||||||
| GCC | GCC | CTG | CAG | GCA | GAC | GGG | CGC | TCC | TGC | ACC | GCA | TCC | GCG | ACG | CAG | 1047 |
| Alá | Alá | Leu | Gin | Alá | Asp | Gly Arg | Ser | Cys | Thr | Alá | Ser | Alá | Thr | Gin | ||
| 255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
| TCC | TGC | AAC | GAC | CTC | TGC | GAG | CAC | TTC | TGC | GTT | CCC | AAC | CCC | GAC | CAG | 1095 |
| Ser | Cys | Asn | Asp | Leu | Cys | Glu | His | Phe | Cys | Val | Pro | Asn | Pro | Asp | Gin |
270 275 280
HU 215 532 Β
| CCG | GGC | TCC | TAC | TCG | TGC | ATG | TGC | GAG | ACC | GGC TAC CGG | CTG | GCG | GCC 1143 |
| Pro | Gly | Ser | Tyr | Ser | Cys | Met | Cys | Glu | Thr | Gly Tyr Arg | Leu | Alá | Alá |
| 285 | 290 | 295 | 300 |
| GAC Asp | CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT | 1191 | ||||||||||||||
| Gin Kis | Arg | Cys Glu Asp 305 | Val | Asp Asp 310 | Cys | Ile | Leu | Glu | Pro 315 | Ser | ||||||
| CCG | TGT | CCG | CAG | CGC | TGT | GTC | AAC | ACA | CAG | GGT | GGC | TTC | GAG | TGC | CAC | 1239 |
| Pro | Cys | Pro | Gin | Arc | Cys | Val | Asn | Thr | Gin | Gly Gly | Phe | Glu | Cys | His | ||
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
| TGC | TAC | CCT | AAC | TAC | GAC | CTG | GTG | GAC | GGC | GAG | TGT | GTG | GAG | CCC | GTG | 1287 |
| Cys | Tyr | Pro | Asn | Tyr Asp | Leu | Val | Asp | Gly | Glu | Cys | Val | Glu | Pro | Val | ||
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
| GAC | CCG | TGC | TTC | AGA | GCC | AAC | TGC | GAG | TAC | CAG | TGC | CAG | CCC | CTG | AAC | 1335 |
| Asp | Pro | Cys | Phe | Arg | Alá | Asn | Cys | Glu | Tyr | Gin | Cys | Gin | Pro | Leu | Asn | |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
| CAA | ACT | AGC | TAC | CTC | TGC | GTC | TGC | GCC | GAG | GGC | TTC | GCG | CCC | ATT | CCC | 1383 |
| Gin | Thr | Ser | Tyr | Leu | Cys | Val | Cys | Alá | Glu | Gly | Phe | Alá | Pro | Ile | Pro | |
| 365 | 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| CAC | GAG | CCG | CAC | AGG | TGC | CAG | ATG | TTT | TGC | AAC | CAG | ACT | GCC | TGT | CCA | 1431 |
| His | Glu | Pro | His | Arg | Cys | Gin | Met | Phe | Cys | Asn | Gin | Thr | Alá | Cys | Pro | |
| 385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
| GCC | GAC | TGC | GAC | CCC | AAC | ACC | CAG | GCT | AGC | TGT | GAG | TGC | CCT | GAA | GGC | 1479 |
| Alá | Asp | Cys | Asp | Pro | Asn | Thr | Gin | Alá | Ser | Cys | Glu | Cys | Pro | Glu | Gly | |
| 400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
| TAC | ATC | CTG | GAC | GAC | GGT | TTC | ATC | TGC | ACG | GAC | ATC | GAC | GAG | TGC | GAA | 1527 |
| Tyr | He | Leu | Asp Asp Gly | Phe | Ile | Cys | Thr | Asp | Ile | Asp | Glu | Cys | Glu | |||
| 415 | 420 | 425 | ||||||||||||||
| AAC | GGC | GGC | TTC | TGC | TCC | GGG | GTG | TGC | CAC | AAC | CTC | CCC | GGT | ACC | TTC | 1575 |
| Asn | Gly Gly | Phe | Cys | Ser | Gly | Val | Cys | His | Asn | Leu | Pro | Gly | Thr | Phe | ||
| 430 | 435 | 440 | ||||||||||||||
| GAG | TGC | ATC | TGC | GGG | CCC | GAC | TCG | GCC | CTT | GTC | CGC | CAC | ATT | GGC | ACC | 1623 |
| Glu | Cys | Ile | Cys | Gly | Pro | Asp | Ser | Alá | Leu | Val | Arg | His | Ile | Gly | Thr | |
| 445 | 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| GAC | TGT | GAC | TCC | GGC | AAG | GTG | GAC | GAG | GAC | TAT | AGC | GGC | TCT | GGC | GAG | 1671 |
| Asp Cys Asp | Ser | Gly Lys | Val | Asp | Glu | Asp | Tyr | Ser | Gly | Ser | Gly | Glu | ||||
| 465 | 470 | 475 |
TGACTCGAG 1680
HU 215 532 Β
1. SEQ ID No. 14 A kijelölt jellemző jele: sig peptid
2. A szekvencia hossza: 1680 Helyek: 190,243
3. A szekvencia típusa: nukleinsav A jellemző meghatározására szolgáló módszer: S
4. Szál: kettős szálú A kijelölt jellemző jele: mát peptid
5. A szekvencia topológiája: lineáris 5 Helyek: 244, 1671
6. Fajta: cDNS—>mRNS A jellemző meghatározására szolgáló módszer: S
7. A szekvencia jellemzői 8. Szekvencia
CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60
AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120
TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180
CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Alá Leu Alá Leu Alá Gly
| -18 | -15 | -10 | -5 | |
| CTG GGG | TTC CCC | GCA CCC GCA GAG | CCG CAG CCG GGT GGC | AGC CAG TGC 279 |
| Leu Gly | Phe Pro | Alá Pro Alá Glu 1 | Pro Gin Pro Gly Gly 5 | Ser Gin Cys 10 |
| GTC GAG | CAC GAC | TGC TTC GCG CTC | TAC CCG GGC CCC GCG | ACC TTC CTC 327 |
| Val Glu | His Asp 15 | Cys Phe Alá Leu 20 | Tvr Pro Gly Pro Alá 25 | Thr Phe Leu |
| AAT GCC | AGT CAG | ATC TGC GAC GGA | CTG CGG GGC CAC CTA | ATG ACA GTG 375 |
| Asn Alá 30 | Ser Gin | Ile Cys Asp Gly 35 | Leu Arg Gly His Leu 40 | Met Thr Val |
| CGC TCC | TCG GTG | GCT GCC GAT GTC | ATT TCC TTG CTA CTG | AAC GGC GAC 423 |
| Arg Ser 45 | Ser Val | Alá Alá Asp Val 50 | Ile Ser Leu Leu Leu 55 | Asn Gly Asp 60 |
| GGC GGC | GTT GGC | CGC CGG CGC CTC | TGG ATC GGC CTG CAG | CTG CCA CCC 471 |
| Gly Gly | Val Gly Arq Arg Arg Leu 65 | Trp Ile Gly Leu Gin 70 | Leu Pro Pro 75 | |
| GGC TGC | GGC GAC | CCC AAG CGC CTC | GGG CCC CTG CGC GGC | TTC CAG TGG 519 |
| Gly Cys | Gly Asp 80 | Pro Lys Arg Leu | Gly Pro Leu Arg Gly 85 | Phe Gin Trp 90 |
| GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567 | ||||
| Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Alá Arg Leu Asp 95 100 105 | ||||
| CTC AAT | GGG GCT | CCC CTC TGC GGC | CCG TTG TGC GTC GCT | GTC TCC GCT 615 |
| Leu Asn 110 | Gly Alá | Pro Leu Cys Gly 115 | Pro Leu Cys Val Alá 120 | Val Ser Alá |
HU 215 532 Β
| GCT | GAG | GCC | ACT | GTG | CCC | AGC | GAG | CCG | ATC | TGG | GAG | GAG | CAG | CAG | TGC | 563 |
| Alá | Glu | Alá | Thr | Val | .Pro | Ser | Glu | Pro | He | Trp | Glu | Glu | Gin | Gin | Cys | |
| 125 | 130 | 135 | 140 |
| GAA GTG AAG | GCC GAT GGC | TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC | 711 | |||||||||||||
| Glu | Val Lys | Alá | Asp 145 | Gly | Phe | Leu | Cys | Glu 150 | Phe | His | Phe | Pro | Alá 155 | Thr | ||
| TGC | AGG | CCA | CTG | GCT | GTG | GAG | CCC | GGC | GCC | GCG | GCT | GCC | GCC | GTC | TCG | 759 |
| Cys | Arg | Pro | Leu | Alá | Val | Glu | Pro | Gly | Alá | Alá | Alá | Alá | Alá | Val | Ser | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| ATC | ACC | TAC | GGC | ACC | CCG | TTC | GCG | GCC | CGC | GGA | GCG | GAC | TTC | CAG | GCG | 807 |
| Ile | Thr | Tyr Gly | Thr | Pro | Phe | Alá | Alá | Arg | Gly | Alá | Asp | Phe | Gin | Alá | ||
| 175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
| CTG | CCG | GTG | GGC | AGC | TCC | GCC | GCG· | -GTG | GCT | CCC | CTC | GGC | TTA | CAG | CTA | 855 |
| Leu | Pro | Val | Gly | Ser | Ser | Alá | Alá | Val | Alá | Pro | Leu | Gly | Leu | Gin | Leu | |
| 190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| ATG | TGC | ACC | GCG | CCG | CCC | GGA | GCG | GTC | CAG | GGG | CAC | TGG | GCC | AGG | GAG | 903 |
| Met | Cys | Thr | Alá | Pro | Pro | Gly | Alá | Val | Gin | Gly | His | Trp | Alá | Arg | Glu | |
| 205 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| GCG | CCG | GGC | GCT | TGG | GAC | TGC | AGC | GTG | GAG | AAC | GGC | GGC | TGC | GAG | CAC | 951 |
| Alá | Pro | Gly | Alá | Trp | Asp | Cys | Ser | Vai | Glu | Asn | Gly Gly | Cys | Glu | His | ||
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| GCG | TGC | AAT | GCG | ATC | CCT | GGG | GCT | CCC | CGC | TGC | CAG | TGC | CCA | GCC | GGC | 999 |
| Alá | Cys | Asn | Alá | Ile | Pro | Gly | Alá | Pro | Arg | Cys | Gin | Cys | Pro | Alá | Gly | |
| 240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
| GCC | GCC | CTG | CAG | GCA | GAC | GGG | CGC | TCC | TGC | ACC | GCA | TCC | GCG | ACG | CAG | 1047 |
| Alá | Alá | Leu | Gin | Alá | Asp Gly Arg | Ser | Cys | Thr | Alá | Ser | Alá | Thr | Gin | |||
| 255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
| TCC | TGC | AAC | GAC | CTC | TGC | GAG | CAC | TTC | TGC | GTT | CCC | AAC | CCC | GAC | CAG | 1095 |
| Ser | Cys | Asn | Asp | Leu | cys | Glu | Hfs | Phe | Cys | Val | Pro | Asn | Pro | Asp | Gin | |
| 270 | 275 | 280 |
| CCG GGC TCC TAC Pro Gly Ser Tyr 285 | TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC | 1143 | ||||||||||||||
| Ser | Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Alá Alá | |||||||||||||||
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| GAC | CAA | CAC | CGG | TGC | GAG | GAC | GTG | GAT | GAC | TGC | ATA | CTG | GAG | CCC | AGT | 1191 |
| Asp | Gin | His | Arg | Cys | Glu | Asp | Val | Asp | Asp | cys | Ile | Leu | Glu | Pro | Ser | |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
| CCG | TGT | CCG | CAG | CGC | TGT | GTC | AAC | ACA | CAG | GGT | GGC | TTC | GAG | TGC | CAC | 1239 |
| Pro | Cys | Pro | Gin | Arg | Cys | Val | Asn | Thr | Gin | Gly Gly | Phe | Glu | Cys | His | ||
| 320 | 325 | 330 |
HU 215 532 Β
| TGC TAC CCT AAC TAC | GAC Asp | CTG Leu | GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG | CCC GTG Pro Val | 1287 | |||||||||||
| Cys | Tyr | Pro Asn 335 | Tyr | Val Asp 340 | Gly Glu | Cys | Val 345 | Glu | ||||||||
| GAC | CCG | TGC | TTC | AGA | GCC | AAC | TGC | GAG | TAC | CAG | TGC | CAG | CCC | CTG | AAC | 1335 |
| Asp | Pro | Cys | Phe | Arg | Alá | Asn | Cys | Glu | Tyr | Gin | Cys | Gin | Pro | Leu | Asn | |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
| CAA | ACT | AGC | TAC | CTC | TGC | GTC | TGC | GCC | GAG | GGC | TTC | GCG | CCC | ATT | CCC | 1383 |
| Gin | Thr | Ser | Tyr. | Leu | Cys | Val | Cys | Alá | Glu | Gly | Phe | Alá | Pro | Ile | Pro | |
| 365 | 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| CAC | GAG | CCG | CAC | AGG | TGC | CAG | ATG | TTT | TGC | AAC | CAG | ACT | GCC | TGT | CCA | 1431 |
| His | Glu | Pro | His | Arg | Cys | Gin | Met | Phe | Cys | Asn | Gin | Thr | Alá | Cys | Pro | |
| 385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
| GCC | GAC | TGC | GAC | CCC | AAC | ACC | CAG | GCT | AGC | TGT | GAG | TGC | CCT | GAA | GGC | 1479 |
| Alá | Asp | Cys | Asp | Pro | Asn | Thr | Gin | Alá | Ser | Cys | Glu | Cys | Pro | Glu | Gly | |
| 400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
| TAC | ATC | CTG | GAC | GAC | GGT | TTC | ATC | TGC | ACG | GAC | ATC | GAC | GAG | TGC | GAA | 1527 |
| Tyr | He | Leu | Asp Asp | Gly | Phe | I le | Cys Thr | Asp | Ile | Asp | Glu | Cys | Glu | |||
| 415 | 420 | 425 | ||||||||||||||
| AAC | GGC | GGC | TTC | TGC | TCC | GGG | GTG | TGC | CAC | AAC | CTC | CCC | GGT | ACC | TTC | 1575 |
| Asn | Gly | Gly | Phe | Cys | Ser | Gly | Val | Cys | His | Asn | Leu | Pro | Gly | Thr | Phe | |
| 430 | 435 | 440 | ||||||||||||||
| GAG | TGC | ATC | TGC | GGG | CCC | GAC | TCG | GCC | CTT | GTC | CGC | CAC | ATT | GGC | ACC | 1623 |
| Glu | Cys | I le | Cys | Gly | Pro | Asp | Ser | Alá | Leu | Val | Arg | His | Ile | Gly | Thr | |
| 445 | 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| GAC | TGT | GAC | TCC | GGC | AAG | GTC | GAC | GAC | GAG | GCC | AGC | GGC | TCT | GGC | GAC | 1671 |
| Asp Cys | Asp | Ser | Gly | Lys | Val | Asp Asp | Glu | Alá | Ser | Gly | Ser | Gly Asp |
465 470 475
TGACTCGAG 1680
HU 215 532 Β
Claims (13)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás trombinkötő anyag - mely a következő aminosavszekvenciával rendelkezik:AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGInCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyleuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspVaHleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVa.lGlyArgArgArgLeuTrpI leGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluVallysAlaAspGlyPheleuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGly'ÁlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlaIleProGlyA1aProArgCysG1nCysProA1aGlyA1aA1aLeuG1nA1aAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProHisGIuProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, amelyben Xj és X2 savas aminosavakat jelent, és Y, és Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav, előállítására, azzal jellemezve, hogy transzformált sejteket tenyésztünk, amely sejtek magukban foglalnak egy olyan rekombináns vektort, amely rekombináns vektor egy replikálható vektort és egy olyan DNS-fragmentumot tartalmaz, amely DNS-fragmentum a tárgyi körben megadott aminosav60 szekvenciát kódoló nukleotidszekvenciával rendelkezik,HU 215 532 Β majd a tenyésztett sejtek által termelt polipeptideket összegyűjtjük. (Elsőbbsége: 1990. 11.30.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan aminosavszekvenciát állítunk elő, amelyben X, jelentése Glu, X2 jelentése Asp, Y! jelentése Tyr és Y2 jelentése Glu. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.)
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan aminosavszekvenciát állítunk elő, amelybenX, jelentése Asp, X2 jelentése Glu, Yt jelentése Alá és Y2 jelentése Asp. (Elsőbbsége: 1990. 11.30.)
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy glikozilezett polipeptidet állítunk elő. (El5 sőbbsége: 1990. 11. 30.)
- 5. Eljárás DNS-fragmentum - mely olyan nukleotidszekvenciával rendelkezik, amely alkalmas a következő aminosavszekvencia kódolására:AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnneCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerleuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnleuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGInTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlaI1eProGlyA1aProArgCysG1nCysProA1aGlyA1aA1aLeuG1nA1aAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysValAsnThrG1nGlyGlyPheG1uCysH i sCysTyrProAsnTyrAspLeuVa1AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2,HU 215 532 Β amelyben X, és X2 savas aminosavakat jelent, és Y] és 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav - előállítá- hogy olyan DNS-fragmentumot állítunk elő, amely sára, azzal jellemezve, hogy egy humán vizeletből szár- olyan aminosavszekvencia kódolására alkalmas, ahol mazó trombinkötő anyagot kódoló DNS-fragmentum 3’ X, jelentése Asp, X2 jelentése Glu, Y, jelentése Alá és végéhez egy speciális DNS-fragmentumot kapcsolunk. 5 Y2 jelentése Asp. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.) (Elsőbbsége: 1990. 11.30.)
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-fragmentumot állítunk elő, mely olyan aminosavszekvencia kódolására alkalmas, ahol
- 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő nukleotidszekvenciával rendelkező DNS-fragmentumot állítjuk elő:X, jelentése Glu, X2 jelentése Asp, Y t jelentése Tyr és 10Y2 jelentése Glu. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.)GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900GACCAACACC GGTGCGAGGA.CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428 (Elsőbbsége: 1990. 11.30.)HU 215 532 Β
- 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő nukleotidszekvenciával rendelkező DNS-fragmentumot állítjuk elő:
GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1428 (Elsőbbsége: 1990. 11.30.)HU 215 532 Β - 10. Eljárás rekombináns vektor előállítására, mely egy replikálódó vektort és egy olyan DNS-fragmentumot foglal magában, amelynek nukleotidszekvenciája a következő aminosavszekvenciát kódolja:AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluJIisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyFheLeuCysGluPheHisFheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGInGlyHisTrpA'laArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGIuHisAlaCysAsnAlaIleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysG'luAspValAspAspCysIleLeuG'luProSerProCysProG'lnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuValAspGlyGIuCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, amelyben X[ és X2 savas aminosavakat jelent, Y, és Y2 jelentése bármely tetszőleges savas aminosav, azzal jellemezve, hogy egy, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-fragmentumot tartalmazó DNS-t egy alkalmas restrikciós endonukleázzal hasítunk, adott esetben egy megfelelő linkért adunk hozzá, és kombináljuk a vektorral, amelyet egy alkalmas restrikciós endonukleázzal hasítunk. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.)
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns vektort a következő (1)-(7) bázisszekvenciákból építjük fel, a transzkripció folya55 matának megfelelő sorrendben:(1) egy promoterként ható nukleotidszekvencia, (2) egy riboszóma kötőhelyként működő nukleotidszekvencia, (3) egy iniciáló kódonként ható nukleotidszekvencia, 60 (4) egy szignál pepiidet kódoló nukleotidszekvencia,HU 215 532 Β (5) az alábbi aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia, (6) egy zárókódonként ható nukleotidszekvencia, és (7) egy poli A addíciós szignálként ható nukleotid szekvencia,AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspleuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaVaTSérlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlaIleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspÁspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCysGlnProLeuÁsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerG1yY2,HU 215 532 Β amelyben Xt és X2 savas aminosavakat jelent, Y! és replikálható vektorból és egy olyan DNS-fragmentumY2 jelentése bármely tetszőleges savas aminosav. (El- bői áll, amely DNS-fragmentum nukleotidszekvenciája sőbbsége: 1990.11.30.) a következő aminosavszekvenciát kódolja:
- 12. Eljárás transzformált sejt előállítására, mely magában foglal egy olyan rekombináns vektort, amely egy 5AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValG'luHisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLetiArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgleuTrpIleGlyleuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProleuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysG1uVa1LysA1aAspGlyPheLeuCysG1uPheHi sPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerIleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGIuHisAlaCysAsnAlaIleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnH i sArgCysG1uAspVa1AspAspCysIleLeuG1uProSerProCysProG1nArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGInCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIleProH i sGluProH isArgCysG1nMetPheCysAsnG1nThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGIuCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGIyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2,HU 215 532 Β amelyben X[ és X2 savas aminosavakat jelent, Y, és Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet egy olyan rekombináns vektorral transzformálunk, amely rekombináns vektor egy olyan DNS-fragmentumot foglal magában, amely DNS-fragmentumot egy, a humán vizeletből származó trombinkötő anyagot kódoló DNS-fragmentum 3'-végének egy specifikus DNS-fragmentummal való kapcsolásával nyertünk. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.)
- 13. Eljárás antikoaguláns készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gyógyszerészeti szempont5 ból elfogadható hordozót és egy olyan trombinkötő anyagot, amelynek aminosavszekvenciája a következő:AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGInTrpValThrGlyAspAsnAsnTbrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspleuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlTeThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyLeuGlnleuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGIuHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspleuCysG'luHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgteuAlaAla AspGlnHisArgCysGIuAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGInGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro HisGluProHisArgCysGInMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhene CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAIaLeuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2,HU 215 532 Β amelyben X] és X2 savas aminosavakat jelent, Yt és Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav, önmagában ismert módon gyógyszerkészítménnyé feldolgozunk. (Elsőbbsége: 1990. 11. 30.) ti szempontból elfogadható hordozót és egy olyan trombinkötő anyagot, amelynek aminosavszekvenciája a következő:
- 14. Eljárás vérlemez-aggregációt gátló készítmény 5 előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gyógyszerészeAlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu TyrProGlyProAlaThrPheleuAsnAlaSerGlnlTeCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGInGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu AlaVaIGluProGIyAlaAlaAlaAlaAlaValSerileThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspG1nProG1ySerTyrSerCysMetCysG1uThrGlyTyrArgLeuA1aAla AspGlnH i sArgCysG1uAspVa1AspAspCysIleLeuGluProSerProCysProG1n ArgCysVa1AsnThrG1nGlyGlyPheG1uCysH i sCysTyrProAsnTyrAspLeuVa1 AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnleu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, amelyben X! és X2 aminosavakat jelent, Y] és Y2 jelentése bármely tetszőleges aminosav, önmagában ismert módon vérlemez-aggregációt gátló 60 készítménnyé feldolgozunk. (Elsőbbsége: 1991.02.25.)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33572090 | 1990-11-30 | ||
| JP3027191 | 1991-02-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU913737D0 HU913737D0 (en) | 1992-02-28 |
| HUT62329A HUT62329A (en) | 1993-04-28 |
| HU215532B true HU215532B (hu) | 1999-01-28 |
Family
ID=26368600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU913737A HU215532B (hu) | 1990-11-30 | 1991-11-29 | Eljárás trombinkötő anyag előállítására |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0488317B1 (hu) |
| KR (1) | KR970001684B1 (hu) |
| AT (1) | ATE123811T1 (hu) |
| AU (2) | AU8803891A (hu) |
| CA (1) | CA2056005C (hu) |
| DE (1) | DE69110419T2 (hu) |
| ES (1) | ES2075927T3 (hu) |
| FI (1) | FI104254B1 (hu) |
| HU (1) | HU215532B (hu) |
| IE (1) | IE68876B1 (hu) |
| IL (2) | IL100093A0 (hu) |
| MX (1) | MX9102273A (hu) |
| NO (1) | NO180306C (hu) |
| NZ (1) | NZ240782A (hu) |
| PT (1) | PT99632B (hu) |
| TW (1) | TW200491B (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19749197A1 (de) * | 1997-11-07 | 1999-05-12 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Bestimmung des antikoagulatorischen Potentials einer Probe |
-
1990
- 1990-11-20 IL IL100093A patent/IL100093A0/xx unknown
-
1991
- 1991-11-20 IL IL100093A patent/IL100093A/xx active IP Right Grant
- 1991-11-21 AU AU88038/91A patent/AU8803891A/en not_active Abandoned
- 1991-11-22 IE IE406691A patent/IE68876B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-11-22 KR KR1019910020865A patent/KR970001684B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-11-22 CA CA002056005A patent/CA2056005C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-26 FI FI915571A patent/FI104254B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-11-27 TW TW080109350A patent/TW200491B/zh active
- 1991-11-28 ES ES91120438T patent/ES2075927T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 AT AT91120438T patent/ATE123811T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 EP EP91120438A patent/EP0488317B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 MX MX9102273A patent/MX9102273A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 NZ NZ240782A patent/NZ240782A/xx unknown
- 1991-11-28 PT PT99632A patent/PT99632B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 DE DE69110419T patent/DE69110419T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-29 HU HU913737A patent/HU215532B/hu not_active IP Right Cessation
- 1991-11-29 NO NO914719A patent/NO180306C/no not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-02-09 AU AU32888/93A patent/AU656453B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ240782A (en) | 1993-05-26 |
| NO180306B (no) | 1996-12-16 |
| FI104254B (fi) | 1999-12-15 |
| TW200491B (hu) | 1993-02-21 |
| KR970001684B1 (ko) | 1997-02-13 |
| AU3288893A (en) | 1993-04-22 |
| AU8803891A (en) | 1992-06-04 |
| IL100093A0 (en) | 1992-08-18 |
| PT99632A (pt) | 1992-10-30 |
| KR920009847A (ko) | 1992-06-25 |
| AU656453B2 (en) | 1995-02-02 |
| NO180306C (no) | 1997-03-26 |
| FI915571A0 (fi) | 1991-11-26 |
| CA2056005C (en) | 2001-09-11 |
| FI104254B1 (fi) | 1999-12-15 |
| DE69110419T2 (de) | 1996-03-21 |
| HUT62329A (en) | 1993-04-28 |
| IE914066A1 (en) | 1992-06-03 |
| HU913737D0 (en) | 1992-02-28 |
| EP0488317A2 (en) | 1992-06-03 |
| FI915571A (fi) | 1992-05-31 |
| EP0488317B1 (en) | 1995-06-14 |
| ATE123811T1 (de) | 1995-06-15 |
| IL100093A (en) | 1997-07-13 |
| NO914719L (no) | 1992-06-01 |
| CA2056005A1 (en) | 1992-05-31 |
| MX9102273A (es) | 1992-06-01 |
| IE68876B1 (en) | 1996-07-24 |
| PT99632B (pt) | 1999-05-31 |
| EP0488317A3 (en) | 1993-03-17 |
| NO914719D0 (no) | 1991-11-29 |
| ES2075927T3 (es) | 1995-10-16 |
| DE69110419D1 (de) | 1995-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3122127B2 (ja) | 抗凝血タンパク質 | |
| Hirata et al. | ADP ribosyl cyclase activity of a novel bone marrow stromal cell surface molecule, BST-1 | |
| AU650893B2 (en) | O-glycosylated alpha-2 interferon | |
| AU595640B2 (en) | Modified c-dna sequence for factor 8c | |
| JP4637913B2 (ja) | ヒトインターフェロンベータ変異体 | |
| JPH05507420A (ja) | 組換えヒト第８因子誘導体 | |
| HU210118B (en) | Method for producing new human tnf polypeptide mutanst | |
| US20070166283A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of hemophilia a | |
| JP3805358B2 (ja) | フォン・ウィルブランド因子の治療用ドメイン | |
| KR20010100980A (ko) | Ｏｐｇ 융합 단백질 조성물 및 방법 | |
| CA1335360C (en) | Recombinant natural killer cell activator | |
| RU2567007C1 (ru) | Новый вариант альфа-1-антитрипсина, способ его получения и применения | |
| US6130203A (en) | Hybrid proteins with modified activity | |
| EP0458903A1 (en) | Soluble analogs of thrombomodulin | |
| WO1993000357A1 (en) | Therapeutic polypeptides based on von willebrand factor | |
| HU215532B (hu) | Eljárás trombinkötő anyag előállítására | |
| US5273962A (en) | Human urinary thrombomodulin with a modified glycosaminoglycan (GAG) binding site | |
| WO1992017192A1 (en) | Therapeutic fragments of von willebrand factor | |
| HU215587B (hu) | Eljárás alfa- és béta-interferonokkal szemben nagy affinitással rendelkező vízoldható polipeptidek, az azokat kódoló DNS-szekvenciák, a polipeptideket kifejezni képes sejtek és a polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására | |
| JP3534434B2 (ja) | トロンボモジュリン類発現用シグナルペプチド | |
| WO1992006999A1 (en) | Therapeutic fragments of von willebrand factor | |
| JP2553425B2 (ja) | トロンビン結合性物質及びその製造法 | |
| HU211284A9 (hu) | Új vízoldható polipeptidek, DNS-szekvenciák, új sejtek, eljárás a fenti polipeptidek előállítására, a fenti polipeptidek felhasználása, továbbá ezeket tartalmazó kompozíciók Az átmeneti oltalom az 1-9. és 14-15. igénypontokra vonatkozik. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |