JP2872255B2 - ファクター▲ｖｉｉｉ▼の高収量生産法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明はファクターVIIIの高収量生産法に関する。更
に具体的には、本発明はvon willebrandファクター存在
下でファクターVIII産生細胞を増殖させファクターVIII
の収量を高める方法に関する。

発明の背景 本出願では下記文献の提示の専門用語を用いる:V.J.M
arder et al."Standard Nomenclature for FactorVIII
and von willebrand Factor:A. Recommendation By the International Committee on T
hrombosis and Haemostasis,"Thrombosis and Haemosta
sis,54,pp.871−72（1985）。“ファクターVIII"とは凝
血前駆体補助因子（procoagulant cofactor）の呼称，
“von willebrandファクター”とは２分子複合体の接着
因子の呼称で、以後“ファクターVIII/vWf"と称する。

凝血因子：ファクターVIIIは接着因子であるvon will
ebrandファクター（“vWf"）と非共有結合体を作って血
漿内を循環している［L.W.Hoyer,Blood，58,pp.1−13
（1981）］。

ファクターVIII/vWfの凝血前駆体成分であるファクタ
ーVIIIは当初、単一鎖高分子前駆体として合成される
が、その後開裂して“成熟”ファクターVIIIを構成する
フラグメントを生じる［一般的な説明は、W.J.Willams
etal.,Hematology,pp.1085−90,McGraw−Hill,New York
（1972）］。成熟ファクターVIIIはカルシウムイオンを
介して結合した２本の分子鎖すなわち:740個のアミノ酸
からなるアミノ末端長鎖と684個のアミノ酸からなるカ
ルボキシル末端短鎖とから構成されている。ファクター
VIIIの１次翻訳生成物は単一鎖で、そこでは成熟ファク
ターVIIIの長鎖908個のアミノ酸の“成熟ポリペプチ
ド”を介して短鎖と隔てられている。この“成熟ポリペ
プチド”の切除は、Arg 1648−Glu 1649のペプチド結合
のところでの１次翻訳生成物の蛋白分解的開裂によって
開始する。最初切れ目が生じると、蛋白分解的開裂が次
々に起り、生成したばかりの長鎖はカルボキシル末端の
ところから短くなっていき、結果として740個のアミノ
酸からなる完成した長鎖となり、これと684個のアミノ
酸からなる短鎖と合わせて成熟ファクターVIIIが構成さ
れる［L.−0.Andesson et al."Isolation and Characte
rization of Human FactorVIII:Molecular Forms in Co
mmercial FactorVIII Concentrate,Cryoprecipitate,an
d Plasma,PNAS(USA),83,pp.2979−83（1986）参照］こ
の複合体はその後トロンビンによりArg 1689−Ser 1690
結合のところで開裂され活性化される［D.Eaton et a
l.,Biochemistry,25,pp.505−12（1986）］。

von willebrandファクター（“vWf"）は大型の多量体
血漿蛋白で少なくとも２個のサブユニットからなり、こ
れらがジサルファイド結合でつながって一体となってい
る。vWfは止血過程で大切な役割を持った蛋白で正常な
血小板凝集と接着性に関係している。すなわち、血管が
傷付くとこのvWfが血小板を基底膜にくっつける仲介役
をし、比較的大型ポリマーであることと相俟って血管損
傷部位での血小板凝集機能を発揮するわけである［T.S.
Zimmerman et al.,"Factor VIII/von willebrand Facto
r,"Progress in Hematology,13,pp/279−309（1983）,
E.B.Brown,editor］。出血疾患であるvon Willebrand病
タイプIIAではこのvWf蛋白が欠落している［Z.M.Rugger
i＆T.S.Zimmerman,"Variant von willebrand's Diseas
e,J.Clin.Invest.,65,pp.1318−25（1980）］。

成熟vWf蛋白は数段階を経て合成される。先ず、2813
個のアミノ酸からなる24万〜26万の分子量のprepro−vW
fサブユニットとして血管の内皮細胞と巨核細胞で合成
される［E.A.Jaffe et al.,"Synthesis of Antihemophi
lic Factor Antigen By Cultured Human Endothelial C
ells",J.Clin.Invest.,52,pp.2757−64（1973）;R.Nach
man et al.,"Synthesis of FactorVIII Antigen By Cul
tured Guinea Pig Megakaryo−cytes,J.Clin,Invest.,6
0,pp.914−21（1977）;C.L.Verweij et al.,"Full−len
gth von Willebrand Factor（vWf）c DNAencodes a Hig
hly Repetitive Protein Considerably Larger Than th
e Mature vWf Subunit,",EMBO J.,5,pp.1939−47（198
6）］。炭水化物付加プロセッシングを経たあと、サブ
ユニット間にジサルファイド結合が生じかつ前駆体が開
裂して成熟二量体が生成する。内皮細胞内にある通称we
ibel−Palade体と呼ばれる特殊機能の分泌小胞に最大50
個のサブユニットからなる多量体が集まって調節ルート
を経て分泌される［L.A.Sporn et al.,"Inducible Secr
etion of Large,Biologically Patent von Willebrand
Factor Multimers",Cell,46,pp.185−90（1986）］。内
皮細胞からのvWfの放出はトロンビンの作用によって誘
導され、この結果、weibel−Palade体は消滅するに至
る。

ファクターVIII/vWf複合体が形成される部位（群）と
形成の機構は未だよくわかっていない。一つの共通した
見方として、ファクターvWfは肝細胞によって合成後に
分泌されるとの説がある［M.G.Zelechowska et al.,"Ul
trastructural Localization of Factor VIII Procoagu
lant Antigen in Human Liver Hepatocytes",Matuer,31
7,pp.729−30（1985）;K.L.Wion et al.,"Distribution
of FactorVIII mRNA and Antigen in Human Liver and
Other Tissues",Nature,317,pp.726−28（1985）］。
この考えによると、分泌されたファクターVIIIは隣接す
る類洞内皮細胞によって一旦取り込まれ［H.V.Stel et
al.,"Detection of Factor VIII/Coagulant Antigen in
Human Liver Tissue",Natuer,303,pp.530−32（198
2）］。ここで集まって合成されたばかりのvWfと結び付
いて複合体となりしかる後に吐き出されることになる。
今一つの考え方として、複合体が血漿中で形成される可
能性もある。一度ファクターVIIIがvWfと結び付いてし
まうと、しかる後、アルギニン1689のところで成熟ファ
クターVIIIの短鎖がトロンビンによる開裂作用を受ける
ことによってvWfのなくなった状態でファクターVIIIが
浮き上がり近傍の血小板表面に附着してからファクター
IXaおよびファクターＸと三元複合体を形成するまで９
〜10時間の半減期で以て血漿中を循環する［K.Sewerin
＆L.−O.Andersson,"Binding of Native and Thrombin
Activated FactorVIII to Platelets",Thrombosis Rese
arch,31,pp.695−706（1983）;D.Eaton et al.,"Proteo
lytic Processing of Human FactorVIII,Correlation o
f Specific Cleavages by Thrombin,FactorXa,and Acti
vated Protein C with Activation and Inactivation o
f Factor VIII Coagulant Activity,"Biochemistry,25,
pp.505−12（1986）］。

血友病Ａは伴性出血性疾患の一つでファクターVIIIの
量が不測したりこれの生物学的活性が不充分なことが原
因で起る病気である。急性出血の血友病患者の治療では
正常血清から従来方式によって精製したファクターVIII
の投与が行なわれる。精製のためのいろいろな方法がこ
れまで報告されており、文献に載っている［次を参照:Z
immerman et al.,Unites States Patent 4,361,509;Sau
ndrey ey al.,United States Patent 4,578,218;E.G.D.
Tuddenham et al.,"The Properties of Factor VIII Co
agulant Activity Prepared by Immunoadsorbent Chrom
atoguraphy,Journal of Laboratory Clinical Medicin
e,93,pp.40−53（1979）;D.E.G.Austen,"The Chromatog
raphic Separation of Facttor VIII on Aminohexyl Se
pharose,"British Journal of Hematology,43,pp.669−
74（1979）;M.Weinstein et al.,"Analysis of factor
VIII Coaguant Antigen in Normal,Thrombintreated,an
d Hemophilic Plasma",PNAS(USA),78,pp.5137−41（198
1）;P.J.Fay et al.,"Purification and Characterizat
ion of A Highly Purified Human FactorVIII Consitin
g of A Single Type of Polypeptide Chaion,"PNAS(US
A),79,pp.7200−04（1982）;C.A.Fulcher＆T.S.Zimmerm
an,"Characterization of The Human Factor VIII Proc
oagulant Protein With A Heterologous Precipitating
Antibody",PNAS(USA),79,pp.1648−52（1982）;F.Rotb
lat et al.,Thromb.Heamostasis,50,p.108（1983）;C.
A.Fulcher et al.,Blood,61,pp.807−11（1983］。

ファクターVIIIが血友病の治療のかなめだということ
でこれの大量生産のための数多くの研究が、例えば組み
換えDNA技術によってこれまで行なわれている［例えば
次の文献参照;Genetics Institute,PCT Application Wo
85/01961;Genentech European Patent Application 16
0,457;Chiron European Patent Application 150,735;
J.J,Toole et al.,"Molecular Cloning of a cDNA Enco
ding Human Antihaemophilic Factor"Natuer,312,pp.34
2−47（1984）;and W.I.Wood et al.,Nature,312,pp.33
0−37（1984）］。だが、組み換えファクターVIIIを満
足のゆくほどの高収率で生産するのは難しいため、これ
の高収量生産方法の確立が継続課題となっている。

発明の要旨 本発明は、ファクターVIIIの高収量生産方の提供によ
り上記問題を解決しようとするものである。更に具体的
に言えば、本発明はヒトvWf存在下でファクターVIII産
生細胞を増殖させることによりファクターVIIIの収量を
向上させる方法に関する。本方法では、５〜30μｇのvW
fが培地のなかに存在するが、該培地vWfを補充するか若
しくはvWfをコード化するDNA配列で組換えファクターVI
II産生細胞を形質転換することによりvWfを補充する。
本発明によれば、この方法は天然，組換えいずれのファ
クターVIIIの収量向上にも使える。

図面の簡単な説明 図１は、10μg/mlのvWfを含んだ培養液を用いてクロ
ーンＫについて何回かの誘発実験を行った結果と、vWf
の存在しない培養液を用いて同じ実験を行って得られた
結果を比較したものである。

図２は、クローンＫが誘発されてヒトvWfを0,5,10,2
0,30μg/mlの各水準含んだ培養液中にファクターVIIIが
分泌されることにより蓄積した該ファクターVIIIの量を
示す。

図３は、テストした別の２種類のクローン;Aat2.10と
Aat2.27でのファクターVIIIの収量を示したものであ
る。

図４は、プラスミドRE.neo描いたものでこのなかに
（活性化（modified））ファクターVIII遺伝子が存在し
ていて、アデノウイルス−２主要後期プロモーター（ad
enovirus−2 major late promotor）の転写調節作用を
受けている。

発明の詳細な説明 本発明の内容がさらによくわかるようにするため、以
下詳しく説明する。

説明のなかで用いている用語とそれらの詳細内容乃至
背景を先ず述べておく： ファクターVIII…分子量265,000のポリペプチドで、
成熟化して活性化すると血液凝固カスケードに際してフ
ァクターＸのファクターIXaを依存性成熟化のコファク
ターの機能を有する。本出願でのファクターVIIIには、
ファクターVIII:Cの名称でも知られている糖蛋白質，フ
ァクターVIII凝固前駆体活性蛋白質，ファクターVIII凝
固活性蛋白質を含んでいる［W.j.Williams et al.,Hema
tology pp.1056,1074,1081］。

その上また本出願では、ファクターVIIIの成熟化ポリ
ペプチドの主要部分の欠落している点を特徴とするポリ
ペプチドも“ファクターVIII"に含める。例えば、成熟
化ポリペプチド全体が欠落したような場合、ファクター
VIIIのアミノ末端成熟長鎖とカルボキシル末端成熟短鎖
からなりかつ両者が連がって１本の鎖になっているかま
たはカルシウムや他の金属イオンを介して結び付いてい
る蛋白質をも“ファクターVIII"に含める。

そのほか、ｆ−Met−ファクターVIIIのようなアミノ
末端メチオニンや、ファクターVIIIの生物学的活性を本
質的挾い維持している限り、その他アミノ酸が欠落，置
換の各点を特徴とする蛋白質を含める。個人間でありが
ちな自然の対立性変種のポリペプチドを含む。更には翻
訳後の糖鎖付加の程度，部位が産生宿主または組織の細
胞環境の如何で異なる可能性のあるファクターVIIIポリ
ペプチド類も全て“ファクターVIII"の範壽に含めて考
える。

von willebandファクター…血小板を血管壁に固着さ
せる働きをして血漿中でファクターVIIIのキュリヤーの
機能を有するポリペプチド。

本発明はファクターVIIIの高収量生産方法に関する。
更に具体的には、増殖するファクターVIII産生宿主また
は細胞株の培地にvWfを加えることにより培地中で、組
換え若しくは天然ファクターVIIIを高収率で生産する方
法を提供するものである。本発明の方法では、元来ファ
クターVIIIを産生する宿主細胞の場合はvWfを新鮮な培
養液に加えることができ、外部因子の誘発作用によって
ファクターVIIIを産生する宿主細胞ではこの誘発の直前
にvWfを培養液に加えることができる。それともまた、
宿主細胞のなかでvWfをファクターVIIIと同時に産生さ
せることもできる。この場合宿主細胞はvWf,ファクター
VIIIの双方をコード化するDNA配列で形質転換する。フ
ァクターVIIIの産生中は培養液1ml当り５〜30μｇのvWf
が存在していることが望ましい。更に好ましくはこのレ
ベルを10μｇとする。

後に述べる本発明の実施例では、ファクターVIIIの産
生量増大を証明する目的でアフィニティ精製ヒトvWf（a
ffinity−purified human vWf）を使用したが組換えvWf
も使える。例えば、vWf遺伝子をファクターVIIIを発現
する細胞株に導入した場合、この細胞株は（１）培養液
中にファクターVIIIとvWfを同時に分泌して複合体を形
成するかそれとも（２）小胞体若しくはGolgi体のなか
でファクターVIII/vWf複合体を形成してから開口分泌す
るかのいづれかになる［例えば:D.T.Bonthron et al.,"
Structre of prepro−von Willebrand factor and Its
Expression in Heterologous Cells,Nature,324,pp.270
−73（1986）参照］。特に好ましくは、vWfをコード化
するDNA配列で同時形質転換した細胞内で、成熟化ポリ
ペプチドの主要部分が欠失したものを含んだ組換えファ
クターVIIIを生産するのがよい。該DNA配列は発現調節
配列（expression control sequence）と機能的に結び
付いた組換えDNA分子の形になっている。

理屈に縛られたくはないが、本発明の方法によっても
たらされるファクターVIIIの高収量生産は次の２通りの
モデルのいづれかによって説明できると信じている。一
つは、ファクターVIIIが哺乳動物宿主細胞の開口分泌Go
lgi小胞からでてくると培養液中に存在するvWfがこれと
結合しこれによって細胞外蛋白分解作用からファクター
VIII分子が保護されることになる。もう一つは、vWfが
哺乳動物宿主細胞の小胞体若しくははGolgi体の或箇所
に取込まれここで新たに産生されたこのファクターVIII
と結び付き、恐らくリソゾーム蛋白分解作用からファク
ターVIIIを保護することによって系外に出て行き易い環
境が生まれる。

本発明の方法によって生産されたファクターVIIIの精
製には在来の種々の手段が使える。なかでも有用なもの
には、次の文献に記載されたような天然並びに組換えフ
ァクターVIII精製手段がある［L.−O.Andersson et a
l.,PNAS(USA),83,pp.2979−83（1986）参照］。例えば
本発明の方法によって生じた中間体としてのファクター
VIII/vWf複合体をAnderssonの方法により解離させてフ
ァクターVIIIを得ることができる。

本発明の方法によって生産されたファクターVIIIは精
製後、血友病Ａ治療用組成物乃至手段に、また制御でき
ない出血の治療に有用な種々の薬剤として役立てること
ができる。

本発明の方法によって生産されたファクターVIIIは既
知の方法で以て調合して薬剤として有用な組成物を調製
することができる。この種組成物には更に、調薬上問題
ない在来のキャリアーをも取込れるのが好ましく、また
そのほかの薬剤，キャリアー，アジュバント，賦形剤
等、例えばヒト血清アルブミンや血漿製剤を加えること
ができる。例えばRemington's Pharmaceutical Science
s（E.W.Martin）を参照されたい。こうして出来上がっ
た製剤には、止まらない出血の治療に効く活性化ファク
ターVIIIが或る量含まれているのが普通である。これら
ポリペプチド製剤または薬剤上認められているこれらの
誘導体製剤の投与方法は、ファクターVIIIについて従来
から認可されている方法ならどれでもかまわない。非経
口投与，皮下注射，静脈注射などいづれも可能である。

血友病Ａ療法に使用する本発明の組成物についてはま
た、種々の投与形態をとることができる。好ましい形態
は考えている投与方法やどういう方面の治療に適用する
かによって異なる。１回の投薬量並びに投薬速度はさま
ざまな因子によって違ってくるのが普通であり、例え
ば、急性出血患者に治療を施すのかそれとも予防的措置
として行うかによって異なる。しかし投与するファクタ
ーVIIIの量は出血をとめて上皮形成を促すだけのレベル
でなければならない［Williams,Hematology pp.1335−4
3の考察を参照のこと］。

本発明の内容を一段とよく理解できるよう実施例を以
下に記す。本実施例は単に内容説明が目的であって、こ
れにより本発明の範囲が制約されることにはならない。

実施例 この実施例では、本発明の方法で以て活性化ファクタ
ーVIIIの量産の手順を述べる。先ずはじめに、天然ファ
クターVIIIの成熟化ポリペプチドの主要部分若しくは全
てが欠失した活性化ファクターVIII分子をコード化す
る。cDNA配列を作り上げた。RE.neo構成の制限酵素地図
を図４に示すが、これを見るとREの欠失したファクター
VIIIcDNAの位置がわかる。

RE.neoを数段階で以て作り上げた。先ず最初にRE［AR
G 740−GLU 1649］［ATCC No.53517］欠失構造を下記手
順の２段階で作った。

第１段階で４個のフラグメントを連結して中間体とし
てのプラスミドを作った。これら４個のフラグメントは
次の通り。

（１）462 bpフラグメント…完全鎖長ファクターVIII遺
伝子発現プラスミドをHindIIIで以てArg 740とSer 741
のコドン間で分解し、またヌクレアーゼS1で以て５′AG
CTを取除いてからKpnＩでTyr 586とLen 587のコドン間
で特異的な開裂を起すことによって得た。

（２）合成オリゴヌクレオチド二重鎖フラグメント…
５′pGAA ATA ACT CGT ACT ACT CTT CAG TCA CTT TAT T
GA GCA TGA TGA GAA GTC AGT CTA Gp5′Glu Ile Thr Ar
g Thr Thr Leu Gln Ser Asp 1649 1657 （３）135bpフラグメント…先ず最初にSau3Aで以て完全
鎖長ファクターVIII遺伝子発現プラスミドを分解する。
これによってSer 1657とAsp 1658のコドン間並びにGlu
1794とAsp 1795のコドン間が分解し生じた411bpフラグ
メントを単離した。次いでこの411bpフラグメントをPst
Ｉで以て分解し、Ala 1702とVal 1703のコドン間を開裂
させて135bp 5′フラグメントを得た。

（４）puc18…KpnＩとPstＩで以て分解して得た。

次に前記中間体プラスミドからRE融合をコード化する
624塩基対フラグメントを単離した。これを行うため前
記４個のフラグメントの結合で生じた中間体プラスミド
をAsp718とPstＩで以て分解した。RE融合体をコード化
するこの624塩基対フラグメントで、以前産生したファ
クターVIII欠失体（いわゆるQD欠失体）についての発現
プラスミド中に対応するフラグメントを置き換えた。こ
のQD欠失体では、成熟体ポリペプチド（アミノ酸741−1
648）をコード化しているDNA配列の主要部が欠落してい
るが、該ポリペプチドのなかの約90個のアミノ酸（アミ
ノ末端側の４個のアミノ酸とカルボキシ末端側の86個の
アミノ酸）はそのまま残っている。QD欠失体を作るた
め、完全鎖長ファクターVIII遺伝子発現プラスミドの一
部をEcoRIでGln 744とAsn 745のコドン間を部分分解し
た。５′AATT懸垂部分をヌクレアーゼS1で取除いてから
のプラスミドをアンピシリン耐性遺伝子内の特異なPvu
Ｉ部位のところで分解した。また上記発現プラスミドの
別の一部をBamH1で以て部分分解しLen1562とAsp 1563の
コドン間で開裂させた。５′GATC懸垂部分にKlenowフラ
グメントを継ぎ足してから上記プラスミドをアンピリシ
リン耐性遺伝子内でPvu１で以て分解した。次いでかく
して生じた２つのフラグメント混合物を一緒にしてこれ
らをT4DNAリガーゼで以て結び付けた。こうして生成し
た融合体でGln 744とAsp 1563のコドン間にBamH1部位が
新たに形成された。

QD欠失体についての発現プラスミドを特異なAsp718部
位のところで完全分解し、子ウシの腸ホスファターゼで
以て５′GTAC懸垂体を脱リン酸化してから、このプラス
ミドをPstＩで部分分解し、しかる後RE融合体をコード
化する624bpフラグメントを上記操作で生じたフラグメ
ント混合物に結び付けた。RE融合体の発現をコード化す
るこうして生成したプラスミドをREと称する。

そこで、RE.neoの地図を図４に示しておく。動物細胞
でagptの発現を指令する転写単位をREに挿入することに
よってRE.neoを作り上げた。この転写単位はFred A.M.A
sselbergsより提供されたプラスミドpSVneo 2911から単
離した。このプラスミドpSVneo 2911は次のようにして
作られた。先ず、SV40早期部位（early vegion）全体を
含んだSV40HpaII−Bam HI制限フラグメントをpBRdのCla
ＩとBamHIの間に挿入した［F.A.M.Asselbergs et al.,"
A Recombinant Chinese Hamster Ovary Cell Line Cont
aining A 300−fpld Amplified Tetramer of the Hepat
itis B Genome Together With A Double Selection Mar
ker Expresses High Levels of Viral Protein",J.Mol.
Biol.,189,pp.401−11（1986）］。次に、Ｙ抗原をコー
ド化する比較的小さいHindIII−BamHI制限フラグメント
を、中間体としてのプラスミド（pS V81）で、pSV2neo
に由来するagptコード化する大きいHindIII−BamHI制限
フラグメントで以て、置き換えて［P.Southern and P.B
erg,J.Mol.Appl.Genet.,1,pp.327−41（1982）］、pSVn
eo2911を作った。agptの完全な転写内（プロモーターコ
ード化配列−ポリアデニル化配列）を含んだ、pSVneo 2
911に由来するEcoRI−BamHI制限フラグメントを、Kleno
w酵素で以て平滑末端とし、このKlenow酵素の作用を受
けたSalＩ部位のところで、REに結び付けた。

こうして得られたプラスミドRE.neoは２つのSV40複製
起点を含んでおり、１つはアデノウイルス−２主要後期
プロモーターに対して５′の位置で、もう１つはアミノ
グリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼ（G 418−n
eo）遺伝子の転写を調節するSV40早期プロモータをオー
バーラップしたものであった。かくして正の選択マーカ
ーをREプラスミドに導入してG418培地で増殖する安定な
細胞株を作り出した［P.Southern＆P.Berg,"Transforma
tion of Mammalian Cells to Antibiotic Resistance w
ith a Bacterial Gene under Control of the SV40 Ear
ly Region Promotor",J.Mol.Appl.Genetics.,1,pp,327
−41（1982）;A.Jimenez＆J.Davies,"Exprssion of a T
ransposable Resistance Element in Saccharomyces Ce
revisiae,Nature287,pp.869−71（1980）］。

次に、誘発作用によってファクターVIIIを合成して分
泌する細胞株を得た。この細胞株はアフリカミドリザル
のBSC1腎細胞を40℃で増殖するよう順応させたBSC40細
胞から作り出した［W.W.Brockman＆D.Nathans,pnas(US
A),71,pp.942−46（1974）］。すなわちBSC40細胞を次
の２種類のプラスミドで同時に形質転換した。１つは、
プラスミドRE.neoで、SV40複製起点，ファクターVIIIの
転写単位、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
の転写単位を含んでいる。もう１つは、10倍モル過剰の
プラスミドLTRtsA58で、温度に敏感なSV40T抗原対立遺
伝子の転写単位を含んでいる。突然変位tsA58ウイルス
は、温度に敏感なSV40の突然変異体で39℃では後代を産
生しない。tsA58突然変異体によって特異化されたＴ抗
原蛋白質は、野性型Ｔ抗原蛋白質に較べて非許容温度で
はるかに不安定である［P.Tegtmeyer et al.,Journal o
f Virology,16,pp.168−78（1975）］。

次いで、アミノグリコシド抗生物質G418（ゲネチシン
G418硫酸塩,Gibco Laboratories）中で淘汰されて生
き残った形質転換体のファクターVIII発現を調べた。SV
40複製起点に結び付いているこれら形質転換体のDNA配
列は、培地をＴ抗原発現の許容温度（33℃）に移行させ
ることによって急速に増幅する。SV40T抗原が発現する
と、SV40複製起点のところから機重にも丸まった形
（“オニオンスキン”）の複製が開始し、その結果、起
点近辺でDNA配列が増幅することになる。

目的の好ましい細胞株，クローンK,Aat2,10,Aat2.27
は、BSC40形質転換体で、誘発作用により組換えファク
ターVIIIを合成して分泌する。クローンＫ［ATCC No.CR
L 9206］は、BSC40を起こらせんRE.neoと超らせんLTAts
A58とを同時に形質転換してからG418耐性につき39.5℃
でスクリーニングして得た。また、クローンAat2.10と
同Aat2.27は、特異なAat２部位のところで線状にしたR
E.neoと、超らせんLRtsA58を同時にBSC40を形質転換
し、G418耐性につき39.5℃でスクリーニングして得た。

好ましい細胞株は、標準的なリン酸カルシウム沈澱法
により、10μｇのpL TRtsA58と1.5μｇのRE.neoで径100
mmのペトリ皿の集合状態のBSC40細胞培養体を形質転換
して作った。非許容温度（39.5℃）で薬剤のない培地で
48時間培養したのち、この細胞を当初の密度の1/8に植
え換えて、700μg/mlG418（Gibco Laboratories）の存
在下に39.5℃で培養した。培地は３日おきに新しいのと
交換した。形質転換後15日経ってからクローニングリン
グのあるクローンを単離して、24穴２枚１組の培養皿に
移植した。これら初代細胞株をG418存在下に39.5℃で増
殖させて集合状態とした。両組の培養プレートとも、抗
生物質G418を含むがフェノールレッドは含まない（pH指
示薬は色素産生ファクターVIIIの検定を阻害するため）
完全培地（complete medium）を使って集合状態の培養
液を取替えた。

次いで１個の培養プレートを33℃の培養装置に入れ、
４日後に取出してから、細胞株毎の培養上清を用い２水
準の温度でKabivitrumのCoatest ファクターVIII検定
を行った。更に詳しく調べるため33℃で最高レベルの活
性を示すクローンを選び出した。なお、39.5℃では、無
視できないほどのレベルでファクターVIIIを発現するク
ローンはなかった。

前記のクローン群で、T75フラスコ中39.5℃において
湿潤状態で５％二酸化炭素入りの培養装置中で培養細胞
を増殖させ集密化させることによりファクターVIIIを作
り出した。使用した培地は、DMEM−10％ウシ胎児血清−
4mML−グルタミン−20mMHEPES（pH7.2）−720μｇ−mlG
418であった。集合状態になった時点で、培養液を新鮮
な培養液10mlと取替えてT75フラスコを33℃に保った湿
潤状態で５％二酸化炭素入り培養装置に入れた。これに
よってファクターVIIIの合成が誘発され、培養液のなか
で何日間かに亘ってファクターVIIIの活性が累積的に高
まっていった。

細胞培養に使った新鮮な培養液に、温度水準を動かす
直前に、von Willebrandファクターを加えた。このvon
willebrandファクターの培養液での濃度範囲は５〜30μ
g/mlであった。使ったのは、血漿ファクターVIII（Kabi
vitrum AB）の精製過程で副生物として得られていた成
熟ヒトvWf（2050アミノ酸）であった。血漿ファクターV
III精製の第１段階は、固相ヤギ抗−ヒトvWf上のファク
ターVIII/vWf複合体のアフィニティークロマトグラフィ
ー手法によった［Andersson et al.,PNAS,83,pp.2979−
83（1986）］。免疫吸収物質を洗浄後、ファクターVIII
を0.6M NaClで溶出した。なおvWfは抗体に付着した状態
のままだった。続いてヒトvWfを0.1Mグリシン（pH2.2）
で溶出して、得られた溶液を中和しpH7.4としたのち凍
結した。こうしてアフィニティー精製された調製物質を
SDSポリアクリルアミドゲル上で分析した結果、主に220
Kサブユニットからなることがわかった。調製物質によ
っては220Kサブユニットのアミノ末端130K蛋白分解フラ
グメントを含んでいるものもあった。

次いでKabivitrum AB′s Coatest FactorVIII法で
以てファクターVIIIの活性を定量した。

図１を見ると、vWf存在下ではファクターVIIIの蓄積
量が多くなっていることがわかる。ヒトvWfを含まない
培養液を用いて蓄積したファクターVIIIの活性レベル
を、ヒトvWf 10μg/ml（血漿でのヒトvWf濃度は10μg/m
lである）を加えた培養液を用いた場合のそれとを比較
することによって、ヒトvWfを含んだ培養液中に分泌し
た場合に得られるファクターVIIIの活性レベルは約３倍
高いことがわかった。

ヒトvWf濃度とファクターVIII活性の間の使用量−効
果関係を図２に示す。vWfが含まれている培養液中に蓄
積するファクターVIIIの定量実験の結果、わずか５μg/
mlのヒトvWfの存在によっても、得られるファクターVII
Iの活性は３倍にも高まることが判明した。

図３でわかるように、ヒトvWfの存在によって得られ
るファクターVIIIの活性レベル増大はクローンＫだけに
特異的な現象ではない。クローンAat2.10,同Aat2.27も
同様にファクターVIIIの活性増大が見られた。

最後にヒトvWfを加えない培養液からファクターVIII
をアフィニティ精製すると、子ウシvWfも同時に精製さ
れることがわかった。これはアフィニティ精製したファ
クターVIIIの主要混入汚染物質のアミノ酸配列分析の結
果からの判断である。以上のデータからすると、10％の
ウシ胎児血清中にはファクターVIII/bvWf複合体を生成
するのに充分な濃度の子ウシvWfが存在するようであ
る。だがそれでも、ヒトvWfを培養液に加えることによ
ってファクターVIIIの生成量が増えることに変わりはな
い。この理由は、多量体の或る部分群だけしかファクタ
ーVIIIと結び付くことができず、この種の多量体の濃度
が10％ウシ胎児血清ではアフィニティ精製ヒトvWfの場
合と較べて低いためと思われる。

ところで、これまでに本発明の幾つかの実施態様を示
したが、本発明の基本構造に手を加えて、本発明の方法
並びに構成の利用価値を高める他の実施態様を示すこと
もできるのは言うまでもない。よって本発明の範囲は、
先に実施例によって示した特定の実施態様でなく後記の
請求の範囲によって定まるものと理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 パセク マーク ピー アメリカ合衆国，マサチュセッツ 02178，ベルモント，レキシントン ス トリート 177 (56)参考文献 特開 昭60−243023（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−500646（ＪＰ，Ａ) 実表 昭63−502318（ＪＰ，Ｕ) Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．60，Ｐ．390 〜404（1977)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】培養液1m1当り21μｇより多く30μｇ以下
   のVWFの存在下にファクターVIII分泌細胞を増殖するこ
   とを特徴とするファクターVIII収量増大方法。
2. 【請求項２】細胞が、ファクターVIIIの発現をコード化
   しているDNA配列を特徴とする組換えDNA分子で形質転換
   した単細胞性哺乳動物宿主細胞であり、該DNA配列が、
   該DNA分子中で発現調節配列に機能的に結び付いてい
   る、請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】細胞が、VWFをコード化するDNA配列をもう
   一つの特徴とする組換えDNA分子で形質転換されたもの
   であり、該DNA配列が該DNA分子中で発現調節配列に結び
   付いている、請求の範囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】宿主が、培養BMT10、BSC1、BSC40、COS1、
   COS7、CHOの各細胞並びにその他哺乳動物およびヒトの
   細胞から選ばれたものである、請求の範囲第２項記載の
   方法。
5. 【請求項５】細胞が、ファクターVIIIを分泌するヒト細
   胞株である、請求の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】培地1m1当り21μｇより多く30μｇ以下のV
   WFを含んだ培地中で、ファクターVIIIを分泌する宿収量
   細胞を増殖させ、ファクターVIII/VWF複合体を集めたの
   ち、この複合体からファクターVIIIを単離することを特
   徴とする、ファクターVIIIの高収量生産方法。