JPH07106156B2 - ファクタ−▲ｖｉｉｉ▼および関連生産物の製造 - Google Patents
ファクタ−▲ｖｉｉｉ▼および関連生産物の製造Info
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- JPH07106156B2 JPH07106156B2 JP59504050A JP50405084A JPH07106156B2 JP H07106156 B2 JPH07106156 B2 JP H07106156B2 JP 59504050 A JP59504050 A JP 59504050A JP 50405084 A JP50405084 A JP 50405084A JP H07106156 B2 JPH07106156 B2 JP H07106156B2
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- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は、ヒトファクターVIII:Cの細胞生産をコードす
る組換えデオキシリボ核酸（DNA）およびブタファクタ
ーVIII:CをコードするDNAの製造、ファクターVIII:Cを
コードするDNA分子を得る方法、そのようなDNAを使用す
るヒトおよびブタファクターVIII:Cの発現、それにその
ようなクローンを得るために、そしてヒトファクターVI
II:Cの発現を達成するために使用されるデオキシリボヌ
クレオチドおよびリボヌクレオチドを含む新規化合物に
関する。本発明はまた、組換えDNA技術によるヒトAHFお
よびその製造に関する。
る組換えデオキシリボ核酸（DNA）およびブタファクタ
ーVIII:CをコードするDNAの製造、ファクターVIII:Cを
コードするDNA分子を得る方法、そのようなDNAを使用す
るヒトおよびブタファクターVIII:Cの発現、それにその
ようなクローンを得るために、そしてヒトファクターVI
II:Cの発現を達成するために使用されるデオキシリボヌ
クレオチドおよびリボヌクレオチドを含む新規化合物に
関する。本発明はまた、組換えDNA技術によるヒトAHFお
よびその製造に関する。
ファクターVIII:Cは血友病Ａに欠乏または存在しない血
漿タンパクである。この病気は、男性約20,000人中１人
がかかる遺伝性出血病である。ファクターVIII:Cはま
た、ファクターVIII,抗血友病因子（AHF），抗血友病グ
ロブリン（AHG），血友病ファクターA,血小板助因子、
トロンボプラスチノジェン、トロンボサイトリシンとし
ても知られ、そしてそのように呼ばれている。それが凝
血活性に影響する化合物であることを指示するために、
“ファクターVIII:C"と呼ばれる。ここで使用するよう
に、“ファクターVIII:C"と“AHF"とは同義語である。
漿タンパクである。この病気は、男性約20,000人中１人
がかかる遺伝性出血病である。ファクターVIII:Cはま
た、ファクターVIII,抗血友病因子（AHF），抗血友病グ
ロブリン（AHG），血友病ファクターA,血小板助因子、
トロンボプラスチノジェン、トロンボサイトリシンとし
ても知られ、そしてそのように呼ばれている。それが凝
血活性に影響する化合物であることを指示するために、
“ファクターVIII:C"と呼ばれる。ここで使用するよう
に、“ファクターVIII:C"と“AHF"とは同義語である。
血漿からのAHFの単離は文献に記載されているけれど
も、AHFの詳細な構造は、一部は純粋な材料の十分な量
の入手不能性と、そして多数の夾雑物および精製剤のタ
ンパク分解性のため、これまで同定されていない。不純
なAHFのいくらかの量は新しい冷凍ヒト血漿から処理し
た濃縮製剤として提供されているが、ヒト血漿中のAHF
の極めて低い濃度と、そしてヒト血漿の入手および処理
の高いコストが、血友病の広範な治療に対してこの物質
のコストを禁止的にしている。
も、AHFの詳細な構造は、一部は純粋な材料の十分な量
の入手不能性と、そして多数の夾雑物および精製剤のタ
ンパク分解性のため、これまで同定されていない。不純
なAHFのいくらかの量は新しい冷凍ヒト血漿から処理し
た濃縮製剤として提供されているが、ヒト血漿中のAHF
の極めて低い濃度と、そしてヒト血漿の入手および処理
の高いコストが、血友病の広範な治療に対してこの物質
のコストを禁止的にしている。
本発明は、組換えDNA技術の使用によりヒトAHFの製造を
可能にする。
可能にする。
AHFは、他のタンパクと同様に、特定の配列に並んだ20
種あまりの異なるアミノ酸からなっている。遺伝子操作
技術を使用し、ヒトAHFタンパクをコードする遺伝子を
同定し、そしてクローニングし、該遺伝子を組換えDNA
ベクター中へ挿入し、適当な宿主を該遺伝子を含む該ベ
クターで形質転換し、そのような宿主中にヒトAHF遺伝
子を発現させ、そしてそれによって生産されたヒトAHF
を採取することにより、AHFの生産を可能とする方法が
開発された。同様に、本発明は、組換えDNA技術によっ
てブタAHFの製造、そしてそのようなブタAHF生産に関連
した製品および方法を提供することを可能にする。
種あまりの異なるアミノ酸からなっている。遺伝子操作
技術を使用し、ヒトAHFタンパクをコードする遺伝子を
同定し、そしてクローニングし、該遺伝子を組換えDNA
ベクター中へ挿入し、適当な宿主を該遺伝子を含む該ベ
クターで形質転換し、そのような宿主中にヒトAHF遺伝
子を発現させ、そしてそれによって生産されたヒトAHF
を採取することにより、AHFの生産を可能とする方法が
開発された。同様に、本発明は、組換えDNA技術によっ
てブタAHFの製造、そしてそのようなブタAHF生産に関連
した製品および方法を提供することを可能にする。
最近開発された技術は、それらの起源は天然であるにも
かかわらず、商業的に有用なタンパクおよびペプチドの
合成のため、急速にそして豊富に成長し得る微生物を採
用することを可能にした。これら技術は、適当な微生物
へ通常他の生物によってつくられるタンパクまたはペプ
チドを合成する能力を遺伝的に賦与することを可能にす
る。この技術は、遺伝子物質、通常DNAと、生物によっ
て合成されるタンパクとの間に、すべての生きている生
物に存在する基本的関係を使用する。この関係とは、タ
ンパクのアミノ酸配列の生産はDNAの３個のヌクレオチ
ド配列のシリーズによってコードされることである。タ
ンパク中に最も普通に存在する20種のアミノ酸のめいめ
いの生産に対して特異的にコードする１組またはそれ以
上のトリヌクレオチド配列群（コードンと呼ばれる）が
存在する。めいめいの与えられたトリヌクレオチド配列
と、それをコードする対応するアミノ酸との間の特異的
関係が遺伝暗号を構成する。その結果、すべてのタンパ
クまたはペプチドのアミノ酸配列は、良く理解された関
係に従って、対応するヌクレオチド配列によって表現さ
れる。さらに、このヌクレオチド配列は、原則として、
どんな生きた生物によってもほん訳されることができ
る。遺伝暗号の議論については、その記載を参照として
ここに取りいれたJ.D.Watson,Melecular Biology of Ge
ne（W.A.Benjamin,Inc.,1977），特に347−77頁;C.F.No
rton,Microbiology（Addison,Wesley 1981），および米
国特許第4,363,877号参照。
かかわらず、商業的に有用なタンパクおよびペプチドの
合成のため、急速にそして豊富に成長し得る微生物を採
用することを可能にした。これら技術は、適当な微生物
へ通常他の生物によってつくられるタンパクまたはペプ
チドを合成する能力を遺伝的に賦与することを可能にす
る。この技術は、遺伝子物質、通常DNAと、生物によっ
て合成されるタンパクとの間に、すべての生きている生
物に存在する基本的関係を使用する。この関係とは、タ
ンパクのアミノ酸配列の生産はDNAの３個のヌクレオチ
ド配列のシリーズによってコードされることである。タ
ンパク中に最も普通に存在する20種のアミノ酸のめいめ
いの生産に対して特異的にコードする１組またはそれ以
上のトリヌクレオチド配列群（コードンと呼ばれる）が
存在する。めいめいの与えられたトリヌクレオチド配列
と、それをコードする対応するアミノ酸との間の特異的
関係が遺伝暗号を構成する。その結果、すべてのタンパ
クまたはペプチドのアミノ酸配列は、良く理解された関
係に従って、対応するヌクレオチド配列によって表現さ
れる。さらに、このヌクレオチド配列は、原則として、
どんな生きた生物によってもほん訳されることができ
る。遺伝暗号の議論については、その記載を参照として
ここに取りいれたJ.D.Watson,Melecular Biology of Ge
ne（W.A.Benjamin,Inc.,1977），特に347−77頁;C.F.No
rton,Microbiology（Addison,Wesley 1981），および米
国特許第4,363,877号参照。
それからタンパクがつくられる20種類のアミノ酸は、フ
ェニルアラニン（以後時に“Phe"または“F"と略す），
ロイシン（“Leu",“L"），イソロイシン（“Ile",
“I"），メチオニン（“Met",“M"），バリン（“Val",
“V"），セリン（“Ser",“S"），プロリン（“Pro",
“P"），スレオニン（“Thr",“T"），アラニン（“Al
a",“A"），チロシン（“Tyr",“Y"），ヒスチジン
（“His",“H"），グルタミン（“Gln",“Q"），アスパ
ラギン（“Asp",“N"），グルタミン酸（“Glu",
“E"），システイン（“Cys",“C"），トリプトファン
（“Trp",“W"），アルギニン（“Arg",“R"）およびグ
リシン（“Gly",“G"）である。与えられたコードン中
に含まれることができるトリヌクレオチドの種々の組合
せによってコードされるアミノ酸は表１に見られる。
ェニルアラニン（以後時に“Phe"または“F"と略す），
ロイシン（“Leu",“L"），イソロイシン（“Ile",
“I"），メチオニン（“Met",“M"），バリン（“Val",
“V"），セリン（“Ser",“S"），プロリン（“Pro",
“P"），スレオニン（“Thr",“T"），アラニン（“Al
a",“A"），チロシン（“Tyr",“Y"），ヒスチジン
（“His",“H"），グルタミン（“Gln",“Q"），アスパ
ラギン（“Asp",“N"），グルタミン酸（“Glu",
“E"），システイン（“Cys",“C"），トリプトファン
（“Trp",“W"），アルギニン（“Arg",“R"）およびグ
リシン（“Gly",“G"）である。与えられたコードン中
に含まれることができるトリヌクレオチドの種々の組合
せによってコードされるアミノ酸は表１に見られる。
特定のタンパクをコードする遺伝子またはDNA配列のデ
オキシヌクレオチド配列を知ることは、該タンパクのア
ミノ酸配列の正確な記述を許容する。しかしながら逆は
必ずしも真ならず、メチオニンはたった１種のコードン
でコードされるが、他のアミノ酸は、第１表から明らか
なように、６種までのコードン（例えばセリン）によっ
てコードされることができる。このように、アミノ酸配
列からヌクレオチド配列を予測するにはかなりの不確実
性が存在する。
オキシヌクレオチド配列を知ることは、該タンパクのア
ミノ酸配列の正確な記述を許容する。しかしながら逆は
必ずしも真ならず、メチオニンはたった１種のコードン
でコードされるが、他のアミノ酸は、第１表から明らか
なように、６種までのコードン（例えばセリン）によっ
てコードされることができる。このように、アミノ酸配
列からヌクレオチド配列を予測するにはかなりの不確実
性が存在する。
要約すると、本発明以前にはAHFの構造については非常
に少ししか知られておらず、そして多年にわたる多大の
労作にもかかわらず、当業者はAHFまたはその遺伝子の
構造を決定し、またはAHFを実質上純粋な形で実質的な
量において生産できる操作を提供することが不可能であ
った。
に少ししか知られておらず、そして多年にわたる多大の
労作にもかかわらず、当業者はAHFまたはその遺伝子の
構造を決定し、またはAHFを実質上純粋な形で実質的な
量において生産できる操作を提供することが不可能であ
った。
ヒトAHFのための遺伝子がクローン化され、発現される
こゝに記載する方法は、以下のステップを含む。
こゝに記載する方法は、以下のステップを含む。
（１） ブタAHFの精製； （２） ブタAHFのアミノ酸配列の決定； （３） オリゴヌクレオチドプローブの調製およびブタ
AHFをコードする遺伝子の少なくとも断片を同定および
／または単離するためにそれらプローブの使用； （４） ヒトAHFをコードするヒト遺伝物質を同定およ
び単離するためにブタAHF遺伝子断片の使用； （５） 種々の哺乳類組織からAHFの合成部位の決定の
ため前記AHF DNA断片の使用； （６） ステップ５における組織同定から得られたメッ
センジャーRNAを使用して、ヒトおよびブタAHFをコード
するcDNAセグメントの製造； （７） ステップ６において製造されたcDNAセグメント
から、例えば同じ制限酵素によって切断されたcDNAセグ
メントをリゲーションすることによって全長さのヒトお
よびブタcDNAクローンの構成； （８） AHF合成を命令し得るDNA発現ベクターのＧ生
成； （９） ヒトまたはブタAHFのための全長さのcDNAを持
つ発現ベクターによる適当な宿主の形質転換； （10） 宿主中のヒトまたはブタAHFの発現； （11） 発現されたAHFの採取； この作業の途中において、ゲノムDNAライブラリーをス
クリーニングするための新技術がAHF分子中に含まれて
いるアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用して開発された。
AHFをコードする遺伝子の少なくとも断片を同定および
／または単離するためにそれらプローブの使用； （４） ヒトAHFをコードするヒト遺伝物質を同定およ
び単離するためにブタAHF遺伝子断片の使用； （５） 種々の哺乳類組織からAHFの合成部位の決定の
ため前記AHF DNA断片の使用； （６） ステップ５における組織同定から得られたメッ
センジャーRNAを使用して、ヒトおよびブタAHFをコード
するcDNAセグメントの製造； （７） ステップ６において製造されたcDNAセグメント
から、例えば同じ制限酵素によって切断されたcDNAセグ
メントをリゲーションすることによって全長さのヒトお
よびブタcDNAクローンの構成； （８） AHF合成を命令し得るDNA発現ベクターのＧ生
成； （９） ヒトまたはブタAHFのための全長さのcDNAを持
つ発現ベクターによる適当な宿主の形質転換； （10） 宿主中のヒトまたはブタAHFの発現； （11） 発現されたAHFの採取； この作業の途中において、ゲノムDNAライブラリーをス
クリーニングするための新技術がAHF分子中に含まれて
いるアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用して開発された。
本発明は上記方法と、それに関連して作られる種々のヌ
クレオチド、ベクターおよび他の製品を含む。
クレオチド、ベクターおよび他の製品を含む。
図面の簡単な説明 第１図は、実施例１に記載した69,000ダルトントロンビ
ン開裂産物のアミノ末端配列について決定されたアミノ
酸配列（Ａ）の図である。１番目の残基は同定できなか
った。この配列は、実施例３に記載されたブタAHFエク
ソンのヌクレオチド配列から推論された配列（Ｂ）、お
よび実施例４に記載されたヒトAHFエクソンと比較され
ている。
ン開裂産物のアミノ末端配列について決定されたアミノ
酸配列（Ａ）の図である。１番目の残基は同定できなか
った。この配列は、実施例３に記載されたブタAHFエク
ソンのヌクレオチド配列から推論された配列（Ｂ）、お
よび実施例４に記載されたヒトAHFエクソンと比較され
ている。
第２図は、（Ａ）アミノ末端のウシトロンビン消化断片
と、（Ｂ）後出Aassらにより単離された166KdブタAHF断
片の40Kdトロンビン開裂産物の単一文字で表したアミノ
酸配列を図示する。
と、（Ｂ）後出Aassらにより単離された166KdブタAHF断
片の40Kdトロンビン開裂産物の単一文字で表したアミノ
酸配列を図示する。
第３図は、AHFをコードするブタ遺伝子の少なくとも一
部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設計
を図示する。
部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設計
を図示する。
第４図は、実施例３に記載したバクテリオファージPB34
から得られた、ブタAHFエクソンを含むSma I DNA断片
（34−S1）のためのDNA配列を図示する。
から得られた、ブタAHFエクソンを含むSma I DNA断片
（34−S1）のためのDNA配列を図示する。
第５図は、実施例３に記載した、ブタAHFのためのエク
ソンを持つHae III挿入34−H1のDNA配列の図である。こ
の配列は第４図に示した長い配列内に含まれ、そして第
４図の配列のヌクレオチド250−615に相当する。
ソンを持つHae III挿入34−H1のDNA配列の図である。こ
の配列は第４図に示した長い配列内に含まれ、そして第
４図の配列のヌクレオチド250−615に相当する。
第６図は、実施例４に記載したヒトAHFのためのエクソ
ンの一部を示す、クローン25−S1のSau 3A1インサート
のためのヌクレオチド 34−84のためのDNA配列および推
論したアミノ酸配列の図である。
ンの一部を示す、クローン25−S1のSau 3A1インサート
のためのヌクレオチド 34−84のためのDNA配列および推
論したアミノ酸配列の図である。
第７図は、ヒトAHFをコードする全体の配列を含むDNAヌ
クレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒトAHFの
推論したアミノ酸配列を図示する。
クレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒトAHFの
推論したアミノ酸配列を図示する。
本発明の詳細な説明 本出願の理解を容易にするため、以下の定義が供給され
る。この分野において通用している意義と異なる場合に
は、以下の定義が支配する。
る。この分野において通用している意義と異なる場合に
は、以下の定義が支配する。
増幅とは、細胞がそれらの染色体DNA内で遺伝子反復を
生産する過程を意味する。
生産する過程を意味する。
同時形質転換とは、そのうちの一つが細胞に選択し得る
表現型を与える、該細胞にとって異質の二つ以上の外来
遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を意味する。
表現型を与える、該細胞にとって異質の二つ以上の外来
遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を意味する。
下流とは、ヌクレオチド配列の３′末端へ向かって進行
する方向を意味する。
する方向を意味する。
エンハンサーとは、遺伝子の本体、遺伝子に関して配列
の位置、または配列の配向に関係なく、遺伝子の転写を
可能とし得るヌクレオチド配列である。
の位置、または配列の配向に関係なく、遺伝子の転写を
可能とし得るヌクレオチド配列である。
遺伝子とは、与えられた成熟タンパクをコードするデオ
キシリボヌクレオチド配列である。ここでの目的に対し
ては、遺伝子は、RNA転写開始信号、ポリアデニル化付
加部位、プロモーターまたはエンハンサーのようなほん
訳されない両端域は含まない。
キシリボヌクレオチド配列である。ここでの目的に対し
ては、遺伝子は、RNA転写開始信号、ポリアデニル化付
加部位、プロモーターまたはエンハンサーのようなほん
訳されない両端域は含まない。
選択遺伝子とは、検出し得るタンパクとして該遺伝子を
発現する表現型を細胞へ与える遺伝子である。
発現する表現型を細胞へ与える遺伝子である。
選択剤とは、選択遺伝子の発現の検出を可能とする条件
または物質である。
または物質である。
遺伝子型とは、表現型として観察される、その発現に対
向して細胞内に含まれる遺伝情報である。
向して細胞内に含まれる遺伝情報である。
リゲーションとは、２本のDNA鎖の５′および３′末端
間にフォスフォジエステル結合を形成する過程である。
これはT4リガーゼによる鈍い末端連結を含む、いくつか
の良く知られた酵素法技術によって達成することができ
る。
間にフォスフォジエステル結合を形成する過程である。
これはT4リガーゼによる鈍い末端連結を含む、いくつか
の良く知られた酵素法技術によって達成することができ
る。
配向とは、DNA配列中のヌクレオチドの順序を意味す
る。DNA配列の反転配位とは、他の配位に関して該配位
の５′から３′への順序が、該配位を得たDNA中の基準
点と比較した時反対になっている順序である。そのよう
な基準点は、起源DNAまたは該配列を含んでいる複製し
得るベクターの複製源中の他の特定DNA配列の転写の方
向を含むことができる。
る。DNA配列の反転配位とは、他の配位に関して該配位
の５′から３′への順序が、該配位を得たDNA中の基準
点と比較した時反対になっている順序である。そのよう
な基準点は、起源DNAまたは該配列を含んでいる複製し
得るベクターの複製源中の他の特定DNA配列の転写の方
向を含むことができる。
転写とは、DNA鋳型からRNAの合成を意味する。
形質転換とは、外来DNAの細胞による摂取によって細胞
の遺伝子型を変えることを意味する。形質転換は、ある
場合には細胞の表現型の変化によって検出することがで
きる。形質転換した細胞はトランスフォーマントと呼ば
れる。形質転換前細胞は、親細胞と呼ばれる。
の遺伝子型を変えることを意味する。形質転換は、ある
場合には細胞の表現型の変化によって検出することがで
きる。形質転換した細胞はトランスフォーマントと呼ば
れる。形質転換前細胞は、親細胞と呼ばれる。
ほん訳とは、メッセンジャーRNA（mRNA）からポリペプ
チドの合成を意味する。
チドの合成を意味する。
本発明は、組換えDNA技術によって、ブタファクターVII
I:C遺伝子の同定および単離を始めて可能にする。本発
明はまた、AHFのためのヒト遺伝子を発見および単離す
るため、ブタAHF DNAとヒトAHF DNAとの間の相同の利
点を利用することにより、組換えDNA技術により、ヒト
ファクターVIII:Cを暗号化する遺伝子の単離および同定
を始めて可能にする。ブタAHF遺伝子との相同を経由す
るAHF製造のためのcDNAクローンへのこのルートは、非
常に高価でありかつ実質上入手できないヒトAHFを精製
するための退屈な時間のかかるそして費用のかかる必要
性を回避する。
I:C遺伝子の同定および単離を始めて可能にする。本発
明はまた、AHFのためのヒト遺伝子を発見および単離す
るため、ブタAHF DNAとヒトAHF DNAとの間の相同の利
点を利用することにより、組換えDNA技術により、ヒト
ファクターVIII:Cを暗号化する遺伝子の単離および同定
を始めて可能にする。ブタAHF遺伝子との相同を経由す
るAHF製造のためのcDNAクローンへのこのルートは、非
常に高価でありかつ実質上入手できないヒトAHFを精製
するための退屈な時間のかかるそして費用のかかる必要
性を回避する。
ブタAHFは、最も好ましくは、David Fass et al,“Mono
clonal Antibodies to Porcine AHF Coagulant and The
ir Use in the Isolation of Active Coagulent Protei
n",Blood 59:594−600（1982），およびKnutsen et a
l.,“Porcine Factor VIII:C prepared by affinity I
nteraction with Von Willebrand Factor and Heterolo
gous Antibodies,"Blood,59:615−24（1982）に記載さ
れているモノクロナール抗体精製技術によって最初高度
に精製される。上記論文の記載を参照としてここに取り
入れる。ブタファクターVIII:Cポリペプチドは、適当な
アフィニティークロマトグラフィーカラム上に固定化さ
れた抗VIII:Cモノクロナール抗体へ結合される。約166
および130Kdの分子サイズを有する２種の大きい分子量
ポリペプチドがエチレンジアミンテトラ酢酸で溶離され
る。次に約76Kdの分子量を持つ他のタンパクセグメント
が約50％のエチレングリコールを用いてカラムから溶離
される。これらポリペプチド、および／またはウシトロ
ンビンまたはタンパクを切断する他の適当な試薬を使用
する、該タンパクの酵素消化のような、既知の方法で得
られたこれらポリペプチドの断片の部分的アミノ酸配列
が、次に既知の分析方法によって決定される。これら物
質のアミノ酸配列を基にして、オリゴヌクレオチドプロ
ーブが合成され、その少なくともいくつかはAHFの対応
するセグメントをコードするDNAとハイブリッド化され
るであろう。これらオリゴヌクレオチドは次に、ブタAH
Fをコードする遺伝子のセグメントをスクリーニングす
るために使用される。
clonal Antibodies to Porcine AHF Coagulant and The
ir Use in the Isolation of Active Coagulent Protei
n",Blood 59:594−600（1982），およびKnutsen et a
l.,“Porcine Factor VIII:C prepared by affinity I
nteraction with Von Willebrand Factor and Heterolo
gous Antibodies,"Blood,59:615−24（1982）に記載さ
れているモノクロナール抗体精製技術によって最初高度
に精製される。上記論文の記載を参照としてここに取り
入れる。ブタファクターVIII:Cポリペプチドは、適当な
アフィニティークロマトグラフィーカラム上に固定化さ
れた抗VIII:Cモノクロナール抗体へ結合される。約166
および130Kdの分子サイズを有する２種の大きい分子量
ポリペプチドがエチレンジアミンテトラ酢酸で溶離され
る。次に約76Kdの分子量を持つ他のタンパクセグメント
が約50％のエチレングリコールを用いてカラムから溶離
される。これらポリペプチド、および／またはウシトロ
ンビンまたはタンパクを切断する他の適当な試薬を使用
する、該タンパクの酵素消化のような、既知の方法で得
られたこれらポリペプチドの断片の部分的アミノ酸配列
が、次に既知の分析方法によって決定される。これら物
質のアミノ酸配列を基にして、オリゴヌクレオチドプロ
ーブが合成され、その少なくともいくつかはAHFの対応
するセグメントをコードするDNAとハイブリッド化され
るであろう。これらオリゴヌクレオチドは次に、ブタAH
Fをコードする遺伝子のセグメントをスクリーニングす
るために使用される。
AHFのためのブタ遺伝子一部分が得られれば、該組換え
物質はヒトAHFをコードする遺伝子を探索し、そして単
離するため、ヒトゲノムDNAをスクリーンするために使
用される。この操作において、ヒトAHFとブタAHFとの間
に、かなりの類似性が存在することが確立され、そして
これら類似性の利益がヒトファクターVIII:C遺伝子また
は遺伝子セグメントを単離し、そして同定するために用
いられる。
物質はヒトAHFをコードする遺伝子を探索し、そして単
離するため、ヒトゲノムDNAをスクリーンするために使
用される。この操作において、ヒトAHFとブタAHFとの間
に、かなりの類似性が存在することが確立され、そして
これら類似性の利益がヒトファクターVIII:C遺伝子また
は遺伝子セグメントを単離し、そして同定するために用
いられる。
ブタおよびヒトタンパクの類似性は、アミノ酸配列をコ
ードするDNA配列の対応する類似性に帰せられる。ヒト
およびブタのAHFタンパクをコードする遺伝物質は、高
いパーセントの部分において同一であり、そのため、例
えばBentonおよびDavisの“Screening gt Recombinant
Clones by Hybridizatin to Single Plaques In Situ",
Science,196:180（1977）の操作へかける時、ハイブリ
ッド化を示す。該論文の記載を参照としてここに取り入
れる。
ードするDNA配列の対応する類似性に帰せられる。ヒト
およびブタのAHFタンパクをコードする遺伝物質は、高
いパーセントの部分において同一であり、そのため、例
えばBentonおよびDavisの“Screening gt Recombinant
Clones by Hybridizatin to Single Plaques In Situ",
Science,196:180（1977）の操作へかける時、ハイブリ
ッド化を示す。該論文の記載を参照としてここに取り入
れる。
ヒトAHFのための遺伝子のクローン化したセグメント
は、次に種々のヒト組織の中からAHF mRNAの源を同定
するために使用される。同様に、ブタAHFのためのクロ
ーン化したセグメントの一つまたはそれ以上がブタAHF
のための可能性ある組織源をスクリーニングするために
使用される。このステップは、例えばManiatis et al.,
Molecular Cloning,A Laboratory Manual,（Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1982）に記載されているように、
RNA抽出、ゲル電気永動、ニトロセルロースシートへの
移換、および放射標識したクローン化DNAへのハイブリ
ッド化を含む。この組織源が同定されれば、cDNAライブ
ラリーがつくられ（プラスミドまたは好ましくはバクテ
リオファージラムダベクター中に、両方とも一般に入手
可能）、そして以下に記載するようにAHF cDNAクロー
ンについてスクリーニングされる。cDNAライブラリース
クリーニングのプロセスは、DNA配列決定により、AHFを
コードする全体DNA遺伝子配列を含むことを示す一組のc
DNAクローンが得られるまで繰り返される。
は、次に種々のヒト組織の中からAHF mRNAの源を同定
するために使用される。同様に、ブタAHFのためのクロ
ーン化したセグメントの一つまたはそれ以上がブタAHF
のための可能性ある組織源をスクリーニングするために
使用される。このステップは、例えばManiatis et al.,
Molecular Cloning,A Laboratory Manual,（Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1982）に記載されているように、
RNA抽出、ゲル電気永動、ニトロセルロースシートへの
移換、および放射標識したクローン化DNAへのハイブリ
ッド化を含む。この組織源が同定されれば、cDNAライブ
ラリーがつくられ（プラスミドまたは好ましくはバクテ
リオファージラムダベクター中に、両方とも一般に入手
可能）、そして以下に記載するようにAHF cDNAクロー
ンについてスクリーニングされる。cDNAライブラリース
クリーニングのプロセスは、DNA配列決定により、AHFを
コードする全体DNA遺伝子配列を含むことを示す一組のc
DNAクローンが得られるまで繰り返される。
全長さのヒトまたはブタAHF cDNAが得られたならば、A
HF活性を発現するため、既知の適当な手段、例えば適当
なベクターへの挿入、適当な宿主中へのトランスフェク
ション、形質転換された細胞（トランスフォーマント）
の選択、およびこれらトランスフォーマントの培養がAH
Fタンパクを発現するために使用される。
HF活性を発現するため、既知の適当な手段、例えば適当
なベクターへの挿入、適当な宿主中へのトランスフェク
ション、形質転換された細胞（トランスフォーマント）
の選択、およびこれらトランスフォーマントの培養がAH
Fタンパクを発現するために使用される。
AHFの発現のための宿主ベクター系は原核細胞でもよい
が、しかしAHFの複雑性は好ましい発現系を真核細胞、
特に（少なくとも凝血活性を有する生物学的に活性なAH
Fに対しては）哺乳動物系のものとする。これは真核細
胞（通常哺乳類または脊椎動物細胞）の適当なAHFベク
ターによる形質転換によって容易に達成される。真核細
胞形質転換は、一般によく知られたプロセスであり、そ
して種々の標準的方法によって達成することができる。
これらは、プロトプラスト融合、DNAミクロ注入、染色
体トランスフェクション、溶菌性または非溶菌性ビール
スベクター（例えば、Mulligan et al.,“Nature"（Lon
don）277:108−114（1979）），細胞対細胞融合（Fourn
ier et al.,“Proc.Nat.Acad.Sci."74:319−323（197
7）），リピッド構造（米国特許第4,394,448号）、およ
びDNA沈澱の摂取（Bachetti et al.,“Proc.Nat.Acad.S
ci.74:1590−1594（1977））の使用を含む。イーストま
たはこん虫細胞のような他の真核性細胞も有利に使用し
得る。
が、しかしAHFの複雑性は好ましい発現系を真核細胞、
特に（少なくとも凝血活性を有する生物学的に活性なAH
Fに対しては）哺乳動物系のものとする。これは真核細
胞（通常哺乳類または脊椎動物細胞）の適当なAHFベク
ターによる形質転換によって容易に達成される。真核細
胞形質転換は、一般によく知られたプロセスであり、そ
して種々の標準的方法によって達成することができる。
これらは、プロトプラスト融合、DNAミクロ注入、染色
体トランスフェクション、溶菌性または非溶菌性ビール
スベクター（例えば、Mulligan et al.,“Nature"（Lon
don）277:108−114（1979）），細胞対細胞融合（Fourn
ier et al.,“Proc.Nat.Acad.Sci."74:319−323（197
7）），リピッド構造（米国特許第4,394,448号）、およ
びDNA沈澱の摂取（Bachetti et al.,“Proc.Nat.Acad.S
ci.74:1590−1594（1977））の使用を含む。イーストま
たはこん虫細胞のような他の真核性細胞も有利に使用し
得る。
溶菌性ビールスベクターによって仲介される形質転換が
効率的であるが、しかし多数の理由により不利である。
トランスフェクトされたDNAの最大サイズがビールスの
カプシッドパッキングの形状によって制限される、外来
遺伝子がビールス複製中しばしば消失する、ヘルパービ
ールスまたは特異化された宿主の必要性が存在する、宿
主細胞はパーミッシブでなければならない、そして宿主
がビールス感染の途中で殺されることである。
効率的であるが、しかし多数の理由により不利である。
トランスフェクトされたDNAの最大サイズがビールスの
カプシッドパッキングの形状によって制限される、外来
遺伝子がビールス複製中しばしば消失する、ヘルパービ
ールスまたは特異化された宿主の必要性が存在する、宿
主細胞はパーミッシブでなければならない、そして宿主
がビールス感染の途中で殺されることである。
非溶菌性形質転換は、安定なエピソームとしてある細胞
ライン中に導入されたビールスベクターの転写およびほ
ん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラインを必要と
し、そして多数の不利益を蒙る。“Trends in Biochemi
cal Sciences",1983年３月号,pp.209−212参照。
ライン中に導入されたビールスベクターの転写およびほ
ん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラインを必要と
し、そして多数の不利益を蒙る。“Trends in Biochemi
cal Sciences",1983年３月号,pp.209−212参照。
他方、染色体外DNAが宿主細胞の染色体中に摂取される
他の形質転換方法は、低い形質転換頻度および低い発現
レベルによって特徴づけされていた。これら当初の難点
は、実際に形質転換された細胞（選択遺伝子）の小集団
を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺伝子で形質転換
することによって緩和された。形質転換された細胞の全
集団は、獲得した表現型を有する細胞に有利な条件で育
成されることができ、そのため形質転換された細胞を好
都合に探索することを可能とする。その後、トランスフ
ォーマントは該表現型をもっと強く表現する能力につい
てスクリーニングされることができる。これらは、より
高い発現を検出するような方法で、選択剤を変更するこ
とによって達成される。
他の形質転換方法は、低い形質転換頻度および低い発現
レベルによって特徴づけされていた。これら当初の難点
は、実際に形質転換された細胞（選択遺伝子）の小集団
を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺伝子で形質転換
することによって緩和された。形質転換された細胞の全
集団は、獲得した表現型を有する細胞に有利な条件で育
成されることができ、そのため形質転換された細胞を好
都合に探索することを可能とする。その後、トランスフ
ォーマントは該表現型をもっと強く表現する能力につい
てスクリーニングされることができる。これらは、より
高い発現を検出するような方法で、選択剤を変更するこ
とによって達成される。
選択遺伝子は三つのカテゴリー、すなわち検出し得るよ
うに増幅された選択遺伝子、優性選択遺伝子、および検
出し得るように増幅された優性選択遺伝子に分けられ
る。
うに増幅された選択遺伝子、優性選択遺伝子、および検
出し得るように増幅された優性選択遺伝子に分けられ
る。
検出し得るように増幅された選択された遺伝子は、増幅
が宿主細胞を選択剤の変更へ曝露することによって検出
することができる遺伝子である。優性に活動しない検出
し得るように増幅された遺伝子は、一般に選択遺伝子を
遺伝子型的に欠く親細胞ラインを必要とする。その例
は、ヒドロキシメトールグルタニルCoAレダクターゼ（S
inensky,“Biochem.Biophys.Res.Commun."78:863（197
7）），リボヌクレオチドレダクターゼ（Meuth et al.
“Cell:３:367（1943）），アスパルテートトランスカ
ルバミラーゼ（Kemp et al.“Cell"9:541（1976），ア
デニレートデアミナーゼ（DeBatisseet al.“Mol and C
ell Biol."２（11）:1346−1353（1982）），マウスジ
ヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR），および欠陥プ
ロモーターと共にマウスチミジンキナーゼ（TK）に対す
る遺伝子を含む。
が宿主細胞を選択剤の変更へ曝露することによって検出
することができる遺伝子である。優性に活動しない検出
し得るように増幅された遺伝子は、一般に選択遺伝子を
遺伝子型的に欠く親細胞ラインを必要とする。その例
は、ヒドロキシメトールグルタニルCoAレダクターゼ（S
inensky,“Biochem.Biophys.Res.Commun."78:863（197
7）），リボヌクレオチドレダクターゼ（Meuth et al.
“Cell:３:367（1943）），アスパルテートトランスカ
ルバミラーゼ（Kemp et al.“Cell"9:541（1976），ア
デニレートデアミナーゼ（DeBatisseet al.“Mol and C
ell Biol."２（11）:1346−1353（1982）），マウスジ
ヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR），および欠陥プ
ロモーターと共にマウスチミジンキナーゼ（TK）に対す
る遺伝子を含む。
優性選択遺伝子は、親細胞の遺伝子型に関係なくトラン
スフォーマント中に発現される遺伝子である。大部分の
優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤による処理にお
いて高度に効果的なため、遺伝子を増幅した、または増
幅しなかった細胞ラインを識別することが困難であるた
めに、検出し得るように増幅されない。このタイプの優
性選択遺伝子は、キサンチン−グアニンフォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ（Mulligan et al.“Proc.Nat.
Acad.Sci."78〔４〕:2072−2076（1981）），およびア
ミノグルコシド３′−フォスフォトランスフェラーゼ
（Colbere−Garapin et al.“J.Mol.Biol.",150:1−14
（1981））のような、原核生物酵素に対する遺伝子を含
む。
スフォーマント中に発現される遺伝子である。大部分の
優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤による処理にお
いて高度に効果的なため、遺伝子を増幅した、または増
幅しなかった細胞ラインを識別することが困難であるた
めに、検出し得るように増幅されない。このタイプの優
性選択遺伝子は、キサンチン−グアニンフォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ（Mulligan et al.“Proc.Nat.
Acad.Sci."78〔４〕:2072−2076（1981）），およびア
ミノグルコシド３′−フォスフォトランスフェラーゼ
（Colbere−Garapin et al.“J.Mol.Biol.",150:1−14
（1981））のような、原核生物酵素に対する遺伝子を含
む。
いくらかの優性選択遺伝子は検出できるように増幅され
る。適当な実例は、Haber et al.“Somatic Cell Gene
t."４:499−508（1982）に記載された変異DHFR遺伝子、
HLA抗原のような細胞表面マーカー、およびこの分野で
よく知られているように螢光源または色素源物質から螢
光物質または着色物質を生産する特異性エステラーゼの
ような酵素をコードする遺伝子を含む。
る。適当な実例は、Haber et al.“Somatic Cell Gene
t."４:499−508（1982）に記載された変異DHFR遺伝子、
HLA抗原のような細胞表面マーカー、およびこの分野で
よく知られているように螢光源または色素源物質から螢
光物質または着色物質を生産する特異性エステラーゼの
ような酵素をコードする遺伝子を含む。
検出し得るように増幅された優性選択遺伝子がここで使
用するために好ましい。ある場合は、優性選択遺伝子は
遺伝子の適当な変異によって検出し得るように増幅され
た遺伝子へ変えることができることを理解すべきであ
る。
用するために好ましい。ある場合は、優性選択遺伝子は
遺伝子の適当な変異によって検出し得るように増幅され
た遺伝子へ変えることができることを理解すべきであ
る。
選択遺伝子は最初限られた商業的有用性しかなかった。
それらは摂取したDNAを増幅する性質を有するトランス
フォーマントを選択することを可能としたが、大部分の
選択遺伝子は商業的価値のない生産物を生産した。他
方、商業的に価値ある生産物のための遺伝子は、一般に
それらのトランスフォーマントへ容易に検出し得る（ま
たは単に検出し得る）表現型を与えなかった。これは、
例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で形質転換され
た細胞を与えない酵素またはホルモンについて真理であ
ろう。商業的に興味ある大部分のタンパクはこのグルー
プ、例えばホルモン、血液凝固に関与するタンパク、お
よびフィブリン溶解酵素に属する。
それらは摂取したDNAを増幅する性質を有するトランス
フォーマントを選択することを可能としたが、大部分の
選択遺伝子は商業的価値のない生産物を生産した。他
方、商業的に価値ある生産物のための遺伝子は、一般に
それらのトランスフォーマントへ容易に検出し得る（ま
たは単に検出し得る）表現型を与えなかった。これは、
例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で形質転換され
た細胞を与えない酵素またはホルモンについて真理であ
ろう。商業的に興味ある大部分のタンパクはこのグルー
プ、例えばホルモン、血液凝固に関与するタンパク、お
よびフィブリン溶解酵素に属する。
後に、形質転換される性質を有し、そして選択遺伝子を
増幅する真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことを
するであろうということが発見された。選択遺伝子を追
従することにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子
を同時発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞
の小集団を同定することができた。トランスフォーマン
トを選択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加
した発現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子
の増加した発現をも示すであろうと結論するのが実際で
あった。これは後でもっと詳細に論ずるように、常に正
しいとは限らない。Axelら（米国特許第4,399,216号）
は、ある細胞を、共有結合した、または結合しない遺伝
子を含むベクター系によろうと、そして後者の場合、遺
伝子が宿主細胞中へ後から、または同時に導入されよう
と、二以上の異なった遺伝子で形質転換する過程を記載
するために、同時形質転換なる術語を使用している。同
時形質転換は、“実質上任意の遺伝子の培養細胞中への
導入および統合を許容し（Wigler et al.“Cell",16:77
7−785,（1975）），および“同時形質転換過程の使用
により、所望のタンパク性および他の物質を合成する真
核細胞を生産することが可能”（米国特許第4,399,216
号、カラム3,37−42行）でなければならない。
増幅する真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことを
するであろうということが発見された。選択遺伝子を追
従することにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子
を同時発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞
の小集団を同定することができた。トランスフォーマン
トを選択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加
した発現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子
の増加した発現をも示すであろうと結論するのが実際で
あった。これは後でもっと詳細に論ずるように、常に正
しいとは限らない。Axelら（米国特許第4,399,216号）
は、ある細胞を、共有結合した、または結合しない遺伝
子を含むベクター系によろうと、そして後者の場合、遺
伝子が宿主細胞中へ後から、または同時に導入されよう
と、二以上の異なった遺伝子で形質転換する過程を記載
するために、同時形質転換なる術語を使用している。同
時形質転換は、“実質上任意の遺伝子の培養細胞中への
導入および統合を許容し（Wigler et al.“Cell",16:77
7−785,（1975）），および“同時形質転換過程の使用
により、所望のタンパク性および他の物質を合成する真
核細胞を生産することが可能”（米国特許第4,399,216
号、カラム3,37−42行）でなければならない。
形質転換ベクター AFH同時形質転換に使用されるベクターは、選択遺伝子
およびAHF遺伝子を含むであろう。加えて、形質転換ま
たは同時異質転換ベクター中に、後で記載するようなエ
ンハンサー、プロモーター、イントロン、アクセサリー
DNA,ポリアデニル化部位、および３′非コーティング域
のような他の要素が通常存在するであろう。
およびAHF遺伝子を含むであろう。加えて、形質転換ま
たは同時異質転換ベクター中に、後で記載するようなエ
ンハンサー、プロモーター、イントロン、アクセサリー
DNA,ポリアデニル化部位、および３′非コーティング域
のような他の要素が通常存在するであろう。
適当な選択遺伝子は上に記載した。選択剤は選択遺伝子
の不存在下で細胞生育を阻止するものであることが好ま
しい。そのため、選択遺伝子を失った大規模培養中の復
帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育させないであろ
う。しかしながら、AHFの商業生産においては、細胞毒
素の使用を避け、それにより製品精製工程を単純化する
ことが望ましいであろう。このため、望ましい選択遺伝
子は、トランスフォーマントがさもなければ使用できな
い生育にとって重要な栄養を使用することを可能にする
ものであろう。前述したTK遺伝子は一例である。
の不存在下で細胞生育を阻止するものであることが好ま
しい。そのため、選択遺伝子を失った大規模培養中の復
帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育させないであろ
う。しかしながら、AHFの商業生産においては、細胞毒
素の使用を避け、それにより製品精製工程を単純化する
ことが望ましいであろう。このため、望ましい選択遺伝
子は、トランスフォーマントがさもなければ使用できな
い生育にとって重要な栄養を使用することを可能にする
ものであろう。前述したTK遺伝子は一例である。
二つのクラスのベクターが同時形質転換に用いられた。
第一のクラスの未結合ベクターである。ここでは選択遺
伝子およびAHF遺伝子は共有結合されない。二つの遺伝
子のリゲーションまたは他の結合ステップが必要ないの
で、このクラスのベクターが好ましい。このことは、選
択遺伝子および生産物遺伝子は通常別々の源から得ら
れ、そしてそれらの野生タイプ環境においてリゲートさ
れないから、形質転換過程を単純化する。加えて、同時
形質転換時使用されるAHFおよび選択遺伝子のモル比
は、同時形質転換効率を増すように調節することができ
る。
第一のクラスの未結合ベクターである。ここでは選択遺
伝子およびAHF遺伝子は共有結合されない。二つの遺伝
子のリゲーションまたは他の結合ステップが必要ないの
で、このクラスのベクターが好ましい。このことは、選
択遺伝子および生産物遺伝子は通常別々の源から得ら
れ、そしてそれらの野生タイプ環境においてリゲートさ
れないから、形質転換過程を単純化する。加えて、同時
形質転換時使用されるAHFおよび選択遺伝子のモル比
は、同時形質転換効率を増すように調節することができ
る。
同時形質転換ベクターの第二のクラスは、結合したベク
ターである。これらベクターは、選択およびAHFベクタ
ーが好ましくはリゲーションによって共有結合されてい
る点において未結合ベクターから区別される。
ターである。これらベクターは、選択およびAHFベクタ
ーが好ましくはリゲーションによって共有結合されてい
る点において未結合ベクターから区別される。
こゝではベクターはエンハンサーを含むことができる。
エンハンサーは機能的にプロモーターから区別される
が、しかしプロモーターと協力して作用するように見え
る。それらの細胞レベル上の機能は良くわかっていない
が、それらの独特な特徴は、位置もしくは配位に依存す
ることなく転写を活性化または可能化する能力である。
プロセロターは遺伝子の上流でなければならないが、エ
ンハンサーはイントロンのように、遺伝子内でプロモー
ターから上流または５′に、または遺伝子とポリアデニ
ル化部位との間で遺伝子から下流に、またはポリアデニ
ル化部位から３′に存在することができる。反転したプ
ロモーターは機能しないが、しかし反転したエンハンサ
ーは機能する。エンハンサーはシス活性、すなわちプロ
モーターに対しそれらが同じDNA鎖上に存在する場合の
み効果がある。エンハンサーの一般的議論については、
Khoury et al.,“Cell"33:313−314（1983）参照。
エンハンサーは機能的にプロモーターから区別される
が、しかしプロモーターと協力して作用するように見え
る。それらの細胞レベル上の機能は良くわかっていない
が、それらの独特な特徴は、位置もしくは配位に依存す
ることなく転写を活性化または可能化する能力である。
プロセロターは遺伝子の上流でなければならないが、エ
ンハンサーはイントロンのように、遺伝子内でプロモー
ターから上流または５′に、または遺伝子とポリアデニ
ル化部位との間で遺伝子から下流に、またはポリアデニ
ル化部位から３′に存在することができる。反転したプ
ロモーターは機能しないが、しかし反転したエンハンサ
ーは機能する。エンハンサーはシス活性、すなわちプロ
モーターに対しそれらが同じDNA鎖上に存在する場合の
み効果がある。エンハンサーの一般的議論については、
Khoury et al.,“Cell"33:313−314（1983）参照。
好ましいエンハンサーは、サルビールス40、ポリオマビ
ールス、ウシパピロマビールス、レトロビールスまたは
アデノビールスのような動物ビールスから得られる。ビ
ールスエンハンサーは、大衆が入手し得るビールスから
容易に得ることができる。いくつかのビールス，例えば
ラウスザルコーマビールスおよびサルビールス40のため
のエンハンサー域は良く知られている。Luciw et al.
“Cell"33:705−716（1983）参照。問題のビールスの公
表された制限マップを基にしてこれら域を切除し、そし
てもし必要ならばエンハンサーを所望のベクターに接合
することを可能とするように部位を修飾することは日常
的な化学的事項である。例えば、Kaufman et al.“J.Mo
l.Biol.",159:601−621（1982）および“Mol.Cell Bio
l."２（11）:1304−1319（1982）参照。これら両者の記
載を参照としてこゝに取り入れる。代わりに、エンハン
サーは配列データから合成することができる。ビールス
エンハンサーのサイズは、これを実際の達成できるほど
十分に小さい（一般に約150bp以下）。
ールス、ウシパピロマビールス、レトロビールスまたは
アデノビールスのような動物ビールスから得られる。ビ
ールスエンハンサーは、大衆が入手し得るビールスから
容易に得ることができる。いくつかのビールス，例えば
ラウスザルコーマビールスおよびサルビールス40のため
のエンハンサー域は良く知られている。Luciw et al.
“Cell"33:705−716（1983）参照。問題のビールスの公
表された制限マップを基にしてこれら域を切除し、そし
てもし必要ならばエンハンサーを所望のベクターに接合
することを可能とするように部位を修飾することは日常
的な化学的事項である。例えば、Kaufman et al.“J.Mo
l.Biol.",159:601−621（1982）および“Mol.Cell Bio
l."２（11）:1304−1319（1982）参照。これら両者の記
載を参照としてこゝに取り入れる。代わりに、エンハン
サーは配列データから合成することができる。ビールス
エンハンサーのサイズは、これを実際の達成できるほど
十分に小さい（一般に約150bp以下）。
ベクターアセンブリ中に存在しなければならない他の要
素は、ポリアデニル化接合（付加）部位である。これは
ほん訳された遺伝子区域から下流に位置するDNA配列で
あり、そこから少し下流に転写ストップおよびアデニン
リボヌクレオチドが付加され、メッセンジャーRNAの
３′末端にポリアデニンヌクレオチド尾部を形成する。
ポリアデニル化は、メッセンジャーRNAのレベル、従っ
て生産物タンパクのレベルを減らす事象である、細胞中
の分解に対してメッセンジャーRNAを安定化するのに重
要である。
素は、ポリアデニル化接合（付加）部位である。これは
ほん訳された遺伝子区域から下流に位置するDNA配列で
あり、そこから少し下流に転写ストップおよびアデニン
リボヌクレオチドが付加され、メッセンジャーRNAの
３′末端にポリアデニンヌクレオチド尾部を形成する。
ポリアデニル化は、メッセンジャーRNAのレベル、従っ
て生産物タンパクのレベルを減らす事象である、細胞中
の分解に対してメッセンジャーRNAを安定化するのに重
要である。
真核性ポリアデニル化部位は良く知られている。真核性
遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在する。ヘキサヌ
クレオチド５′−AAUAAA−３′は、ポリアデニル化がス
タートする点から11−30ヌクレオチドに発見される。ポ
リアデニル化部位を含むDNA配列は発表された報告に従
ってビールスから得ることができる。例示的なポリアデ
ニル化配列はマウスベータグロブリン、およびサルビー
ルス40後期または早期域遺伝子から得ることができる
が、しかしビールスのポリアデニル化部位が好ましい。
これら配列は既知であるから、それらは生体外で合成す
ることができ、そしてベクターへ慣用の手法でリゲート
することができる。
遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在する。ヘキサヌ
クレオチド５′−AAUAAA−３′は、ポリアデニル化がス
タートする点から11−30ヌクレオチドに発見される。ポ
リアデニル化部位を含むDNA配列は発表された報告に従
ってビールスから得ることができる。例示的なポリアデ
ニル化配列はマウスベータグロブリン、およびサルビー
ルス40後期または早期域遺伝子から得ることができる
が、しかしビールスのポリアデニル化部位が好ましい。
これら配列は既知であるから、それらは生体外で合成す
ることができ、そしてベクターへ慣用の手法でリゲート
することができる。
ポリアデニル化域は、AHFおよび／または選択遺伝子の
どちらからも下流に配置されなければならないが、どち
らの遺伝子へリゲートすることもできる。それは生産物
遺伝子ではなく、選択遺伝子のみへリゲートすることが
でき、そしてベクターが結合していても結合していなく
てもそうである。ほん訳ストップコードンからポリアデ
ニル化部位を分離する配列は、好ましくはプロモートさ
れない真核性遺伝子のようなほん訳されないオリゴヌク
レオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドおよび
遺伝子はプロモーターを付与されないので、それらは発
現されないであろう。該オリゴヌクレオチドはストップ
コードンからポリアデニル化部位まで約1,000塩基まで
のオーダーでかなりの距離延長しなければならない。こ
の３′非ほん訳オリゴヌクレオチドは、一般に生産物収
率の増加をもたらす。該ベクターはコンセンサス配列か
ら下流約10ないし約30bpで終わることができるが、しか
しその野生タイプ環境においてポリアデニル化部位から
下流に見出される３′配列を保持することが好ましい。
これら配列は、典型的にはポリアデニル化部位から下流
へ約200ないし600塩基対延長する。
どちらからも下流に配置されなければならないが、どち
らの遺伝子へリゲートすることもできる。それは生産物
遺伝子ではなく、選択遺伝子のみへリゲートすることが
でき、そしてベクターが結合していても結合していなく
てもそうである。ほん訳ストップコードンからポリアデ
ニル化部位を分離する配列は、好ましくはプロモートさ
れない真核性遺伝子のようなほん訳されないオリゴヌク
レオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドおよび
遺伝子はプロモーターを付与されないので、それらは発
現されないであろう。該オリゴヌクレオチドはストップ
コードンからポリアデニル化部位まで約1,000塩基まで
のオーダーでかなりの距離延長しなければならない。こ
の３′非ほん訳オリゴヌクレオチドは、一般に生産物収
率の増加をもたらす。該ベクターはコンセンサス配列か
ら下流約10ないし約30bpで終わることができるが、しか
しその野生タイプ環境においてポリアデニル化部位から
下流に見出される３′配列を保持することが好ましい。
これら配列は、典型的にはポリアデニル化部位から下流
へ約200ないし600塩基対延長する。
こゝに記載したベクターは当業者によく知られた技術に
よって合成することができる。選択遺伝子、エンハンサ
ー、プロモーター等のようなベクターの成分は天然源か
ら得ることもできるし、または前記のように合成するこ
ともできる。基本的には、もし成分がビールス機能のよ
うな成分のように、大量に入手し得るDNA中に見出され
るならば、またはポリアデニル化部位のようにそれらを
合成し得るならば、適当な制限酵素の使用により、大量
のベクターは、単に起源生物を培養し、そのDNAを適当
なエンドヌクレアーゼで消化し、DNA断片を分離し、興
味ある要素を含んでいるDNAを同定し、そしてそれを回
収することによって得ることができる。通常、形質転換
ベクターは小量組立てられ、そして次に真核性プラスミ
ドまたはファージのような適当な自律的に複製する合成
ベクターへリゲートされるであろう。大部分の場合、pB
R322ブラスミドを使用することができる。前出Kaufman
et al参照。
よって合成することができる。選択遺伝子、エンハンサ
ー、プロモーター等のようなベクターの成分は天然源か
ら得ることもできるし、または前記のように合成するこ
ともできる。基本的には、もし成分がビールス機能のよ
うな成分のように、大量に入手し得るDNA中に見出され
るならば、またはポリアデニル化部位のようにそれらを
合成し得るならば、適当な制限酵素の使用により、大量
のベクターは、単に起源生物を培養し、そのDNAを適当
なエンドヌクレアーゼで消化し、DNA断片を分離し、興
味ある要素を含んでいるDNAを同定し、そしてそれを回
収することによって得ることができる。通常、形質転換
ベクターは小量組立てられ、そして次に真核性プラスミ
ドまたはファージのような適当な自律的に複製する合成
ベクターへリゲートされるであろう。大部分の場合、pB
R322ブラスミドを使用することができる。前出Kaufman
et al参照。
合成ベクターは、例えばパーミッシブな真核生物のトラ
ンスフェクション、高コピー数への合成ベクターの複
製、細胞溶解による合成ベクターの回収、および細胞片
から合成ベクターの分離によって、慣用手法によりリゲ
ートした形質転換ベクターをクローン化するために使用
される。
ンスフェクション、高コピー数への合成ベクターの複
製、細胞溶解による合成ベクターの回収、および細胞片
から合成ベクターの分離によって、慣用手法によりリゲ
ートした形質転換ベクターをクローン化するために使用
される。
合成ベクターの得られる収穫物は真核性細胞へ直接トラ
ンスフェクトすることができ、または形質転換ベクター
は、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子量による分
離、および形質転換ベクターの回収によって、合成ベク
ターから救出することができる。形質変換ベクター救出
は、合成ベクターの残部が真核性遺伝子増幅、転写また
はほん訳に悪影響しない限り必要でない。例えば、こゝ
で好ましい合成ベクターは、真核細胞に対して有害な配
列を除去したE.Coli変異株プラスミドpBR322である。前
出Kaufman et al参照。この変異株の使用は、同時形質
転換前に、プラスミド残部を除去する必要性を全くなく
す。
ンスフェクトすることができ、または形質転換ベクター
は、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子量による分
離、および形質転換ベクターの回収によって、合成ベク
ターから救出することができる。形質変換ベクター救出
は、合成ベクターの残部が真核性遺伝子増幅、転写また
はほん訳に悪影響しない限り必要でない。例えば、こゝ
で好ましい合成ベクターは、真核細胞に対して有害な配
列を除去したE.Coli変異株プラスミドpBR322である。前
出Kaufman et al参照。この変異株の使用は、同時形質
転換前に、プラスミド残部を除去する必要性を全くなく
す。
同時形質転換、選択および増幅の検出 形質転換すべき細胞はイースプロトプラストを含む任意
の真核細胞でよいが、しかし通常は非カビ細胞である。
一次体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含
む）、および死滅しないおよび／または形質転換された
細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優
性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくて
もよい。
の真核細胞でよいが、しかし通常は非カビ細胞である。
一次体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含
む）、および死滅しないおよび／または形質転換された
細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優
性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくて
もよい。
細胞は、好ましくは前に論じたように安定な哺乳類細胞
ラインであろう。それらの染色体DNA中へ選択遺伝子を
安定に統合することが知られた細胞ライン、例えばチャ
イニーズハムスター卵（CHO）細胞ラインが最良であ
る。COSサル細胞、Bowes細胞ラインのようなメラノーマ
細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維芽細胞、および
マウスNIH 3T3細胞も使用し得る。
ラインであろう。それらの染色体DNA中へ選択遺伝子を
安定に統合することが知られた細胞ライン、例えばチャ
イニーズハムスター卵（CHO）細胞ラインが最良であ
る。COSサル細胞、Bowes細胞ラインのようなメラノーマ
細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維芽細胞、および
マウスNIH 3T3細胞も使用し得る。
未結合ベクターによる同時転換は、順次または同時に達
成することができる（米国特許第4,399,216号を見
よ）。細胞のDNA摂取を容易にする方法は前に記載され
ている。細胞核中へのベクターのマイクロ注入は最高形
質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸カルシウム
沈澱の形のDNAへ親細胞を露出するのが最も便利であ
る。かなり良い同時形質転換効率は、100:1のオーダー
の選択遺伝子に対する生成物のモル過剰による同時形質
転換から得られる。
成することができる（米国特許第4,399,216号を見
よ）。細胞のDNA摂取を容易にする方法は前に記載され
ている。細胞核中へのベクターのマイクロ注入は最高形
質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸カルシウム
沈澱の形のDNAへ親細胞を露出するのが最も便利であ
る。かなり良い同時形質転換効率は、100:1のオーダー
の選択遺伝子に対する生成物のモル過剰による同時形質
転換から得られる。
形質転換条件へ曝露された細胞の個体群は次にトランス
フォーマントを同定するために処理される。同時形質転
換のために処理された培養物の小個体群だけが選択遺伝
子の表現型を示すであろう。培養物中の細胞は表現型に
ついてスクリーニングされる。これら細胞を個々に細胞
選別装置でアッセイすることによって達成することがで
き、その場合、表現型は選択遺伝子によって生産された
酵素による螢光源物質の開裂時の螢光のような信号を発
生する表現型である。しかしながら、好ましくは該表現
型は、前に詳しく論じたような特別の発育培地中でトラ
ンスフォーマントのみが発育または生存することを可能
とする。
フォーマントを同定するために処理される。同時形質転
換のために処理された培養物の小個体群だけが選択遺伝
子の表現型を示すであろう。培養物中の細胞は表現型に
ついてスクリーニングされる。これら細胞を個々に細胞
選別装置でアッセイすることによって達成することがで
き、その場合、表現型は選択遺伝子によって生産された
酵素による螢光源物質の開裂時の螢光のような信号を発
生する表現型である。しかしながら、好ましくは該表現
型は、前に詳しく論じたような特別の発育培地中でトラ
ンスフォーマントのみが発育または生存することを可能
とする。
選択トランスフォーマントは、次に生産物遺伝子のそれ
らの染色体へのリゲーションについて、または生産物自
体の発現についてスクリーニングされる。前者はサウザ
ンブロット分析によって達成することができ、後者は標
準的な免疫学的または酵素的アッセイによって達成する
ことができる。
らの染色体へのリゲーションについて、または生産物自
体の発現についてスクリーニングされる。前者はサウザ
ンブロット分析によって達成することができ、後者は標
準的な免疫学的または酵素的アッセイによって達成する
ことができる。
トランスフォーマントが同定されたならば、MTXのよう
な選択剤の存在下さらにクローニングすることによって
生産物遺伝子の表現を増幅するためのステップが実施さ
れる。米国特許第4,399,216号を見よ。
な選択剤の存在下さらにクローニングすることによって
生産物遺伝子の表現を増幅するためのステップが実施さ
れる。米国特許第4,399,216号を見よ。
こゝに記載したプロセスに従って調製し得るトランスフ
ォーマントは、公知技術による高等生物の生体内トラン
スフェクションに適している。可能性ある宿主動物の一
次体外移植物または安定な細胞ラインが同時形質転換さ
れ、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝子型的に欠け
ている実質上ほかに同質遺伝子的な宿主に接種される。
ォーマントは、公知技術による高等生物の生体内トラン
スフェクションに適している。可能性ある宿主動物の一
次体外移植物または安定な細胞ラインが同時形質転換さ
れ、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝子型的に欠け
ている実質上ほかに同質遺伝子的な宿主に接種される。
本発明は、以下の例証具体例を参照してさらに理解され
るであろう。該具体例は純粋に例示であり、そして請求
の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと
解すべきではない。
るであろう。該具体例は純粋に例示であり、そして請求
の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと
解すべきではない。
特記しない限り、制限エンドヌクレアーゼはそれらの商
業的供給者が推奨する条件および態様で使用される。リ
ゲーション反応は、Maniatis et al., Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Labor
atory 1982）,245−６頁（その記載を参照としこゝに取
り入れる）に記載されているように、その第246頁に記
載されている緩衝液を使用し、そしてDNA濃度１〜100μ
g/mgを使用し、鈍いDNA末端に対しては23℃の温度にお
いて、そしてくっつき易いDNA末端に対しては16℃にお
いて実施される。こゝに記載した“フォスフォターゼ処
理”とはDNAの脱フォスフォリル化を意味し、そして前
出Maniatis et al.の133頁等に記載されている態様で実
施される。“キナーゼ処理”とはDNAのフォスフォリル
化を意味する。電気泳動は、90mMトリス−ホウ酸塩,10m
M EDTAを含有する0.5〜1.5％アガロースゲル中で実施さ
れる。“ニック−トランスレーティング”とは、Rigby
et al.,J.Mol.Biol.,113:237（1977）に記載されている
ように、DNAを32pで標識する方法を意味する。すべての
放射標識したDNAは、どのような標識技術が使用されよ
うが、32pで標識される。
業的供給者が推奨する条件および態様で使用される。リ
ゲーション反応は、Maniatis et al., Molecular Clon
ing,A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Labor
atory 1982）,245−６頁（その記載を参照としこゝに取
り入れる）に記載されているように、その第246頁に記
載されている緩衝液を使用し、そしてDNA濃度１〜100μ
g/mgを使用し、鈍いDNA末端に対しては23℃の温度にお
いて、そしてくっつき易いDNA末端に対しては16℃にお
いて実施される。こゝに記載した“フォスフォターゼ処
理”とはDNAの脱フォスフォリル化を意味し、そして前
出Maniatis et al.の133頁等に記載されている態様で実
施される。“キナーゼ処理”とはDNAのフォスフォリル
化を意味する。電気泳動は、90mMトリス−ホウ酸塩,10m
M EDTAを含有する0.5〜1.5％アガロースゲル中で実施さ
れる。“ニック−トランスレーティング”とは、Rigby
et al.,J.Mol.Biol.,113:237（1977）に記載されている
ように、DNAを32pで標識する方法を意味する。すべての
放射標識したDNAは、どのような標識技術が使用されよ
うが、32pで標識される。
“ラピッド プレップ”とは、例えば前出Maniatis et
al.365−373頁に記載されているバクテリオファージま
たはプラスミドDNAの急速小規模生産を意味する。
al.365−373頁に記載されているバクテリオファージま
たはプラスミドDNAの急速小規模生産を意味する。
本発明の他の局面によれば、AHFの医薬製剤が提供され
る。本発明に従って生産されたヒトAHFの医薬製剤は、
この技術分野においてよく知られた操作に従って非経口
投与のために製造される。
る。本発明に従って生産されたヒトAHFの医薬製剤は、
この技術分野においてよく知られた操作に従って非経口
投与のために製造される。
ヒトに使用される医薬製剤は、形質転換した細胞から採
取した滅菌したAHFを含む。AHFポリペプチドまたはAHF
活性を産生するその十分な部分に加え、一種またはそれ
以上の許容し得るその担体と、そして場合により他の治
療成分を含むことができる。担体は、製剤の他の成分と
共存し得るとの意味において許容し得るものでなければ
ならず、そしてその受容者にとって有害であってはなら
ない。該製剤は、単位投与形態で便利に提供されること
ができ、そして薬剤学の分野において良く知られた任意
の方法によって製造することができる。
取した滅菌したAHFを含む。AHFポリペプチドまたはAHF
活性を産生するその十分な部分に加え、一種またはそれ
以上の許容し得るその担体と、そして場合により他の治
療成分を含むことができる。担体は、製剤の他の成分と
共存し得るとの意味において許容し得るものでなければ
ならず、そしてその受容者にとって有害であってはなら
ない。該製剤は、単位投与形態で便利に提供されること
ができ、そして薬剤学の分野において良く知られた任意
の方法によって製造することができる。
非経口投与に適した本発明の医薬製剤は、有利には、好
ましくは受容者の血液と等張である溶液をつくるため滅
菌した溶液の添加によって復元し得るAHFポリペプチド
の無菌凍結乾燥製剤を含むことができる。該製剤は、単
位または多数投与容器、例えばシールしたアンプルまた
はバイアル中に提供することができる。
ましくは受容者の血液と等張である溶液をつくるため滅
菌した溶液の添加によって復元し得るAHFポリペプチド
の無菌凍結乾燥製剤を含むことができる。該製剤は、単
位または多数投与容器、例えばシールしたアンプルまた
はバイアル中に提供することができる。
無菌AHFまたはその溶液に加え、本発明の医薬製剤は希
釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、
保存剤（抗酸化剤を含む）その他のような一種またはそ
れ以上の追加の成分を含んでもよい。ゼラチン、乳糖、
デンプン、ステアリン酸マグネシウム、微粉シリカゲ
ル、ココアバター、タルク、植物性および動物性油脂、
植物性ゴム、およびポリアルキレングリコール、および
医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の医薬製剤の製
造に適している。非経口用途のための製剤は、担体であ
る水または薬剤学的に許容し得る液体の無菌溶液または
懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容し得る液体で
希釈するための無菌固体AHFを含む。
釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、
保存剤（抗酸化剤を含む）その他のような一種またはそ
れ以上の追加の成分を含んでもよい。ゼラチン、乳糖、
デンプン、ステアリン酸マグネシウム、微粉シリカゲ
ル、ココアバター、タルク、植物性および動物性油脂、
植物性ゴム、およびポリアルキレングリコール、および
医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の医薬製剤の製
造に適している。非経口用途のための製剤は、担体であ
る水または薬剤学的に許容し得る液体の無菌溶液または
懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容し得る液体で
希釈するための無菌固体AHFを含む。
本発明の医薬製剤は、血友病Ａの治療に有用である。こ
れら製剤はまた、血液凝固が関与するプロセスの生体内
および生体外研究において、およびAHF分子の免疫学的
および生物学的特徴の研究において、重要な道具を提供
する。
れら製剤はまた、血液凝固が関与するプロセスの生体内
および生体外研究において、およびAHF分子の免疫学的
および生物学的特徴の研究において、重要な道具を提供
する。
実施例１ タンパク配列分析 ブタファクターVIII:Cを前出のKnutsenおよびFass（198
2）;Fass et al.（1982）に発表された操作に従って、D
avid Fassによって精製された。アミノ酸配列分析は、
以下に記載する76,000ダルトンタンパクのウシトロンビ
ン消化生成物について実施される。
2）;Fass et al.（1982）に発表された操作に従って、D
avid Fassによって精製された。アミノ酸配列分析は、
以下に記載する76,000ダルトンタンパクのウシトロンビ
ン消化生成物について実施される。
抗VIII:Cモノクロナール抗体カラムへ結合したブタAHF
ポリペプチドは、２ステップにおいて次々に溶離される
ことができる（Fass et al.1982）。二種の巨大分子量
スペシス,166,000および130,000ダルトンはEDTAで溶離
し得る。約76,000ダルトンの分子量を有する残りのポリ
ペプチドは、次に50％エチレングリコールで溶離するこ
とができる。
ポリペプチドは、２ステップにおいて次々に溶離される
ことができる（Fass et al.1982）。二種の巨大分子量
スペシス,166,000および130,000ダルトンはEDTAで溶離
し得る。約76,000ダルトンの分子量を有する残りのポリ
ペプチドは、次に50％エチレングリコールで溶離するこ
とができる。
76,000ダルトンのタンパクは、5mMトリス−HCl（pH7.
5）,0.15M NaCl中における広汎な透析の後、トロンビン
で消化する。ウシトロンビン消化は、ウシトロンビン１
単位/mlを用いて室温で60分間実施し、さらにトロンビ
ン１単位/mlを加え、そしてさらに60分間インキュベー
トする。トロンビン消化は0.01％SDS中で90℃で10分間
加熱することによって打ち切る。76,000ダルトンタンパ
クの主なトロンビン消化生成物は、69,000ダルトン（69
Kd）のポリペプチドである。
5）,0.15M NaCl中における広汎な透析の後、トロンビン
で消化する。ウシトロンビン消化は、ウシトロンビン１
単位/mlを用いて室温で60分間実施し、さらにトロンビ
ン１単位/mlを加え、そしてさらに60分間インキュベー
トする。トロンビン消化は0.01％SDS中で90℃で10分間
加熱することによって打ち切る。76,000ダルトンタンパ
クの主なトロンビン消化生成物は、69,000ダルトン（69
Kd）のポリペプチドである。
前記の69Kdポリペプチドスペシスの１μｇ以下を、U.K.
Laemmli,Nature,277:680（1970）（その記載をこゝに参
照として取り入れる）の操作によりSDSゲル電気泳動
後、放射性マーカーとして役立つようにヨード化する。
TAS緩衝液（50mMトリス−酢酸塩（pH7.8）,0.1％SDS）
中に溶解したポリペプチドを、担体を含まないヨウ素−
125の5mCiを含む同じ緩衝液100μへ加える。TAS緩衝
液中2.5mg/mlのクロラミンＴ（ベーカー）50μを加
え、溶液を１分間かきまぜる。反応をTAS緩衝液中メタ
重亜硫酸ナトリウム2.5mg/ml溶液50μを加え、１分間
かきまぜることによって停止する。標識したタンパクは
小容積のセファデックスＧ−25Mカラム（PD−10,ファル
マシア）を使用するクロマトグラフィーにより、取り込
まれなかったI125から分離する。該カラムは、ヨウ化ナ
トリウム2.5mg/mlを含むTAS緩衝液の数倍カラム容積を
もってあらかじめ平衡化される。空容積を集め、そして
タンパク完全性を前出Laemmli（1970）の操作に従ってS
DSゲル電気泳動によって分析する。
Laemmli,Nature,277:680（1970）（その記載をこゝに参
照として取り入れる）の操作によりSDSゲル電気泳動
後、放射性マーカーとして役立つようにヨード化する。
TAS緩衝液（50mMトリス−酢酸塩（pH7.8）,0.1％SDS）
中に溶解したポリペプチドを、担体を含まないヨウ素−
125の5mCiを含む同じ緩衝液100μへ加える。TAS緩衝
液中2.5mg/mlのクロラミンＴ（ベーカー）50μを加
え、溶液を１分間かきまぜる。反応をTAS緩衝液中メタ
重亜硫酸ナトリウム2.5mg/ml溶液50μを加え、１分間
かきまぜることによって停止する。標識したタンパクは
小容積のセファデックスＧ−25Mカラム（PD−10,ファル
マシア）を使用するクロマトグラフィーにより、取り込
まれなかったI125から分離する。該カラムは、ヨウ化ナ
トリウム2.5mg/mlを含むTAS緩衝液の数倍カラム容積を
もってあらかじめ平衡化される。空容積を集め、そして
タンパク完全性を前出Laemmli（1970）の操作に従ってS
DSゲル電気泳動によって分析する。
放射標識した69Kdタンパクを後のモニタリングのためそ
の未標識対応タンパクへ加える。該タンパクは次に個々
に電気泳動的に濃縮される。タンパク溶液は0.1％SDS,1
0mMジチオスレイトールへ調節され、そしてCoomassieブ
リリアントブルー（Serva）を加え、溶液を非常に薄く
ブルーに着色する。
の未標識対応タンパクへ加える。該タンパクは次に個々
に電気泳動的に濃縮される。タンパク溶液は0.1％SDS,1
0mMジチオスレイトールへ調節され、そしてCoomassieブ
リリアントブルー（Serva）を加え、溶液を非常に薄く
ブルーに着色する。
溶液は次にスペクトラポア透析チューブ（約14,000の分
子量カットを有するSpectrum Medical Industries,Inc.
製）を使用してTAS緩衝液中で大体透析する。透析した
タンパクサンプルは、次にHunkapiller et al.,Meth.En
zymol.,Enzyme Structures,PartI,91:227（1983）によ
って示された設計の電気泳動濃縮装置に入れられ、TAS
緩衝液中で24時間50ボルトで濃縮される。
子量カットを有するSpectrum Medical Industries,Inc.
製）を使用してTAS緩衝液中で大体透析する。透析した
タンパクサンプルは、次にHunkapiller et al.,Meth.En
zymol.,Enzyme Structures,PartI,91:227（1983）によ
って示された設計の電気泳動濃縮装置に入れられ、TAS
緩衝液中で24時間50ボルトで濃縮される。
上の操作で濃縮された69Kd AHFポリペプチドは、前出La
emmliに従ってSDS−ポリアクリルアミドゲルを通して電
気泳動される。放射標識されたトレーサーポリペプチド
のオートラジオグラフィーによって同定される、精製さ
れたタンパクがゲルから切り出され、電気溶離され、そ
して前出Hunkapiller et al.によって記載されたように
濃縮される。濃縮されたタンパクは、Hewick et al.,J.
Biol,Chem.256:7990（1981）に記載された気相シーケネ
ーターを使用する直接アミノ酸配列分析に適している。
emmliに従ってSDS−ポリアクリルアミドゲルを通して電
気泳動される。放射標識されたトレーサーポリペプチド
のオートラジオグラフィーによって同定される、精製さ
れたタンパクがゲルから切り出され、電気溶離され、そ
して前出Hunkapiller et al.によって記載されたように
濃縮される。濃縮されたタンパクは、Hewick et al.,J.
Biol,Chem.256:7990（1981）に記載された気相シーケネ
ーターを使用する直接アミノ酸配列分析に適している。
69,000ダルトントロンビン開裂生成物の２−42残基を延
びるアミノ末端配列は、第１図に図示するとおりであ
る。１番目の残基“X"は同定できなかった。前出Fass e
t al.によって記載された166Kd AHF断片の（Ａ）アミノ
末端および（Ｂ）それからの40Kdウシトロンビン消化生
成物のアミノ酸配列は第２図に示されている。76Kdポリ
ペプチドのアミノ末端は、Ｘ−Ile Ser Leu Pro Thr Ph
e Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile
Pheである。
びるアミノ末端配列は、第１図に図示するとおりであ
る。１番目の残基“X"は同定できなかった。前出Fass e
t al.によって記載された166Kd AHF断片の（Ａ）アミノ
末端および（Ｂ）それからの40Kdウシトロンビン消化生
成物のアミノ酸配列は第２図に示されている。76Kdポリ
ペプチドのアミノ末端は、Ｘ−Ile Ser Leu Pro Thr Ph
e Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile
Pheである。
実施例２ ブタAHF遺伝子のためのオリゴヌクレオチド
プローブの化学的合成 （ａ）ペンタペプチドプローブ給源 決定されたブタAHF断片の部分的アミノ酸配列は、ブタA
HFオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして合成す
ることを許容する。遺伝暗号（表１）から、このアミノ
酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが可能で
ある。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列毎に二
つ以上の可能性あるDNAコード配列が存在する。従っ
て、正確なDNA配列を確かめるため、合理的な数のオリ
ゴヌクレオチドのみを必要とするAHF分子の区域に対し
て複数の相補性オリゴヌクレオチドプローブ配列が容易
される。そのような区域は、最低の変性度を有する５個
ないし８個の連続するアミノ酸配列をサーチすることに
よって選択される。該区域が選択された後、オリゴヌク
レオチドの給源が合成され、それは選択された区域の５
個ないし８個のアミノ酸をコードできるすべての可能性
あるDNA配列を含むであろう。
プローブの化学的合成 （ａ）ペンタペプチドプローブ給源 決定されたブタAHF断片の部分的アミノ酸配列は、ブタA
HFオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして合成す
ることを許容する。遺伝暗号（表１）から、このアミノ
酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが可能で
ある。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列毎に二
つ以上の可能性あるDNAコード配列が存在する。従っ
て、正確なDNA配列を確かめるため、合理的な数のオリ
ゴヌクレオチドのみを必要とするAHF分子の区域に対し
て複数の相補性オリゴヌクレオチドプローブ配列が容易
される。そのような区域は、最低の変性度を有する５個
ないし８個の連続するアミノ酸配列をサーチすることに
よって選択される。該区域が選択された後、オリゴヌク
レオチドの給源が合成され、それは選択された区域の５
個ないし８個のアミノ酸をコードできるすべての可能性
あるDNA配列を含むであろう。
ブタAHFの69,000ダルトントロンビン開裂断片において
は、アミノ末端から18番目ないし22番目のアミノ酸まで
を含むペンタペプチド配列があり、これは、15個のヌク
レオチド長さに対し、めいめい５個のコードンを有する
16個までの異なるDNA配列によってコードされることが
できる。
は、アミノ末端から18番目ないし22番目のアミノ酸まで
を含むペンタペプチド配列があり、これは、15個のヌク
レオチド長さに対し、めいめい５個のコードンを有する
16個までの異なるDNA配列によってコードされることが
できる。
プローブは、混合物あたり２ないし８またはそれ以上の
オリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られ
た数の混合物を合成することによってつくられる。すべ
ての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源が
つくられる。
オリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られ
た数の混合物を合成することによってつくられる。すべ
ての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源が
つくられる。
これらオリゴヌクレオチドは、例えば、その記載を参照
としこゝに取り入れるR.L.Letsinger et al.,J.Am,Che
m.Soc.98:3655（1967）に開示されているフォスフォト
リエステル法により、人手によって合成することができ
る。他の方法はこの分野で良く知られている。こゝにそ
の記載を参照として取り入れたMatteucciおよびCaruthe
rs,J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）参照。
としこゝに取り入れるR.L.Letsinger et al.,J.Am,Che
m.Soc.98:3655（1967）に開示されているフォスフォト
リエステル法により、人手によって合成することができ
る。他の方法はこの分野で良く知られている。こゝにそ
の記載を参照として取り入れたMatteucciおよびCaruthe
rs,J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）参照。
しかしながら、好ましくは所望のポリペプチド配列のた
めの合成オリゴヌクレオチドプローブは、上に示した完
全自動アプライド、バイオシステムズ、DNAシンセサイ
ザーの助けにより、同じ化学によって合成される。
めの合成オリゴヌクレオチドプローブは、上に示した完
全自動アプライド、バイオシステムズ、DNAシンセサイ
ザーの助けにより、同じ化学によって合成される。
このように製造されたオリゴヌクレオチドは、次にその
記載を参照としてこゝに取り入れたH.Fritz et al.,Bio
chemistry,17:1257（1978）に記載されているような逆H
PLCカラム上で精製することができる。80％HOAcによる
脱トリチル化の後、得られるオリゴヌクレオチドは通常
純粋であり、そしてプローブとして直接使用することが
できる。もし夾雑物があれば、合成DNAは好ましくは少
し異なる勾配システムを使用して、同じHPLCカラム上で
さらに精製することができる。
記載を参照としてこゝに取り入れたH.Fritz et al.,Bio
chemistry,17:1257（1978）に記載されているような逆H
PLCカラム上で精製することができる。80％HOAcによる
脱トリチル化の後、得られるオリゴヌクレオチドは通常
純粋であり、そしてプローブとして直接使用することが
できる。もし夾雑物があれば、合成DNAは好ましくは少
し異なる勾配システムを使用して、同じHPLCカラム上で
さらに精製することができる。
オリゴヌクレオチドは〔−32p〕ATPおよびT4ポリペプチ
ドキナーゼを使用することによって標識され、そしてそ
れらの配列は、その記載を参照として取り入れるSanger
et al.,PNAS U.S.A.70:1209（1973）に記載された二次
元クロマトグラフィーにより、またはMeth.Enzymology
65:499（1977）記載のMaxan−Gilbert法によって検定
される。
ドキナーゼを使用することによって標識され、そしてそ
れらの配列は、その記載を参照として取り入れるSanger
et al.,PNAS U.S.A.70:1209（1973）に記載された二次
元クロマトグラフィーにより、またはMeth.Enzymology
65:499（1977）記載のMaxan−Gilbert法によって検定
される。
（ｂ）45個ヌクレオチドプローブ 本発明の独特な面は、AHF遺伝子またはその断片につい
てゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするため、
オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。オ
リゴヌクレオチドはcDNAライブラリーをスクリーニング
するために使用されているが（ここにその記載を参照と
して取り入れるM.Jaye et al.,Nuclei Acid Research,1
1:2325（1982）参照）、ゲノムライブラリーは以前cDNA
プローブのみにより、すなわち記載されたタンパクのた
めの組織源が同定され、そしてゲノムサーチによって発
見された遺伝子のDNA配列に正確にマッチしたcDNAを生
産するのに用いられた後で生産されたプローブにより成
功してスクリーニングされていた。
てゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするため、
オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。オ
リゴヌクレオチドはcDNAライブラリーをスクリーニング
するために使用されているが（ここにその記載を参照と
して取り入れるM.Jaye et al.,Nuclei Acid Research,1
1:2325（1982）参照）、ゲノムライブラリーは以前cDNA
プローブのみにより、すなわち記載されたタンパクのた
めの組織源が同定され、そしてゲノムサーチによって発
見された遺伝子のDNA配列に正確にマッチしたcDNAを生
産するのに用いられた後で生産されたプローブにより成
功してスクリーニングされていた。
本件の場合、興味あるタンパクのアミノ酸配列をコード
するゲノムライブラリー中の遺伝子セグメントを同定す
るためにオリゴヌクレオチドを使用することが可能であ
ることが示され、そしてそのような遺伝子セグメントの
同定はmRNA,cDNAまたはその後のゲノムスクリーニング
技術に使用するための性格なプローブを提供する。
するゲノムライブラリー中の遺伝子セグメントを同定す
るためにオリゴヌクレオチドを使用することが可能であ
ることが示され、そしてそのような遺伝子セグメントの
同定はmRNA,cDNAまたはその後のゲノムスクリーニング
技術に使用するための性格なプローブを提供する。
好ましくは、こゝでそうであるように、興味あるタンパ
クのアミノ酸配列の少なくとも２個のセグメントに対応
するオリグヌクレオチドが使用される。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドプローブの少なくとも１個が、選択さ
れたアミノ酸配列をコードし得るすべての可能性あるDN
A配列を総合して含むオリゴヌクレオチドの一つまたは
それ以上の給源の形で使用される。好ましくは、比較的
短いプローブ、例えば11ないし25ヌクレオチド、好まし
くは15ないし20ヌクレオチドが比較的長いプローブ、例
えば30ないし200ヌクレオチド、好ましくは40ないし50
ヌクレオチドと組合せて使用される。２番目のプローブ
は確認のために使用することができ、そしてDNAセグメ
ントの同定のためには常に必要ではない。好ましくは、
プローブの一方、そしてもっと好ましくは長い方のプロ
ーブは以下に記載する規則１ないし４に従って設計され
る。
クのアミノ酸配列の少なくとも２個のセグメントに対応
するオリグヌクレオチドが使用される。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドプローブの少なくとも１個が、選択さ
れたアミノ酸配列をコードし得るすべての可能性あるDN
A配列を総合して含むオリゴヌクレオチドの一つまたは
それ以上の給源の形で使用される。好ましくは、比較的
短いプローブ、例えば11ないし25ヌクレオチド、好まし
くは15ないし20ヌクレオチドが比較的長いプローブ、例
えば30ないし200ヌクレオチド、好ましくは40ないし50
ヌクレオチドと組合せて使用される。２番目のプローブ
は確認のために使用することができ、そしてDNAセグメ
ントの同定のためには常に必要ではない。好ましくは、
プローブの一方、そしてもっと好ましくは長い方のプロ
ーブは以下に記載する規則１ないし４に従って設計され
る。
規則1.コードン優先性 他の配慮なしに、類似の哺乳類遺伝子中の支配的または
類似の配列にマッチしたヌクレオチドが選ばれた。Mech
anism of Ageing Dev.,18:（1982）参照。
類似の配列にマッチしたヌクレオチドが選ばれた。Mech
anism of Ageing Dev.,18:（1982）参照。
規則2.有利なGT対合 ヌクレオチドＧは、その相補体Ｃへの結合に加えて、ヌ
クレオチドＴと弱い結合を生成し得る。Agarwal et a
l.,J.Biol.Chem.256:1023（1981）参照。このため、不
確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの選択に
直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし生ずる
ハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドがＣでな
く、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド化はな
お安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれたなら
ば、対応するA:C不和合性はプローブがゲノムDNAとハイ
ブリッド化する能力を破壊するのに十分であり得る。
クレオチドＴと弱い結合を生成し得る。Agarwal et a
l.,J.Biol.Chem.256:1023（1981）参照。このため、不
確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの選択に
直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし生ずる
ハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドがＣでな
く、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド化はな
お安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれたなら
ば、対応するA:C不和合性はプローブがゲノムDNAとハイ
ブリッド化する能力を破壊するのに十分であり得る。
規則3.5′CG配列の回避 可能性ある不確実性から選択する時、コードン内にせ
よ、コードン間にせよ,5′CpG配列を含まないヌクレオ
チドを選択せよ。
よ、コードン間にせよ,5′CpG配列を含まないヌクレオ
チドを選択せよ。
規則4.ミスマッチ位置 使用のためコードン配列を選ぶにあたり、分子の末端近
くのミスマッチは、分子の中心近くのミスマッチほどハ
イブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。こ
のため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な
疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に
近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレ
オチド配列の給源をテストすることであったが、プロー
ブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づく
決定の対象らしかった。
くのミスマッチは、分子の中心近くのミスマッチほどハ
イブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。こ
のため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な
疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に
近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレ
オチド配列の給源をテストすることであったが、プロー
ブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づく
決定の対象らしかった。
45−マ−プローブのため選ばれた配列およびアミノ酸配
列、可能性あるDNA配列、および実際のプローブ配列、
すなわちAHFエクソンのために決定された実際にコード
するストランドの相補体は第３図に示すとおりである。
列、可能性あるDNA配列、および実際のプローブ配列、
すなわちAHFエクソンのために決定された実際にコード
するストランドの相補体は第３図に示すとおりである。
このようにして、選択を含むヌクレオチド位置の中で、
３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択群を含む給源
を使用することによってカバーされ、５種が正しく予測
され、１種が正しくないが幾分中立性を維持することが
予測され、そして他の４種は誤りであった。
３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択群を含む給源
を使用することによってカバーされ、５種が正しく予測
され、１種が正しくないが幾分中立性を維持することが
予測され、そして他の４種は誤りであった。
約11％のミスマッチ（5/45）にもかゝわらず、45−マ−
オリゴヌクレオチドの給源は、以下記載するようにブタ
AHF遺伝子断片を強く同定するために適切である。
オリゴヌクレオチドの給源は、以下記載するようにブタ
AHF遺伝子断片を強く同定するために適切である。
実施例３ ブタゲノムライブラリーのスクリーニング ブタゲノムライブラリーがバクテリオファージベクター
ラムダJ1を使用して構成される。ラムダJ1はL47.1（Loe
nen et al.,Gene,20:249（1980））から、1.37kbおよび
2.83kb Eco RI−Bam HI断片を95kb Eco R1−Hind III−
Xba I−bg1 II−Bam HI ポリリンカーによって置換する
ことによって得られる。6.6kb Bam HI断片はその時L47.
1に関して逆の配向の直接の反復体として存在する。Bam
HI断片についてクローニング能力は8.6〜23.8kbであ
る。Bam HI開裂ブタDNA（Piccini et al.,Cell,30:205
（1982）に記載のように調製した）をフェノール抽出
し、エタノール沈澱し、そしてマイクロフュージ中の遠
心によって濃縮する。Bam HIブタDNA0.67μｇを、T4 DN
Aリガーゼ（前出Maniatis et al.,474頁）10単位を含む
10μｌリゲーション緩衝液中において、前出Maniatis e
t al.,275−279頁に記載するように調製したラムダJ1Ba
m HIアームの２μｇヘリゲートする。リゲートしてDNA
はパッケージされ、そして前出Maniatis et a.,291頁に
記載されているようにプレートされる。
ラムダJ1を使用して構成される。ラムダJ1はL47.1（Loe
nen et al.,Gene,20:249（1980））から、1.37kbおよび
2.83kb Eco RI−Bam HI断片を95kb Eco R1−Hind III−
Xba I−bg1 II−Bam HI ポリリンカーによって置換する
ことによって得られる。6.6kb Bam HI断片はその時L47.
1に関して逆の配向の直接の反復体として存在する。Bam
HI断片についてクローニング能力は8.6〜23.8kbであ
る。Bam HI開裂ブタDNA（Piccini et al.,Cell,30:205
（1982）に記載のように調製した）をフェノール抽出
し、エタノール沈澱し、そしてマイクロフュージ中の遠
心によって濃縮する。Bam HIブタDNA0.67μｇを、T4 DN
Aリガーゼ（前出Maniatis et al.,474頁）10単位を含む
10μｌリゲーション緩衝液中において、前出Maniatis e
t al.,275−279頁に記載するように調製したラムダJ1Ba
m HIアームの２μｇヘリゲートする。リゲートしてDNA
はパッケージされ、そして前出Maniatis et a.,291頁に
記載されているようにプレートされる。
約４×105pfuが、8,000pfu/プレートの割合でNZCYMアガ
ロースを収容した15cmプラスチックプトリ皿上のE.coli
株c600上にプレートされる。これら組換えファージは前
述の45−マ−プローブを使用してWooの方法（1979）に
よってスクリーニングされ、プローブとして、前述のよ
うに32pで放射標識される。フィルターが次に５×SSC,5
×Denhardt,0.1％SDS,および５×106cpm/mlプローブ中
で、45℃において16時間ハイブリッド化され、５×SSC,
0.1％SDS中50℃で洗浄され、そして高輝度スクリーン
（デュポン ライトニンク−プラス）を使用するオート
ラジオグラフィーへかけられる。オートラジオグラフィ
ーは、種々の程度で45−マ−とハイブリッド化したファ
ージを明らかにする。フィルターは次に0.5M NaOH中で
変性され、1.0M トリスpH7.5,1.5M NaCl中で中和され、
そしてハイブリッド化および洗浄温度が37℃であるほか
は45−マ−について記載したとおりに15−マ−へハイブ
リッド化する。両方のプローブへハイブリッド化された
一つのファージを元のプレートから取り、そして100pfu
をプレートし、溶菌斑を前記のように15−マ−をプロー
ブとして用いてスクリーニングする。
ロースを収容した15cmプラスチックプトリ皿上のE.coli
株c600上にプレートされる。これら組換えファージは前
述の45−マ−プローブを使用してWooの方法（1979）に
よってスクリーニングされ、プローブとして、前述のよ
うに32pで放射標識される。フィルターが次に５×SSC,5
×Denhardt,0.1％SDS,および５×106cpm/mlプローブ中
で、45℃において16時間ハイブリッド化され、５×SSC,
0.1％SDS中50℃で洗浄され、そして高輝度スクリーン
（デュポン ライトニンク−プラス）を使用するオート
ラジオグラフィーへかけられる。オートラジオグラフィ
ーは、種々の程度で45−マ−とハイブリッド化したファ
ージを明らかにする。フィルターは次に0.5M NaOH中で
変性され、1.0M トリスpH7.5,1.5M NaCl中で中和され、
そしてハイブリッド化および洗浄温度が37℃であるほか
は45−マ−について記載したとおりに15−マ−へハイブ
リッド化する。両方のプローブへハイブリッド化された
一つのファージを元のプレートから取り、そして100pfu
をプレートし、溶菌斑を前記のように15−マ−をプロー
ブとして用いてスクリーニングする。
PB 34と命名された陽性ファージをプラグとして取り、
そして前出Maniatis et an.,65−66頁に記載されている
ようにプレート溶解質をつくるために使用した。小規模
のPB 34 DNAの単離が前出Maniatis et al.,371−372頁
記載の操作を使用して達成される。このDNAの10μを
制限酵素 Hae IIIで切断し、次に子ウシアルカリ性フォ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を使用してラ
オスファターゼ処理された。フェノール抽出した後、Sm
a I切断 M13mp8 DNAを添加し、溶液を0.2M NaClとし、
そして２容積のエタノールの添加によって核酸を沈澱す
る。沈澱したDNAは遠心によってペレット化され、そし
てリゲーション混合物２μ中に再溶解され、そしてDN
Aは23℃で30分間リゲートされ、リガーゼ緩衝液で50μ
へ希釈され、さらに３時間リゲートされる。この反応
物５μがE.coli JM 101/TG 1株を形質転換するために
使用される。
そして前出Maniatis et an.,65−66頁に記載されている
ようにプレート溶解質をつくるために使用した。小規模
のPB 34 DNAの単離が前出Maniatis et al.,371−372頁
記載の操作を使用して達成される。このDNAの10μを
制限酵素 Hae IIIで切断し、次に子ウシアルカリ性フォ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を使用してラ
オスファターゼ処理された。フェノール抽出した後、Sm
a I切断 M13mp8 DNAを添加し、溶液を0.2M NaClとし、
そして２容積のエタノールの添加によって核酸を沈澱す
る。沈澱したDNAは遠心によってペレット化され、そし
てリゲーション混合物２μ中に再溶解され、そしてDN
Aは23℃で30分間リゲートされ、リガーゼ緩衝液で50μ
へ希釈され、さらに３時間リゲートされる。この反応
物５μがE.coli JM 101/TG 1株を形質転換するために
使用される。
細胞は、SOBM倍地50ml中（SOBMは、トリプトン２％，イ
ースト抽出物0.5％,NaCl0.1M,KOH0.11g/,20mM MgSO4
である）37℃でO.D.500 0.5まで発育させることによっ
て形質転換に対して適応させる。細胞は2500rpmにおい
て10分間４℃において遠心することによってペレット化
される。細胞は、100mM RbCl,45mM MnCl2,50mM CaCl2,1
0mM MESカリウムpH6.4（MES＝メチルエタンスルホン
酸）3.5ml中に再懸濁される。
ースト抽出物0.5％,NaCl0.1M,KOH0.11g/,20mM MgSO4
である）37℃でO.D.500 0.5まで発育させることによっ
て形質転換に対して適応させる。細胞は2500rpmにおい
て10分間４℃において遠心することによってペレット化
される。細胞は、100mM RbCl,45mM MnCl2,50mM CaCl2,1
0mM MESカリウムpH6.4（MES＝メチルエタンスルホン
酸）3.5ml中に再懸濁される。
適切な細胞200μがリゲーション反応物5ml中に含まれ
るDNAで０℃において30分間形質転換される。細胞は次
に42℃で90秒ヒートショックされ、その後静止JM 101/T
G 1細胞100μを含有する0.8％アガロース/SOBM4mlが
添加され、10cm SOBMアガロースペトリ皿上にプレート
される。
るDNAで０℃において30分間形質転換される。細胞は次
に42℃で90秒ヒートショックされ、その後静止JM 101/T
G 1細胞100μを含有する0.8％アガロース/SOBM4mlが
添加され、10cm SOBMアガロースペトリ皿上にプレート
される。
15−マ−へハイブリッド化する、PB34からのHae III断
片を含んでいるサブクローンが、前出のBentonおよびDa
visの操作を使用してスクリーニングすることによって
同定される。このクローンが単離され、鋳型として使用
するために調製される。34−H1と命名された、このクロ
ーン中に存在するHae III断片のDNA配列が第５図に示さ
れている。M 13鋳型DNAは感染させた細胞を37℃で５時
間生育することによって調製される。細胞はベックマン
マイクロフュージ中で10分間遠心することによってペレ
ット化される。上清1.0ml（ビールスを含んでいる）を
除去し、20％ポリエチレングリコール,2.5M NaCl200μ
を加える。このサンプルを次に室温で15分間インキュ
ベートし、ベックマンマイクロフュージ中で５分間遠心
する。ペレットをTE 100ml中に溶解し、4M NaCH3COOpH
4.5の7.5μを加え、そしてサンプルをフェノール−ク
ロロホルム1:1混合物で２回、そしてクロロホルムで１
回抽出する。単一ストランドのファージDNAを次にエタ
ノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱したDNA
はベックマンマイクロフュージ中の遠心によってペレッ
ト化し、1mM トリス pH 8.0,0.1mM EDTA30μ中に溶解
する。DNA配列決定は、15−マ−をプライマーとして使
用し、ジデオキシ鎖成端技術によって実施する。Sanger
et al.,PNAS U.S.A.,74:5463（1977）参照。第４図お
よび第５図に示した配列中に含まれる、観察された配列
は、第１に表した69kd断片のアミノ末端配列中のフェニ
ルアラニン２からグルタミン15までの区域によって囲ま
れた同じ14個のアミノ酸を含むので、該サブクローンが
ブタAHFエクソンを含んでいることを確認した。それ以
上の確認は、34−H1ベクター中のポリリンカーの隣接点
にユニバーサルプライマー（Bethesda Research Labs）
をプライミングすることにより、34−H1ベクター中のHa
e IIIインサートの５′端から配列決定することによっ
て得られた。また、34−H1と命名されたこのクローンか
らのインサートは、DNAをEco RIおよびHind IIIで制限
し、子ウシアルカリ性フォスファターゼでフォスファタ
ーゼ処理し、そしてEco RI,Hind III開裂 M13mp9 DNAへ
リゲートすることにより、M13mp9中へ再クローンされ
た。ユニバーサルプライマーに関してHae IIIセグメン
トの反転を含有するこのクローンも前述のように配列決
定された。インサート34−H1のすべてについての得られ
た配列データは第５図に示されている。この配列は、こ
のサブクローンは、ヌクレオチド169から267までにおい
て、69kd断片（第１図）のフェニルアラニン２からアル
ギニン31までの少なくとも30個のアミノ酸をコードでき
るブタAHF遺伝子のエクソンを含有していることを確認
する。
片を含んでいるサブクローンが、前出のBentonおよびDa
visの操作を使用してスクリーニングすることによって
同定される。このクローンが単離され、鋳型として使用
するために調製される。34−H1と命名された、このクロ
ーン中に存在するHae III断片のDNA配列が第５図に示さ
れている。M 13鋳型DNAは感染させた細胞を37℃で５時
間生育することによって調製される。細胞はベックマン
マイクロフュージ中で10分間遠心することによってペレ
ット化される。上清1.0ml（ビールスを含んでいる）を
除去し、20％ポリエチレングリコール,2.5M NaCl200μ
を加える。このサンプルを次に室温で15分間インキュ
ベートし、ベックマンマイクロフュージ中で５分間遠心
する。ペレットをTE 100ml中に溶解し、4M NaCH3COOpH
4.5の7.5μを加え、そしてサンプルをフェノール−ク
ロロホルム1:1混合物で２回、そしてクロロホルムで１
回抽出する。単一ストランドのファージDNAを次にエタ
ノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱したDNA
はベックマンマイクロフュージ中の遠心によってペレッ
ト化し、1mM トリス pH 8.0,0.1mM EDTA30μ中に溶解
する。DNA配列決定は、15−マ−をプライマーとして使
用し、ジデオキシ鎖成端技術によって実施する。Sanger
et al.,PNAS U.S.A.,74:5463（1977）参照。第４図お
よび第５図に示した配列中に含まれる、観察された配列
は、第１に表した69kd断片のアミノ末端配列中のフェニ
ルアラニン２からグルタミン15までの区域によって囲ま
れた同じ14個のアミノ酸を含むので、該サブクローンが
ブタAHFエクソンを含んでいることを確認した。それ以
上の確認は、34−H1ベクター中のポリリンカーの隣接点
にユニバーサルプライマー（Bethesda Research Labs）
をプライミングすることにより、34−H1ベクター中のHa
e IIIインサートの５′端から配列決定することによっ
て得られた。また、34−H1と命名されたこのクローンか
らのインサートは、DNAをEco RIおよびHind IIIで制限
し、子ウシアルカリ性フォスファターゼでフォスファタ
ーゼ処理し、そしてEco RI,Hind III開裂 M13mp9 DNAへ
リゲートすることにより、M13mp9中へ再クローンされ
た。ユニバーサルプライマーに関してHae IIIセグメン
トの反転を含有するこのクローンも前述のように配列決
定された。インサート34−H1のすべてについての得られ
た配列データは第５図に示されている。この配列は、こ
のサブクローンは、ヌクレオチド169から267までにおい
て、69kd断片（第１図）のフェニルアラニン２からアル
ギニン31までの少なくとも30個のアミノ酸をコードでき
るブタAHF遺伝子のエクソンを含有していることを確認
する。
成端コードンはすべての三つの読み取りフレームにおい
てヌクレオチド267（第５図）から下流に発見すること
ができ、そして一致した５′継木部位配列もヌクレオチ
ド266−267間の該区域に発見されるので、アルギニン31
はイントロンを境界するように見える。さらに、下流DN
Aによってコードされるであろうアミノ酸配列は、ブタA
HFの69kd断片に観察されるそれと完全に異なっている。
てヌクレオチド267（第５図）から下流に発見すること
ができ、そして一致した５′継木部位配列もヌクレオチ
ド266−267間の該区域に発見されるので、アルギニン31
はイントロンを境界するように見える。さらに、下流DN
Aによってコードされるであろうアミノ酸配列は、ブタA
HFの69kd断片に観察されるそれと完全に異なっている。
PB 34 DNAはBam HIで切断され、そしてアガロースゲル
を通して電気泳動され、そしてゲルを５μg/ml臭化エチ
ジウム中で染色した後紫外線によって可視化された。約
6.6kb,6.0kb,1.8kbの三つのインサートが観察された。
ゲル中のDNAは前出Maniatis et al.383−386頁に記載の
ようにニトロセルロースへ移された。ロ過物の15−マ−
へのハイブリッド化およびオートラジオグラフィーが前
述のように実施された。オートラジオグラフィーは、6.
0kbバンドが15−マ−プローブへハイブリッド化されたA
HF遺伝子断片を含んでいることを示した。
を通して電気泳動され、そしてゲルを５μg/ml臭化エチ
ジウム中で染色した後紫外線によって可視化された。約
6.6kb,6.0kb,1.8kbの三つのインサートが観察された。
ゲル中のDNAは前出Maniatis et al.383−386頁に記載の
ようにニトロセルロースへ移された。ロ過物の15−マ−
へのハイブリッド化およびオートラジオグラフィーが前
述のように実施された。オートラジオグラフィーは、6.
0kbバンドが15−マ−プローブへハイブリッド化されたA
HF遺伝子断片を含んでいることを示した。
このように、ブタAHFをコードする遺伝子の部分がはじ
めて単離され、同定された。バクテリオファージラムダ
組換えクロンPB34は、ATCC 40087としてアメリカン、タ
イプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。
めて単離され、同定された。バクテリオファージラムダ
組換えクロンPB34は、ATCC 40087としてアメリカン、タ
イプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。
実施例４ ヒトAHF遺伝子の位置決定 Maniatis et al.,Cell,15:678（1978）によって記載さ
れたヒトゲノムライブラリーが、E.coli LE 392株（一
般に入手可能）を６×105pfuで感染させ、そして15cm N
ZCYM寒天プレート上に20,000pfu/プレートの密度でプレ
ートすることにより、ヒトAHF遺伝子についてスクリー
ニングされる。これらファージは前出のBentonおよびDa
visの操作を用い、実施例３に記載した6.0kbブタAHF断
片でスクリーニングし、プローブとしてニックトランス
レーションによって32pで標識される。強いハイブリッ
ド化信号を示すファージを採取し、約100pfu/10cmプレ
ートでプレートし、一方のプローブとして放射標識した
45−マ−を、そして他方のプローブとして6.0kb Bam HI
断片を使用し、前述のように二重にスクリーニングす
る。両方のプローブへハイブリッド化するHH−25と命名
されたファージが同定され、プレートストックがつくら
れ、そして前述のようにラピッドプレップDNAが調製さ
れる。ファージDNAがSau 3A Iで切断され、子ウシアル
カリ性フォスファターゼでフォスファターゼ処理され、
フェノール抽出され、そしてBam HI切断M13mp8 DNAの20
ngと共沈される。沈澱したDNAは遠心によってペレット
化され、T4 DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液２μ
中に再溶解される。リゲーションは16℃において２分
間実施され、T4 DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液
50μへ希釈され、16℃でさらに３時間インキュベート
される。この反応混合物５μが実施例に記載したよう
にE.coli JM 101/TG 1株を形質転換するために使用され
る。
れたヒトゲノムライブラリーが、E.coli LE 392株（一
般に入手可能）を６×105pfuで感染させ、そして15cm N
ZCYM寒天プレート上に20,000pfu/プレートの密度でプレ
ートすることにより、ヒトAHF遺伝子についてスクリー
ニングされる。これらファージは前出のBentonおよびDa
visの操作を用い、実施例３に記載した6.0kbブタAHF断
片でスクリーニングし、プローブとしてニックトランス
レーションによって32pで標識される。強いハイブリッ
ド化信号を示すファージを採取し、約100pfu/10cmプレ
ートでプレートし、一方のプローブとして放射標識した
45−マ−を、そして他方のプローブとして6.0kb Bam HI
断片を使用し、前述のように二重にスクリーニングす
る。両方のプローブへハイブリッド化するHH−25と命名
されたファージが同定され、プレートストックがつくら
れ、そして前述のようにラピッドプレップDNAが調製さ
れる。ファージDNAがSau 3A Iで切断され、子ウシアル
カリ性フォスファターゼでフォスファターゼ処理され、
フェノール抽出され、そしてBam HI切断M13mp8 DNAの20
ngと共沈される。沈澱したDNAは遠心によってペレット
化され、T4 DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液２μ
中に再溶解される。リゲーションは16℃において２分
間実施され、T4 DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液
50μへ希釈され、16℃でさらに３時間インキュベート
される。この反応混合物５μが実施例に記載したよう
にE.coli JM 101/TG 1株を形質転換するために使用され
る。
溶菌斑がBentonおよびDavis操作を使用し、そして放射
標識した15−マ−でプローブすることによってスクリー
ニングされる。ハイブリッド化を示す25−S1と命名され
たファージ溶菌斑が単離され、そして単一ストランドフ
ァージDNAが前記のようにDNA配列化鋳型として使用する
ために調製される。配列化は、プライマーとして15−マ
−を使用し、前出Sanger et al.によって記載されたジ
デオキシ鎖成端技術を使用して実施され、そして第６図
に示す情報ストランドDNA配列を与える。この態様で配
列化された84ヌクレオチドは、ブタAHFの相同区域と85
％の相同を示した。第１図に示したブタAHF69kd区域２
−16と、第６図のヒトヌクレオチド配列から推論した対
応する区域との間には、たった１個のアミノ酸の違いが
ある。この高い程度の相同は、組換えファージHH−25の
DNAはAHF遺伝子から発散することを示す。
標識した15−マ−でプローブすることによってスクリー
ニングされる。ハイブリッド化を示す25−S1と命名され
たファージ溶菌斑が単離され、そして単一ストランドフ
ァージDNAが前記のようにDNA配列化鋳型として使用する
ために調製される。配列化は、プライマーとして15−マ
−を使用し、前出Sanger et al.によって記載されたジ
デオキシ鎖成端技術を使用して実施され、そして第６図
に示す情報ストランドDNA配列を与える。この態様で配
列化された84ヌクレオチドは、ブタAHFの相同区域と85
％の相同を示した。第１図に示したブタAHF69kd区域２
−16と、第６図のヒトヌクレオチド配列から推論した対
応する区域との間には、たった１個のアミノ酸の違いが
ある。この高い程度の相同は、組換えファージHH−25の
DNAはAHF遺伝子から発散することを示す。
このように、ヒトAHF遺伝子のためのエクソンがはじめ
て単離され、同定された。バクテリオファジラムダ組換
えHH−25は、寄託番号ATCC 40086としてアメリカン、タ
イプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。
て単離され、同定された。バクテリオファジラムダ組換
えHH−25は、寄託番号ATCC 40086としてアメリカン、タ
イプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。
実施例５ AHFを活発に転写する細胞の同定 上に記載したブタおよびヒトAHFエクソンは種々の機能
のために有用であり、その一つは生体内においてAHF合
成部位である組織の同定を許容するスクリーニング剤と
してである。AHFの天然の発現の途中に生成されるmRNA
に対する正確な相補体としてエクソンを使用することを
基礎とする多数の方法が利用可能である。このスクリー
ニング操作において、生体の各種の部分からの組織がそ
の内に含まれるmRNAを放出するように処理され、そして
AHFに対するエクソンを含んでいるDNA断片へハイブリッ
ド化され、そしてもしmRNAの分子がそのエクソンへハイ
ブリッド化すれば、該mRNAの源である組織がAHFの源で
ある。
のために有用であり、その一つは生体内においてAHF合
成部位である組織の同定を許容するスクリーニング剤と
してである。AHFの天然の発現の途中に生成されるmRNA
に対する正確な相補体としてエクソンを使用することを
基礎とする多数の方法が利用可能である。このスクリー
ニング操作において、生体の各種の部分からの組織がそ
の内に含まれるmRNAを放出するように処理され、そして
AHFに対するエクソンを含んでいるDNA断片へハイブリッ
ド化され、そしてもしmRNAの分子がそのエクソンへハイ
ブリッド化すれば、該mRNAの源である組織がAHFの源で
ある。
1. スクリーニング操作 腎臓、肝臓、すい臓、ひ臓、骨髄、リンパ節等を含む、
種々の器管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参
照としこゝに取り入れるCox,Methods Enzymol.,12B:120
（1968）によって記載されたグアニジン塩酸塩抽出によ
り、いくつかの修飾を加えて調製される。要約すれば、
組織は、8 Mグアニジン塩酸塩（またはその記載をこゝ
に参照として取り入れたChirgwin et al.,Biochemistry
18:5294（1979）によって提案された4M グアニジンイ
ソチオシアネート，また前出Maniatis et al.,189頁そ
の他を参照）、50mM トリス（PH7.5）,10mM EDTA中へ体
外移植し、最高スピードで１分間オムニミキサー（Sorv
all）中でホモジナイズする。ホモジネートをSorvall H
B−４ローター中で５分間5000rpmで清澄化し、RNAを0.5
容積のエタノールの添加によって沈澱する。該RNAは溶
解し、水に溶解する前に6 Mグアニジン塩酸塩からさら
に３回沈澱する。
種々の器管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参
照としこゝに取り入れるCox,Methods Enzymol.,12B:120
（1968）によって記載されたグアニジン塩酸塩抽出によ
り、いくつかの修飾を加えて調製される。要約すれば、
組織は、8 Mグアニジン塩酸塩（またはその記載をこゝ
に参照として取り入れたChirgwin et al.,Biochemistry
18:5294（1979）によって提案された4M グアニジンイ
ソチオシアネート，また前出Maniatis et al.,189頁そ
の他を参照）、50mM トリス（PH7.5）,10mM EDTA中へ体
外移植し、最高スピードで１分間オムニミキサー（Sorv
all）中でホモジナイズする。ホモジネートをSorvall H
B−４ローター中で５分間5000rpmで清澄化し、RNAを0.5
容積のエタノールの添加によって沈澱する。該RNAは溶
解し、水に溶解する前に6 Mグアニジン塩酸塩からさら
に３回沈澱する。
この給源からのメッセンジャーRNAは、オリゴ（dT）セ
ルロース（Collaborative Research）上のクロマトグラ
フィーによってエンリッチされる。
ルロース（Collaborative Research）上のクロマトグラ
フィーによってエンリッチされる。
このmRNAは次に、前出Maniatis et al.,202−３頁に記
載されているように、ホルムアルデヒドを含有するアガ
ロースゲルを通る電気泳動へかけられる。ゲル中のmRNA
は次にニトロセルロースフィルターへ移される（前出 M
aniatis et an.,203−４頁）。
載されているように、ホルムアルデヒドを含有するアガ
ロースゲルを通る電気泳動へかけられる。ゲル中のmRNA
は次にニトロセルロースフィルターへ移される（前出 M
aniatis et an.,203−４頁）。
このようにして得られたmRNAは、上で得られた放射標識
したブタまたはヒトエクソンDNAでハイブリッド化さ
れ、ハイブリッドの存在がオートラジオグラフィーによ
って検出される。放射性信号は、mRNAの組織源は体内に
おけるAHF合成の源であることを指示する。
したブタまたはヒトエクソンDNAでハイブリッド化さ
れ、ハイブリッドの存在がオートラジオグラフィーによ
って検出される。放射性信号は、mRNAの組織源は体内に
おけるAHF合成の源であることを指示する。
代わりに、mRNAはS1保護スクリーニング方によってスク
リーニングされることができる。
リーニングされることができる。
S1ヌクレアーゼは、単一ストランドDNAを加水分解する
が、しかしハイブリッド化したmRNA/DNAのような塩基対
合したヌクレオチドは加水分解しない酵素である。この
ため、アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオ
グラフィー後の放射性バンドの存在は、AHFエクソンに
対応する単一ストランドDNAが相補正mRNA,すなわちAHF
に対するmRNAによって保護されていることを示す。この
ため、このmRNAの源であった組織は生体内におけるAHF
の合成部位である。このスクリーニング方法は上に記載
したスクリーニング方法よりもいくらかはもっと感受性
である。
が、しかしハイブリッド化したmRNA/DNAのような塩基対
合したヌクレオチドは加水分解しない酵素である。この
ため、アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオ
グラフィー後の放射性バンドの存在は、AHFエクソンに
対応する単一ストランドDNAが相補正mRNA,すなわちAHF
に対するmRNAによって保護されていることを示す。この
ため、このmRNAの源であった組織は生体内におけるAHF
の合成部位である。このスクリーニング方法は上に記載
したスクリーニング方法よりもいくらかはもっと感受性
である。
該mRNAに対し相補性である、単一ストランドの放射標識
されたDNAよりなるプローブが、ブタゲノムサブクロー
ン34−H1のDNA合成を開始するためM13のユニバーサルプ
ライマーを使用して合成される。この反応は、50mMトリ
スpH7.4,5mM MgCl2,1mM 2−メルカプトエタノール,50mM
Nacl,ユニバーサルプライマー10ng,34−53 鋳型DNA200
−400ng,およびDNAポリメラーゼＩ（E.coli）のKlenow
断片の溶液100μ中で実施される。反応液は23℃で60
分間、70℃で10分間インキュベートされ、Pst I50単位
が添加され、追加の60分間インキュベートされる。
されたDNAよりなるプローブが、ブタゲノムサブクロー
ン34−H1のDNA合成を開始するためM13のユニバーサルプ
ライマーを使用して合成される。この反応は、50mMトリ
スpH7.4,5mM MgCl2,1mM 2−メルカプトエタノール,50mM
Nacl,ユニバーサルプライマー10ng,34−53 鋳型DNA200
−400ng,およびDNAポリメラーゼＩ（E.coli）のKlenow
断片の溶液100μ中で実施される。反応液は23℃で60
分間、70℃で10分間インキュベートされ、Pst I50単位
が添加され、追加の60分間インキュベートされる。
反応はフェノール／クロロホルム抽出によって停止さ
れ、NaClが0.2Mへ添加され、そして次に100％エタノー
ル２容積で沈澱される。沈澱したDNAは遠心によりペレ
ット化され、20％シュークロース、50mM NaOH,0.1％ク
レゾールグリーン中に再溶解され、そして次に50mM NaO
H,10mMEDTA中の２％アガロースを通して電気泳動され
る。得られる単一ストランド断片はオートラジオグラフ
ィーによって探索され、バンドが切除され、そしてDNA
が透析チューブ中の電気溶離によって単離される。
れ、NaClが0.2Mへ添加され、そして次に100％エタノー
ル２容積で沈澱される。沈澱したDNAは遠心によりペレ
ット化され、20％シュークロース、50mM NaOH,0.1％ク
レゾールグリーン中に再溶解され、そして次に50mM NaO
H,10mMEDTA中の２％アガロースを通して電気泳動され
る。得られる単一ストランド断片はオートラジオグラフ
ィーによって探索され、バンドが切除され、そしてDNA
が透析チューブ中の電気溶離によって単離される。
サンプルmRNAは、上述のグアニジン塩酸塩法によって肝
臓、ひ臓等の組織から調製される。
臓、ひ臓等の組織から調製される。
次にプローブは、50％ホルムアミド、0.4M NaCl,40mM P
IPES（ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸））pH6.5,1mM EDTA,5−50μg mRNA,15μ中２μｇ
の標識DNA中で、サンプルmRNA（オリゴ（dT）クロマト
ブラフィーエンリッチステップから得られた）へハイブ
リッド化される。ハイブリッド化は、冷たいS1ヌクレア
ーゼ緩衝液200μ（0.25M NaCl,0.3M NaCH3COO,pH4.
5）,1mM ZnSO4,5％グリセロール,S1ヌクレアーゼ1000単
位の添加によって停止される。サンプルをフェノール抽
出し、イーストtRNA10μｇと共にエタノール沈澱し、そ
してMaxam−Gilbert,PNAS U.S.A.74:560（1977）に記載
した５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通す電気泳
動による分析へかける。
IPES（ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸））pH6.5,1mM EDTA,5−50μg mRNA,15μ中２μｇ
の標識DNA中で、サンプルmRNA（オリゴ（dT）クロマト
ブラフィーエンリッチステップから得られた）へハイブ
リッド化される。ハイブリッド化は、冷たいS1ヌクレア
ーゼ緩衝液200μ（0.25M NaCl,0.3M NaCH3COO,pH4.
5）,1mM ZnSO4,5％グリセロール,S1ヌクレアーゼ1000単
位の添加によって停止される。サンプルをフェノール抽
出し、イーストtRNA10μｇと共にエタノール沈澱し、そ
してMaxam−Gilbert,PNAS U.S.A.74:560（1977）に記載
した５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通す電気泳
動による分析へかける。
実施例６ 組織からAFH mRNAをえるてためAHFエクソンD
NAの使用 mRNAの源である組織が同定されれば、該組織からのAHF
mRNAが抽出され、cDNAライブラリーを構成するために使
用れる。このcDNAライブラリーは、以下に記載するよう
にゲノムクローン中に含まれたイントロンなしに、AHF
のアミノ配列をコードする全長さのcDNAクローンを同定
し、構成するために用いられる。その後で、AHFタンパ
クをコードするcDNAが、AHF発現のため適当な宿主中の
適当な発現ベクター中に挿入される。
NAの使用 mRNAの源である組織が同定されれば、該組織からのAHF
mRNAが抽出され、cDNAライブラリーを構成するために使
用れる。このcDNAライブラリーは、以下に記載するよう
にゲノムクローン中に含まれたイントロンなしに、AHF
のアミノ配列をコードする全長さのcDNAクローンを同定
し、構成するために用いられる。その後で、AHFタンパ
クをコードするcDNAが、AHF発現のため適当な宿主中の
適当な発現ベクター中に挿入される。
ヒトAHFは血友病治療または他の用途のため大きい需要
があるので、ヒトAHF cDNAの調製を記載する。
があるので、ヒトAHF cDNAの調製を記載する。
1. ヒトAHFのためのmRNAの取得 AHF合成に責任あるヒト組織からのmRNAは、前に記載し
たようにCoxにより記載され、Chirgwinによって修飾さ
れたグアニジン塩酸塩法によって調製された。
たようにCoxにより記載され、Chirgwinによって修飾さ
れたグアニジン塩酸塩法によって調製された。
オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィーカラムから
得られたmRNAのそれ以上の分画は、10mMトリス−HCl（p
H7.4）,1mM EDTAおよび0.2％SDSを含む５−20％シュー
クロース勾配上にベックマンSW28中において24時間22,0
00rpmで遠心することによる沈澱によって得られる。分
画（1.0ml）が集められ、酢酸ナトリウムが0.2Mまで添
加され、そして分画は水に溶解する前に２回エタノール
沈澱された。分画したRNAのサイズ分布は、2.2Mホルム
アルデヒドを含有する1.4％アガロースゲルを通す電気
泳動によって決定された。
得られたmRNAのそれ以上の分画は、10mMトリス−HCl（p
H7.4）,1mM EDTAおよび0.2％SDSを含む５−20％シュー
クロース勾配上にベックマンSW28中において24時間22,0
00rpmで遠心することによる沈澱によって得られる。分
画（1.0ml）が集められ、酢酸ナトリウムが0.2Mまで添
加され、そして分画は水に溶解する前に２回エタノール
沈澱された。分画したRNAのサイズ分布は、2.2Mホルム
アルデヒドを含有する1.4％アガロースゲルを通す電気
泳動によって決定された。
28より大きいＳ（Svedberg）価を有するmRNA沈降物を二
重ストランドcDNAの合成のためにプールする。このRNA
の10μｇを10mMメチル水銀ハイドロオキサイド10μ中
において室温で変性する。140mMの２−メルカプトエタ
ノールをメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化する
ために添加する。次にRNAは、140mM KCl,100mMトリス−
HCl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート1mM,200μg/mlオリゴ（dT）12−18,10mM MgC
l2,および0.1μCi 32p−dCTP/mlを含んでいる50μへ
希釈される。これら反応は、AMV逆トランスクリプター
ゼ（Life Sciences）17単位／μの３μを添加した
後、42℃で１時間実施される。反応は0.25M EDTA（pH8.
0）を20mMまで添加することによって停止される。得ら
れる混合物はフェノール／クロロホルム（1:1）の等容
積で１回、そしてクロロホルムで１回抽出される。次に
サンプルは10mMトリス−HCl（pH8.0）,100mM NaCl,1mM
EDTA中に平衡化したセファロースCL−4Bカラム（ファル
マシア）5mlで上クロマトグラフィーされる。空容積が
集められ、そして核酸（RNA/cDNAハイブリッドを含んで
いる）がエタノール2.5容積の添加によって沈澱され
る。
重ストランドcDNAの合成のためにプールする。このRNA
の10μｇを10mMメチル水銀ハイドロオキサイド10μ中
において室温で変性する。140mMの２−メルカプトエタ
ノールをメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化する
ために添加する。次にRNAは、140mM KCl,100mMトリス−
HCl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート1mM,200μg/mlオリゴ（dT）12−18,10mM MgC
l2,および0.1μCi 32p−dCTP/mlを含んでいる50μへ
希釈される。これら反応は、AMV逆トランスクリプター
ゼ（Life Sciences）17単位／μの３μを添加した
後、42℃で１時間実施される。反応は0.25M EDTA（pH8.
0）を20mMまで添加することによって停止される。得ら
れる混合物はフェノール／クロロホルム（1:1）の等容
積で１回、そしてクロロホルムで１回抽出される。次に
サンプルは10mMトリス−HCl（pH8.0）,100mM NaCl,1mM
EDTA中に平衡化したセファロースCL−4Bカラム（ファル
マシア）5mlで上クロマトグラフィーされる。空容積が
集められ、そして核酸（RNA/cDNAハイブリッドを含んで
いる）がエタノール2.5容積の添加によって沈澱され
る。
好ましくは、上の操作と組合せて、Ullrich et al.,Nat
ure,303:821（1983）に記載されているように、AHFエク
ソンオリゴヌクレオチドセグメントも逆転写を開始する
ためオリゴdTrの代わりに使用される。
ure,303:821（1983）に記載されているように、AHFエク
ソンオリゴヌクレオチドセグメントも逆転写を開始する
ためオリゴdTrの代わりに使用される。
RNA−cDNAは脱イオン水35μ中に溶解され、100mMカコ
ジル酸カリウム（PH6.8）,100μM dCTP,1mM 2−メルカ
プトエタノール,1mM塩化コバルトを添加し、そしてデオ
キシチジルターミナルトランスフェラーゼ（pH Biochem
icals）10単位を加え、反応物を37℃で30秒間インキュ
ベートすることによって酵素的に尾部処理される。反応
は0.25M EDTAを10mMまで添加することによって停止され
る。トリス−HCl（pH8.0）を300mMまで添加し、そして
サンプルはフェノール／グロロホルム（1:1）の等容積
で１回、そしてクロロホルムの等容積で抽出される。核
酸はエタノール2.5容積の添加によってこの生成物から
沈澱される。
ジル酸カリウム（PH6.8）,100μM dCTP,1mM 2−メルカ
プトエタノール,1mM塩化コバルトを添加し、そしてデオ
キシチジルターミナルトランスフェラーゼ（pH Biochem
icals）10単位を加え、反応物を37℃で30秒間インキュ
ベートすることによって酵素的に尾部処理される。反応
は0.25M EDTAを10mMまで添加することによって停止され
る。トリス−HCl（pH8.0）を300mMまで添加し、そして
サンプルはフェノール／グロロホルム（1:1）の等容積
で１回、そしてクロロホルムの等容積で抽出される。核
酸はエタノール2.5容積の添加によってこの生成物から
沈澱される。
dC尾部処理されたハイブリッド分子は、10mM KCl中170
μg/mlオリゴ（dG）14−18セルロースで43℃にて10分
間、そして23℃にて10分間アンニールされる。この反応
生成物は次に100mM硫酸アンモニウム、1mM 2−メルカプ
トエタノール、100mM MgCl2,100μg/mlウシ血清アルブ
ミン（シグマ、コーンファクターＶ），および100μM
ニコチナマイドアデニンジヌクレオチドを含む100μ
へ希釈される。２番目のストランドのcDNA合成は、RNア
ーゼＨ（Ｐ−L Biochemicals）１単位、E.coli DNAリガ
ーゼ１単位、およびDNAポリメラーゼI10単位を添加する
ことによって開始され、そして16℃で12時間インキュベ
ートされる。
μg/mlオリゴ（dG）14−18セルロースで43℃にて10分
間、そして23℃にて10分間アンニールされる。この反応
生成物は次に100mM硫酸アンモニウム、1mM 2−メルカプ
トエタノール、100mM MgCl2,100μg/mlウシ血清アルブ
ミン（シグマ、コーンファクターＶ），および100μM
ニコチナマイドアデニンジヌクレオチドを含む100μ
へ希釈される。２番目のストランドのcDNA合成は、RNア
ーゼＨ（Ｐ−L Biochemicals）１単位、E.coli DNAリガ
ーゼ１単位、およびDNAポリメラーゼI10単位を添加する
ことによって開始され、そして16℃で12時間インキュベ
ートされる。
次にサンプルは前に記載したようにセファローズCL−4B
上でクロマトグラフィーされる。二重ストランドDNAは
エタノール沈澱され、そしてRNA−cDNAハイブリット尾
部処理について記載したようにdC尾部処理される。
上でクロマトグラフィーされる。二重ストランドDNAは
エタノール沈澱され、そしてRNA−cDNAハイブリット尾
部処理について記載したようにdC尾部処理される。
2. ヒトAHF DNAについてスクリーニング 上に記載したようにして得られたdC尾分処理された二重
ストランドcDNAは、10mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDT
A,100mM NaCl中37℃で２時間等モル量のdG尾分処理pBR
322（New England Nuclear）でアンニールされる。アン
ニールされたキメラ様分子はバクテリア形質転換に使用
するまで−20℃で冷凍される。
ストランドcDNAは、10mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDT
A,100mM NaCl中37℃で２時間等モル量のdG尾分処理pBR
322（New England Nuclear）でアンニールされる。アン
ニールされたキメラ様分子はバクテリア形質転換に使用
するまで−20℃で冷凍される。
バクテリア形質転換は、E.coli MC1061株（ソース）を
使用して実施される。細胞（50ml）は600nmにおける光
学密度0.25まで生育される。細胞は2500rpmにおいて12
分間遠心することによって濃縮され、無菌100mM CaCl2
中で洗浄され、そして前に記載したように遠心によって
ペレット化される。細胞は無菌100mM CaCl2中に再懸濁
され、そして４℃に12時間保たれる。アンニールしたキ
メラ様分子は、適切な細胞200μ当たり5ngの二重スト
ランドcDNAの比で４℃において30分間インキュベートさ
れる。次にバクテリアは42℃２分のヒートショックへか
けられる。Ｌ−ブロス1.0mlが加えられ、細胞は37℃で
１時間インキュベートされる。細胞は次に５μg/mlテト
ラサイクリンを含有するLB−寒天プレート上にプレート
される。
使用して実施される。細胞（50ml）は600nmにおける光
学密度0.25まで生育される。細胞は2500rpmにおいて12
分間遠心することによって濃縮され、無菌100mM CaCl2
中で洗浄され、そして前に記載したように遠心によって
ペレット化される。細胞は無菌100mM CaCl2中に再懸濁
され、そして４℃に12時間保たれる。アンニールしたキ
メラ様分子は、適切な細胞200μ当たり5ngの二重スト
ランドcDNAの比で４℃において30分間インキュベートさ
れる。次にバクテリアは42℃２分のヒートショックへか
けられる。Ｌ−ブロス1.0mlが加えられ、細胞は37℃で
１時間インキュベートされる。細胞は次に５μg/mlテト
ラサイクリンを含有するLB−寒天プレート上にプレート
される。
ヒトAHFクローンは、その記載を参照としてこゝに取り
入れたGrunsteinおよびHogness PNAS U.S.A.72:3961（1
975）のコロニーハイブリディゼイション法を使用て同
定される。cDNAライブラリーは、Ｌ−ブロス/5μg/mlテ
トラサイクリン寒天プレートの上に重ねたニトロセルロ
ースフィルター（Schleicher and Schuell）上にプレー
トされる。コロニーは37℃で一夜生育され、次にフィル
ターは無菌Whatman 3Mペーパー上に置かれる。次にあら
かじめ湿したニトロセルロースフィルターをマスターフ
ィルターに対して押し付け、これらフィルターを18ゲー
ジ針を使用して止める。レプリカフィルターを次に37℃
においてLB−テトラサイクリンプレート上でコロニーが
１〜2cmの直径に達するまで発育させる。次にフィルタ
ーは150μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBプレ
ートへ移され、37℃で16〜24時間インキュベートされ
る。
入れたGrunsteinおよびHogness PNAS U.S.A.72:3961（1
975）のコロニーハイブリディゼイション法を使用て同
定される。cDNAライブラリーは、Ｌ−ブロス/5μg/mlテ
トラサイクリン寒天プレートの上に重ねたニトロセルロ
ースフィルター（Schleicher and Schuell）上にプレー
トされる。コロニーは37℃で一夜生育され、次にフィル
ターは無菌Whatman 3Mペーパー上に置かれる。次にあら
かじめ湿したニトロセルロースフィルターをマスターフ
ィルターに対して押し付け、これらフィルターを18ゲー
ジ針を使用して止める。レプリカフィルターを次に37℃
においてLB−テトラサイクリンプレート上でコロニーが
１〜2cmの直径に達するまで発育させる。次にフィルタ
ーは150μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBプレ
ートへ移され、37℃で16〜24時間インキュベートされ
る。
次にフィルターが除去され、0.5M NaOHで室温で５分間
飽和させたWhatman 3Mペーパー上に置かれる。次にフィ
ルターは1Mトリス−HCl（pH7.5）,1.5M NaClで飽和させ
たWhatman 3M上に、そして次に2x標準食塩クエン酸塩
（SSC）で飽和させたWhatman 3M上に置くことによって
中和される。SSC（1x）は0.15M NaCl,0.015M クエン酸
ナトリウムである。
飽和させたWhatman 3Mペーパー上に置かれる。次にフィ
ルターは1Mトリス−HCl（pH7.5）,1.5M NaClで飽和させ
たWhatman 3M上に、そして次に2x標準食塩クエン酸塩
（SSC）で飽和させたWhatman 3M上に置くことによって
中和される。SSC（1x）は0.15M NaCl,0.015M クエン酸
ナトリウムである。
フィルターを風乾し、減圧下80℃で２時間焼付ける。フ
ィルターのプレハイブリディゼイションは、10mMトリス
−HCl（pH8.0）,1mM EDTA,0.1％SDS中65℃で30分間、そ
して7x SSC,5x Denhardt′ｓ（1x Denhardt′ｓは0.02
％ポリビニルピロリジン、0.02％フィコル,0.02％ウシ
血清アルブミンである）、100μg/ml変性サケ精子DNA,
および0.1％SDS中30分間で実施される。
ィルターのプレハイブリディゼイションは、10mMトリス
−HCl（pH8.0）,1mM EDTA,0.1％SDS中65℃で30分間、そ
して7x SSC,5x Denhardt′ｓ（1x Denhardt′ｓは0.02
％ポリビニルピロリジン、0.02％フィコル,0.02％ウシ
血清アルブミンである）、100μg/ml変性サケ精子DNA,
および0.1％SDS中30分間で実施される。
上で記載したように調整した32p標識ヒトエクソンDNAが
106cpm/mlまで添加され、ハイブリディゼイションが37
℃で12〜16時間実施される。次にフィルターは7xSSC,0.
1％SDSの数回の交換で37℃において１〜２時間洗浄され
る。次にフィルターは風乾され、コダックXARフィルム
およびDupont Lightning Plus高輝度スクリーンを使用
してオートラジオグラフィーへかけられる。
106cpm/mlまで添加され、ハイブリディゼイションが37
℃で12〜16時間実施される。次にフィルターは7xSSC,0.
1％SDSの数回の交換で37℃において１〜２時間洗浄され
る。次にフィルターは風乾され、コダックXARフィルム
およびDupont Lightning Plus高輝度スクリーンを使用
してオートラジオグラフィーへかけられる。
バックグランド上にハイブリディゼイション信号を示す
コロニーが、プラスミドDNAのラピットプレップ精製の
ため、テトラサイクリン５μg/mlを含むＬ−ブロス中で
生育される。プラスミドDNAは、その記載を参照として
こゝに取り入れたHolmes et al.,Anal.Biochem.,114:19
3（1981）の方法によって精製される。このDNAの部品商
標を制限エンドヌクレアーゼPst1で開裂し、そして断片
を１％アガロース/TBEゲルを通して電気透析し、そして
その記載をこゝに参照として取り入れたE.Southern,J.M
ol.Biol.98:503（1975）の操作に従ってしみをつける。
ニトロセルロースフィルターは、コロニーハイブリディ
ゼイションについて記載したように、放射標識したヒト
AHFエクソンDNAでハイブリッド化される。AHFエクソンD
NAへハイブリッド化するPstIインサートを含んだプラス
ミドがDNA配列分析に使用される。
コロニーが、プラスミドDNAのラピットプレップ精製の
ため、テトラサイクリン５μg/mlを含むＬ−ブロス中で
生育される。プラスミドDNAは、その記載を参照として
こゝに取り入れたHolmes et al.,Anal.Biochem.,114:19
3（1981）の方法によって精製される。このDNAの部品商
標を制限エンドヌクレアーゼPst1で開裂し、そして断片
を１％アガロース/TBEゲルを通して電気透析し、そして
その記載をこゝに参照として取り入れたE.Southern,J.M
ol.Biol.98:503（1975）の操作に従ってしみをつける。
ニトロセルロースフィルターは、コロニーハイブリディ
ゼイションについて記載したように、放射標識したヒト
AHFエクソンDNAでハイブリッド化される。AHFエクソンD
NAへハイブリッド化するPstIインサートを含んだプラス
ミドがDNA配列分析に使用される。
配列決定のため、プラスミドDNA（培養物0.75mlから前
出Holmes et al.の操作により精製）が制限エンドヌク
レアーゼSau 3a Iで完結まで消化される。34−S1である
と同定された生成したDNA断片は、第４図に図示したDNA
配列を持っている。このDNAはフェノール／クロロホル
ム抽出後エタノール沈澱され、10μTE（10mMトリス−
HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMジチオスレイトール,1mM
ATPおよび過剰のT4 DNAリガーゼ100μ中において、B
am H1開裂M13 mp 9の複製形DNAとリゲートする。リゲー
ションは15℃において２〜４時間実施される。
出Holmes et al.の操作により精製）が制限エンドヌク
レアーゼSau 3a Iで完結まで消化される。34−S1である
と同定された生成したDNA断片は、第４図に図示したDNA
配列を持っている。このDNAはフェノール／クロロホル
ム抽出後エタノール沈澱され、10μTE（10mMトリス−
HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMジチオスレイトール,1mM
ATPおよび過剰のT4 DNAリガーゼ100μ中において、B
am H1開裂M13 mp 9の複製形DNAとリゲートする。リゲー
ションは15℃において２〜４時間実施される。
このリゲーション反応物５μは、前記したE.coli JM1
01/TG1株200μを形質転換するために使用される。組
換えは、Davis et al.,J.Mol.Biol.36:413（1968）によ
って記載されているベーターガラクトシダーゼ活性のた
めの指示としてＸ−galを含んでいるLB寒天プレート上
で生育する時白い溶菌斑として同定される。
01/TG1株200μを形質転換するために使用される。組
換えは、Davis et al.,J.Mol.Biol.36:413（1968）によ
って記載されているベーターガラクトシダーゼ活性のた
めの指示としてＸ−galを含んでいるLB寒天プレート上
で生育する時白い溶菌斑として同定される。
ヒトエクソンへハイブリッド化する組換えファージ包囲
配列は、その記載をこゝに参照として取り入れたBenton
et al.,Science 196:180（1977）の操作により、放射
標識したヒトAHFエクソンをプローブとして使用して同
定される。ハイブリディゼイション信号を示す溶菌斑を
取り、Ｌ−ブロス1.5ml倍地中で生育させる。これら培
養物から調製した単一ストランドファージDNAは、オリ
ゴヌクレオチドプライムDNA合成反応に鋳型として使用
される。
配列は、その記載をこゝに参照として取り入れたBenton
et al.,Science 196:180（1977）の操作により、放射
標識したヒトAHFエクソンをプローブとして使用して同
定される。ハイブリディゼイション信号を示す溶菌斑を
取り、Ｌ−ブロス1.5ml倍地中で生育させる。これら培
養物から調製した単一ストランドファージDNAは、オリ
ゴヌクレオチドプライムDNA合成反応に鋳型として使用
される。
配列化はジデオキシ鎖成端方法を使用して実施される。
例えば、Sanger et al.,PNAS U.S.A.74:5463（1977）参
照。
例えば、Sanger et al.,PNAS U.S.A.74:5463（1977）参
照。
ヒトAHF組換え型はそれらのヌクレオチド配列をヒトAHF
のヒトエクソン配列から既知のそれと比較することによ
り同定される。
のヒトエクソン配列から既知のそれと比較することによ
り同定される。
3. ブタAHF mRNA ヒトAHF組換え型は、全くヒト組織cDNAライブラリーに
ついて記載したように構成したブタ組織ライブラリーを
スクリーニングするために使用される。見込みあるブタ
AHF組換えDNAクローンは、先に記載したようにブタ32p
標識エクソン断片を使用し、Grunstein−Hogness法によ
って同定される。プローブは、その記載をこゝに参照と
して取り入れたRigby et al.,J.Mol.Biol.133:237（197
7）によって記載されたニック−トランスレーションに
よって32pで標識したブタAHFエクソンセグメントであ
る。
ついて記載したように構成したブタ組織ライブラリーを
スクリーニングするために使用される。見込みあるブタ
AHF組換えDNAクローンは、先に記載したようにブタ32p
標識エクソン断片を使用し、Grunstein−Hogness法によ
って同定される。プローブは、その記載をこゝに参照と
して取り入れたRigby et al.,J.Mol.Biol.133:237（197
7）によって記載されたニック−トランスレーションに
よって32pで標識したブタAHFエクソンセグメントであ
る。
ハイブリディゼイションを示すコロニーは前記したラピ
ッドプレッププラスミド精製目的のために生育される。
プラスミドDNAは制限エンドヌクレアーゼ Pst 1で開裂
され、１％アガロース/TBEを通して電気泳動され、E.So
uthern（1975）の操作によってしみをつけられる。しみ
は32pで標識したニックトランスレートされたブタAHF組
換えDNAとハイブリッド化される。
ッドプレッププラスミド精製目的のために生育される。
プラスミドDNAは制限エンドヌクレアーゼ Pst 1で開裂
され、１％アガロース/TBEを通して電気泳動され、E.So
uthern（1975）の操作によってしみをつけられる。しみ
は32pで標識したニックトランスレートされたブタAHF組
換えDNAとハイブリッド化される。
全長さのクローンは、この分野でよく知られているよう
に（“遺伝子ウオーキング”）、例えば両方のクローン
に共通な制限酵素部位において重複するクローンからの
DNA断片をリゲートすることにより、慣用の態様で構成
される。
に（“遺伝子ウオーキング”）、例えば両方のクローン
に共通な制限酵素部位において重複するクローンからの
DNA断片をリゲートすることにより、慣用の態様で構成
される。
4. ステップ２または３からの全長さのクローンの同定 既存のクローンの５′端とmRNAの５′端との間の距離
は、その配列が既存のAHFクローンの５′（アミノ末
端）区域から由来するオリゴヌクレオチドプライマーを
使用し、Agarwal et al.,“J.B.C."256（２）:1023−10
28（1981）に記載されたプライマー延長技術によって分
析することができる。もしこの操作を用いて発達したゲ
ルが二以上の転写を示せば、最も強いバンドが全体のmR
NA転写を表しているものと考えなければならない。
は、その配列が既存のAHFクローンの５′（アミノ末
端）区域から由来するオリゴヌクレオチドプライマーを
使用し、Agarwal et al.,“J.B.C."256（２）:1023−10
28（1981）に記載されたプライマー延長技術によって分
析することができる。もしこの操作を用いて発達したゲ
ルが二以上の転写を示せば、最も強いバンドが全体のmR
NA転写を表しているものと考えなければならない。
しかしながら、５′未ほん訳配列の長い区域を含んでい
る多数のmRNAが存在する。このように、ヒトAHF DNAの
発現は完全なcDNAクローンの獲得次第であってはならな
い。例えば、配列分析によって、メチオニンコードン
と、続いて既知の真核タンパク分泌信号と類似または同
一であり、そして残りのコードンを持つフレーム中にあ
る配列の存在を示すクローンが得られる。形質転換およ
び発現は、予期されたサイズでありそしてポリ（Ｔ）
３′末端を含有するメチオニン分泌信号配列を含有する
クローンについて実施しなければならない。
る多数のmRNAが存在する。このように、ヒトAHF DNAの
発現は完全なcDNAクローンの獲得次第であってはならな
い。例えば、配列分析によって、メチオニンコードン
と、続いて既知の真核タンパク分泌信号と類似または同
一であり、そして残りのコードンを持つフレーム中にあ
る配列の存在を示すクローンが得られる。形質転換およ
び発現は、予期されたサイズでありそしてポリ（Ｔ）
３′末端を含有するメチオニン分泌信号配列を含有する
クローンについて実施しなければならない。
5. 代替操作 前記１ないし３の方法の代わりとして、ブタまたはヒト
AHFのためのcDNAクローンは以下の態様でバクテリオフ
ァージベクターを使用して同定されることが好ましい。
AHFのためのcDNAクローンは以下の態様でバクテリオフ
ァージベクターを使用して同定されることが好ましい。
AHF合成に責任あるヒト胎児肝臓組織からのmRNAが、実
施例５のセクション１において述べたCoxにより記載さ
れ、Chirgwin et al.によって修飾された、グアニジン
塩酸塩法によって調製された。一番目のストランドのcD
NAは、前出実施例６、セクション１に記載した操作によ
ってポリA+胎児肝臓RNA10μｇから合成された。詳しく
は、このRNA10μｇは10mMメチル水銀ハイドロオキサイ
ド10μ中で室温で変性された。２−メルカプトエタノ
ール140mMがメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化
するために添加された。次にこのRNAは、140mM Kcl,100
mMトリス−HCl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチ
ドトリリン酸1mM,200μg/mlオリゴ（dT）12−18,10mM M
gCl2,および0.1μCi32 p−dCTP/mlを含んでいる50μ
へ希釈された。これら反応はAMV逆トランスクリプター
ゼ（Life Sceiences）17単位／μの３μを添加した
後、42℃で１時間実施された。
施例５のセクション１において述べたCoxにより記載さ
れ、Chirgwin et al.によって修飾された、グアニジン
塩酸塩法によって調製された。一番目のストランドのcD
NAは、前出実施例６、セクション１に記載した操作によ
ってポリA+胎児肝臓RNA10μｇから合成された。詳しく
は、このRNA10μｇは10mMメチル水銀ハイドロオキサイ
ド10μ中で室温で変性された。２−メルカプトエタノ
ール140mMがメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化
するために添加された。次にこのRNAは、140mM Kcl,100
mMトリス−HCl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチ
ドトリリン酸1mM,200μg/mlオリゴ（dT）12−18,10mM M
gCl2,および0.1μCi32 p−dCTP/mlを含んでいる50μ
へ希釈された。これら反応はAMV逆トランスクリプター
ゼ（Life Sceiences）17単位／μの３μを添加した
後、42℃で１時間実施された。
プライマー延長したライブラリーの１番目のストランド
合成のため、独特な相補性38マーの200ピコグラムがCH3
HgOH変性ステップに含められ、そして反応物は140mMベ
ーターメルカプトエタノール,0.7M KC1,1mM EDTA,20mM
トリス−HCl（pH8.3,42℃）,RNアーゼ（Biotec）１単位
／μとなし、50℃で２分間および42℃で２分間インキ
ュベートされた。次にこれは140mM KCl,100mMトリス−H
Cl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチドトリリン酸
1mM,10mM MgCl2,および0.1μCi 32 p−dCTP/μを含む
50μへ希釈された。反応物は17単位／μAMV逆トラ
ンスクリプターゼ３μの添加後、42℃で１時間インキ
ューベートされた。
合成のため、独特な相補性38マーの200ピコグラムがCH3
HgOH変性ステップに含められ、そして反応物は140mMベ
ーターメルカプトエタノール,0.7M KC1,1mM EDTA,20mM
トリス−HCl（pH8.3,42℃）,RNアーゼ（Biotec）１単位
／μとなし、50℃で２分間および42℃で２分間インキ
ュベートされた。次にこれは140mM KCl,100mMトリス−H
Cl（pH8.3,42℃），各デオキシヌクレオチドトリリン酸
1mM,10mM MgCl2,および0.1μCi 32 p−dCTP/μを含む
50μへ希釈された。反応物は17単位／μAMV逆トラ
ンスクリプターゼ３μの添加後、42℃で１時間インキ
ューベートされた。
１番目のストランド合成後、反応物は10mM MgCl2,50mM
トリス pH 7.4,5mM2−メルカプトエタノール、7.5mM NH
4SO3,各デオキシヌクレオチドトリリン酸250μＭを含む
150μへ希釈され、そして２番目のストランドの合成
がRNアーゼ（E.coli）１単位およびDNAポリメラーゼI45
単位の添加によって開始された。反応物は16℃で８時間
インキュベートされ、そしてEDTAを20mMへ添加すること
によって停止され、水で最終容積200μとされた。次
にEcoR1メチル化がＳ−アデノシルメチオニンを50μＭ
へ、そしてEcoR1メチラーゼ40単位を添加することによ
って実施された。これら反応物は37℃で１時間インキュ
ベートされ、フェノール／クロロホルム抽出によって停
止され、10mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDTAで平衡化
されたアファデックスG50を用いてクロマトグラフィー
された。空容積をプールし、エタノール添加によって沈
澱させた。
トリス pH 7.4,5mM2−メルカプトエタノール、7.5mM NH
4SO3,各デオキシヌクレオチドトリリン酸250μＭを含む
150μへ希釈され、そして２番目のストランドの合成
がRNアーゼ（E.coli）１単位およびDNAポリメラーゼI45
単位の添加によって開始された。反応物は16℃で８時間
インキュベートされ、そしてEDTAを20mMへ添加すること
によって停止され、水で最終容積200μとされた。次
にEcoR1メチル化がＳ−アデノシルメチオニンを50μＭ
へ、そしてEcoR1メチラーゼ40単位を添加することによ
って実施された。これら反応物は37℃で１時間インキュ
ベートされ、フェノール／クロロホルム抽出によって停
止され、10mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDTAで平衡化
されたアファデックスG50を用いてクロマトグラフィー
された。空容積をプールし、エタノール添加によって沈
澱させた。
cDNA分子は、50mMトリスpH8.3,10mM MgCl2,10mM2−メル
カプトエタノール、50mM NaCl,各デオキシヌクレオチド
トリリン酸50μM,100μg/ml卵アルブミンおよびT4ポリ
メラーゼ５単位を含有する200μ中において鈍末端化
された。反応は37℃で30分間インキュベートされ、次に
フェノール／クロロホルム抽出によって停止された。次
に核酸はエタノール添加によって沈澱された。
カプトエタノール、50mM NaCl,各デオキシヌクレオチド
トリリン酸50μM,100μg/ml卵アルブミンおよびT4ポリ
メラーゼ５単位を含有する200μ中において鈍末端化
された。反応は37℃で30分間インキュベートされ、次に
フェノール／クロロホルム抽出によって停止された。次
に核酸はエタノール添加によって沈澱された。
EcoR1“リンカー”（Collaborative Research）が次
に、合計容積45μ中において前出のManities et al.,
243頁の標準条件で、鈍化cDNAへリゲートされた。反応
はEDTAを15mMへ添加することにより停止され、フェノー
ル／クロロホルムで抽出された。核酸はエタノールによ
って沈澱され、遠心によってペレット化された。リンカ
ー処理されたcDNAは100μＭトリス−HCl（pH7.2）,5mM
MgCl2,50mM NaCl 200μ中に再溶解され、そしてEcoR1
300単位で37℃で２時間消化された。反応物は次にフェ
ノール／クロロホルムで抽出され、10mMトリス（pH8.
0）1mM EDTA,0.1M NaOHで平衡化されたセファロース CL
−4B上でクロマトグラフィーにかけられた。空容積中の
cDNAは集め、エタノールで沈澱し、遠心によってペレッ
ト化された。
に、合計容積45μ中において前出のManities et al.,
243頁の標準条件で、鈍化cDNAへリゲートされた。反応
はEDTAを15mMへ添加することにより停止され、フェノー
ル／クロロホルムで抽出された。核酸はエタノールによ
って沈澱され、遠心によってペレット化された。リンカ
ー処理されたcDNAは100μＭトリス−HCl（pH7.2）,5mM
MgCl2,50mM NaCl 200μ中に再溶解され、そしてEcoR1
300単位で37℃で２時間消化された。反応物は次にフェ
ノール／クロロホルムで抽出され、10mMトリス（pH8.
0）1mM EDTA,0.1M NaOHで平衡化されたセファロース CL
−4B上でクロマトグラフィーにかけられた。空容積中の
cDNAは集め、エタノールで沈澱し、遠心によってペレッ
ト化された。
cDNAは、10mMトリス−HCl（pH8.0）,1mM EDTA中に再溶
解され、そしてEcoR1開裂フォスファターゼ処理ラムダC
haron21a DNAへ、cDNA対ベクターDNAの種々の比率にお
いて標準リゲーション条件でリゲートされた。リゲート
されたDNAはパッケージされ、そして前出Manitis et a
l.,64,256頁に確立された操作を用いてタイターされ
た。該ライブラリーはプレートされ、そして前出Benton
およびDavisに記載された条件のもとで32p−標識ヒトエ
クソンDNAを使用してスクリーニングされた。約10,000
塩基対にまたがる重複するクローンが得られ、そしてそ
の実質的部分がヒトAHFをコードする１本の長い開いた
読取りフレームを解明するために配列化された。それか
ら得られたヒトAHFをコードする組換えDNAヌクレオチド
配列、および推論されたヒトAHFのためのアミノ酸配列
が第７図に示されている。重複するクローンが当分野で
良く知られた慣用技術を用い、すなわち重複するクロー
ンからのDNA断片を両方のクローンに共通な制限酵素部
位においてリゲートすることにより、ベクターpSP64（P
romega Biotec）中にアセンブルされた。pSP64−VIIIと
命名された、第７図に示したヌクレオチド配列を含んで
いるpSP64組換えクローンは、アメリカン、タイプ、カ
ルチャー、コレクションに寄託されている。（寄託番号
ATCC 39812） 実施例７ ヒトまたはブタAHFの発現 この実施例は、実施例６の方法によって得られた全長さ
のクロームを同時形質転換系に用いる、AHFの発現を意
図する。
解され、そしてEcoR1開裂フォスファターゼ処理ラムダC
haron21a DNAへ、cDNA対ベクターDNAの種々の比率にお
いて標準リゲーション条件でリゲートされた。リゲート
されたDNAはパッケージされ、そして前出Manitis et a
l.,64,256頁に確立された操作を用いてタイターされ
た。該ライブラリーはプレートされ、そして前出Benton
およびDavisに記載された条件のもとで32p−標識ヒトエ
クソンDNAを使用してスクリーニングされた。約10,000
塩基対にまたがる重複するクローンが得られ、そしてそ
の実質的部分がヒトAHFをコードする１本の長い開いた
読取りフレームを解明するために配列化された。それか
ら得られたヒトAHFをコードする組換えDNAヌクレオチド
配列、および推論されたヒトAHFのためのアミノ酸配列
が第７図に示されている。重複するクローンが当分野で
良く知られた慣用技術を用い、すなわち重複するクロー
ンからのDNA断片を両方のクローンに共通な制限酵素部
位においてリゲートすることにより、ベクターpSP64（P
romega Biotec）中にアセンブルされた。pSP64−VIIIと
命名された、第７図に示したヌクレオチド配列を含んで
いるpSP64組換えクローンは、アメリカン、タイプ、カ
ルチャー、コレクションに寄託されている。（寄託番号
ATCC 39812） 実施例７ ヒトまたはブタAHFの発現 この実施例は、実施例６の方法によって得られた全長さ
のクロームを同時形質転換系に用いる、AHFの発現を意
図する。
1. AHF形質転換ベクターを得るための直接法を以下に
記載する。pCVSVLプラスミドをPstIで部分的に消化し、
消化物をゲル電気泳動上で分離する。可視化後、全長さ
のプラスミドに相当する線状DNA断片をpCVSVL−B1とし
て単離する。
記載する。pCVSVLプラスミドをPstIで部分的に消化し、
消化物をゲル電気泳動上で分離する。可視化後、全長さ
のプラスミドに相当する線状DNA断片をpCVSVL−B1とし
て単離する。
AHFのためのcDNA実施例５のクローニングベクターからP
stIによる部分消化によって救出する。部分的消化物を
ゲル電気泳動上に分離し、そして全長さのcDNAの分子量
に相当するバンドを単離する。pCVSVL−B1をこのDNA断
片でアンニールし、15℃においてT4リガーゼでリゲート
し、E.coli HB 101株中へトランスフェクトし、トラン
スフォーマントをテトラサイクリン耐性について選択す
る。選択したE.coliトランスフォーマントをテトラサイ
クリン存在下に育成する。プラスミドpCVSVL−B1aが慣
用方法で回収される。該プラスミド中のcDNAの適切な配
向は、適当なエンドヌクレアーゼによる不斉消化により
慣用態様で決定することができる。
stIによる部分消化によって救出する。部分的消化物を
ゲル電気泳動上に分離し、そして全長さのcDNAの分子量
に相当するバンドを単離する。pCVSVL−B1をこのDNA断
片でアンニールし、15℃においてT4リガーゼでリゲート
し、E.coli HB 101株中へトランスフェクトし、トラン
スフォーマントをテトラサイクリン耐性について選択す
る。選択したE.coliトランスフォーマントをテトラサイ
クリン存在下に育成する。プラスミドpCVSVL−B1aが慣
用方法で回収される。該プラスミド中のcDNAの適切な配
向は、適当なエンドヌクレアーゼによる不斉消化により
慣用態様で決定することができる。
2. 同時形質転換：選択および増幅 プラスミドpCVSVL−A1aもしくはpCVSVL−B1aと、pAdD26
SVpA＃３（前出Kaufman et al.）とを混合し（50μg HP
および0.5μg pAdD26VpA＃３）、そしてNaOAc pH4.5を
0.3Mへそしてエタノール2.5容積の添加によって再沈澱
する。沈澱したDNAを風乾し、2X HEBSS（0.5ml）中に再
懸濁し、そして記載（前出Kaufman et al.）のように0.
25M CaCl2（0.5ml）と激しく混合する。カルシウム−フ
ォスフェート−DNA沈澱を室温で30分間落着かせ、そし
てCHO DUKK−B1細胞（ChasinおよびUrlaub 1980,コロン
ビア大学から入手可能）へ適用する。これらの細胞の発
育および維持は記載されている（前出Kaufman et al.お
よびChasinおよびUrlaub,1980）。
SVpA＃３（前出Kaufman et al.）とを混合し（50μg HP
および0.5μg pAdD26VpA＃３）、そしてNaOAc pH4.5を
0.3Mへそしてエタノール2.5容積の添加によって再沈澱
する。沈澱したDNAを風乾し、2X HEBSS（0.5ml）中に再
懸濁し、そして記載（前出Kaufman et al.）のように0.
25M CaCl2（0.5ml）と激しく混合する。カルシウム−フ
ォスフェート−DNA沈澱を室温で30分間落着かせ、そし
てCHO DUKK−B1細胞（ChasinおよびUrlaub 1980,コロン
ビア大学から入手可能）へ適用する。これらの細胞の発
育および維持は記載されている（前出Kaufman et al.お
よびChasinおよびUrlaub,1980）。
このDUKK−B1細胞をトランスフェクション前に５×105/
10cm皿で24時間副次培養する。室温で30分間インキュベ
ートした後、10％ウシ胎児血清を含む倍地を適用し、細
胞を37℃で4,5時間インキュベートする。該倍地は次
に、10％ウシ胎児血清、チミジン、アデノシンおよびデ
オキシアデノシン10μg/ml,それにペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含むａ−倍地2mlの単層から除去さ
れる。２日後該細胞は1:15の割合で10％透析ウシ胎児血
清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含み、ヌク
レオチドを欠くａ−倍地中へ副次培養される。細胞は次
に４〜５日後同じ倍地を再び供給される。
10cm皿で24時間副次培養する。室温で30分間インキュベ
ートした後、10％ウシ胎児血清を含む倍地を適用し、細
胞を37℃で4,5時間インキュベートする。該倍地は次
に、10％ウシ胎児血清、チミジン、アデノシンおよびデ
オキシアデノシン10μg/ml,それにペニシリンおよびス
トレプトマイシンを含むａ−倍地2mlの単層から除去さ
れる。２日後該細胞は1:15の割合で10％透析ウシ胎児血
清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含み、ヌク
レオチドを欠くａ−倍地中へ副次培養される。細胞は次
に４〜５日後同じ倍地を再び供給される。
選択倍地中への副次培養10〜12日後、コロニーが出現す
る。AHF遺伝子のメトトレキセート（MTX）選択および検
出、選択遺伝子増幅はAxel et al.の米国特許第4,399,2
16号、または前出のKaufman et al.に従って実施され
る。
る。AHF遺伝子のメトトレキセート（MTX）選択および検
出、選択遺伝子増幅はAxel et al.の米国特許第4,399,2
16号、または前出のKaufman et al.に従って実施され
る。
AHF収率は、DUKK−B1細胞の代わりに、永久細胞ラインE
A.hy 926（Edgell et al.,“Proc.Natl.Acad.Sci."80:3
734−3737（1983））を同時形質転換することによって
改良し得る。この場合同時形質転換する選択遺伝子は、
Haber et an.,“Somatic Cell Genetics"4:499−508（1
982）に記載された優性DHFR遺伝子でなければならな
い。さもなければ、同時形質転換および培養は実質上本
明細書のどこかに述べているとおりである。
A.hy 926（Edgell et al.,“Proc.Natl.Acad.Sci."80:3
734−3737（1983））を同時形質転換することによって
改良し得る。この場合同時形質転換する選択遺伝子は、
Haber et an.,“Somatic Cell Genetics"4:499−508（1
982）に記載された優性DHFR遺伝子でなければならな
い。さもなければ、同時形質転換および培養は実質上本
明細書のどこかに述べているとおりである。
3. AHFの生産 セクション２において選択されたAHF生産CHOトランスフ
ォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中に維持
される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養するこ
とにより10までスケールアップされる。この培地はMT
Xを含有する必要はなく、選択遺伝子復帰突然変異株を
除去するように、ヌクレオチドを含有しないであろう。
ォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中に維持
される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養するこ
とにより10までスケールアップされる。この培地はMT
Xを含有する必要はなく、選択遺伝子復帰突然変異株を
除去するように、ヌクレオチドを含有しないであろう。
培養上清は、血漿サンプルについて使用するための標準
アッセイ法（ファクターVIII欠乏血漿の凝血時間の短
縮）に従って凝血活性についてモニターされる。上清
は、ファクターVIIIアッセイの感度を増すために、ポリ
エチレングリコールおよびグリシン沈澱（血漿からAHF
の精製に使用するため既知であるように）のような慣用
技術によって精製し得る。
アッセイ法（ファクターVIII欠乏血漿の凝血時間の短
縮）に従って凝血活性についてモニターされる。上清
は、ファクターVIIIアッセイの感度を増すために、ポリ
エチレングリコールおよびグリシン沈澱（血漿からAHF
の精製に使用するため既知であるように）のような慣用
技術によって精製し得る。
ファクターVIII活性がピークに達した時、細胞が遠心に
よって培地から分離される。次にファクターVIIIが回収
され、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱によ
って精製される。凝血活性がファクターVIII欠乏血漿に
おいて示される。
よって培地から分離される。次にファクターVIIIが回収
され、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱によ
って精製される。凝血活性がファクターVIII欠乏血漿に
おいて示される。
4. AHFの生産のための代替操作 全体のAHFコーディング区域を含んでいる全長さのcDNA
が前記したHH−25中のエクソン、該エクソンの５′およ
び３′区域が重複している２種のcDNAクローン、そして
３′cDNAクローンが重複しそして成端コードンを過ぎて
続いている３番目のクローンから形成された。これは、
合成Sal I部位がイニシエーターメチオニンに対してち
ょうど５′に、そしてAHFをコードする配列の末端のほ
ん訳停止信号に対して３′に配置されるように形成され
た。これはpSP64のポリリンカーSalI部位中へ配置し、
そしてそれから切り取ることを許容した。このクローン
（pSP64−VIII）からのSal I断片が精製され、そしてpC
VSVL2へリゲートされた。pCVSVL2は、慣用の操作によっ
て達成されるSV40ポリアデニル化配列の３′に位置する
Pst I部位を欠いていること、およびアデノビールス主
要後期プロモーター（MLP）から上流にSV40 Ava II
（Ｄ）断片の重複を含んでいることを除き、発現ベクタ
ーpCVSVL（Kaufman et al.,Mol.Cell Biol.,2:1304（19
82），その記載を参照としてこゝに取り入れる）と同一
であるプラスミドである。pCVSVL2はpAdD26SVpA（１）
（前出Kaufman et al.参照）から、二つのSV40 Ava II
“D"断片の各末端においてXho Iリンカーを加え、そし
てそれらをpAdD26SVpA（１）のXho I部位へ挿入するこ
とによって誘導された。Ava II“D"断片は、SV40後期プ
ロモーターがAd2主要後期プロモータと同じ配向になる
ように両方共挿入される。pCVSVLおよびpAdD26VpA
（３）については、前出Kaufman et al.参照。pSP64−V
IIIのSal I断片をpCVSVL2中へ挿入するため、pCVSVL2中
の独特のPst I部位はRothstein et al.,Methods Enzy
m.,69:98（1980）に記載の操作によってSal I部位へ変
えられ、そしてpSP64−VIIIから切り取ったSal I断片が
pCVSVL2−VIIIが得られるように挿入された。
が前記したHH−25中のエクソン、該エクソンの５′およ
び３′区域が重複している２種のcDNAクローン、そして
３′cDNAクローンが重複しそして成端コードンを過ぎて
続いている３番目のクローンから形成された。これは、
合成Sal I部位がイニシエーターメチオニンに対してち
ょうど５′に、そしてAHFをコードする配列の末端のほ
ん訳停止信号に対して３′に配置されるように形成され
た。これはpSP64のポリリンカーSalI部位中へ配置し、
そしてそれから切り取ることを許容した。このクローン
（pSP64−VIII）からのSal I断片が精製され、そしてpC
VSVL2へリゲートされた。pCVSVL2は、慣用の操作によっ
て達成されるSV40ポリアデニル化配列の３′に位置する
Pst I部位を欠いていること、およびアデノビールス主
要後期プロモーター（MLP）から上流にSV40 Ava II
（Ｄ）断片の重複を含んでいることを除き、発現ベクタ
ーpCVSVL（Kaufman et al.,Mol.Cell Biol.,2:1304（19
82），その記載を参照としてこゝに取り入れる）と同一
であるプラスミドである。pCVSVL2はpAdD26SVpA（１）
（前出Kaufman et al.参照）から、二つのSV40 Ava II
“D"断片の各末端においてXho Iリンカーを加え、そし
てそれらをpAdD26SVpA（１）のXho I部位へ挿入するこ
とによって誘導された。Ava II“D"断片は、SV40後期プ
ロモーターがAd2主要後期プロモータと同じ配向になる
ように両方共挿入される。pCVSVLおよびpAdD26VpA
（３）については、前出Kaufman et al.参照。pSP64−V
IIIのSal I断片をpCVSVL2中へ挿入するため、pCVSVL2中
の独特のPst I部位はRothstein et al.,Methods Enzy
m.,69:98（1980）に記載の操作によってSal I部位へ変
えられ、そしてpSP64−VIIIから切り取ったSal I断片が
pCVSVL2−VIIIが得られるように挿入された。
pCVSVL2−VIIIは、ベクターのアデノビールスMLPからAH
Fをコードする配列の転写を許容する正確な５′から
３′への配向を含んでいる。pCVSVL2−VIIIはアメリカ
ン、タイプ、カルチャー、コレクションへ寄託されてい
る。（寄託番号 ATCC 39813） pCVSVL2−VIIIは、サルCOS−７細胞（Mellon et al.,Ce
ll27:279（1981））中へ、SampayracおよびDanna,PNAS
U.S.A.78:7575（1981）に記載されたDEAEデキストラン
トランスフェクションプロトコールを使用して導入され
た。細胞は血清を含まない培地中で培養され、トランス
フェクション３日後、AHF活性についてアッセイされ
た。
Fをコードする配列の転写を許容する正確な５′から
３′への配向を含んでいる。pCVSVL2−VIIIはアメリカ
ン、タイプ、カルチャー、コレクションへ寄託されてい
る。（寄託番号 ATCC 39813） pCVSVL2−VIIIは、サルCOS−７細胞（Mellon et al.,Ce
ll27:279（1981））中へ、SampayracおよびDanna,PNAS
U.S.A.78:7575（1981）に記載されたDEAEデキストラン
トランスフェクションプロトコールを使用して導入され
た。細胞は血清を含まない培地中で培養され、トランス
フェクション３日後、AHF活性についてアッセイされ
た。
ファクターVIII:C活性は、Didishein,Science129:389
（1959）に記載された染色体基質アッセイによって測定
され、ヒトファクターVIII:C発現が約0.05単位/mlのレ
ベルで達成されたことを確実にした。
（1959）に記載された染色体基質アッセイによって測定
され、ヒトファクターVIII:C発現が約0.05単位/mlのレ
ベルで達成されたことを確実にした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】（１）（ａ）異種調節制御配列へ作用可能
に連結されており、 （ｂ）厳格なる条件下で、 ５′ GAC ATT TAT GAT GAG GAT GAA ATT CAG AGC CCC CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG のヌクレオチド配列へハイブリダイズし、 （ｃ）発現したときにヒトファクターVIII:C凝血促進活
性を示しかつアミノ酸配列： を有するタンパクをコードする、 二重ストランドDNAで形質転換した単離哺乳類細胞を培
養するステップ、 （２）培養物から前記タンパクを回収するステップを含
むことを特徴とするファクターVIII:C凝血促進活性を有
するタンパクの製造方法。 - 【請求項２】前記細胞が選択遺伝子で同時形質転換され
ている第１項の方法。 - 【請求項３】前記DNAが配列： を有する第１項の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/546,650 US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1983-10-28 | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US546650 | 1983-10-28 | ||
| US64403684A | 1984-08-24 | 1984-08-24 | |
| US644036 | 1984-08-24 | ||
| PCT/US1984/001641 WO1985001961A1 (en) | 1983-10-28 | 1984-10-12 | Production of factor viii and related products |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1215851A Division JPH02227078A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP1215850A Division JPH02182188A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP5024748A Division JP2549049B2 (ja) | 1983-10-28 | 1993-01-20 | ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61500646A JPS61500646A (ja) | 1986-04-10 |
| JPH07106156B2 true JPH07106156B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=27068312
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59504050A Expired - Lifetime JPH07106156B2 (ja) | 1983-10-28 | 1984-10-12 | ファクタ−▲ｖｉｉｉ▼および関連生産物の製造 |
| JP1215850A Pending JPH02182188A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP1215851A Pending JPH02227078A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP5024748A Expired - Lifetime JP2549049B2 (ja) | 1983-10-28 | 1993-01-20 | ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1215850A Pending JPH02182188A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP1215851A Pending JPH02227078A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP5024748A Expired - Lifetime JP2549049B2 (ja) | 1983-10-28 | 1993-01-20 | ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0162067B1 (ja) |
| JP (4) | JPH07106156B2 (ja) |
| DK (1) | DK174927B1 (ja) |
| ES (4) | ES8700868A1 (ja) |
| FI (1) | FI86436C (ja) |
| IE (1) | IE57884B1 (ja) |
| IT (1) | IT1177066B (ja) |
| MX (1) | MX9203437A (ja) |
| WO (1) | WO1985001961A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4716117A (en) * | 1984-10-26 | 1987-12-29 | Chiron Corporation | Monoclonal antibodies to factor VIIIC |
| US5045455A (en) * | 1984-01-12 | 1991-09-03 | Chiron Corporation | Factor VIII:C cDNA cloning and expression |
| US5004804A (en) * | 1984-01-12 | 1991-04-02 | Nordisk Gentofte | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
| DE3588242T2 (de) * | 1984-01-12 | 2004-03-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Für Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| FI86885C (fi) * | 1984-04-20 | 1992-10-26 | Genentech Inc | Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill |
| EP0182448A3 (en) * | 1984-08-24 | 1987-10-28 | Genetics Institute, Inc. | Production of factor viii and related products |
| US8597910B1 (en) | 1985-04-11 | 2013-12-03 | Children's Medical Center Corporation | DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells |
| AU591671B2 (en) * | 1985-04-11 | 1989-12-14 | Children's Medical Center Corporation | Von willebrand factor |
| DE3531360A1 (de) * | 1985-09-03 | 1987-05-07 | Merck Patent Gmbh | Dna-sequenzen, rekombinante dna-molekuele und verfahren zur herstellung des enzyms mutarotase aus acinetobacter calcoaceticus |
| US5250421A (en) * | 1986-01-03 | 1993-10-05 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C-type proteins |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| WO1987004187A1 (en) * | 1986-01-03 | 1987-07-16 | Genetics Institute, Inc. | METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS |
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| FR2599754B1 (fr) * | 1986-06-06 | 1989-12-29 | Transgene Sa | Procede de preparation de facteur viii a partir de cellules de mammiferes |
| ATE63335T1 (de) | 1986-07-11 | 1991-05-15 | Miles Inc | Herstellung von rekombinantem protein. |
| EP0302925A4 (en) * | 1987-01-30 | 1989-04-24 | Biogen Nv | METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII IN LARGE QUANTITIES. |
| CA1331157C (en) * | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US6060447A (en) * | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| EP0690126B1 (en) | 1987-06-12 | 2001-11-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| EP0500734B1 (en) * | 1989-11-17 | 1998-02-11 | Novo Nordisk A/S | Protein complexes having factor viii:c activity and production thereof |
| US5155218A (en) | 1990-05-08 | 1992-10-13 | Neurogenetic Corporation | Dna encoding human 5-ht1d receptors |
| DK53792D0 (da) * | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| US5563045A (en) * | 1992-11-13 | 1996-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric procoagulant proteins |
| US5910481A (en) * | 1995-11-13 | 1999-06-08 | Immuno Ag | Hybrid proteins with modified activity |
| US6221349B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Avigen, Inc. | Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells |
| US6200560B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-03-13 | Avigen, Inc. | Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells |
| DK3211085T3 (da) | 2003-09-30 | 2021-06-21 | Univ Pennsylvania | Klader af adeno-associeret virus (aav), sekvenser, vektorer indeholdende disse og anvendelser deraf |
| WO2005123928A1 (en) * | 2004-06-08 | 2005-12-29 | Battelle Memorial Institute | Production of human coagulation factor viii from plant cells and whole plants |
| DK2359867T3 (en) | 2005-04-07 | 2015-01-05 | Univ Pennsylvania | A method for increasing an AAV vector function |
| US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| CA2793633A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| SG10201601110VA (en) | 2011-02-17 | 2016-03-30 | Univ Pennsylvania | Compositions and methods for altering tissue specificity and improving aav9-mediated gene transfer |
| US9719106B2 (en) | 2013-04-29 | 2017-08-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof |
| US10058624B2 (en) | 2015-04-16 | 2018-08-28 | Emory University | Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof |
| US20240043494A1 (en) | 2020-08-07 | 2024-02-08 | Amicus Therapeutics, Inc. | Vesicle Targeting Proteins And Uses Of Same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US602312A (en) * | 1898-04-12 | eades | ||
| JPS58131918A (ja) * | 1981-12-14 | 1983-08-06 | スクリツプス・クリニツク・アンド・リサ−チ・フアンデ−シヨン | 因子８親凝集性活性蛋白質の調整方法およびその方法に使用する免疫吸着剤 |
| JPS60243023A (ja) * | 1984-04-20 | 1985-12-03 | ジエネンテク，インコーポレイテツド | 機能的な第５１１１因子の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663280A (en) * | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| DE3588242T2 (de) * | 1984-01-12 | 2004-03-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Für Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
-
1984
- 1984-10-12 EP EP84904025A patent/EP0162067B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-12 WO PCT/US1984/001641 patent/WO1985001961A1/en active IP Right Grant
- 1984-10-12 JP JP59504050A patent/JPH07106156B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-23 IE IE2734/84A patent/IE57884B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-10-26 IT IT23351/84A patent/IT1177066B/it active
- 1984-10-26 ES ES537146A patent/ES8700868A1/es not_active Expired
-
1985
- 1985-06-27 DK DK198502923A patent/DK174927B1/da active Protection Beyond IP Right Term
- 1985-06-27 FI FI852547A patent/FI86436C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-09-02 ES ES546654A patent/ES8800359A1/es not_active Expired
- 1985-09-02 ES ES546655A patent/ES8704546A1/es not_active Expired
- 1985-09-02 ES ES546653A patent/ES8800987A1/es not_active Expired
-
1989
- 1989-08-21 JP JP1215850A patent/JPH02182188A/ja active Pending
- 1989-08-21 JP JP1215851A patent/JPH02227078A/ja active Pending
-
1992
- 1992-06-26 MX MX9203437A patent/MX9203437A/es unknown
-
1993
- 1993-01-20 JP JP5024748A patent/JP2549049B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US602312A (en) * | 1898-04-12 | eades | ||
| JPS58131918A (ja) * | 1981-12-14 | 1983-08-06 | スクリツプス・クリニツク・アンド・リサ−チ・フアンデ−シヨン | 因子８親凝集性活性蛋白質の調整方法およびその方法に使用する免疫吸着剤 |
| JPS60243023A (ja) * | 1984-04-20 | 1985-12-03 | ジエネンテク，インコーポレイテツド | 機能的な第５１１１因子の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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