FI104260B - Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekij-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-johdannaisen valmistamiseksi - Google Patents

Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekij-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-johdannaisen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI104260B
FI104260B FI922745A FI922745A FI104260B FI 104260 B FI104260 B FI 104260B FI 922745 A FI922745 A FI 922745A FI 922745 A FI922745 A FI 922745A FI 104260 B FI104260 B FI 104260B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
factor viii
kda
human factor
derivative
biologically active
Prior art date
Application number
FI922745A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922745A0 (fi
FI104260B1 (fi
Inventor
Jack Spira
Kerstin Larsson
Peter Lind
Annelie B Almstedt
Eva Maria Gray
Helena Inga Sandberg
Mona Sydow-Baeckman
Original Assignee
Biovitrum Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20377785&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI104260(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biovitrum Ab filed Critical Biovitrum Ab
Publication of FI922745A0 publication Critical patent/FI922745A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104260B publication Critical patent/FI104260B/fi
Publication of FI104260B1 publication Critical patent/FI104260B1/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compositions Of Oxide Ceramics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Confectionery (AREA)

Description

x 104260
Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisenteki jä-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-joh-5 dannaisen valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee DNA-sekvenssiä, joka koodittaa biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisen-tekijä-VIII -johdannaista, yhdistelmä-DNA-ilmentämisvekto-10 ria, joka sisältää tällaisen DNA-sekvenssin, eläinalkupe-rää olevia isäntäsoluja, jotka on transformoitu tällaisella yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorilla, ja menetelmää yh-distelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII -johdannaisen valmistamiseksi. Ihmisentekijä-VIII -johdannainen käsittää kaksi me-15 talli-ionisillan yhdistämää polypeptidiä.
Keksinnön tausta
Tavanomainen verenvuototauti eli verenvuototauti-A on yleisin perityistä verenvuotohäiriöistä. Se on seurausta X-kromosomiin liittyvästä vajauksesta veren koagulaa-20 tiotekijässä VIII. Se vaivaa lähes pelkästään miehiä ja esiintymistiheys on 1 - 2 yksilössä 10 000 miehestä. X-kromosomivajauksen välittävät naispuoliset kantajat, jotka : j : eivät itse sairasta verenvuototautia. Riippuen X-kro- ··· mosomin mutaation tyypistä tekijä-VIII joko ei toimi tai « t · t 25 puuttuu, mikä johtaa viivästyneeseen veren koagulaatioon.
.·. : Verenvuototauti-A:n kliininen ilmenemismuoto on epänormaa- • · · | li verenvuototaipumus ja ennen hoidon tekijä-VIII -konsen- • · · traateilla käyttöön ottamista vakavaa verenvuototauti-A:ta * sairastavan henkilön keskimääräinen elinikä oli alle 20 30 vuotta. Plasmasta saatujen tekijä-VIII -konsentraattien käyttö on parantanut verenvuototautipotilaiden tilannetta *«· ·.· · huomattavasti. Keskimääräinen elinikä on kasvanut paljon .···. ja useimmilla heistä on mahdollisuus elää enemmän tai vä- hemmän normaalia elämää. Kuitenkin konsentraatteihin ja « 1 niiden käyttöön on liittynyt tiettyjä ongelmia. Vakavimmat 2 104260 ovat olleet virusten välittyminen. Aiemmin aidsia, hepa-tiitti-B:tä ja ei-A-ei-B-hepatiittia aiheuttavat virukset ovat iskeneet vakavasti verenvuototautia sairastavaan väestöön. Vastikään monien kaupallisten konsentraattien 5 tuotantomenetelmään on liitetty erilaisia menetelmiä virusten inaktivoimiseksi. Markkinoille on samoin tulossa uusia erittäin puhdistettuja tekijä-VIII -konsentraatteja, joiden odotetaan olevan paljon turvallisempia verrattuna vanhempiin konsentraatteihin mitä tulee vaaraan virusten 10 välittymisestä. Kuitenkaan mitään takeita virusten puuttumisesta ei voida antaa. Konsentraatit ovat lisäksi suhteellisen kalliita, koska raakamateriaali plasma on kallista rajoitetun saatavuuden johdosta.
Yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII todennäköisesti ratkai-15 see suuren osan ongelmista, jotka liittyvät plasmaperäis-ten tekijä-VIII -konsentraattien käyttöön. Koska tarvitaan yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII verenvuototauti-A:n hoitoon, muutama ryhmä työskentelee tällä hetkellä tällaisen tuotteen kehittämiseksi. Kuitenkin yhdistelmä-DNA-tekijä-20 VIII:n kehittämisessä on kohdattu joitakin vaikeuksia. Yksi suurimmista ongelmista on yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII :n tuottaminen riittävän korkeina saantoina. Suurin : : : osa suoritetusta kehitystyöstä on suoritettu käyttäen
··· cDNA-geeniä, joka koodittaa täysimittaista tekijä-VIII
» · · · Ϊ*. >t 25 -molekyyliä.
.·. : Tämä keksintö kuvaa deletoitua tekijä-VIII
• · · S' | -cDNA:ta, joka koodittaa yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII -joh- • ♦· I..* dannaista, joka vastaa molekyylipainoltaan ja muilta • · · ** * biokemiallisilta ominaispiirteiltään aiemmin kuvattua 30 plasmatekijä-VIII -muotoa, jota esiintyy huomattavia V * määriä kaupallisissa konsentraateissa (Anderson, L.-O., et 0 : al^., Proc.Nat 1. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2979 - 2983) . Il- mentämistaso, joka saadaan ilmentämällä molekyyli eläinso-luviljelmässä, on osoittautunut huomattavasti korkeammaksi 35 kuin jos tekijä-VIII:n ilmentämiseksi käytetään täysimit- 3 104260 täisen tekijä-VIII:n cDNA:ta. Uudella deletoidulla tekijä-VIII -cDNA:lla saadaan todennäköisesti riittävän korkeita saantoja yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:aa käytettäväksi teollisessa menetelmässä yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:n far-5 maseuttiseksi valmistamiseksi.
Käytettyjä määritelmiä
Seuraavassa 2 332 aminohapon yksisäikeisen täysimittaisen tekijä-VIII:n eri rakennealueista käytetty nimistö on samanlainen kuin Veharin, G.A., et ai.. Nature 10 312 (1984) 337 - 342, määrittelemät. Täten AI-ja A2-alueet sisältyvät tekijä-VIII:n noin 200 kDa:n (aminohapot 1-1 648) - noin 90 kDa:n (aminohapot 1 - 740) raskasketjumuo-toon. A3-, Cl- ja C2-alueet sisältyvät tekijä-VIII:n noin 80 kDa:n kevyeen ketjuun (aminohapot 1 649 - 2 332) . B-15 alue muodostaa täysimittaisen yksiketjutekijä-VIII:n voi makkaasti glykosyloidun keskialueen tai tekijä-VIII:n raskaan ketjun 200 kDa:n muodon C-pääosan (aminohapot 741 - 1 648) . Ilmaisu "tekijä-VIII-deleetiojohdannainen" määritellään yhdeksi tai useammaksi polypeptidiketjuksi, joilla on 20 tekijä-VIII:C -aktiivisuutta, ja jotka on saatu täysimittaisesta tekijä-VIII -polypeptidistä deletoimalla yksi tai useampi aminohappo. Ilmaisu "tekijä-VIII:QD" määritellään : polypeptidiket juksi, joka on saatu täysimittaisesta teki- ··· jä-VIII :sta, ja josta puuttuvat aminohapot 745 - 1 562.
• « · · 25 Ilmaisu "tekijä-VIII :RE" määritellään polypeptidiket juksi, : joka on saatu täysimittaisesta teki jä-VIII: sta, ja josta • · · .·, · puuttuvat aminohapot 741 - 1 648. Ilmaisu "tekijä-VIII :SQ" • · · !..* määritellään polypeptidiket juksi, joka on saatu täysimit- • · · • * · • täisestä tekijä-VIII:sta, ja josta puuttuvat aminohapot 30 743 - 1 636.
• · » *.* * Tekniikan taso • · · : Tuoreessa plasmassa, joka on valmistettu proteaa- V. si-inhibiittorien läsnä ollessa, tekijä-VIII: 11a on osoi-
4 I
tettu olevan molekyylipaino 280 kDa ja sen on osoitettu 35 koostuvan kahdesta peptidiketjusta, joiden molekyylipainot « 1 4 4 4 1 4 · 4 104260 ovat 200 kDa ja vastaavasti 80 kDa (Andersson, L.-O., et ai. . Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 (1986) 2979 - 2983) . Näitä ketjuja pitävät yhdessä metalli-ionisillat. Tekijä-VIII-molekyylin enemmän tai vähemmän proteolyyttisesti hajon-5 neita muotoja todettiin aktiivisiksi fragmenteiksi tekijä- VIII-materiaalissa, joka oli puhdistettu kaupallisista konsentraateista [Andersson, L.-O., et ai.. 1986; Andersson, et ai.. EP 0 197 901 (1985)]. Tekijä-VIII:n fragmen-toidut muodot, joiden molekyylipainot olivat 260 kDa -10 170 kDa, koostuivat yhdestä raskaasta ketjusta, jonka mo- lekyylipaino oli 180 kDa - 90 kDa (jolloin kaikissa varianteissa oli identtinen N-pää), yhdistettynä 80 kDa:n kevyeen ketjuun. Raskaiden ketjujen N-pääalue on identtinen yksiketjutekijä-VIII:n vastaavaan nähden, joka saatiin 15 tekijä-VIII-cDNA:n nukleotidisekvenssitiedoista (Wood, W.I., et ah, Nature 312 (1984) 330 - 336, Vehar, G.A. , et ai.. Nature 312 (1984) 337 - 342).
Pienin aktiivinen muoto, jonka molekyylipaino on 170 kDa ja joka sisältää yhden 90 kDa:n ja yhden 80 kDa:n 20 ketjun, voitiin aktivoida trombiinilla samassa määrin kuin muodot, joiden molekyylipainot ovat korkeammat. Se edustaa täten ei-aktivoitua muotoa. Sillä on myös osoitettu olevan .· j täysi biologinen aktiivisuus in vivo verenvuototautia sai- ]i' rastavissa koirissa testattuna (Brinkhous, K.M., et ai. .
25 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 8752 - 8756) . Täten ve-
renvuotoa tyrehdyttävä teho oli sama kuin tekijä-VIII
• » : -muodoilla, joiden molekyylipaino on korkeampi. Edelleen • · · saatiin osoitus, että 170 kDa:n muodon pysyvyys in vivo • · · ’ oli 50 % korkeampi kuin muotojen, joiden molekyylipaino on 30 korkeampi.
• · ♦ *·* * Se seikka, ettei keskellä sijaitseva voimakkaasti *.* * glykosyloitu osa tekijä-VIII -polypeptidiketjusta, joka on aminohappojen Arg-739 ja Glu-1649 välissä, vaikuta olevan välttämätön täydelle biologiselle aktiivisuudelle, on • 35 johtanut useat tutkijat pyrkimyksiin tuottaa yhdistelmä- 5 104260 DNA-tekijä-VIII -johdannaisia, joista puuttuu tämä alue. Tähän on päästy deletoimalla se osa cDNArta, joka koodit-taa keskellä sijaitsevaa voimakkaasti glykosyloitua osaa tekijä-VIII:sta, joko kokonaan tai osittain.
5 Esimerkiksi J.J. Toole et ai. raportoivat rakenta neensa ja ilmentäneensä tekijä-VIII:n, josta puuttuvat aminohapot 982 - 1562 ja vastaavasti 760 - 1639 (Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5939 - 5942) . D.L. Eaton et ai. raportoivat rakentaneensa ja ilmentäneensä tekijä-10 VIII:n, josta puuttuvat aminohapot 797 - 1562 (Biochemistry 25 (1986) 8343 - 8347). R.J. Kaufman kuvasi tekijä-VIII :n ilmentämistä, josta puuttuvat aminohapot 741 - 1646 (PCT-patenttihakemusjulkaisu nro WO 87/04 187). N. Sarver et ai. raportoivat rakentaneensa ja ilmentäneensä tekijä-15 Villin, josta puuttuvat aminohapot 747 - 1560 (DNA 6.
(1987) 553 - 564). M. Pasek raportoi tekijä-VIII:n rakentamisesta ja ilmentämisestä, josta puuttuvat aminohapot 745 - 1562 ja vastaavasti aminohapot 741 - 1648 (PCT-patenttihakemusjulkaisu nro 88/0 0831) . K.-D. Langner rapor-20 toi tekijä-VIII:n rakentamisesta ja ilmentämisestä, josta puuttuvat aminohapot 816 - 1598 ja vastaavasti aminohapot 741 - 1689 (Behring Inst .Mitt. 82 (1988) 16 - 25; EP
:.: : 295 597). P. Meulien gt ai. raportoivat tekijä-VIII:n ra- * kentamisesta ja ilmentämisestä, josta puuttuvat aminohapot 25 868 - 1562 ja vastaavasti aminohapot 771 - 1666 (Protein :*·.· Engineering 2:4 (1988) 301 - 306, EP-0 303 540 AI) . Kun • · : nämä tekijä-VIII -cDNA:n deletoidut muodot ilmennetään ni- • · .·;·. säkässoluissa, tuotantotaso on tyypillisesti 10 kertaa • · · korkeampi täysimittaiseen tekijä-VIII:aan verrattuna.
... 30 Edelleen on tehty yrityksiä 90 kDa:n ja 80 kDa:n • · · l"' ketjujen ilmentämiseksi erikseen kahdesta eri cDNA-joh- • · · ’·[ * dannaisesta samassa solussa (Burke, R.L., et ai. . J.
Biol.Chem. 261 (1986) 12574 - 12578; Pavirani, A., et ai. , • « « *:··· Biochem.Bioohys .Res . Commun. 145 (1987) 234 - 240) . Kuiten- . 35 kin tässä systeemissä rekonstituution teho in vivo vai- « < · * < < « « « 6 104260 kuttaa rajoitetulta talteen otettuna tekijä-VIII:C -aktiivisuutena mitattuna.
Keksinnön kuvaus
Esillä oleva keksintö käsittelee menetelmiä pro-5 teiinien tuottamiseksi, jotka koostuvat yhdestä tai useammasta polypeptidiketjusta ja joilla on tekijä-VIII-C-aktiivisuutta. Spesifisemmin esillä oleva keksintö antaa käyttöön modifioidun cDNA-sekvenssin, joka on saatu täysimittaisesta tekijä-VIII-cDNA:sta ja joka eläinsoluissa 10 ilmennettynä johtaa korkean tason tuotantoon proteiinia, jolla on tekijä-VIII:C -aktiivisuutta ja joka koostuu oleellisesti kahdesta polypeptidiketjusta, joiden mole-kyylipainot ovat 90 kDa ja vastaavasti 80 kDa.
Täten esillä oleva keksintö koskee DNA-sekvenssiä, 15 jolle on tunnusomaista, että se koodittaa biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII -johdannaista, joka koostuu oleellisesti kahdesta polypeptidiketjusta, joiden molekyylipainot ovat 90 kDa ja vastaavasti 80 kDa, jolloin DNA-sekvenssi kykenee sopivassa isäntäsolussa 20 ilmentämään mainitun johdannaisen ja erittämään sitä, ja käsittää ensimmäisen DNA-segmentin, joka koodittaa ihmis-entekijä-VIII:n 90 kDa:n ketjun, ja toisen DNA-segmentin, : joka koodittaa ihmisentekijä-VIII :n 80 kDarn ketjun, jol- loin segmenttejä yhdistää toisiinsa liittäjä-DNA-segment-25 ti, joka koodittaa 12 aminohappotähdettä, jotka ovat pe- ;\j räisin C-päästä, ja 2 aminohappotähdettä, jotka ovat pe- • · : räisin N-päästä, ihmisentekijä-VIII:n B-alueelta.
.·;·[ Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA-ilmentämisvek- • · · toria, jolle on tunnusomaista, että se sisältää transkrip- ... 30 tioyksikön, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen ♦ · · *·|#* DNA-sekvenssin, promoottorin ja polyadenylaatiosignaa- • · · lisekvenssin.
:***: Keksintö koskee myös eläinalkuperää olevia isäntä- soluja, jotka on transformoitu edellä määritellyn mukai- ,· . 35 sella yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorilla.
• « « « ·« • · « • · 7 104260
Lisäksi keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII -johdannaisen valmistamiseksi, jonka ilmentää edellä kuvattu DNA-sek-venssi.
5 Menetelmälle on tunnusomaista, että eläinsolulin- jaa, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 2 mukaisella yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorilla, viljellään kasvualustassa, joka mahdollistaa ihmisentekijä-VIII -johdannaisen ilmentämisen ja erityksen, joka johdannainen koos-10 tuu kahdesta polypeptidistä, joiden molekyylipainot ovat 90 kDa ja vastaavasti 80 kDa ja joita yhdistää toisiinsa metalli-ionisilta, ja mainittu johdannainen otetaan talteen kasvualustasta.
Näin valmistettu ihmisentekijä-VIII -johdannainen, 15 käsittää 90 kDa:n alueen ja siihen metalli-ionisillalla liitettynä liittäjäpeptidin välityksellä ihmisentekijä-VIII: n 80 kDa:n alueen.
Proteiinin saamiseksi, jolla on tekijä-VIII:C -aktiivisuutta ja joka koostuu edellä kuvatuista kahdesta po-20 lypeptidiketjusta, yksittäinen polypeptidiketju, joka on muodostunut in vivo -translaation kautta, on pilkottava joko translaation jälkeen prosessoimalla tuotantosolussa : tai prosessoimalla proteolyyttisesti in vitro, tai käyttä- mällä kumpaakin. Koska proteiini, jolla on tekijä-VIII 25 -aktiivisuutta ja joka koostuu kahdesta polypeptidiket j us - :*·.· ta, joiden molekyylipainot ovat 200 kDa ja 80 kDa, voidaan • · j eristää ihmisplasmasta, oletetaan, että prosessoiville • · entsyymeille löytyy tarkoituksenmukainen pilkkomiskohta • · · edellä esitetyn mukaisesti yksiketjuisesta täysimittaisen ... 30 tekijä-VIII:n translaation primaarituotteesta. Todennäköi- • · · ·[/ simmin tärkeä prosessointikohta in vivo sijaitsee Arg- • · · *·| * 1648 :n karboksyylipään puolella. Kypsymisessä lohkeaminen
Arg-l648:n kohdalta johtaa tekijä-VIII -proteiiniin, joka • · · • ;··; koostuu kahdesta ketjusta, joiden molekyylipainot ovat 200 .* . 35 kDa ja 80 kDa. Koska Arg-1648 vaikuttaa sijaitsevan raken- « · · * · · • · « · 8 104260 nealueiden välisellä rajalla tekijä-VIII -molekyylissä, se muodostaa steerisesti lähestyttävän kohdan prosessointi-entsyymille tai -entsyymeille. Oletettavasti Arg-740:n kohdalla on toinen prosessointikohta, joka johtaa 200 5 kDa:n ketjun muuttumiseen 90 kDa:n ketjuksi in vitro, jolloin muodostuu tekijä-VIII:n 90 kDa:n ja 80 kDa:n muoto, joka esiintyy kaupallisissa ihmisplasmaperäisissä tekijä-VIII -konsentraateissa. Esillä olevan keksinnön mukaan on todettu, että tekijä-VIII -deleetiojohdannaisen 10 tuottamiseksi, joka voidaan prosessoida joko in vivo tai in vitro, tai sekä että, kaksiketjuiseksi proteiiniksi, joka koostuu 90 kDa:n ja 80 kDa:n polypeptidiketjuista, Arg-740:ä ja Arg-1648:aa ympäröivät aminohapposekvenssit on säilytettävä, jotta säilytettäisiin rakenteelliset 15 edellytykset oikeaoppiselle lohkeamiselle. Spesifisemmin, jos esimerkiksi aminohapot 743 - 1636 täysimittaisesta tekijä-VIII -polypeptidistä on deletoitu, saadaan uusi po-lypeptidiketju, jossa Arg-740:ä ja Arg-1648:aa liittää toisiinsa 14 aminohappoa. Näistä 14 aminohaposta viiden 20 aminopään aminohapon sekvenssi vastaa suoraan viittä aminohappoa, jotka seuraavat Arg-740:ä täysimittaisessa tekijä-VIII:ssa. Samoin 12 karboksyylipään aminohapon · edeltävästä 14 aminohapon fragmentista sekvenssi vastaa #>|·' suoraan 12 aminohappoa, jotka edeltävät Glu-1649:ää täysi- 25 mittaisessa tekijä-VIII: ssa, jolloin muodostuu 3 aminoha-pon limitys B-alueen N- ja C-päänalueiden välille.
• · .·. : Jotta tuotettaisiin korkeassa saannossa tekijä- • · · • · VIII :SQ -proteiinia, joka koostuu edellä esitetyn mukai- • · · sesti kahdesta polypeptidiketjusta, tekijä-VIII -deleetio- ... 30 johdannaista koodittava cDNA kootaan tehokkaaseen trans- • · · ’·] 1 kriptioyksikköön yhdessä sopivien säätely-yksiköiden kans- • · · *·1 1 sa kloonausvektoriin, jota voidaan lisäännyttää Ej_ colissa alan ammattilaisille tunnettujen menetelmien mukaan. Te- • · · hokkaita transkription säätely-yksiköitä voitaisiin saada / t 35 eukaryoottisten solujen kromosomi-DNA:sta. Esimerkiksi • · · • M • · t · · « 9 104260 voidaan käyttää promoottori-tehostinyhdistelmiä voimakkaasti konstitutiivisesti transkriboiduista geeneistä, edullisesti metallotioneiini, β-aktiini tai GRP78. Samoin t tehokkaita transkriptioni! säätely-yksiköitä voidaan saada 5 viruksista, joiden luontaisia isäntiä ovat eukaryoottiset solut. Esimerkiksi voidaan käyttää promoottori-tehostinyh-distelmiä, jotka ovat peräisin eläinisännissä esiintyvistä viruksista, edullisesti tehostinta ja promoottoria, jotka esiintyvät Rous-sarkoomaviruksen pitkässä päätytoistossa, 10 apinaviruksessa 40, adenoviruksen pääasiallista myöhäis-promoottoria sekä ihmisen sytomegaloviruksen välitöntä varhaispromoottoria. Jotta saataisiin stabiileja korkean saannon määriä tekijä-VIII:SQ -cDNArsta transkriboitua mRNA:ta, transkptioyksikön tulisi sisältää 31-puoleisessa 15 osassaan DNA-alue, joka koodittaa transkription lopetus-polyadenylaatiosekvenssin. Edullisesti tämä sekvenssi saadaan apinavirus-40:n aikaiselta transkriptioalueelta tai kaniinin β-globiinigeenistä.
Tekijä-VIII:SQ -cDNA, joka on koottu tehokkaaseen 20 transkriptioyksikköön, viedään sitten sopivaan isäntäorga-nismiin tekijä-VIII:SQ -proteiinin ilmentämiseksi. Edullisesti tämän organismin tulisi olla selkärankaisalkuperää : oleva eläinsolulinja oikean laskostumisen, disulfidisil- <t]j1 tamuodostuksen ja erityksen sekä muiden translaation jäl- 25 keisten modifikaatioiden varmistamiseksi. Esimerkkejä vii- ·1·.· meksi mainituista ovat asparagiiniin liittyvä glykosylaa- • · tio, tyrosiini-O-sulfatointi ja syntyvän yksittäisen poly- • · peptidiketjun proteolyyttinen prosessointi, joka on oleel- i · «
linen 90 kDa:n ja 80 kDa:n kaksiketjuisen tekijä-VIII
... 30 -proteiinin muodostamiseksi. Esimerkkejä solulinjoista, • · · joita voidaan käyttää, ovat apinan COS-solut, hiiren L- i « i * solut, hiiren C127-solut, hamsterin BHK-21-solut ja edul- ·“1: lisesti CHO-solut.
• « · ·...; Tekijä-VIII-SQ -cDNA:ta koodittava transkriptioyk- ,· , 35 sikkö voidaan viedä eläinsolulinjaan usealla eri tavalla.
• · · t « · • · • · 10 104260
Yksi esimerkki tästä on muodostaa yhdistelmä-DNA-tuotteita edellä kuvatusta transkriptioyksiköstä ja erilaisiin eläinviruksiin pohjautuvista vektoreista. Esimerkkejä näistä ovat vektorit, jotka pohjautuvat lehmänrokkoviruk-5 seen, SV40-virukseen ja edullisesti nautapapilloomaviruk-seen.
Tekijä-VIII:SQ -cDNA:ta koodittava transkriptioyk-sikkö voidaan samoin viedä eläinsolulinjaan yhdessä toisen yhdistelmä-DNA-geenin kanssa, joka voi toimia dominoivana 10 valikointimerkkinä näissä soluissa, spesifisten solukloo-nien eristyksen helpottamiseksi, jotka ovat sisällyttäneet yhdistelmä-DNA:n genomiin. Esimerkkejä tämän tyypin dominoivista valikointimerkkigeeneistä ovat Tn5-aminoglykosi-difosfotransferaasi (resistenssi genetisiinille, G418), ja 15 puromysiiniasetyylitransferaasi (resistenssi puromysiinil- le) . Tällaista valikointimerkkigeeniä koodittava trans-kriptioyksikkö voi sijaita joko samassa vektorissa kuin tekijä-VIII:SQ -yksikköä koodittava. Se voidaan myös koo-dittaa erilliseen vektoriin, joka viedään ja integroidaan 20 samanaikaisesti isäntäsolugenomiin, mikä usein johtaa tiiviiseen fysikaaliseen sidokseen eri transkriptioyksiköiden välillä.
: Muut tyypit dominoivia valikointimerkkigeenejä, joita voidaan käyttää yhdessä tekijä-VIII-SQ -cDNA:n kans- 25 sa, pohjautuvat erilaisiin transkriptioyksiköihin, jotka j\j koodittavat dihydrofolaattireduktaasia (dhfr). Kun tämän- • · : tyyppinen geeni on viety soluihin, joista puuttuu endo- geeninen dhfr-aktiivisuus, edullisesti CHO-soluihin (DUKX- • · ·
Bll, DG-44), se mahdollistaa näiden kasvun nukleosideja ... 30 vailla olevassa kasvualustassa. Esimerkki tällaisesta kas- • · · vualustasta on Ham's F12, joka ei sisällä hypoksantiinia, :·: : tymidiiniä ja glysiiniä. Näitä dhfr-geenejä voidaan käyt-
tää yhdessä edellä esitetyn tyypin mukaisen tekijä-VIII:SQ
• · · -transkriptioyksikön kanssa CHO-soluissa, joko liitettynä ,·. 35 samaan vektoriin tai kahdessa eri vektorissa, jolloin muo- « « · • ·« 1 « 11 104260 dostetaan dhfr-positiivisia solulinjoja, jotka tuottavat yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:SQ -proteiinia.
Jos edellä kuvattuja solulinjoja kasvatetaan syto-toksisen dhfr-inhibiittorin metotreksaatin läsnä ollessa, 5 esiin tulee uusia solulinjoja, jotka ovat resistenttejä metotreksaatille. Nämä solulinjat voivat tuottaa yhdistel-mä-DNA-tekijä-VIII:SQ -proteiinia lisääntyneellä nopeudella toisiinsa liitettyjen dhfr- ja tekijä-VIII:SQ -trans-kriptioyksiköiden kasvaneen lukumäärän johdosta. Kun näitä 10 solulinjoja lisäännytetään kasvavien pitoisuuksien meto-treksaattia (1 - 10 000 nM) läsnä ollessa, voidaan saada uusia solulinjoja, jotka tuottavat tekijä-VIII:SQ -proteiinia hyvin korkealla nopeudella.
Edellä, kuvattuja tekijä-VIII:SQ -proteiinia tuot-15 tavia solulinjoja voidaan kasvattaa suuressa mittakaavassa joko suspensioviljelmänä tai erilaisilla kiinteillä tuilla. Esimerkkejä näistä tuista ovat mikrokantajat, joiden pohjana ovat dekstraani- tai kollageenimatriisit, tai kiinteät tuet onttojen kuitujen tai erilaisten keraamisten 20 materiaalien muodossa. Suspensioviljelmänä tai mikrokanta-jakasvatuksena edellä kuvattujen solulinjojen viljely voidaan suorittaa joko eräviljelynä tai perfuusioviljelynä, · jolloin tuotetaan jatkuvasti käsiteltyä kasvualustaa pit- t<j·1 kähköjen ajanjaksojen ajan. Täten esillä olevan keksinnön 25 mukaan edellä kuvatut solulinjat sopivat hyvin teollisen ·1·.· menetelmän kehittämiseksi yhdistelmä-DNA-teki jä-VIII :SQ:n » · : tuottamiseksi, joka vastaa alkuperäistä kahden polypepti- diketjun tekijä-VIII :aa (90 kDa ja 80 kDa) , joka voidaan • · · eristää ihmisplasmasta.
... 30 Yhdistelmä-DNA-teki jä-VIII: SQ -proteiini, joka ak- • · · -1·1 ’ kumuloituu edellä kuvatun tyyppiseen CHO-solukasvualus- • · 9 *·1 1 taan, voidaan konsentroida ja puhdistaa erilaisilla hioke- ·«"1: miallisilla menetelmillä, mukaan lukien menetelmillä, • · t joissa käytetään eroja koossa, varauksessa, liukoisuudes- ,· 35 sa, hydrofobisuudessa, spesifisessä affiniteetissa jne.
« · · « «« « · · 12 104260 käsitellyssä kasvualustassa esiintyvän yhdistelmä-DNA-te-kijä-VIII:SQ:n ja muiden aineiden välillä.
Esimerkki tällaisesta puhdistuksesta on yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:SQ -proteiinin adsorbointi monoklonaali-5 seen vasta-aineeseen, joka on immobilisoitu kiinteälle tuelle. Desorption jälkeen tekijä-VIII:SQ -proteiinia voidaan puhdistaa edelleen erilaisilla edellä esitettyihin ominaisuuksiin perustuvilla kromatografisilla tekniikoilla .
10 Keksinnön mukaisesti saatua proteiinia, jolla on tekijä-VIII -aktiivisuutta, voidaan formuloida farmaseuttisiin valmisteisiin terapeuttista käyttöä varten. Tuotettu yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:SQ -proteiini voidaan liuottaa tavanomaisiin, fysiologisesti hyväksyttäviin vesipoh-15 jäisiin puskuriliuoksiin, joihin voidaan lisätä mahdollisesti farmaseuttisia lisäaineita farmaseuttisten valmisteiden saamiseksi.
Esillä olevaa keksintöä kuvataan edelleen yksityiskohtaisemmin seuraavissa ei-rajoittavissa esimerkeis-20 sä. Keksinnön spesifisten suoritusmuotojen kuvaus tehdään viitaten oheisiin piirrustuksiin, joissa:
Kuvio 1 on kaaviomainen esitys täysimittaisen teki-. jä-VIII:n ja tekijä-VIII:SQ:n välisestä suhteesta. 90
» * I
kDa:n ketjun C-pään ja 80 kDa:n ketjun N-pään välisen « · · ····' 25 alueen primaarirakenne esitetään. Pystysuora nuoli osoit- • · : *** taa peptidisidoksen, joka pilkkomalla saadaan kaksiket- • · :.*·· juinen tuote;
Kuvio 2 on esitys plasmidista pKGE436, joka sisäl- ·*·*: tää tekijä-VIII:SQ -cDNA:n ihmisen sytomegaloviruspromoot- 30 torin transkription säätelyn alla; .···. Kuvio 3 on esitys plasmidista pKGE327, joka sisäl- « · · l..' tää hiiren dihydrofolaattireduktaasi-cDNA:n hiiren rinta- • · · *. kasvainviruksen pitkän päätytoiston transkription säätelyn « · · alla; • · • · • · · • ·» • » • · 104260 13
Kuvio 4 on esitys yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:SQ:n blot-immuunimäärityksestä polyakryyliamidigeelielektrofo-reesin jälkeen natriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa;
Kuviossa 5 esitetään kaavio muutoksista yhdistelmä-5 DNA-tekijä-VIII:SQ:n tekijä-VIII -aktiivisuudessa trom- biinin läsnäollessa suoritetun inkuboinnin jälkeen; ja
Kuvio 6 esittää muutoksia yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII :SQ:n SDS-PAGE - ja blot-immuunimäärityskuvioissa ihmisen α-trombiinin läsnäollessa suoritetun inkuboinnin 10 jälkeen.
Esimerkki 1
Tekijä-VIII -cDNArsta rakennettiin deleetiojohdannainen, joka koodittaa polypeptidiketjun, josta puuttuu valtaosa B-alueesta, mutta joka sisältää osia B-alueen 15 aminopään ja karboksyylipään sekvensseistä, jotka ovat oleellisia translaation primaarituotteen proteolyyttiselle prosessoinnille in vivo kahdeksi polypeptidiketjuksi.
Tekijä-VIII -CDNAin mutatointi 894 emäsparin Kpnl-PstI -restriktiofragmentti, joka 20 saatiin tekijä-VIII:QD -deleetiojohdannaisen cDNArsta (M.
Pasek, PCT-patenttihakemusjulkaisu nro WO 88/00 831), ja joka koodittaa aminohapot Leu 587 - Ala 1702, vietiin bakteerifaagivektoriin M13mpl9 (Yanisch-Perron, C., et * · · ···/ ai. . Gene 33 (1985) 103 - 119) alalla sinänsä tunnetuin • · · ···· 25 menetelmin. Saatua yhdistelmä-DNA -faagikloonia käytettiin • · i *** lähteenä yksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi, jota käytet- • · tiin templaattina oligonukleotidiohjatussa mutatoinnissa (Nakamaye, K., ja Eckstein, F., Nucl.Acids Res. 14 (1986) :1·1: 9679 - 9698) . 10 μg puhdistettua renkaan muotoista yksi- 30 säikeistä vektori-DNA:ta liitettiin 8 pikomooliin 5'-fos-foryloitua oligonukleotidia, jonka sekvenssi oli seuraava: • · · • · · • · · ! ' 5'-GCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAGAATCCACCAGTCTTGAAACGC-3' • · · • · • · · • · · • · 14 104260
Renkaan muotoisen DNA:n toinen säie syntetisoitiin saadulle templaatille lisäämällä kaikkia neljää deoksi-nukleotidia, dCTPaS, 12 yksikköä DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmenttia ja 12 yksikköä T4-DNA-ligaasia. Reak-5 tioseosta inkuboitiin yön yli 16 °C:ssa, minkä jälkeen sitä rikastettiin kaksisäikeisen DNA:n suhteen suodattamalla se nitroselluloosan läpi NaCl:n läsnä ollessa pitoisuutena 500 mM. 1/5 puhdistetusta kaksisäikeisestä DNA:sta pilkottiin inkuboimalla 5 yksiköllä restriktioentsyymiä Neil, ja 10 käsiteltiin 50 yksiköllä eksonukleaasi-III:a siinä määrin, että faagi-DNA-templaattisäie osittain poistui. Saatu osa-dupleksi muutettiin kaksisäikeiseksi DNA:ksi käsittelemällä 3 yksiköllä DNA-polymeraasi-I:tä ja 2 yksiköllä T4-DNA-ligaasia kaikkien neljän deoksinukleotiditrifosfaatin läs-15 nä ollessa 16 °C:ssa 3 tunnin ajan. 1/4:11a saatua seosta transformoitiin 300 μΐ coli TG1 -kantaa. Saaduista mu-tatoiduista faagiklooneista 10:lie suoritettiin dideoksi-sekvensointi (Sanger, F., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467). Yhdellä saaduista faagiklooneista 20 oli odotuksia vastaava nukleotidisekvenssi, mikä osoitti, että oli poistettu 228 emäsparin segmentti, joka vastaa aminohappoja Asp 1563 - Ser 1637 tekijässä VIII:QD. Täl-. löin muodostuu uusi 666 emäsparin Kpnl-PstI-fragmentti ··· · tekijä-VIII -cDNA:sta M13mpl9-vektoriin, joka (fragmentti) ··.: 25 koodittaa fuusiota Phe 742 :n ja Ser 1637 :n välillä tekijä- : *·· VIII -proteiinissa (tekijä-VIII :SQ) .
• · :/·· Nisäkkään ilmentämisvektorin rakentaminen, joka koodittaa tekijä-VIII:SQ:ta • · 666 emäsparin Kpnl-PstI-fragmentti, joka koodittaa 30 edellä kuvattua tekijä-VIII:SQ -fuusiota, eristettiin M13mpl9-faagi-DNA:n kaksisäikeisestä replikoituvasta muo- • · · dosta ja vietiin vektoriin pKGE431. Tämä vektori koostuu • · ·
’. 2046 emäsparin Kpnl-SphI-fragmentista tekijä-VIII:RE
-cDNA:sta (M. Pasek, PCT-hakemusjulkaisu WO 88/00 831, •:“i 35 ATCC-talletusnumero 53517), joka fragmentti koodittaa te- * • · • · · 104260 15 kijä-VIII:RE -proteiinin aminohappoja Leu 587 - Met 2176 pUC19:ssä. Tekijä-VIII:SQ:n 666 emäsparin Kpnl-PstI-fragmentin sovittamiseksi halutulla tavalla pKGE431-DNA oli avattava pilkkomalla täydellisesti Kpnl:llä ja osittain 5 Pstlrllä. pKGE431-fragmentti, jossa PstI pilkkoi tekijä-VIII:RE -proteiinin Ala 1702:ta vastaavassa asemassa, eristettiin ja ligatoitiin edellä esitettyyn tekijä-VIII:-SQ -cDNA:n Kpnl-Pstl-fragmenttiin, jolloin saatiin vektori pKGE432. Viimeksi mainittua vektoria pilkottiin Kpnlrllä 10 ja Apalrllä, ja vastaava 1700 emäsparin Kpnl-Apal-fragmentti, joka koodittaa tekijä-VIII:SQ -proteiinin aminoha-poja Leu 587 - Ala 2047, ligatoitiin suureen fragmenttiin vektorista pKGE347, jota oli pilkottu Kpnlrllä ja Apal:-llä. Vektori pKGE347, jonka pohjana on EL. coli 15 -kloonausvektori pBR327, koostuu ihmisen sytomegalovirus- tehostin/promoottorista, joka on kooditettu 741 emäsparin DNA-segmenttiin (nukleotidiasemat -671 - +71, Boshart, M., et ai.. Cell 41 (1985) 521 - 530) ylävirtaan tekijä-VIII:-QD -cDNArsta, jolloin SV40:n t-antigeeni-introni ja poly-20 adenylaatiosekvenssi ovat 3'-puoleisessa osassa. Saatu vektori (pKGE436), joka esitetään kuviossa 2, sisältää täydellisen tekijä-VIII:SQ -cDNArn, ja on identtinen . pKGE347:ään nähden lukuun ottamatta kooditettua erilaista • · « ··· · tekijä-VIII -deleetiojohdannaista.
...: 25 Esimerkki 2 : *·· Kiinalaisen hamsterin munasar jasolujen transfek- • · • '·· tointi • · :\j Soluviljelymaljassa, jonka halkaisija oli 10 cm, ·*·*: 0,5 miljoonaa dihydrofolaattireduktaasivajaata kiinalaisen 30 hamsterin munasarjasolua (CHO-DG44, jotka saatiin Dr. L.A.
Chasinilta, Columbia University, New York) siirrostettiin • ♦ ·
Dulbeccon modifioituun Eagles/Ham's F12 -kasvualustaan f « < (1:1), jota oli täydennetty 10 %:lla vasikansikiöseerumia, ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa 5 % hiilidioksidia käsit-35 tavassa inkubaattorissa. Seuraavana päivänä solut pestiin « · • · · • · • · 16 104260 tuoreella kasvualustalla, minkä jälkeen ne transfektoitiin kalsiumfosfaattimenetelmällä 10 ^g:lla l:l-seosta, jossa oli tekijä-VIII:SQ -ilmentämisvektoria pKGE436 ja dihydro-folaattireduktaasivektoria pKGE327, alalla tunnetuilla me-5 netelmillä. Vektori pKGE327 sisältää transkriptioyksikön, joka koostuu hiiren rintakasvainviruksen pitkästä pääty-toistosta ylävirtaan hiiren dihydrofolaattireduktaasi-cDNA:sta, jolloin SV40:n t-antigeeni- ja polyadenylaa-tiosekvenssit ovat 31-puoleisessa osassa kloonattuina vek-10 toriin pML2 myötäpäivään (kuvio 3). Päivänä 3 kasvualusta poistettiin, solut pestiin ja jaettiin uusiin soluviljely-maljoihin. Päivänä 4 valikointi dihydrofolaattireduk-taasipositiivisten solujen suhteen käynnistettiin korvaamalla kasvualusta edellä esitetyllä soluviljelykasvualus-15 talla, josta puuttuivat hupoksantiini, glysiini ja tymi-diini, ja jota oli täydennetty 10 %:lla perusteellisesti dialysoitua vasikansikiöseerumia. Kasvualusta vaihdettiin kahdesti viikossa ja noin 2 viikon kuluttua dihydrofolaat-tireduktaasipositiivisten solujen pesäkkeitä voitiin ottaa 20 talteen. Näitä pesäkkeitä kasvatettiin edelleen 25 cm2:n soluviljelypulloissa, minkä jälkeen, kun solut olivat lähes kasvaneet yhteen, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, joka sisälsi 3 % vasikansikiöseerumia. 24 I · « ’·· : tunnin kuluttua kasvualustan tekijä-VIII :C -aktiivisuutta 25 testattiin käyttäen synteettisen substraatin menetelmää « · • *·· (Coatest, tekijä-VIII:C, Kabi) . Tulokset esitetään alla : taulukossa 1.
• · • · • » « • · · • * • I» • · · • · · I · • · « • · · • · · « · · < · i « 4 « « « I t I < ( · • • · • · · • I I • · « · 17 104260
Taulukko 1
Tekijä-VIII:SQ:ta tuottavia CHO-D644 -solulinjoja
Solulinja nro Coatest- Solulirtja nro Coatest- g määritys määritys _(mU/ml)_ (mU/ml) 208:1 10 208:13 107 2 73 14 167 3 147 15 253 10 4 27 16 253 5 107 17 313 6 80 18 307 7 73 19 27 8 87 20 287 15 9 93 21 393 10 33 22 467 11 47 23 107 12 147 24 180 20 Tekijä-VIII:SQ:ta tuottavien CHO-DG44 -solulinjojen monistus
Taulukon 1 CH0-DG44 -solulinja 208:22, joka tuottaa 467 mU/ml/päivä tekijä-VIII:SQ:ta, valittiin jatko- II· ··! · geenimonistukseen valikoimalla ja kasvattamalla metotrek- 25 saatilla. Usean viikon viljelyn jälkeen metotreksaatti- • · • 1·· pitoisuudessa 20 mM solulinja 208:22 muodosti useita uusia • · resistenttejä soluklooneja. Nämä kloonit otettiin yksit-täin talteen ja niitä lisäännytettiin edelleen erillisinä • · viljelminä kuten edellä kuvattiin. Tekijä-VIII:C:n tuot-30 toteho näiden kloonien kasvualustassa määritettiin kuten esimerkissä 1. Tulokset esitetään taulukossa 2.
« « · ♦ · ♦ ··· ♦ ♦ · • · · • · · • · « « « « · • · · • · · • · 18 104260
Taulukko 2
Vahvistettuja solulinjoja, jotka tuottavat tekijä-VIII:SQ:ta ja jotka on saatu CHO-D644 -solulinjasta 208:22 5
Solulinja nro Coatest- Solulin^a nro Coatest- määritys määritys _(mU/ml)_(mU/ml ? 208:22:1 1040 208:22:13 1070 2 690 14 860 10 3 660 15 930 4 720 16 680 5 800 17 790 6 940 18 750 7 1100 19 960 15 8 260 20 80 9 900 21 1130 10 660 22 920 11 720 23 950 12 870 24 1010 20
Esimerkki 3
Tekijä-VIII:SQ:n puhdistus ja biokemiallinen karakterisointi « · ·’··' ’· Vahvistetun CHO-DG44 -solulinjan 208:22 tuottaman 25 tekijä-VIII :SQ.-n biokemiallisia ominaispiirteitä tutkit- • · • *·· tiin. Kasvualustasta saatua tekijä-VIII -materiaalia puh- : *.: distettiin osittain ennen tutkimusta. Tähän kuului immu- • · :*·.· noaf f initeettikromatograf iavaihe, jossa käytettiin mat- • « riisiä, joka sisälsi tekijä-VIII -vastaisia monoklonaali-30 siä vasta-aineita, ja sitä seurasi ioninvaihtokromatogra-#...e f iavaihe. Saadun puhdistetun tekijä-VIII -materiaalin spe- sifinen aktiivisuus oli 3 000 - 4 000 IU/A^, ja suhde te- • · · * kijä-VIII -aktiivisuus/tekijä-VIII -antigeeni oli lähellä yhtä (aktiivisuus mitattiin Coatest-määrityksellä (Kabi) , ·:··: 35 ja antigeeni määritettiin ELISA-määrityksellä käyttäen 80 « · • · · • «t • · • · 19 104260 kDa ketjua vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita) . Puhdistetulla tekijä-VIII:SQ -materiaalilla suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja Western-blot -analyysi. SDS-PAGE suoritettiin Laemmlin 5 mukaan, Nature 227 (1970) 680 - 685. Western-blot -analyysissä käytettiin kaniinin polyklonaalisia anti-ihmisente-kijä-VIII -vasta-aineita, ja analyysi suoritettiin oleellisesti kuten ovat kuvanneet Towbin, H., et ai.. Proc.-Natl.Acad.Sci. USA 76 (1979) 4350 - 4354. Saadut tulokset 10 esitetään kuviossa 4, vyöhyke 1: plasmatekijä-VIII, joka sisältää 80 kDa:n kevyen ketjun ja raskaita ketjuja, joiden koot ovat 200 kDa:sta 90 kDa:hän. Vyöhykkeet 2 ja 3: yhdistelmä-DNA-tekijä-VIII:SQ, joka sisältää 80 kDarn ketjun ja 90 kDa:n ketjun. Materiaalit olivat peräisin kah-15 desta eri erästä tekijä-VIII:SQ:ta, jotka oli puhdistettu kuten edellä kuvattiin. Analyysi täten osoitti, että tekijä-VIII :SQ -materiaalissa esiintyi kaksi pääasiallista nauhaa; yksi 90 kDa:n kohdalla ja yksi dublettinauha 80 kDa:n kohdalla. Nämä kaksi nauhaa todettiin samassa ase-20 massa geelissä kuin 90 kDa:n ja 80 kDa:n peptidit, jotka edustavat pienintä biologisesti aktiivista kompleksia plasmatekijä-VIII:sta. Pieni määrä 170 kDa:n nauhaa (< 5 % kokonaismateriaalista) todettiin myös tekijä-VIII:SQ -ma-
• · I
··: : teriaalista, ja se edusti oletettavasti ei-pilkottua 25 translaation primaarituotetta. Edelleen N-pään sekvenssi- • · • *·· määritys käyttäen tekijä-VIII :SQ -proteiinin automati- soitua Edman-pilkkomista osoitti, että 90 kDa:n ja 80 ·*·.· kDa:n ketjujen N-päät ovat identtiset plasmasta saadun 90 • · kDa + 80 kDa -tekijä-VIII:n vastaaviin nähden. Tämä tulos 30 osoitti siten, että primaarituotteen proteolyyttinen pro-sessointi in vivo kahdeksi polypeptidiketjuksi oli ollut • ♦ · tehokas.
• * · * Tekijä-VIII :SQ voitiin aktivoida ihmisentrombiinil- : : la annoksesta riippuvaisella tavalla. Sitten seurasi inak- ·;··: 35 tivaatio. Kuviossa 5 esitetään aktiivisuusmuutoksista • · mmm • · · m · m m m 104260 20 saatu kuvaaja, kun lisättiin 0,1 U:ta trombiinia kohden 1 IU puhdistettua tekijä-VIII:SQ:ta. Yksivaiheista hyydytysmenetelmää (Mikaelsson, M., et. ai. . Blood 62 (1983) 1006 - 1015) käytettiin reaktioseosnäytteiden vä- 5 littömäksi määrittämiseksi. 15-kertainen aktivaatio saatiin yhdessä minuutissa, mitä sitten seurasi inaktivaatio. Natriumdodekyylisulfaattia lisättiin pitoisuus 0,02 g/ml reaktion pysäyttämiseksi näytteissä analyysiä varten. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja Western-blot-ana-10 lyysi ihmisentekijä-VIII:n vastaisilla kaniinin poly-klonaalisilla vasta-aineilla suoritettiin näytteillä, jotka oli otettu aikavälein reaktion aikana (kuvio 6) . Elektroforeesi ja blot-immuunimääritys suoritettiin kuten kuvataan kuvion 4 yhteydessä.
15 Saaduista tuloksista ilmeni tekijä-VIII -peptidien molekyylimuutos, joka oli identtinen plasmantekijä-VIII:n vastaavaan inkuboitaessa trombiinilla. Täten trombiini pilkkoi 90 kDa:n peptidin ja saatiin 50 kDa:n ja 40 kDa:n peptidit. 80 kDa: n peptidi tuli pilkotuksi, jolloin muo-20 dostui 70 kDa:n peptidi. Heikko nauha, joka nähdään 170 kDa:n kohdalla tekijä-VIII:SQ -näytteessä, hävisi trombiinilla suoritetun inkuboinnin ensimmäisen minuutin aikana, ja muodostui ilmeisesti peptidejä, jotka olivat • · « M : identtisiä 90 kDa - 80 kDa -kompleksista muodostuneisiin 25 nähden. Tutkimukset trombiinilla osoittivat, että tekijä- • · • *·· VIII:SQ käyttäytyy kuten plasmantekijä-VIII vuorovaikutuk- sessa tämän entsyymin kanssa. Tämä piirre katsotaan oleel- :*·.· liseksi biologiselle aktiivisuudelle in vivo.
• ·
Tekijä-VIII :SQ:n vuorovaikutusta ihmisen von Wille-30 brand -tekijän kanssa tutkittiin käyttäen kokoekskluusio-kromatografiaa Sepharose CL-6B -geelissä. 10 IU tekijäni. VIII:SQ:ta inkuboitiin 30 U:lla puhdistettua ihmisen von • · · ’*1 * Willebrand -tekijää 37 °C:ssa 20 minuutin ajan. Sitten in- : : kubointiseos laitettiin Sepharose CL-6B -geelillä pakat-
·:··· 35 tuun kolonniin. Kaikki materiaali, jolla oli tekijä-VIII
• · • · · • · · • · « • · 21 104260 -aktiivisuutta, eluoitui tyhjätilavuudessa von Willebrand -tekijän kanssa. Kun tekijä-VIII:SQ:ta ilman lisättyä von Willebrand -tekijää laitettiin kolonniin, materiaali, jolla oli tekijä-VIII -aktiivisuutta, eluoitui vain sisäfrak-5 tioissa kohdassa, jossa myös plasmantekijä-VIII:n 90 kDa -80 kDa -muoto eluoitui. Tämä tulos osoittaa, että tekijä-VIII :SQ:11a on kyky sitoutua von Willebrand -tekijään, joka ominaisuus on välttämätön hyvälle pysyvyydelle in vivo (Brinkhous, K.M., gt ai.. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82 10 (1985) 8752 - 8756).
Esillä olevan keksinnön mukainen tekijä-VIII:SQ -DNA on talletettu 13. joulukuuta 1989 talletuslaitokseen die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu-ren, jossa se on saanut talletusnumeron DSM 5693.
15 « « · • · · « « · · • · · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · « · · • M • · • · * • · · • · · • ·· • · · • · · ··· • · « • · · • · · • · • · • · « I » • · * I * « · · • · « ·

Claims (4)

22 104260
1. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisen- 5 tekijä-VIII -johdannaista, joka koostuu oleellisesti kahdesta polypeptidiketjusta, joiden molekyylipainot ovat 90 kDa ja vastaavasti 80 kDa, jolloin DNA-sekvenssi kykenee sopivassa isäntäsolussa ilmentämään mainitun johdannaisen ja erittämään sitä, ja käsittää ensimmäisen DNA-segmentin, 10 joka koodittaa ihmisentekijä-VIII:n 90 kDa:n ketjun, ja toisen DNA-segmentin, joka koodittaa ihmisentekijä-VIII:n 80 kDa:n ketjun, jolloin segmenttejä yhdistää toisiinsa liittäjä-DNA-segmentti, joka koodittaa 12 aminohappotähdettä, jotka ovat peräisin C-päästä, ja 2 aminohappotäh-15 dettä, jotka ovat peräisin N-päästä, ihmisentekijä-VIII:n B-alueelta.
2. Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori, tunnet -t u siitä, että se sisältää transkriptioyksikön, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin, pro- 20 moottorin ja polyadenylaatiosignaalisekvenssin.
3. Eläinalkuperää oleva isäntäsolu, tunnet -t u siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 2 : mukaisella yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorilla. lii «
4. Menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä- • « · · :·. 25 DNA-ihmisentekijä-VIII -johdannaisen valmistamiseksi, jon- • ·· . ka ilmentää patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, • ·· II tunnettu siitä, että eläinsolulinjaa, joka on • · · **#/ transformoitu patenttivaatimuksen 2 mukaisella yhdistelmä- • · · DNA-ilmentämisvektorilla, viljellään kasvualustassa, joka 30 mahdollistaa ihmisentekijä-VIII -johdannaisen ilmentämisen ··· V : ja erityksen, joka johdannainen koostuu kahdesta polypep- : tidistä, joiden molekyylipainot ovat 90 kDa ja vastaavasti ..... 80 kDa ja joita yhdistää toisiinsa metalli-ionisilta, ja « · '**. mainittu johdannainen otetaan talteen kasvualustasta. • · « • « • · « • I « · • 9 ^ 104260
FI922745A 1989-12-15 1992-06-12 Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekij-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-johdannaisen valmistamiseksi FI104260B1 (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8904239 1989-12-15
SE8904239A SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1989-12-15 Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
PCT/SE1990/000809 WO1991009122A1 (en) 1989-12-15 1990-12-06 A recombinant human factor viii derivative
SE9000809 1990-12-06

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI922745A0 FI922745A0 (fi) 1992-06-12
FI104260B true FI104260B (fi) 1999-12-15
FI104260B1 FI104260B1 (fi) 1999-12-15

Family

ID=20377785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922745A FI104260B1 (fi) 1989-12-15 1992-06-12 Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekij-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-johdannaisen valmistamiseksi

Country Status (21)

Country Link
EP (3) EP1293513A3 (fi)
JP (1) JP2644084B2 (fi)
AT (2) ATE232213T1 (fi)
AU (1) AU645539B2 (fi)
BR (1) BR9007921A (fi)
CA (1) CA2071875C (fi)
DE (3) DE19975066I2 (fi)
DK (2) DK0786474T3 (fi)
ES (2) ES2189897T3 (fi)
FI (1) FI104260B1 (fi)
HK (2) HK1009290A1 (fi)
HU (1) HU211504A9 (fi)
IE (1) IE904510A1 (fi)
LU (1) LU90457I2 (fi)
NL (1) NL990035I2 (fi)
NO (1) NO309041B1 (fi)
NZ (1) NZ236276A (fi)
PT (1) PT96208B (fi)
SE (1) SE465222C5 (fi)
SG (1) SG66753A1 (fi)
WO (1) WO1991009122A1 (fi)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6060447A (en) * 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
IL86693A (en) 1987-06-12 1994-06-24 Stichting Centraal Lab Proteins that have the activity IIIV of the blood, a process for their preparation that uses cells are produced through genetic engineering and pharmaceutical preparations that contain them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
SE468050C (sv) * 1991-03-15 1998-04-27 Pharmacia & Upjohn Ab Rekombinant derivat av human faktor VIII
US5663060A (en) * 1992-04-07 1997-09-02 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5744446A (en) * 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5364771A (en) * 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US5888974A (en) * 1992-04-07 1999-03-30 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
DK53792D0 (da) * 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
WO1994007510A1 (en) * 1992-10-02 1994-04-14 Kabi Pharmacia Ab Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
SE9300509D0 (sv) * 1993-02-16 1993-02-16 Kabi Pharmacia Ab Peg treatment
SE9301581D0 (sv) * 1993-05-07 1993-05-07 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
SE504074C2 (sv) * 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9303601D0 (sv) * 1993-11-01 1993-11-01 Kabi Pharmacia Ab Improved cell cultivation method and medium
US6288030B1 (en) 1993-12-22 2001-09-11 Amgen Inc. Stem cell factor formulations and methods
IL113010A0 (en) * 1994-03-31 1995-10-31 Pharmacia Ab Pharmaceutical formulation comprising factor VIII or factor ix with an activity of at least 200 IU/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
SE9403915D0 (sv) * 1994-11-14 1994-11-14 Annelie Almstedt Process A
SE503424C2 (sv) * 1994-11-14 1996-06-10 Pharmacia Ab Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
SE9501189D0 (sv) * 1995-03-31 1995-03-31 Pharmacia Ab Protein formulation
AU6455896A (en) * 1995-07-11 1997-02-10 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
EP1318198B1 (en) * 1996-05-14 2006-03-22 Biovitrum Ab Process for producing a recombinant polypeptide involving the addition of an inhibitor of chymotrypsins to the cell culture medium
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
JP2002517180A (ja) * 1997-12-05 2002-06-18 ジ・イミユーン・リスポンス・コーポレーシヨン 増大された発現を示す新規ベクターおよび遺伝子
US7820796B2 (en) 1998-03-12 2010-10-26 Genetics Institute, Llc. Methods for producing Factor VIII proteins
US6797505B2 (en) * 1998-05-27 2004-09-28 Cell Genesys, Inc. Recombinant AAV vectors for gene therapy of hemophilia A
US6200560B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
JP5149470B2 (ja) 1999-02-22 2013-02-20 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 新規のアルブミンを含有していない第ｖｉｉｉ因子処方物
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
MXPA02009221A (es) * 2000-03-22 2005-07-25 Octagene Gmbh Produccion de factores de coagulacion sanguineo recombinantes en lineas celular humanas.
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
GB0207092D0 (en) 2002-03-26 2002-05-08 Sod Conseils Rech Applic Stable pharmaceutical composition containing factor VIII
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
LT1596887T (lt) 2003-02-26 2022-04-25 Nektar Therapeutics Polimero-faktoriaus viii fragmento konjugatai
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
DK2586456T3 (en) 2004-10-29 2016-03-21 Ratiopharm Gmbh Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
MX350293B (es) 2004-11-12 2017-09-04 Bayer Healthcare Llc Modificacion dirigida al sitio del factor viii.
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
US8999678B2 (en) 2005-04-07 2015-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1739179A1 (en) 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
PL3121266T3 (pl) 2006-01-04 2020-07-13 Baxalta Incorporated Wolne od oligopeptydów pożywki do hodowli komórkowej
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
ES2521490T3 (es) 2006-12-15 2014-11-12 Baxter International Inc. Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada.
CN101646779B (zh) 2007-02-23 2014-12-03 Sk化学株式会社 制备和纯化因子viii及其衍生物的方法
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
US9359629B2 (en) 2007-12-27 2016-06-07 Baxalta Incorporated Cell culture processes
MX2010009154A (es) 2008-02-27 2010-09-09 Novo Nordisk As Moleculas conjugadas del factor viii.
LT2393828T (lt) 2009-02-03 2017-01-25 Amunix Operating Inc. Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos
ES2966234T3 (es) 2009-06-09 2024-04-18 Prolong Pharmaceuticals Llc Composiciones de hemoglobina
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
KR101832937B1 (ko) 2009-07-27 2018-02-28 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
ES2590679T3 (es) 2009-07-27 2016-11-23 Lipoxen Technologies Limited Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre
EP2470559B1 (en) 2009-08-24 2017-03-22 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
GB0915481D0 (en) 2009-09-04 2009-10-07 Arecor Ltd Stable manufacture of factor V111
MX336830B (es) 2009-12-06 2016-02-03 Biogen Hemophilia Inc Polipeptidos hibridos y quimericos del factor viii-fc, y metodos de uso de los mismos.
WO2011095604A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh Half-life prolongation of proteins
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
CA2793633A1 (en) 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2012006635A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2616486B1 (en) 2010-09-15 2019-01-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
EA032056B1 (ru) 2010-12-22 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтид Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
HUE043921T2 (hu) 2011-02-17 2019-09-30 Univ Pennsylvania Készítmények és módszerek szövetspecifitás módosítására és AAV9-mediált géntranszfer javítására
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
EA029045B1 (ru) 2011-07-08 2018-02-28 Байоджен Хемофилия Инк. Химерные и гибридные полипептиды фактора viii и способы их применения
WO2013016454A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Biogen Idec Hemophilia Inc. Assays to monitor bleeding disorders
AU2012324020A1 (en) 2011-12-30 2013-07-18 Grifols, S.A. Method for purifying Factor VIII
LT2802668T (lt) 2012-01-12 2018-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Imunogeninio atsako prieš faktorių viii individuose, kuriems skiriama faktoriaus viii terapija, sumažinimas
LT2804623T (lt) 2012-01-12 2019-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
WO2013123457A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
CN104519897A (zh) 2012-06-08 2015-04-15 比奥根艾迪克Ma公司 促凝血化合物
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
ES2770501T3 (es) 2012-07-11 2020-07-01 Bioverativ Therapeutics Inc Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos
RU2500818C1 (ru) * 2012-07-19 2013-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
US20150266944A1 (en) 2012-10-30 2015-09-24 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
HRP20231183T1 (hr) 2013-02-15 2024-01-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani gen faktora viii
TWI683666B (zh) 2013-03-15 2020-02-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
JP6330026B2 (ja) 2013-03-15 2018-05-23 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子ポリペプチド製剤
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
EP4368194A3 (en) 2013-06-28 2024-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
EP3875106A1 (en) 2013-08-08 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
US20160311885A1 (en) 2013-08-14 2016-10-27 Biogen Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
WO2015048330A2 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Biogen Idec Ma Inc. On-column viral inactivation methods
EP3060242A1 (en) 2013-10-22 2016-08-31 DBV Technologies Method of treating haemophilia by inducing tolerance to blood factors
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015085276A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Biogen Idec Ma Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
EP3757116A1 (en) 2013-12-09 2020-12-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genome engineering
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
AU2015214245B2 (en) 2014-02-04 2020-09-10 Biogen Ma Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
WO2016012595A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Csl Behring Gmbh Improved factor viii preparations suitable for therapeutic use and processes to obtain these
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
WO2016168728A2 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
UA126016C2 (uk) 2015-08-03 2022-08-03 Біовератів Терапеутікс Інк. Злитий білок фактора іх
EP3411478B1 (en) 2016-02-01 2022-06-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii genes
US20200085915A1 (en) 2016-12-02 2020-03-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of inducing immune tolerance to clotting factors
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
KR20200035130A (ko) 2017-08-09 2020-04-01 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 이의 용도
WO2019067766A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Sigilon Therapeutics, Inc. METHODS, COMPOSITIONS AND IMPLANTABLE ELEMENTS COMPRISING ACTIVE CELLS
CA3090136A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor viii
WO2019195056A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising stem cells
TW202014181A (zh) 2018-04-04 2020-04-16 美商希吉隆醫療公司 可植入顆粒及相關方法
TW202015723A (zh) 2018-05-18 2020-05-01 美商百歐維拉提夫治療公司 治療ａ型血友病的方法
MX2021001599A (es) 2018-08-09 2021-07-02 Bioverativ Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico y sus usos para la terapia genica no viral.
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
TW202115127A (zh) 2019-06-19 2021-04-16 美商百歐維拉提夫治療公司 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物
JP2023537070A (ja) 2020-08-07 2023-08-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 小胞を標的とするタンパク質及びその使用
JP2024532262A (ja) 2021-08-23 2024-09-05 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 最適化第ｖｉｉｉ因子遺伝子
WO2023056331A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
WO2024081310A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR910006424B1 (ko) * 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
JP2525022B2 (ja) * 1986-01-03 1996-08-14 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド ▲ＶＩＩＩ▼：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法
EP0251843A1 (fr) * 1986-06-06 1988-01-07 Transgene S.A. Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères
JPH0637425B2 (ja) * 1986-11-11 1994-05-18 株式会社クラレ 高沸点（メタ）アクリル酸エステルの製造方法
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
JP2586092B2 (ja) * 1988-04-06 1997-02-26 三菱瓦斯化学株式会社 多官能（メタ）アクリル酸エステルの製造法
ES2112255T3 (es) * 1989-11-17 1998-04-01 Novo Nordisk As Complejos proteicos que tienen actividad del factor viii:c y su produccion.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2119769T5 (es) 2006-04-16
EP1293513A3 (en) 2003-04-02
DK0506757T3 (da) 1999-05-25
AU7039391A (en) 1991-07-18
WO1991009122A1 (en) 1991-06-27
CA2071875C (en) 2006-08-08
NZ236276A (en) 1993-03-26
FI922745A0 (fi) 1992-06-12
JP2644084B2 (ja) 1997-08-25
NO922325D0 (no) 1992-06-12
HU211504A9 (en) 1995-11-28
EP0506757A1 (en) 1992-10-07
DE69032600T3 (de) 2006-07-20
NO309041B1 (no) 2000-12-04
AU645539B2 (en) 1994-01-20
DE19975066I2 (de) 2005-07-07
LU90457I2 (fr) 2001-04-13
ES2189897T3 (es) 2003-07-16
DE69032600D1 (de) 1998-10-01
EP0506757B2 (en) 2005-10-26
NL990035I1 (nl) 1999-12-01
CA2071875A1 (en) 1991-06-16
DK0506757T4 (da) 2006-02-20
NL990035I2 (nl) 2000-01-03
EP0506757B1 (en) 1998-08-26
NO922325L (no) 1992-08-11
EP0786474A1 (en) 1997-07-30
PT96208A (pt) 1991-09-30
SE8904239D0 (sv) 1989-12-15
HK1019449A1 (en) 2000-02-11
IE904510A1 (en) 1991-07-17
ES2119769T3 (es) 1998-10-16
SE465222B (sv) 1991-08-12
JPH05502161A (ja) 1993-04-22
DK0786474T3 (da) 2003-03-03
ATE232213T1 (de) 2003-02-15
DE69034040D1 (de) 2003-03-13
FI104260B1 (fi) 1999-12-15
ATE170219T1 (de) 1998-09-15
SE465222C5 (sv) 1998-02-10
EP0786474B1 (en) 2003-02-05
HK1009290A1 (en) 1999-05-28
SG66753A1 (en) 2001-12-19
SE8904239L (sv) 1991-06-16
BR9007921A (pt) 1992-11-10
EP1293513A2 (en) 2003-03-19
DE69034040T2 (de) 2003-11-20
PT96208B (pt) 1998-05-29
DE69032600T2 (de) 1999-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104260B (fi) Biologisesti aktiivista yhdistelmä-DNA-ihmisentekij-VIII-johdannaista koodittava DNA, tämän sisältävä yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori ja isäntäsolu sekä menetelmä biologisesti aktiivisen yhdistelmä-DNA-ihmisentekijä-VIII-johdannaisen valmistamiseksi
US5661008A (en) Recombinant human factor VIII derivatives
EP0533862B1 (en) Recombinant human factor viii derivatives
US6228620B1 (en) Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
CA1341229C (en) Procoagulant proteins derived from factor viii: c
US6060447A (en) Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
CA2068728A1 (en) Protein complexes having factor viii:c activity and production thereof
JP2872255B2 (ja) ファクター▲ｖｉｉｉ▼の高収量生産法
US5910481A (en) Hybrid proteins with modified activity
EP1673391B1 (en) MODIFIED cDNA FOR HIGH EXPRESSION LEVELS OF FACTOR VIII AND ITS DERIVATIVES
EP1502921A1 (en) Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: PHARMACIA & UPJOHN AKTIEBOLAG

HC Name/ company changed in application

Owner name: PHARMACIA & UPJOHN AKTIEBOLAG