FI104254B - Menetelmä trombiinia sitovan aineen tuottamiseksi ja siinä käyttökelpoiset DNA-fragmentit, rekombinanttivektorit ja näillä transformoidut solut - Google Patents

Description

1 104254

Menetelmä trombiinia sitovan aineen tuottamiseksi ja siinä käyttökelpoiset DNA-fragmentit, rekombinanttivektorit ja näillä transformoidut solut 5 Keksinnön tausta

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee DNA-fragmenttia, joka koodit-taa trombiinia sitovan aineen aminohapposekvenssiä, rekom-binanttivektoria joka sisältää mainitun DNA-fragmentin, 10 transformoitua solua, joka sisältää mainitun rekom-binanttivektorin, ja menetelmää trombiinia sitovan aineen tuottamiseksi. Uudella trombiinia sitovalla aineella on verihiutaleiden kerääntymistä estävää aktiivisuutta, ja se on käyttökelpoinen veren hyytymisen estämisessä.

15 Tekniikan tason kuvaus

On tehty paljon työtä koskien sitä roolia, joka trombiinilla on proteolyyttisenä entsyyminä veren hyytymisen säätelyssä, ja veren hyytymisen mekanismi on selvitetty suurimmalta osaltaan.

20 Julkaistun raportin mukaan trombiini aktivoi pro teiini C:n, jonka sanotaan vaikuttavan fibrinolyyttisissä ja hyytymistä estävissä järjestelmissä, ja kanin keuhko-kudosuutteissa on tietty aine, joka toimii koentsyyminä aktivaatiomekanismille. Aineelle on annettu nimi trombomo-; 25 duliini [N.L. Esmon ym., J. Biological Chemistry. 257.

(2) , 859 - 864 (1982)] .

N. Aoki ym. raportoivat, että ihmisen istukasta eristetyllä ihmisen trombomoduliinilla, jonka molekyyli-paino on noin 71 000 ei-pelkistävissä olosuhteissa, on 30 ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia kuin Esmonin ym. raportoimalla trombomoduliinilla rThromb. Res.. 37. 353 -364 (1985)].

I. Maruyama ym. vertasivat ihmisen istukasta eristetyn trombomoduliinin, jonka molekyylipaino on noin 35 75 000, aktiivisuuksia yllä mainitun kanin trombomodulii- 104254 nin aktiivisuuksien kanssa. He raportoivat, että näitten kahden trombomoduliinin aktiivisuudet olivat identtiset rj. Clin. Invest.. 75, 987 - 991 (1985)].

H. Ishii ym. raportoivat, että ihmisen plasma ja 5 ihmisen virtsa sisälsivät aineita, joilla oli samoja aktiivisuuksia kuin trombomoduliinilla ja että näiden plasmassa olevien aineiden molekyylipainot olivat 63 000 ja 54 000 fJ. Clin. Invest.. 76, 2178 - 2181 (1985)].

Esillä olevan keksinnön keksijät löysivät aikaisem-10 min kahdentyyppistä trombiinia sitovaa aktiivisuutta ihmisen virtsasta. Ne ovat erilaisia kuin yllä mainitut aineet; niillä on pienemmät molekyylipainot, se on: noin 39 000 ja 31 000 ei-pelkistävissä olosuhteissa. Keksijät jättivät aineita koskevan patenttihakemuksen (julkiseksi 15 tullut JP-patenttijulkaisu (Kokai) 146 898/1988).

Lisäksi keksijät erottivat kahdentyyppistä trombiinia sitovaa ainetta (A) ja (B) ihmisen virtsasta ja ihmisen kudoksista peräisin olevien solujen elatusaineesta, ja kehittivät menetelmän, jolla voidaan tuottaa suuria määriä 20 näitä trombiinia sitovia aineita stabiililla tavalla. Keksijät jättivät aikaisemmin trombiinia sitovia aineita ja menetelmää koskevat patenttihakemukset (EP-patenttijulkaisu 455 681).

Keksijät hankkivat ihmisen virtsasta peräisin ole-; 25 vaa trombiinia sitovaa ainetta rekombinantti-DNA-tekniik kaa käyttäen (r-UTM) ja jättivät tätä menetelmää koskevan patenttihakemuksen (JP-patenttihakemus 54 446/1991).

Kanin keuhkoista peräisin olevan trombomoduliinin tiedetään lisäävän antitrombiini III:n aktiivisuutta [K.

30 T. Preissner ym. J. Biological Chemistry. 265. 4915 - 4922 ! (1990)] . Sellaista aktiivisuutta ei kuitenkaan ole naudas- ta saatavalla trombomoduliinilla [H. V. Jakubowski ym., J. Biological Chemistry. 261. 3876 (1986)], ja ihmisen istukasta peräisin oleva trombomoduliini estää antitrombiini 3 1C4254 III:n toimintaa [K. Hirahara ym. Thrombo. Res., 57. 117 -126 (1990)].

Alalla tunnetaan myös kaksi liukoista trombomodu-liinia, jotka on tuotettu geeniteknisesti. Toisen tiede-5 tään lisäävän antitrombiini III:n aktiivisuutta ja toisen tiedetään olevan sellaista kykyä vailla [K. Nawa ym., Biochem. Biophvs. Res.. 171. 729 - 737 (1990)]. Näiden trombomoduliinien tiedetään kuitenkin estävän trombiinin koaguloitumista verihiutaleessa, millä on tärkeä rooli 10 veren hyytymisjärjestelmässä, mutta niillä ei öle ADP-koa-gulaatiovaikutusta [N. L. Esmon, J. Biological Chemistry. 258. 12238 - 12242 (1983)].

On näin ollen suotavaa edistää antitrombiini III:n aktiivisuutta ja verihiutaleiden kasaantumista estävää 15 aktiivisuutta ihmisen trombomoduliineissa ja muissa trom-biinia sitovissa aineissa.

Keksinnön yhteenveto Tämän tilanteen takia esillä olevan keksinnön keksijät ovat suorittaneet laajoja tutkimuksia ja havainneet, 20 että sellainen transformantti, joka on valmistettu transformoimalla isäntäsolu rekombinanttivektorilla, johon on yhdistetty DNA-fragmentti, joka on saatu yhdistämällä ihmisen virtsasta peräisin olevaa trombiinia sitovaa ainetta koodattavan DNA-fragmentin 3-päähän spesifinen DNA-frag-25 mentti, voi tuottaa trombiinia sitovaa ainetta, joka on peräisin ihmisen virtsasta ja joka kykenee lisäämään antitrombiini III:n aktiivisuutta ja estämään verihiutaleiden kasaantumista.

Keksintö koskee siten menetelmää trombiinia sitovan 30 aineen tuottamiseksi, jolla on seuraava aminohapposekvens-’ si A1aProA1aG1uProG1nProGlyGlySerG1nCysVa1G1uHisAs pCysPheA1aLeu TyrProGlyProAlalhrPheleuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis 35 LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerleuLeuLeuAsnGlyAsp

GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGIyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp 4 104254

PrcLysArgleuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer

TyrSerArgT rpA1aArgleuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVa1

AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys 5 GluVallysAlaAspGlyPheleuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu

AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerI1eThrTyrG1yThrProPheAla

AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu

GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu 10 AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla

IleProGlyAlaProArgCysGInCysProAlaGlyAlaAlaLeuGInAlaAspGlyArg

SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro

AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla 15

AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGIn ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProleuAsnGlnThrSerTyrleuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGInAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrIleleuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHi sAsnLeu : 25 ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuVa1ArgHisIleGlyThr

AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Y1 ja Y2 edustavat mitä tahansa aminohappoja, jolle menetelmälle on 30 tunnusomaista, että viljellään transformoitu solu, joka sisältää rekom- « binanttivektorin, joka sisältää replikoitavissa olevan vektorin ja DNA-fragmentin, jolla on nukleotidisekvenssi, joka koodittaa mainittua aminohapposekvenssiä, ja 104254 kerätään viljeltyjen solujen tuottamat polypep-tidit. Aminohapposekvenssiin viitataan tästä lähtien nimellä "sekvenssi A". Keksintö koskee myös DNA-fragmenttia, jolla on nukleotidisekvenssi, joka kykenee koodittamaan 5 sekvenssiä A, rekombinanttivektoria, joka sisältää mainitun DNA-fragmentin ja replikoitavissa olevan vektorin, ja transformoitua solua, joka sisältää mainitun rekombinant-tivektorin.

Trombiinia sitova aine osoittaa verihiutaleiden 10 kerääntymistä estävää aktiivisuutta, ja on käyttökelpoinen hyytymisen estämiseksi.

Muut tämän keksinnön tavoitteet, piirteet ja edut käyvät alempana helpommin ilmi seuraavasta kuvauksesta.

Lyhyt piirroksen kuvaus 15 Kuvio 1 on kaavio, joka havainnollistaa keksinnön mukaisen ekspressiovektorin, pCDM-GAG-UTMl ja pCDM-GAG-UTM2, rakennetta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ja edulliset suoritusmuodot 20 Tämän keksinnön mukaisesti trombiinia sitova aine voidaan valmistaa esimerkiksi seuraavasti. Ensin valmistetaan templaatti-DNA katkaisemalla ihmisen istukan genomin DNA sopivalla restriktioendonukleaasilla. Templaatti-DNA:-ta seulotaan käyttäen koettimena DNA-aluketta, joka on : 25 syntetisoitu tunnetun ihmisen trombomoduliinigeenin nukle- otidisekvenssin mukaisesti [Shirai, T. ym. J. Biochem., 103. 281 - 285 (1988)] . Täten tuotettu DNA pilkotaan sopivalla restriktioendonukleaasilla, ja näin saadut DNA-fragmentit ligatoidaan kloonausvektorin kanssa mikro-organis-3 0 min transformaatiota varten. Plasmidi-DNA uutetaan trans-·. formantista ja käsitellään restriktioendonukleaasilla, jolloin syntyy 1 404 emästä sisältävä DNA-fragmentti, joka koodittaa ihmisen virtsasta peräisin olevaa trombiinia sitovaa ainetta. Oligonukleotidi, jolla on nukleotidisek-3 5 venssi joka koodittaa aminohapposekvenssiä X^YjSerGlySer- • 104254

GlyY2, insertoidaan DNA-fragmenttiin ja täten saadaan DNA-fragmentti, joka sisältää tämän keksinnön mukaisen DNA-fragmentin. Tyypillisiä esimerkkejä tämän keksinnön mukaisista DNA-fragmenteista ovat ne, joilla on SEQ ID nro 3:n 5 ja SEQ ID nro 4:n mukainen nukleotidisekvenssi. Tämän keksinnön mukaiset DNA-fragmentit eivät kuitenkaan ole rajoittuneet niihin. Mitkä tahansa DNA-fragmentit, jotka kykenevät koodittamaan aminohapposekvenssiä, joka muodostaa trombiinia sitovan aineen tämän keksinnön mukaisesti, 10 se on: sekvenssi A, edullisesti SEQ ID nro 1 ja SEQ ID nro 2, kuuluvat tämän keksinnön suoja-alaan.

Keksinnön mukaisen DNA-fragmentin sisältävän rekom-binanttivektorin muodostaminen voidaan suorittaa kytkemällä keksinnön mukainen DNA-fragmentti replikoitavissa 15 olevaan ekspressiovektoriin.

Ekspressiovektorina voidaan käyttää mistä tahansa lähteistä, esim. prokaryooteista (tyypillisesti E^_ colis-ta), hiivoista, hyönteisviruksista, selkärankaisten viruksista ym. peräisin olevia ekspressiovektoreita, niin kauan 20 kuin ne ovat replikoitavissa.

Jotta saataisiin varmistettua trombiinia sitovan aineen tehokas tuotanto, on suotavaa että rekombinant-tiekspressiovektori muodostetaan seuraavista nukleotidi-sekvensseistä (1) - (7) tässä järjestyksessä transkription : 25 alavirtasuuntaa kohden: (1) promoottorina toimiva nukleotidisekvenssi, (2) ribosomia sitovana kohtana toimiva nukleotidisekvenssi , (3) initiaatiokodonina toimiva nukleotidisekvenssi, 30 (4) signaalipeptidiä koodittava nukleotidisekvens- si, (5) sekvenssin (A) mukaista aminohapposekvenssiä koodittava nukleotidisekvenssi, (6) lopetuskodonina toimiva nukleotidisekvenssi, ja • « 104254 (7) Poly-A:n lisäyssignaalina toimiva nukleotidi-sekvenssi .

Vektorina käytetään edullisesti plasmidi-DNA:ta, esimerkiksi plasmidia joka voi monistaa itseään, esim. Eh_ 5 coli -isäntä-mikro-organismissa, ja joka voi ekspressoida insertoidun geenin transformoimalla nisäkässoluja. Sellainen plasmidi-DNA sisältää nukleotidisekvenssejä, jotka plasmidilta vaaditaan, jotta se kykenisi monistamaan itsensä Eh. colissa. kuten nukleotidisekvenssin, joka toimii 10 replikaattorina ColEI-plasmidisarjassa, nukleotidisekvens sin, joka toimii promoottorina nisäkässoluissa, geenin, joka toimii valikointimerkkinä transformoidussa EL. colissa . ja geenin, joka toimii valikointimerkkinä transformoiduissa nisäkässoluissa. Edullisessa suoritusmuodossa se 15 sisältää lisäksi replikaattori-nukleotidisekvenssin, kuten SV40 ori:n, polyooma-ori:n tai HSV-ori:n, joka toimii nisäkässoluissa. Edullisia esimerkkejä promoottoreista ovat esimerkiksi seuraavat promoottorit: sytomegaloviruksen, SV40:n, polyoomaviruksen, naudan papilloomaviruksen, ade-20 noviruksen jne.; retroviruksen LTR, esim. MMTV; metallo-tioneiinigeenin promoottori, ja vastaavat. Esimerkkejä E. coli -valikointimerkeistä ovat ampisilliiniresistenssi-geenit, kanamysiiniresistenssigeenit, tetrasykliiniresis-tenssigeenit, kloramfenikoliresistenssigeenit ja vastaa-; 25 vat. Esimerkkejä nisäkässolun valikointimerkeistä ovat neomysiiniresistenssigeenit, hygromysiini B -resistenssi-geenit, tymidiinikinaasigeenit, dihydrofolaattireduktaasi-geenit, ksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasigeenit ja vastaavat. Näitä geenejä voidaan käyttää joko yksinään 30 tai kahden tai useamman geenin yhdistelmänä.

Keksinnön mukaisen DNA-fragmentin inkorporaatio edellä mainittuihin vektoreihin voidaan suorittaa katkaisemalla DNA-fragmentin sisältävä DNA sopivalla restrik-tioendonukleaasilla, haluttaessa lisäämällä sopiva linkke-35 ri, ja yhdistämällä se vektorin kanssa, joka on katkaistu 104254 sopivalla restriktioendonukleaasilla. Tässä käytettäviksi sopivia restriktioendonukleaaseja ovat esimerkiksi Eco Rl,

Sph I, Pst I, Hind III, Bam HI, Xho I, Xba I, Ban III, Sma I, Neo I ja vastaavat. Voidaan käyttää myös nukleotideja 5 muokkaavia entsyymejä, kuten eksonukleaasi III, Bal31, SI nukleaasi, eksonukleaasi VII, mung bean -nukleaasi, DNA-polymeraasi ja vastaavia. Linkkerinä voidaan käyttää Eco Rl -linkkeriä, Sma I -linkkeriä, Neo I -linkkeriä, Bam HI -linkkeriä, Xho I -linkkeriä, Hind III -linkkeriä, Pst I 10 -linkkeriä, Sph I -linkkeriä, Xba I -linkkeriä tai vastaavia .

Transformoituja soluja, jotka voivat tuottaa tehokkaasti rekombinanttivektoria ja/tai trombiinia sitovaa ainetta, voidaan saada introdusoimalla edellä mainitulla 15 menetelmällä saatu rekombinanttiekspressiovektori isän- täsoluihin kompetenttia solua käyttävällä menetelmällä, protoplastimenetelmällä, kalsiumfosfaattia käyttävällä sekasaostusmenetelmällä, elektroporaatiomenetelmällä, DEAE-dekstraanimenetelmällä, lipofektiinimenetelmällä tai 20 vastaavalla. Transformanttia hankittaessa isäntäsoluina käytetään edullisesti yksisoluisia organismeja, kuten bakteereja ja hiivoja, viljeltyjä hyönteissoluja, viljeltyjä selkärankaissoluja ja vastaavia. E. coli -isäntäsoluina käytetään edullisesti E. coli K12-kannan eri mutantteja, : 25 esim. HB 101, C600K, JM101, JM103, JM105, JM109, MV1034, MB1184, MC1061/P3 ja vastaavia. Edullisia annettuja esimerkkejä nisäkässoluista ovat COS-solut, CHO-solut, L-so-lut, C127-solut, NIH3T3-solut, HeLa-solut ja vastaavat.

Trombiinia sitova aine voidaan saada viljelemällä 30 näin saatua transformanttia, uuttamalla ja eristämällä se viljellyistä soluista tai viljelmän elatusaineesta. Erilaisia luonnollisia tai keinotekoisia elatusaineita voidaan käyttää transformoitujen solujen viljelyssä. Elatus-aineet sisältävät edullisesti hiililähteitä, kuten soke-35 reita, alkoholeja, ja orgaanisten happojen suoloja; typpi- • 1C4254 lähteitä kuten proteiiniseoksia, aminohappoja ja ammonium-suoloja; ja epäorgaanisia suoloja. Lisäksi mukana voi edullisesti olla vitamiineja ja antibiootteja, jotka vastaavat valikointimerkkigeenejä. Jos vektori on sellaista 5 tyyppiä jonka ekspressiota voidaan säädellä, on välttämätöntä lisätä menetelmä, jolla indusoidaan ekspressio viljelyn aikana. Viljelyn jälkeen viljelmäliemi sentrifugoi-daan viljelynesteen erottamiseksi soluista. Jos trombiinia sitova aine kerääntyy viljeltyihin soluihin, solut tuhota-10 an jäädytys-sulatus -menetelmällä, ultraäänikäsittelyllä, "French press" -laitteella, entsyymikäsittelyllä, homogenisoimalla tai vastaavasti, ja trombiinia sitova aine liuotetaan käyttämällä EDTA:ta, pinta-aktiivisia aineita, karbamidia, guanidiinihydrokloridia tai vastaavia.

15 Puhdistettu trombiinia sitova aine voidaan saada käsittelemällä viljelyneste tai solu-uute, joka sisältää näin valmistetun trombiinia sitovan aineen, pylväskromato-grafisesti. Ioninvaihtokromatografiaa, affiniteettikroma-tografiaa, esim. sitä joka käyttää monoklonaalista vasta-20 ainetta, joka on kuvattu julkiseksi tulleessa, JP-patent-tijulkaisussa (Kokai) 45 398/1989, geelisuodatuskromato-grafiaa, tai vastaavaa voidaan käyttää joko itsenäisesti tai yhdistelmänä. Näin saaduista trombiinia sitovista aineista niillä, joilla on aminohapposekvenssi SEQ ID nro 1 : 25 tai SEQ ID nro 2, on seuraavat ominaisuudet.

(1) Aminohapposekvenssi:

Perustuen DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssiin, aminohapposekvenssin katsotaan olevan se joka on esitetty SEQ IDrssä nrot 1 ja 2.

30 (2) Molekyylipaino: . ·. 55 000 - 100 000 määritettynä SDS-polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla ei-pelkistävissä olosuhteissa.

(3) Isoelektrinen piste: pH 3 - 4 määritettynä isoelektrisellä elektroforee-35 simenetelmällä amfolyyttiä käyttäen.

• 104254 (4) Sokerianalyysi:

Molekyylipainon perusteella ajatellaan, että trom-biinia sitoviin aineisiin on sitoutunut kaksi sokeria tai enemmän. Aminohapposekvenssin perusteella toisen sokereis-5 ta ajatellaan olevan hapan polysakkaridi, joka on kiinnittynyt aminohappoon Ser(474).

(5) Toiminnot:

Omaa antitrombiini-aktiivisuutta.

Lisää antitrombiini III:n aktiivisuutta.

10 Pystyy estämään verihiutaleiden kerääntymistä.

Injektiovalmisteet ovat tyypillisiä esimerkkejä koostumuksesta, joka sisältää tämän keksinnön mukaisesti saatua trombiinia sitovaa ainetta hyytymistä estävänä aineena. Sellaisten injektiovalmisteiden edullinen muoto on 15 kylmäkuivattu jauhe, joka voidaan liuottaa tislattuun veteen tai fysiologiseen suolaliuokseen joka kerta kun se annetaan. Laskimonsisäinen injektio on edullinen valmisteen antotapa.

Vaikkakin annos riippuu potilaan oireista, ruumiin-20 painosta ja vastaavista, edullinen annos on 10 Mg/kg -10 mg/kg. Keksinnön mukaisesti saatu trombiinia sitova aine ei aiheuta epänormaaliutta edellä mainitulla annos-alueella. Se on täysin turvallinen aine.

Muut tämän keksinnön piirteet käyvät ilmi kuvat- : 25 taessa seuraavia suoritusmuotoesimerkkejä, jotka annetaan keksinnön havainnollistamiseksi ja jotka eivät ole tarkoitettuja sitä rajoittaviksi.

Esimerkkejä

Esimerkki 1 30 Trombiinia sitovan aineen geenin kloonaus :. Aluke #1, jolla on SEQ ID nro 5:n mukainen sekvens- si, ja aluke #2, jolla on SEQ ID nro 6:n mukainen sekvenssi, syntetisoitiin käyttäen DNA-syntetisaattoria (ABI Model 381A) , viitaten ihmisen trombomoduliinigeenin nukle-35 otidisekvenssiin [Shirai, T. ym. J. Biochem.. 103. 281 - • 104254 285 (1988)]. Templaatti-DNA valmistettiin digestoimalla ihmisen istukan genomista DNA:ta (Clonetech-yhtiön tuote) Bam HI -entsyymillä. Geenin monistus suoritettiin seuraav-an formulaation mukaisessa reaktioliuoksessa käyttäen Qui-5 ck Thermo System -laitetta (Model QTS-10M; tavaramerkki, valmistaja Japan Genetic -yhtiö), toistamalla 30 inkubaa-tiosykliä; yksi sykli sisälsi inkubaation 94 °C:ssa 2 minuutin ajan, 50 °C:ssa 3 minuutin ajan ja 72 °C:ssa 4 minuutin ajan. Reaktion jälkeen osa reaktiotuotetta kerättiin, 10 jotta saatiin vahvistettua kohde-DNA-juovan monistuminen agaroosigeelielektrofeesilla.

Reaktioliuos Tislattu vesi71 μΐ Puskuriliuos *10 μΐ 15 dNTP-seosliuos (2,5 mM) 8 μΐ

Aluke #1 (20 μΜ) 5 μΐ Aluke #2 (20 μΜ) 5 μΐ Templaatti-DNA (1 μg/μl) 1 μΐ AmpliTaq (5 yksikköä/μΐ) 0,5 μΐ 20 * Puskuriliuos: 0,1 M kaliumkloridi 0,1 M Tris-HCl -puskuri (pH 8,3) 0,1 % gelatiini 15 mM magnesiumkloridi DNA kerättiin reaktioliuoksesta etanolisaostuksel-: 25 la, digestoitiin Xho I:lla ja Kpn I:lla ja alistettiin agaroosigeelielektroforeesiin, jotta saatiin 1,57 kilo-emäksen Xho Ι-Κρη I -fragmentit. Erikseen digestoitiin kloonausta varten vektori pUC118 [Vieira, J. ja Messing, J-, Methods Enzvmol.. 153. 3 - 11 (1987)] Hind II:lla, 30 liitettiin Xho I -linkkeriin, ja digestoitiin edelleen Xho *· I:lla ja Kpn I:lla, jolloin saatiin vektorifragmentit aga roosigeelielektrof oreesin avulla. Vektorifragmentit ja 1,57 kiloemäksen Xho Ι-Κρη I -fragmentit ligatoitiin ja E. coli MV1034 [Vieira, J. ja Messing, J., Methods Enzvmol., 35 153, 3-11 (1987)] transformoitiin ligatoidulla DNA:11a.

« 12 104254

Plasmidi-DNA uutettiin näin saadusta transforman-tista ja digestoitiin restriktioendonukleaasilla. Tällä tavalla valittiin 6 kloonia, jotka sisälsivät plasmidin, johon oli insertoitu ihmisen trombomoduliinigeenista saatu 5 1,57 kiloemäksen Xho I-Kpn I -fragmentti.

Näin saaduissa klooneissa olevien insertoitujen fragmenttien nukleotidisekvenssien määritys paljasti 1-3 mutatoitua kohtaa kussakin fragmentissa. Sitten yhdistettiin yllä mainitun vektorifragmentin kanssa 0,31 kiloemäk-10 sen Xho I-Sma I -fragmentti kloonista 2, 0,65' kiloemäksen Sma I-Miu I -fragmentti kloonista 1 ja 0,62 kiloemäksen Miu I-Kpn I -fragmentti kloonista 4, joilla yhdelläkään ei ollut mutatoituneita kohtia, jolloin saatiin plasmidi pUCTM/XHO-KPN, joka sisälsi ihmisen trombomoduliinigeenin 15 insertoidun fragmentin, jolla oli oikea sekvenssi.

Esimerkki 2

Vektorin muodostus trombiinia sitovan aineen eks- pressoimiseksi

Jotta saataisiin yhdistettyä ihmisen virtsasta 20 peräisin olevan trombiinia sitovan aineen aminohapposekvenssin C-pään Asp:iin glykosaminoglykaanin additiokohta, linkkerit $1 - $6, joilla oli vastaavasti nukleotidisek-venssit SEQ ID nrot 7 - 12, syntetisoitiin ja kukin 5'-pää fosforyloitiin.

: 25 pUCTM/XHO-KPN digestoitiin Xho I:lla ja Kpn I:lla, jotta saataisiin valmistettua ihmisen trombomoduliini-geenistä peräisin oleva 1,57 kiloemäksen Xho I-Kpn I -fragmentti. Tämä 1,57 kiloemäksen fragmentti ligatoitiin nisäkässoluekspressiovektoriin CDM8 (Invitrogen-yhtiön 30 tuote), joka oli digestoitu Xho I:lla ja defosforyloitu \ yhdessä linkkereiden $1, $2, $3 ja $4 kanssa 1,57 kilo- « emäksen fragmentti ligatoitiin myös Xho I -digestoidun ja defosforyloidun CDM8:n kanssa linkkereillä $1, $2, $5 ja $6. EL. coli MC1061/P3 [Seed, B. ja Aruffo, A., Proc. Natl. 35 Acad. Sei., USA, 84, 3365 - 3369 (1987)] transformoitiin 104254 ligatoiduilla DNA-molekyyleillä. Plasmidi-DNA:t uutettiin näin valmistetuista transformanteista ja digestoitiin restriktioendonukleaaseilla, jotta saataisiin vahvistettua insertiosuunta ja koko. Keksinnön mukaisen DNA-fragmentin 5 sisältävät 1,68 kiloemäksen fragmentit leikattiin Xho I:lla irti 8 kloonista, joissa osoittautui olevan oikea insertiosuunta ja oikea restriktioendonukleaasikartta. Kaikkien kloonien nukleotidisekvensseissä havaittiin SEQ ID 13:n tai 14:n sekvenssi, mikä vahvisti että eks-10 pressiovektorit oli muodostettu oikein.

Näin saaduille keksinnön mukaisille ekspressiovek-toreille annettiin nimiksi pCDM-GAG-UTMl ja pCDM-GAG-UTM2 (Kuvio 1) ja vektorit sisältävälle transformantille annettiin nimeksi E. coli MC1061/P3 (pCDM-GAG-UTMl) ja E. coli 15 MC1061/P3 (pCDM-GAG-UTM2).

Esimerkki 3

Trombiinia sitovan aineen ekspressio viljellyissä nisäkässoluissa COS7-solut transfektoitiin pCDM-GAG-UTMl:llä tai 20 pCDM-GAG-UTM2:11a DEAE-dekstraanimenetelmällä [Seed, B. ja Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84, 3365 - 3369 (1987)] . 5 x 10s solua siirrostettiin 60 mm viljelymaljalle ja seuraavana päivänä viljelmäelatusaine imettiin pois ja korvattiin 2 ml :11a Dulbeccon muokattua minimielatus-: 25 ainetta (DMEM), joka sisälsi 10 % Nu-seerumia. 10 μg (1 Mg/μΙ) pCDM-GAG-UTMl:ta tai pCDM-GAG-UTM2:ta lisättiin 100 μ1:33η10 mg/ml DEAE-dekstraaniliuosta (keskimääräinen molekyylipaino 5 x 10s, Pharmacian tuote) PBS:ssä, ja tuloksena oleva liuos sekä 10 μΐ 20 mM klorokiinia lisättiin 30 soluviljelyliemeen. 4 tunnin viljelyn jälkeen 37 °C:n läm-• Potilassa, viljelyelatusaine imettiin pois ja 2 ml 10 % DMS0:ta (PBS:een liuotettuna) lisättiin. Seoksen annettiin seistä hiljaa huoneenlämpötilassa 2 minuutin ajan. Sen jälkeen kun DMSO-liuos oli imetty pois, lisättiin 3 ml 35 DMEM:ia, joka sisälsi 10 % FCS:ia, ja seosta viljeltiin t 104254 37 °C:n lämpötilassa 24 tuntia. Viljelyelatusaine korvattiin DMEM:11a joka ei sisältänyt FCS:ia, jonka jälkeen viljelyä jatkettiin vielä toiset 48 tuntia. Viljelyn jälkeen supernatantti kerättiin.

5 Yllä mainitulla menetelmällä saatu viljelyelatus aine pantiin kulkemaan 1 ml Sepharose 4B-pylvään läpi (2 mg IgG/ml hartsia) , johon oli kytketty monoklonaalinen vasta-aine A - 73 (julkiseksi tullut JP-patenttijulkaisu (Kokai) 45 398/1989; 2 mg IgG/ml hartsia). Pylväs pestiin 10 (1) 2 ml :11a 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), joka oli 0,1 M NaCl:n suhteen, (2) 20 ml :11a 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), joka oli 1 M NaClm ja 0,05 % Tween 20:n suhteen, ja (3) 5 ml 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), joka oli 1 M NaCl:n suhteen, jota seurasi eluutio 5 ml :11a 15 0,02 M Tris-HCl- puskuria (pH 7,4), joka oli 2 M natrium- tiosyanaatin, 5 mM EDTA:n ja 1 M NaCl:n suhteen. Eluaatti dialysoitiin 50 mM asetaattipuskuria vastaan, joka oli 0,1 M NaClm suhteen (pH 4,5) ja puhdistettiin pylväässä Mono-Q-sepharosella. Pylväs pestiin samalla puskurilla ja 20 eluoitiin lineaarisella gradientilla 0,1 - 2 M NaCl 50 mM asetaattipuskurissa (pH 4,5), jolloin saatiin puhdistetut trombiinia sitovat aineet (r-GAG-UTMl ja r-GAG-UTM2).

Esimerkki 4

Viljeltyjen nisäkässolujen trombiinia sitovan ain-: 25 een ekspressio CHO *K1-solut transfektoitiin pCDM-GAG-UTMl:11a kal-siumfosfaattimenetelmällä [Gorman, C., "DNA Cloning" IRL Press, Englanti, voi. 2, 143 - 190 (1985)] . 5 x 10s CHO-K1 -solua siirrostettiin 10 cm petrimaljalle ja seuraavana 30 päivänä viljelyelatusaine (Ham F12 -elatusaine, joka si-sälsi 10 % FCS:ia, ja johon tästä lähtien viitataan nimellä Elatusaine) vaihdettiin. Neljä (4) tuntia sen jälkeen lisättiin DNA:n ja kalsiumfosfaatin yhdessä saostunut sakka. Tässä käytetty yhdessä saostunut sakka valmistettiin 35 seuraavalla tavalla. 20 μg pCDM-GAG-UTMl:ia ja 100 ng neo- • is 104254 mysiiniresistenssigeeniä liuotettiin 450 μΐ-.aan 1 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8,0) - 0,1 mM EDTA ja sekoitettiin 50 /xl:aan 2,5 M kalsiumkloridia. Seos lisättiin tipoittain 500 μ1:33η liuosta: 50 mM HEPES (pH 7,12) - 280 mM NaCl-5 1,5 mM natriumvetyfosfaatti, ja sen jälkeen kun sen oli annettu seistä hiljaa, liuos lisättiin soluviljelyelatus-aineeseen 24 tunnin viljelyn ajaksi. Elatusaine vaihdettiin tuoreeseen ja viljeltiin toiset 24 tuntia, jonka jälkeen elatusaine korvattiin selektiivisellä elatusaineella, 10 joka sisälsi 400 μ9/πι1 G418:aa. 2 viikon jälkeen tuotetut pesäkkeet siirrettiin 24-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin jatkuvasti niin kauan, että viljelmä oli konfluentti. Supernatantti kerättiin viljelmän elatusaineesta. Eritetty trombiinia sitova aine (r-GAG-UTMl) analysoitiin kvantita-15 tiivisesti hyvin tuottavien kloonien valikoimiseksi. Kloonausta jatkettiin edelleen valitulle kloonille laimennos-sarjamenetelmää käyttäen. Näin saaduille transformoiduille soluille annettiin nimi CHO-GUTM 1 - 8 ja ne talletettiin Fermentation Research Institute -laitokseen. Agency of 20 Industrial Science and Technology (FERM P-3260). Transformoitua solua CHO-GUTM 1-8 viljeltiin UC202-elatusainees-sa (Nissui Pharmaceutial -yhtiön tuote), jossa oli 1 % FCS, 225 cm2 pullossa, niin että se tuli täyteen, jonka jälkeen elatusaine korvattiin 50 ml:11a UC202-elatusainet- : 25 ta joka ei sisältänyt FCS:ia. 1 viikon jälkeen viljelmän supernatantti kerättiin ja lisättiin sama määrä tuoretta elatusainetta, joka ei sisältänyt FCS:ia. Kun oli vielä viljelty 1 viikko, viljelmän supernatantti kerättiin ja sen vahvistettiin sisältävän siihen eritettynä 3 -4 μ^/ναΐ 30 trombiinia sitovaa ainetta.

·. Puhdistettu trombiinia sitova aine saatiin saman menetelmän mukaan kuin esimerkin 3 jälkiosassa.

« · 16 104254

Esimerkki 5

Trombiinia sitovan aineen piirteitä

Suoritettiin SDS-PAGE Laemmlin menetelmän mukaisesti (Nature, 227. 680-685) puhdistetuille trombiinia sito-5 ville aineille. Proteiini siirrettiin PVDF-membraanille Matsudairan menetelmän mukaisesti f J. Biol. Chem.. 262 (21) , 10035 - 10038] . PVDF-membraani saatettiin sitten reagoimaan 0,05 M Tris-HCl-puskurissa (TBS), joka oli 0,1 % naudan seerumin albumiinin ja 0,1 M NaCl:n suhteen, 10 huoneenlämmössä 2 tunnin ajan. Sen jälkeen kun liuos oli poistettu, jäännös pestiin perusteellisesti TBS-0,05 % Tween 20 -liuoksella ja saatettiin reagoimaan piparjuuri-peroksidaasiin konjugoidun monoklonaalisen vasta-aineen A-60 kanssa TBS-0,05 % Tween 20 -liuoksessa huoneenlämmössä 15 1 tunnin ajan. Liuos poistettiin ja jäännös pestiin perus teellisesti 0,05 % Tween 20-TBS -liuoksella ja pantiin värjäytymään 50 ml:aan etikkahappopuskuria (pH 5,0), joka sisälsi 5 mg 3-amino-9-etyylikarbatsolia ja 25 μΐ 30 % vetyperoksidia, jolloin saatiin vahvistettua leveä juova, 20 joka on luonteenomainen glykosaminoglykaani-additiotuot-teille.

Esimerkki 6 r-UTM:ia ja r-GAG-UTMl:tä ja 2:ta, jotka ovat keksinnön mukaisesti saatuja trombiinia sitovia aineita, kä-: 25 siteltiin kutakin 0,1 μg/ml pitoisuuksina 5 μΐιΐΐθ kon- droitinaasia (10 mU, Seikagaku Kogyo K.K.:n tuote) 37 °C:n lämpötilassa 40 minuutin ajan. Immunoblottaus suoritettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 5, jotta saatiin vahvistettua kondroiittisulfaattityyppisten kovalenttisten gly-30 kosaminoglykaanisidosten läsnäolo trombiinia sitovissa ai-·. neissa.

Esimerkki 7

Anti-koagulantti-aktiivisuus

Keksinnön mukaisesti saadut trombiinia sitova ai-35 neet rUTM ja r-GAG-UTMl ja 2, 2,5 μg/ml kukin, sekoitet- « 104254 tiin ihmisen fibrinogeenin (2,5 mg/ml) ja ihmisen antit-rombiini III :n kanssa (0 tai 250 /zg/ml) , ja liuotettiin 5 mM CaCl2-liuokseen. Naudan trombiinia (0,5 U/ml) lisättiin liuoksiin hyytymisajan mittaamiseksi. Tulokset esite-5 tään taulukossa 1.

Taulukko 1

Kontrolli (sek.) r-UTM (sek.) r-GAG-UTMl (sek.) r-GAG-UTM2 (sek.) 10 ATIII (-) 43,3 61,8 77,2 80,1 ATIII (+) 49,5 80,8 >400 >400

Taulukko 1 osoittaa, että trombiinia sitovat aineet 15 hidastavat veren hyytymistä yhdistymällä trombiiniin. An- titrombiini III:n läsnäolon aiheuttama trombiinia sitovien aineiden anti-koagulantti-aktiivisuuden huomattava nousu näkyy myös.

Esimerkki 8 20 Anti-koagulantti-aktxi. visuus rUTM (9-90 nM), tai keksinnön mukaisesti saadun trombiinia sitovan aineen r-GAG-UTMl tai r-GAG-UTM2 (9 -90 nM) , jotka oli liuotettu liuokseen, joka sisälsi naudan fibrinogeeniä (1 mg/ml) 20 mM Tris-HCl-puskurissa 25 (pH 7,4), joka oli 0,15 M NaCl:n suhteen, sekoitettiin . naudan trombiinin kanssa (18 nM), jotta saataisiin mitat- tua koaguloitumiseen vaadittava aika. Kalibrointikäyrän perusteella, joka oli tehty käyttämällä eri konsentraati-oissa naudan trombiinia, määritettiin 50-%:isen eston ai-30 heuttavat konsentraatiot (IC50). Tulokset näytetään taulukossa 2.

18 104254

Taulukko 2 IC50 (nM) 5 r-UTM 80 r-GAG-UTMl 16 r-GAG-UTM2 15 10 Esimerkki 9

Anti-koagulantti-aktiivisuus

Keksinnön mukaisesti saatuja (17 nM) aineita tai r-UTM:ia (17 nM), jotka oli liuotettu liuokseen, joka sisälsi naudan fibrinogeeniä (1 mg/ml) 20 mM Tris-HCl-puskuris- 15 sa (pH 7,4), joka oli 0,15 mM NaCl:n suhteen, sekoitettiin naudan trombiinin kanssa (18 nM), jotta saataisiin mitattua hyytymiseen vaadittava aika. Tulokset esitetään taulukossa 3 .

Taulukko 3 20 _

Koagulaatioaika (s)

Kontrolli 28,1 r-UTM 29,6 : 25 r-GAG-UTMl 300,0 r-GAG-UTM2 295,3

Esimerkki 10 30 Verihiutaleiden kasaantumista estävä aktiivisuus * 8 μΐ:aan keksinnön mukaisesti saadun aineen liuosta (10‘6 - 10~8) ja verihiutalepitoiseen plasmaan (PRP) (200 μΐ) , joka oli valmistettu kanin korvalaskimosta otetusta verestä, lisättiin 2 μΜ adenosiinidifosfaattia (ADP) veri- 35 hiutaleiden kasaantumisen mittaamista varten. 50 % estymi- 104254 sen aiheuttava konsentraatio, se on: keksinnön mukaisesti saatujen yhdisteiden se konsentraatio, joka estää ADP:n aiheuttaman kasaantumisen, ja joka määritettiin sen kalib-rointikäyrän perusteella, joka valmistettiin käyttäen 5 ADP:tä eri konsentraatioissa, oli 2 x 10'7 M r-GAG-UTMl:lie ja 2,1 x 10"7 M r-GAG-UTM2:lie. r-UTM ei osoittanut kasaantumista estävää aktiivisuutta testatulla konsentraatioalu-eella (10'6 - 10'8 M) .

Esimerkki 11 10 Muutokset veren konsentraatiossa

Katetri työnnettiin nukutetun Wistar-rotan (koiras-puolinen) oikeaan reisilaskimoon ja katetrin läpi annettiin nopeasti 1 mg/ml/kg testattuja yhdisteitä, r-GAG-UTMl ja r-UTM2. Verinäytteet, 0,1 ml kukin, jotka oli otettu 15 ennen antoa ja 1, 3, 6, 10, 20, 30, 60 ja 120 minuuttia annon jälkeen, sekoitettiin hepariinin kanssa ja ne palvelivat plasmanäytteinä, joista määritettiin konsentraatio veressä. Veressä olevan konsentraation mittaus tehtiin kaksikerros-ELISA-menetelmän avulla käyttäen ihmisen 20 trombiinia sitovan proteiinin vastaista monoklonaalista vasta-ainetta. Molempien testattujen yhdisteiden havaittiin olevan analysoitavissa yksitilamenetelmällä. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

: 25 Taulukko 4 r-GAG-UTMl r-UTM (n=5) T1/2 (min) 75,2 ± 10,8 45,4 ± 2,6 30 AUC (min -/zg/ml 1380 ± 64 872 ± 64

Kuten yllä havainnollisesti esitetään, keksinnön mukaisesti saadut trombiinia sitovat aineet edistävät an-35 titrombiini III:n aktiivisuutta ja estävät verihiutaleiden kasaantumista, ja omaavat itsessään antitrombiini-aktiivi- 104254 suutta. Täten ne ovat hyödyllisiä anti-koagulantti-aineiden vaikuttavana komponenttina. Lisäksi keksinnön mukaisesti saatua trombiinia sitovaa ainetta voidaan tuottaa halvalla suuressa mittakaavassa.

5 On ilmeistä, että yllä olevien oppien valossa monet tämän keksinnön muokkaukset ja variaatiot ovat mahdollisia. On näin ollen ymmärrettävä, että mukana olevien patenttivaatimusten suoja-alan sisällä keksintöä voidaan soveltaa muutenkin kuin tässä erityisesti kuvataan.

10 Sekvenssilistaukset 1. SEQ ID nro 1 2. Sekvenssin pituus: 476 3. Sekvenssin tyyppi: aminohappo 4. Sekvenssin topologia: lineaarinen 15 5. Laatu: proteiini 6. Sekvenssi

Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro G1y Gly Ser Gin Cys Vai Glu His Asp 5 10 15

Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gin 20 20 25 30

Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser Ser Vai 35 40 45

Ala Ala Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Vai Gly 50 55 60

Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp ·· 25 55 70 75 80

Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr Gly Asp 85 90 95

Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110

Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cvs Vai Ala Vai Ser Ala Ala Glu Ala Thr 30 115 " 120 125

Vai Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai Lys Ala 130 135 140

Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160

Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Vai Ser Ile Thr Tyr Gly 35 165 170 175

Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Vai Gly 180 185 190 2i 104254

Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205

Pro Pro Gly Ala Val Gin Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 c Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 lie Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gin 245 250 255

Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin Ser Cys Asn Asp 260 265 270 10

Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr 275 280 285

Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin His Arg 290 295 300 ic Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys lie Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gin 305 310 315 320

Arg Cys Val Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335

Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 20

Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr 355 360 365

Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro He Pro His Glu Pro His 370 375 380 25 Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp I 385 390 395 400

Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr lie Leu Asp 405 410 415

Asp Gly Phe He Cys Thr Asp lie Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 30

Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys He Cys 435 440 445

Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His He Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 1

Gly Lys Val Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu 465 470 475 22 1 0 4 2 5 4 1. SEQ ID nro 2 2. Sekvenssin pituus: 476 3. Sekvenssin tyyppi: aminohappo 4. Sekvenssin topologia: lineaarinen 5 5. Laatu: proteiini 6. Sekvenssi

Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu His Asd 10 5 10 15

Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gin 20 25 30

Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Vai Arg Ser Ser Vai 35 40 45 15

Ala Ala Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Vai Glv 50 55 60

Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asd 65 70 75 80

Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gin Trp Vai Thr Gly Asp 20 85 90 95

Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110

Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 25

Vai Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gin Gin Cys Glu Vai Lys Ala 130 135 140

Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 1^5 150 155 160 or. Ala Val 01u Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Vai Ser Ile Thr Tyr Gly 30 165 170 175 *·] Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gin Ala Leu Pro Vai Gly 180 185 190

Ser Ser Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 35 104254

Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220

Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 5 lie Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gin 245 250 255

Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin Ser Cys Asn Asp 260 265 270

Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr 10 275 280 285

Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin His Arg 290 295 300

Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys lie Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gin 305 310 315 320 15

Arg Cys Val Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335

Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350

Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr 20 355 360 365

Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro lie Pro His Glu Pro His 370 375 380

Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 25 I Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr He Leu Asp 405 410 415

Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp He Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430

Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys lie Cys 30 435 440 445 : Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His He Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460

Gly Lys Val Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp 465 470 475 35 24 1C4254 1. SEQ ID nro 3 2. Sekvenssin pituus: 1428 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: kaksijuosteinen 5 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen 6. Laatu: cDNA mRNA:ksi 7. Sekvenssi 10 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 15 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 20 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540

GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 6PU

GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 25 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 30 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 35 25 104254 CACGAGCC6C ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 5 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428 1. SEQ ID nro 4 10 2. Sekvenssin pituus: 1428 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: kaksijuosteinen 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen 6. Laatu: cDNA mRNA:ksi 15 7. Sekvenssi GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 20 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 25 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 30 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 35 26 104254 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 810

AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 90U

GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 5 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1000 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 10 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1300 GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1420 15 1. SEQ ID nro 5 2. Sekvenssin pituus: 21 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 20 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi

AGGGCCGGGC ACTTATAAAC T

;· 25 1. SEQ ID nro 6 2. Sekvenssin pituus: 21 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 30 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

.* 6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi 1

CCCAGTGGTC CAGTGACGTC A

1Q4254 1. SEQ ID nro 7 2. Sekvenssin pituus: 39 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 5 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi

CTTCGAGTGC ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGTCCG

10 1. SEQ ID nro 8 2. Sekvenssin pituus: 49 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 15 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi

ATGTGGCGGA CAAGGGCCGA GTCGGGCCCG CAGATGCACT CGAAGGTAC

20 1. SEQ ID nro 9 2. Sekvenssin pituus: 65 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen ; 25 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGTGGACGAG GACTATAGCG GCTCTGGCGA 60 30 GTGAC 65 1. SEQ ID nro 10 2. Sekvenssin pituus: 63 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 35 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen 28 104254

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi TCGAGTCACT CGCCAGAGCC GCTATAGTCC TCGTCCACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 60 5 CCA 63 1. SEQ ID nro 11 2. Sekvenssin pituus: 65 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 10 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGtcGACGAC GAGGCCAGCG GCTCTGGCGA 60 15 CTGAC 65 1. SEQ ID nro 12 2. Sekvenssin pituus: 63 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: yksijuosteinen 20 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen

6. Laatu: muu nukleiinihappo, syntetisoitu DNA

7. Sekvenssi TCGAGTCAGT CGCCAGAGCC GCTGGCCTCG TCGTCGACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 60 ; 25 CCA 63 1. SEQ ID nro 13 2. Sekvenssin pituus: 1680 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 4. Juosteisuus: kaksijuosteinen 30 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen 6. Laatu: cDNA mRNA:ksi 7. Sekvenssin piirteet:

Ominaispiirteen määrittävä symboli: signaalipeptidi Kohdat: 190 - 243

35 Ominaispiirteen määritysmenetelmä: S

29 104254

Ominaispiirteen määrittävä symboli: kypsä peptidi Kohdat: 244 - 1671 Piirteen määritysmenetelmä: S

8. Sekvenssi 5 CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60 AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120 TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180 10 CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly -18 -15 -10 -5 CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279

Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys 1 5 10 15 GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327

Vai Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu 15 20 25 AAT GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375

Asn Ala Ser Gin Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Vai 30 35 40 20 CGC TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC 423

Arg Ser Ser Vai Ala Ala Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp 45 50 55 60 GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471

Gly Gly Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu Pro Pro 25 65 70 75 : GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519

Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gin Trp 80 85 90 GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567 30 Vai Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp 95 100 105 CTC AAT GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615

Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai Ser Ala 110 115 120 GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663 ^ Ala Glu Ala Thr Vai Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gin Gin Cys 125 130 135 140 30 104254 GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711

Glu Vai Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr 145 150 155 TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759 c Cys Arg Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Vai Ser 160 165 170 ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807

Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gin Ala 175 180 185 CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855 10 Leu Pro Vai Gly Ser Ser Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu 190 195 200 ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903

Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala Arg Glu 205 210 215 220 15 GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951 Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Vai Glu Asn Gly Gly Cys Glu His 225 230 235 GCG TGC AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC 999

Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly 240 245 250 20 GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG 1047 Ala Ala Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin 255 260 265 TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG 1095

Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Vai Pro Asn Pro Asp Gin 270 275 280 . 25 CCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC 1143

Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala 285 290 295 300 GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT 1191

Asp Gin His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser 30 305 310 315 : CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC 1239

Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His 320 325 330 TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG 1287 ok Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai 335 340 345 3i 104254 GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC 1335

Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn 350 355 360 CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC 1383

Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro lie Pro 5 365 370 375 380 CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA 1431

His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro 385 390 395 GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC 1479 10 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 400 405 410 TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA 1527

Tyr lie Leu Asp Asp Gly Phe He Cys Thr Asp He Asp Glu Cys Glu 415 420 425 AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC 1575 15 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 430 435 440 GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC 1623

Glu Cys He Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His lie Gly Thr 445 450 455 460 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 GAC TGT GAC TCC GGC AAG GTG GAC GAG GAC TAT AGC GGC TCT GGC GAG 1671 2

Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu 3 465 470 475 4 TGACTCGAG 1680 5 1. SEQ ID nro 14 6 2. Sekvenssin pituus: 1680 7 ’ 3. Sekvenssin tyyppi: nukleiinihappo 8 4. Juosteisuus: kaksijuosteinen 9 5. Sekvenssin topologia: lineaarinen 10 6. Laatu: cDNA mRNA:ksi 11 7. Sekvenssin piirteet: 12

Ominaispiirteen määrittävä symboli: signaalipeptidi 13

Kohdat: 190 - 243 14

Piirteen määritysmenetelmä: S

15

Ominaispiirteen määrittävä symboli: kypsä peptidi 16

Kohdat: 244 - 1671

Piirteen määritysmenetelmä: S

8. Sekvenssi 32 104254 CTCGA6CCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60 5 AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120 TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180 CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231

Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly -18 -15 -10 -5 10 CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279

Leu Gly Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys 1 5 10 GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327

Vai Glu His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu 15 20 25 15 AAT GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375

Asn Ala Ser Gin Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Vai 30 35 40 CGC TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC 423

Arg Ser Ser Vai Ala Ala Asp Vai Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp 20 45 50 55 60 GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471

Gly Gly Vai Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gin Leu Pro Pro 65 70 75 GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519 25 Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gin Trp : 80 85 90 GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567

Vai Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp 95 100 105 CTC AAT GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615

Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai Ser Ala 110 115 120 GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663

Ala Glu Ala Thr Vai Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gin Gin Cys 35 125 130 135 140 33 104254 GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711

Glu Vai Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr 145 150 155 5 TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759

Cys Arg Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Vai Ser 160 165 170 ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807

Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gin Ala 175 180 185 10 CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855

Leu Pro Vai Gly Ser Ser Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu 190 195 200 ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903

Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala Arg Glu 205 210 215 220 15 GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951

Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Vai Glu Asn Gly Gly Cys Glu His 225 230 235 GCG TGC AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC 999

Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly 20 240 245 250 GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG 1047

Ala Ala Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin 255 260 265 TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG 1095

Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Vai Pro Asn Pro Asp Gin 270 275 280 CCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC 1143

Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala 285 290 295 300 30 GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT 1191

Asp Gin His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser 305 310 315 « CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC 1239

Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His 320 325 330 35 34 104254 TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG 1287

Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Vai Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val 335 340 345 5 GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC 1335

Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn 350 355 360 CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC 1383 •Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro lie Pro 365 370 375 380 10 CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT CCA 1431

His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro 385 390 395 GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC 1479

Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 400 405 410 15 TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA 1527 Tyr lie Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp He Asp Glu Cys Glu 415 420 425 AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC 1575

Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 430 435 440 20 GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC 1623

Glu Cys He Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His He Gly Thr 445 450 455 460 GAC TGT GAC TCC GGC AAG GTC GAC GAC GAG GCC AGC GGC TCT GGC GAC 1671

Asp Cys Asp Ser Gly Lys Val Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp 25 465 470 475 TGACTCGAG 1680

Claims (25)

35 104254

1. Menetelmä trombiinia sitovan aineen tuottamiseksi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi 5 AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp 10 GlyGIyValGIyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp PrcLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGInTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrVaIProSerGluProIleTrpGluGluGlnGInCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerIleThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu

20 GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro

25 AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaA]a AspGInH isArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGIn ArgCysValAsnThrG1nG1yGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys

30 GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProI lePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGInThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGIyPheCysSerGlyValCysHi sAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaleuValArgHisIleGIyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerG1yY2, 36 1 0 4 2 5 4 jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Y1 ja Y2 edustavat mitä tahansa aminohappoja, tunnettu siitä, että viljellään transformoitu solu, joka sisältää rekom-5 binanttivektorin, joka sisältää replikoitavissa olevan vektorin ja DNA-fragmentin, jolla on nukleotidisekvenssi, joka koodittaa mainittua aminohapposekvenssiä, ja kerätään viljeltyjen solujen tuottamat polypep- tidit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan trombiinia sitova aine, jossa Xl on Glu, X2 on Asp, Y1 on Tyr ja Y2 on Glu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan trombiinia sitova aine, jossa Xl on Asp, X2 on Glu, Y1 on Ala ja Y2 on Asp.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan trombiinia sito- 20 va aine, joka on glykosyloitu polypeptidi.

5. DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että sillä on nukleotidisekvenssi, joka kykenee koodittamaan seuraavaa aminohapposekvenssiä, AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu ^ TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGInlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerleuLeuleuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgleuTrpIleGlyLeuGlnleuProProGlyCysGlyAsp ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer 30 TyrSerArgTrpAlaArgleuAspLeuAsnGlyAlaProleuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluVallysAlaAspGlyPheleuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu 35 AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerIleThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu 37 1 0 4 2 5 4 G1yLeuG1nleuMetCysThrA1aProProG1yA1aVa1G1nG1yH i sTrpA1aArgG1u AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGIyCysGluHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaleuGInAlaAspGlyArg 5 SerCysThrAlaSerAlaThrGInSerCysAsnAspleuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal 10 AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle 15 CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaleuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Y1 ja Y2 20 edustavat mitä tahansa aminohappoja.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että Xl on Glu, X2 on Asp, Yl on Tyr ja Y2 on Glu.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-fragmentti, : 25 tunnettu siitä, että Xl on Asp, X2 on Glu, Yl on Ala ja Y2 on Asp.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että sillä on seuraava nukleotidi-sekvenssi

30 GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCICCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240

35 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 104254 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 5 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 10 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960

15 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200

20 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen DNA-fragmentti, : tunnettu siitä, että sillä on seuraava nukleotidi- sekvenssi GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 30 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 35 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 39 1 0 4 2 5 4 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 5 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 1Q AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080

15 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 20 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1428

10. Rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että se sisältää replikoitavissa olevan vektorin ja DNA-25 fragmentin, jolla on nukleotidisekvenssi, joka koodittaa : seuraavaa aminohapposekvenssiä AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu TyrProGlyProAlalhrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis

30 LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGIyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp ProlysArgleuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgleuAspLeuAsnGlyAlaProleuCysGlyProLeuCysVaI

35 AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerIleThrTyrGlyThrProPheAla « 104254 AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla 5 neProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla 10 AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysneLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspL-euVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrleuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro ^-5 HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhel1e CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysITeCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr 20 AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyYZ, jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Y1 ja Y2 edustavat mitä tahansa aminohappoja.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen rekombinantti-25 vektori, tunnettu siitä, että se sisältää seuraa- vat nukleotidi-sekvenssit (1) - (7) , tässä järjestyksessä transkription alavirtasuuntaa kohden, (1) promoottorina toimiva nukleotidisekvenssi, (2) ribosomia sitovana kohtana toimiva nukleotidi-sekvenssi, (3) initiaatiokodonina toimiva nukleotidisekvenssi. (4) signaalipeptidiä koodittava nukleotidisekvenssi, (5) alempana esitettyä aminohapposekvenssiä koodit- 35 tava nukleotidisekvenssi, (6) lopetuskodonina toimiva nukleotidisekvenssi, ja 4i 104254 (7) Poly-A:n lisäyssignaalina toimiva nukleotidi-sekvenssi / AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu 5 TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspVallleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp 10 ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProleuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProITeTrpGluGluGlnGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu 15 AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerIleThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyleuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGIuAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla 20 IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla 25 AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln • ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysH i sCysTyrProAsnTyrAspLeuVa1 AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGInCys GlnProLeuAsnGliiThrSerTyrleuCysValCysAlaGluGlyPlieAlaProI lePro 30 H isGluProH i sArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHi sAsnLeu 104254 ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaleuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, 5 jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Yi ja Y2 edustavat mitä tahansa happamia aminohappoja.

12. Transformoitu solu, tunnettu siitä, että se sisältää rekombinanttivektorin, joka sisältää replikoi -10 tavissa olevan vektorin ja DNA-fragmentin, jolla on nuk-leotidisekvenssi, joka koodittaa seuraavaa aminohappo-sekvenssiä AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu

15 TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGInlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuleuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp ProlysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer

20 TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluVallysAlaAspGlyPheleuCysGluPheHi sPheProAlaThrCysArgProleu AlaVa lGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAla ^ AlaArgGlyAlaAspPheGInAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu • GlyLeuGlnleuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyH isTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg 30 SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspleuCysGluHi sPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgleuAlaAla AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal O ^ AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys « 104254 GlnProLeuAsnGInThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro 5 HisGluProHisArgCysGlnHetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGInAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrIleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr

10 AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Y1 SerGlySerGlyY2, jossa Xl ja X2 edustavat happamia aminohappoja ja Y1 ja Y2 edustavat mitä tahansa aminohappoja. 104254