DE3588242T2

DE3588242T2 - Für Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen

Info

Publication number: DE3588242T2
Application number: DE3588242T
Authority: DE
Inventors: George Kuo; Frank R. Masiarz; Martha Truett; Pablo Valenzuela; Mirella Ezban Rasmussen; Jennifer Carlton Favaloro
Original assignee: Novo Nordisk AS; Chiron Corp
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1985-01-11
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2005-01-12
Also published as: JPH04218399A; EP0150735B2; DK165506C; EP0466199B1; EP1006182A2; ATE78871T1; DE122004000028I1; ATE224445T1; NL300153I1; EP0150735A2; EP1006182A3; DK38892A; JPS60185723A; LU91087I2; NL300119I1; NL300118I2; JP2000023670A; NL300120I1; DK13585A; DK38892D0

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese von Polypeptidfragmenten des menschlichen Faktors VIIIC, insbesondere eines Fragments mit einem Molekulargewicht von 77/80 kd, von DNA-Sequenzen, die Teile dieses Polypeptidfragments codieren, von extrachromosomalen Elementen, die diese DNA-Fragmente umfassen, einer komplexen Sonde zum Absuchen von DNA-Sequenzen, von entsprechenden DNA-Konstrukten und von monoclonalen Antikörpern, die mittels eines Immungens hergestellt werden, das die vorstehend genannten Polypeptidfragmente umfaßt.
Dieser Erfindungsgegenstand wird gemäß den Patentansprüchen erreicht. Die abhängigen Ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen.
Gemäß dem vorstehend definierten Erfindungsgegenstand betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Synthese von Polypeptidfragmenten des menschlichen Faktors VIIIC, insbesondere eines Fragments mit einem Molekulargewicht von 77/80 kd, von DNA-Sequenzen, die Teile diese Polypeptidfragments codieren, von extrachromosomalen Elementen, die diese DNA-Fragmente umfassen, einer komplexen Sonde zum Absuchen von DNA-Sequenzen, und von entsprechenden DNA-Konstrukten.
Das Stammpatent EP 150 735 (Anmeldungsnummer 85 100223.8-2105) betrifft eine einzelne Proteinzusammensetzung, die einen über Calcium verbundenen Komplex des 77/80 kd-Polypeptidfragments mit einem 92,5 kd-Fragment umfaßt, das eine Gerinnungsaktivität ähnlich jener des menschlichen Faktors VIIIC aufweist.
Faktor VIIIC ist ein Plasmaprotein, das am intrinsischen Weg der Blutgerinnung beteiligt ist. Er fehlt oder ist defekt bei Individuen mit der erblichen, X-chromosomalen rezessiven Bluterkrankheit Hämophilie A. Die Isolation des Faktors VIIIC bereitete große Schwierigkeiten, zum einen aufgrund seiner extrem niedrigen Konzentration im Plasma, zum anderen, weil er ein Degradationszwischen- oder -endprodukt eines größeren Proteinvorläufers zu sein scheint. Deshalb haben Versuche, den Faktor VIIIC zu isolieren, komplexe Gemische von erheblicher Heterogenität und schwankenden Molekulargewichten ergeben.
Eine Methode, die breite Anwendung zur Herstellung physiologisch aktiven Proteins gefunden hat, beinhaltet die Isolierung des Proteins von Interesse in gereinigter Form. Das Protein von Interesse leistet unschätzbare Dienste bei der Entwicklung einer rekombinanten DNA mit der Fähigkeit zur Produktion dieses Proteins. Hat man das Protein von Interesse, so kann man monoclonale Antikörper herstellen, die für dieses Protein spezifisch sind und dazu verwendet werden können, die Produktion des Proteins in Lysaten, seine Expression aus mRNA in Oocyten oder aus einem cDNA-Gen in einzelligen Mikroorganismen zu etablieren. Weiterhin kann man durch Aminosäuresequenzierung Sonden mit Codons für die bestimmte Aminosäuresequenz entwickeln, die mit mRNA, chromosomaler DNA oder cDNA hybridisieren und dadurch die Auffindung, Isolation und Expression des relevanten Gens oder der Botschaft und die Erzeugung des gewünschten Produktes mit hohen Ertrag in einem oder mehreren Wirten betreiben.
US-A-4.361.509 und die darin zitierten Verweise beschreiben die Reinigung des Faktors VIIIC (vgl. auch Fulcher und Zimmerman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 1648-1652). Tuddenham et al., J. of Lab. Clinical Medicine (1979) 93: 40–53 beschreibt die Reinigung des Faktors VIIIC unter Verwendung von polyclonalen Antikörpern. Austen, British J. Hematology (1979) 43: 669–674 beschreibt die Verwendung von Aminohexyl-Sepharose zur Reinigung von Faktor VIIIC. Weinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 5137-5141 beschreibt eine Studie über die Wirkung von Thrombin auf den Faktor VIIIC. Vgl. auch Kuo et al., Abstracts for IX International Congress of Thrombosis and Hemostasis, Kopenhagen, Juli 1983. Weiterhin wurde von C. A. Fulcher, J. R. Roberts und T. S. Zimmerman, Blood (1983) 61, Nr. 4: 807–811; gezeigt, daß aus dem Thrombindegradationsprodukt von menschlichem Faktor VIIIC mittels SDS-Gelelektrophorese zwei Polypeptidfragmente von 79/80 kd und 92 kd isoliert werden können.
Es werden Verfahren und Mittel zur Herstellung des menschlichen Faktors VIIIC, seiner Vorläufer und Untereinheiten durch Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Kultur von Säugetiergewebezellen bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet die Isolierung von reinem Faktor VIIIC, von dessen Untereinheiten und Fragmenten und die Bestimmung von deren physiologischer Verwandtschaft, besonders unter Verwendung von Thrombinverdauung. Es wird wenigstens ein Teil von jeder der verwandten Polypeptidserien sequenziert, und die Sequenzen werden zur Entwicklung von komplexen Sonden benützt. Fragmente genomi scher DNA werden nach homologen Sequenzen sondiert, und hybridisierende Fragmente werden isoliert und weiterbehandelt, bis sie ein DNA-Fragment ergeben, das eine komplette Untereinheit oder ein Fragment codiert und/oder sie werden zur Isolation reifer mRNA verwendet, aus der ds-cDNA erhalten werden kann. Die DNA-Sequenz kann dann zum Einschleusen in einen Expressionsvektor weiterbehandelt, und der Expressionsvektor zur Einführung der Sequenz in einen kompatiblen Wirt zwecks Expression des Polypeptids verwendet werden.
Gemäß der Erfindung können Fragmente und Untereinheiten von menschlichem Faktor VIIIC im wesentlichen in reiner Form bereitgestellt werden. Weiterhin werden Verfahren und Mittel bereitgestellt zur Expression von Faktor VIIIC-Untereinheiten und Fragmenten, zur Herstellung des Faktors VIIIC als Vorläufer oder in seiner aktiven Form, oder zur Bereitstellung einzelner Untereinheiten zur Verwendung in Kombination mit natürlich verfügbaren Untereinheiten. Die Untereinheiten und Fragmente haben eine oder mehrere biologische Eigenschaften, die mit dem Faktor VIIIC assoziiert sind, wie Epitopstellen, Gerinnungsaktivität und Immunogenität, so daß sie zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die Anwendung als Reagenzien, besonders als markierte Reagenzien in Immuntests finden.
Menschlicher Faktor VIIIC ist ein komplexes Protein, das im wesentlichen in reiner Form isoliert werden kann, und das ein apparentes Molekulargewicht von etwa 460 kd aufweist. Durch Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen erhält man eine große Zahl Fragmente von wechselnden Molekulargewichten: 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 und 77 kd, wobei die beiden letzteren als Doppelbande wandern. Die Analyse der Fragmente durch chemische und Proteasespaltung, auch durch Thrombin, unter Verwendung von Antikörpern zur Verfolgung der immunogenen Verwandtschaften und von Spaltungsmustern zur Verfolgung der strukturellen Verwandtschaften zeigt, daß das 92,5 kd-Polypeptid mit den 240-, 160-, 140-, und 115 kd-Polypeptiden verwandt ist, während die 77/80 kd-Doppelbande keine mit den anderen Peptiden gemeinsamen identifizierbaren Eigenschaften zu haben scheint, mit Ausnahme des 240 kd-Polypeptids. Es zeigt sich weiterhin, daß die 77/80 kd-Doppelbande durch Thrombin in eine 67/70 kd-Doppelbande konvertiert wird, während das 92,5 kd-Polypeptid im gereinigten Faktor VIIIC-Material bei Behandlung mit Thrombin von diesem direkt oder indirekt in zwei Polypeptide von etwa 40 kd und 52,5 kd gespaltet wird. Es zeigt sich, daß die elektrophoretisch isolierten 77/80 kd-Doppelbanden-Polypeptide blockierte N-Enden, die 67/70 kd-Doppelbanden-Polypeptide hingegen nicht blockierte N-Enden haben.
Es zeigt sich ferner, daß der Locus des Faktors VIIIC Exons mit umfangreichen Introns beinhaltet, wobei die Exons verschiedene mit Faktor VIIIC assoziierte Domänen beinhalten. Somit können einzelne Exons isoliert werden, die spezifische, am Faktor VIIIC-Komplex beteiligte Polypeptide oder Fragmente davon beinhalten. Indem man spezifische, am Faktor VIIIC beteiligte Aminosäuresequenzen, deren Untereinheiten und Fragmente identifiziert, kann man die Exons aus genomischer DNA selektiv isolieren und diese Exons allein, in Kombination untereinander oder in Verbindung mit synthetischer DNA verwenden um Sequenzen bereitzustellen, die Polypeptiduntereinheiten des Faktors VIIIC oder von Fragmenten davon codieren und die Herstellung davon ermöglichen.
Bequemerweise werden die sowohl Exons als auch Introns enthaltenden genomischen DNA-Sequenzen des Faktors VIIIC in einen Expressionsvektor eingeschleust, der sich zur Transkription und Translation in Säugetierzellen eignet, und der sowohl substantielle Mengen richtig gespleißter mRNA liefert, die zum Clonieren von cDNA geeignet ist, als auch die Produktion von Faktor VIIIC, dessen Untereinheiten oder Fragmenten ermöglicht. Weiterhin können die aus dem Genom isolierten DNA-Sequenzen zur Hybridisierung mit natürlicher, Faktor VIIIC-codiert mRNA, verwendet werden. Die mRNA kann dann zur Herstellung von ds-cDNA zur Codierung der Untereinheiten des Faktors VIIIC verwendet werden. Die DNA-Sequenzen können zur Expression verwendet werden, indem sie in einen geeigneten Expressionsvektor mit den nötigen regulatorischen Signalen für Transkription und Translation eingeschleust werden. Der Faktor VIIIC-Genexpressionsvektor (ein Expressionsvektor mit einem oder mehreren Genen, das/die den ganzen oder einen Teil des Faktors VIIIC, dessen Vorläufer, Untereinheiten oder Fragmente codiert/codieren) kann in einen kompatiblen Wirt eingeschleust und dieser Wirt zur Expression von Faktor VIIIC gezüchtet werden. Durch Wahl eines geeigneten Wirtes kann die Faktor VIIIC-DNA stromabwärts von einem sekretorischen Signal(Leader)- und Verarbeitungssignal insertiert werden, so daß das Produkt vom Wirt sekretiert und zum vollständigen Polypeptid weiterverarbeitet wird. Je nach Bedarf kann das Polypeptid noch weiter bearbeitet werden, um Funktionen oder Substituenten einzubauen, die im natürlich vorkommenden Polypeptid zu finden sind.
Im ersten Schritt der vorliegenden Erfindung wird hochreiner Faktor VIIIC gewonnen und seine Eigenschaften werden bestimmt. Gereinigter Faktor VIIIC kann aus handelsüblichem menschlichem antihämophilem Faktor (AHF) gewonnen werden, der seinerseits aus frischem, normalem menschlichem Plasma als ein Kryopräzipitat hergestellt wird und ungefähr eine 40-fache Anreicherung desselben darstellt. Der Faktor VIIIC wird weiter konzentriert und gerei nigt, indem der antihämophilem Faktor in einem geeigneten Puffer, z. B. Imidazol-Lysin-HCl in Kochsalzlösung, pH 7,4, aufgelöst wird, gefolgt von Chromatographie auf einer Affinitätssäule mit entweder polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern gegen Faktor VIIIC oder Faktor VIIIR. Bequemerweise sind die Antikörper kovalent an eine Sepharoseunterlage gebunden. Faktor VIIIC kann aus der Säule eluiert werden, indem eine Kombination aus einer relativ hohen Calciumionenkonzentration und Glycerol verwendet wird. Die aus der Säule erhaltenen Fraktionen können dann mit einem geeigneten Puffer, der eine niedrige Calciumionenkonzentration enthält, wie vorstehend beschrieben dialysiert werden. Anschließend können sie unter Verwendung einer Aminohexyl-Sepharosesäule, die mit einem Puffer hoher Calcium- oder Natiumkonzentration eluiert wird, weiter gereinigt werden. Zusätzliche Chromatographieschritte, z. B. Gelatinesepharose, HPLC, Ionenaustausch auf Dextransulfat oder Mono Q, Affinitätssäulen mit Lectinen oder Antikörpern gegen Faktor VIIIC sorgen für weitere Reinigung. Insbesondere die Anwendung von Dextransulfat entfernt Spurenkontamination, z. B. Fibrinogen, Fibronectin, IgG aus der Zubereitung, so daß man ein Produkt erhält, das im wesentlichen frei von fremden Proteinen ist. Die Aktivität der Fraktionen aus den Säulen kann mittels Gerinnungstests (im Handel erhältliche Kits) und für den Faktor VIIIC spezifische Antikörper entweder auf biologische oder auf antigene Aktivität oder auf beide überwacht werden. Bezogen auf die Konzentration des Faktors VIIIC im Plasma, können mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren Reinigungsgrade bis 200.000-fach erreicht werden.
Eigenschaften des Faktors VIIIC
Gelfiltrationsversuche zeigen, daß der Faktor VIIIC sich als Komplex mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 460 kd verhält. Mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese (unter denaturierenden Bedingungen) können sieben einzelne Polypeptide von unterschiedlichen Molekulargewichten isoliert werden. Ausweislich ihrer Molekulargewichte sind dies die Fragmente 240, 160, 115, 92,5, 80, 77 kd. Die Eigenschaften dieser Fragmente wurden folgendermaßen bestimmt:
Der erste Versuch bestand in der Verwendung von Inhibitorantikörpern, die aus dem Blut hämophiler Patienten isoliert wurden, und die als Z- und E-Antikörper bezeichnet wurden. Beide Antikörper reagierten mit der 77/80 kd-Doppelbande. Der E-Antikörper reagierte heftig mit dem 240 kd-Polypeptid und schwach mit mehreren Banden zwischen der Doppelbande und dem 240 kd-Polypeptid. Der Z-Antikörper reagierte auch mit dem 240 kd-Polypeptid nur schwach.
In Immunfällungsversuchen fällt der E-Antikörper die 77/80 kd-Doppelbande ebenso wie jene von hohem Molekulargewicht von 160, 140, 115 und 92,5 kd, wobei die Doppelbande eine der stärker ausgeprägten Banden ist. Die Einbeziehung von EGTA führt zum Verlust der Banden außer der Doppelbande, was darauf hinweist, daß die 92,5 kd-Spezies mit der 77 kd- und/oder der 80 kd-Spezies in einem durch eine Ca²⁺-Brücke gebildeten Komplex assoziiert ist.
Im nächsten Versuch wurden monoclonale Antikörper hergestellt, die sowohl die mit dem Faktor VIIIC zusammenhängende Gerinnungstätigkeit hemmen, als auch mit den Bestandteilen des Komplexes reagieren: Klasse I reagiert mit der 77/80 kd-Doppelbande und dem 240 kd-Polypeptid, Klasse II reagiert mit den 160-, 140-, 115- und 92,5 kd-Polypeptiden. Immunfällung von thrombinverdautem Faktor VIIIC mit Antikörpern der Klasse I zeigte, daß die resultierende 70/67 kd-Doppelbande aus der 77/80 kd-Doppelbande, die im Faktor VIIIC vorkommt, abgeleitet ist. Der Test mit den monoclonalen Antikörpern Klasse II zeigte, daß die 160-, 140- und 115-kd-Peptide Vorläufer des 92,5 kd-Peptids sind. Auch ein 40 kd-Peptidspaltprodukt des 92,5 kd-Peptids wurde von den Antikörpern Klasse II gebunden. Ein ELISA-Test unter Verwendung monoclonaler Antikörper in Gegenwart und in Abwesenheit von EGTA bestätigt die Ca²⁺-Brücken-Assoziierung zwischen den 92,5 kd- und den 77 kd- und/oder 80 kd-Bestandteilen des Faktor VIIIC-Komplexes.
Beim Immunabsorptionssäulenverfahren können sowohl menschliche Inhibitoren als auch monoclonale Antikörper verwendet werden, um den Faktor VIIIC zu erhalten, oder um diesen unter Verwendung von EGTA in seine Bestandteile, nämlich das 92,5 kd- und das 77/80 kd-Peptid aufzulösen.
Der nächste Versuch beinhaltete die Thrombindegradation von gereinigtem Faktor VIIIC-Material bei pH-Werten von 6,8 und 7,4. Aliquote wurden auf Gerinnungsaktivität getestet und mit TCA für eine Gelanalyse gefällt. Es zeigte sich, daß die Gerinnungsaktivität im Lauf der Zeit zu- und dann abnahm, wobei diese Zu- und Abnahmen mit solchen der Menge der 92,5 kd-Spezies einhergingen. Kurzzeitige (5- bis 15-minütige) Thrombinbehandlung des gereinigten Faktor VIIIC-Materials erhöhte den Anteil der 92,5 kd-Spezies, während die 77/80 kd-Doppelbande teilweise in eine 67/70 kd-Doppelbande konvertiert wird. Läßt man lange Thrombinverdauungszeiten zu, z. B. eine Stunde, so wird das 92,5 kd-Protein degradiert, und es treten zwei neue Peptide von 40 und 52,5 kd auf, wobei das 40 kd-Peptid die immunogenen Eigenschaften der 92,5 kd-Spezies beibehält. Es zeigt sich, daß das 52,5 kd-Peptid ana log zum 92,5 kd-Peptid ein Spaltprodukt durch chemische und enzymatische Degradationsmuster und -produkte ist.
Im nächsten Versuch wurden einzelne Faktor VIIIC-Untereinheiten und -Vorläufer (z. B. 240, 77/80, 92,5 kd-Proteine) durch präparative SDS-Gelelektrophorese isoliert und eine Thrombinverdauung der isolierten Polypeptide im Zeitverlauf durchgeführt. Das 240 kd-Fragment, das aus einem präparativen Gel isoliert wurde, erzeugte 160-, 140-, 115- und 92,5 kd-Banden. Die 80 kd- und 77 kd-Fragmente erzeugten ein 70 kd- bzw. ein 77 kd-Fragment.
Es wird ein Faktor VIIIC-Komplex abgeleitet, der die 77 kd- und/oder 80 kd-Spezies und das 92,5 kd-Polypeptid als über eine Calciumbrücke verbundener Komplex in hochreiner Form enthält. Nach der Behandlung in anti-Faktor VIIIR-Immunabsorptions- und Aminohexyl-Sepharosesäulen ist die Reinheit des Faktor VIIIC-Materials (der Komplex- und Vorläuferspezies) bezogen auf das Gesamtprotein gewöhnlich größer als 80%, oft größer als 90%, und kann 98% oder höher sein. Die Reinheit des Komplexes ist wenigstens 20%, meist aber 30%, bezogen auf das Gesamtprotein. Die Anwendung zusätzlicher Chromatographieschritte, z. B. von Dextransulfat, steigert den Reinheitsgrad des Faktor VIIIC-Materials (Komplex plus Vorläufer) auf wenigstens 90% und meist noch höher. Die Reinheit der durch präparative SDS-Gelelektrophorese isolierten Faktor VIIIC-Bestandteile, nämlich der 92,5 kd-Spezies und der 77/80 kd-Doppelbande, beträgt gewöhnlich mindestens 98%. Wie vorstehend angegeben, kann der Komplex erhalten werden, indem monoclonale Antikörper verwendet werden, die für ein Mitglied der Doppelbande oder für das 92,5 kd-Polypeptid spezifisch sind. Anschließend kann der Komplex mit einem denaturierenden oder einem chaotropen Lösungsmittel, z. B. wässrigen Harnstoff bzw. Thiocyanat vom Antikörper abgetrennt werden.
Herstellung von Sonden
Ein Teil der Aminosäuresequenz des N-Endes der 67- und 70 kd-Polypyptide lautet folgendermaßen:
Auf der Grundlage dieser Sequenz können Sonden für die 67/70 kd-Doppelbande (und somit auch die 77/80 kd-Doppelbande, aus der sie abgeleitet ist) hergestellt werden, die folgende Sequenzen aufweisen:
Die N-terminale Aminosäuresequenz des 52,5 kd-Proteins lautet im wesentlichen folgendermaßen:
Auf der Grundlage dieser Aminosäuresequenz kann nach dem codierenden Strang folgende Sonde für das 52,5 kd-Protein hergestellt werden:
Die Aminosäuresequenzen von drei Fragmenten des 77/80 kd-Proteins sind folgende:
Auf der Grundlage der jeweiligen Sequenz können nach dem nichtcodierenden Strang folgende Sonden hergestellt werden:
Die Sequenzen dieser Peptide und die Herstellung der entsprechenden Sonden werden nachfolgend im experimentellen Teil detailliert beschrieben.
Isolierung der DNA
Die vorstehend genannten Sonden können zum Aufspüren und Isolieren von entweder genomischer DNA oder mRNA verwendet werden. Das Clonieren genomischer DNA beinhaltet deren Spaltung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, um eine teilweise Verdauung und Größenselektion von Fragmenten von etwa 10–25 kb zu erreichen. Die Restriktionsverdauung sollte unvollständig sein, so daß überlappende Fragmente cloniert werden. Diese Fragmente können im geeigneten Vektor cloniert werden, so daß sie eine "Bibliothek" von Clones in Mikroorganismen, z. B. Bakterien wie E. coli bilden. Es können verschiedene Vektoren verwendet werden, darunter Plasmide und Viren wie pBR322, Lambda, Charon 4A, EMBL-4 oder ähnliche.
Die DNA wird mit den vorstehend beschriebenen, enzymatisch radioaktiv markierten Sonden abgesucht, und homologe Sequenzen werden aufgespürt. Jene Sequenzen, die mit einer oder mehreren Sonden hybridisieren, können ein- oder mehrere Male wiedercloniert und -hybridisiert werden.
Um kleinere Fragmente in der Größenordnung von 1–10 kb, meist aber von 1–6 kb zu erhalten, können ein oder mehrere Restriktionsenzyme verwendet werden, die vom/von den ursprünglichen Restriktionsenzymen verschieden sind. Diese Fragmente können dann subcloniert und auf positive Fragmente abgesucht werden. Die synthetischen Sonden können als Primer zur Sequenzierung von DNA-Fragmenten verwendet werden. Am bequemsten können jene Fragmente sequenziert werden, die eine zu einer oder mehreren Sequenzen der vorstehenden Sonden, bei denen die homologe Sequenz ungefähr 5 bis maximal etwa 500 Basen vom 5'-Ende entfernt ist, komplementäre Sequenz beibehalten. Andere Fragmente von Interesse sind jene an den Enden des ursprünglich clonierten Fragments, da diese in anderen Clones der "Bibliothek" vertreten sein und somit dazu dienen werden, das ganze Chromosom „abzuschreiten", bis das komplette gewünschte Gen wiedergewonnen ist.
Nach der Sequenzierung des DNA-Fragments wird das Fragment aufgrund der festgestellten Sequenz weiter manipuliert. Anhand der Sequenz kann man einen offenen Leserahmen bestimmen, der die festgestellte Aminosäuresequenz enthält. Durch Bestimmung der Restriktionsstellen kann man die Größe des Fragments weiter verringern, ohne codierende Sequenzen zu verlieren, obwohl die Entfernung einer kurzen Sequenz am N-Ende hinnehmbar ist, da diese unter Verwendung geeigneter Adapter ersetzt werden kann. Stehen keine Restriktionsstellen an geeigneten Orten zur Verfügung, kann das DNA-Fragment durch Bal31-Resektion über variierende Zeiträume modifiziert, die resultierenden Fragment cloniert und die 5'-Enden mittels verschiedener Verfahren bestimmt werden. Bequemerweise kann man durch geeignete Wahl der 3'- Basen, an die das resektierte Fragment angefügt wird, eine Erkennungsstelle für ein bestimmtes Restriktionsenzym schaffen. Auf diese Weise kann man die resultierenden Clone nach den vorbestimmten Restriktionsstellen absuchen, die die Gegenwart eines an die gewünschte Stelle resektierten Fragments anzeigen.
Wünschenswerterweise können Exons oder Fragmente von solchen, gewöhnlich von wenigstens 50 bp, meist von wenigstens 100 bp, sogar von etwa 250 bp oder mehr, denaturiert und als Sonden für mRNA aus menschlichen Zellen benützt werden, besonders jener Zellen, die mRNA für Faktor VIIIC produzieren. Durch Isolierung hybridisierender mRNA, kann die mRNA durch Translation in Eizellen oder in einem Reticulocytenlysat abgesucht werden, und die Produktion von Faktor VIIIC kann durch Antikörper gegen Faktor VIIIC oder durch Gerinnungsaktivität aufgrund von Bindungen an Faktor VIIIC-Untereinheiten entdeckt werden. Die mRNA kann dann, z. B. durch Verwendung von AMV Reverser Transkriptase revers transkribiert werden. Mit verschiedenen Verfahren kann die ss-cDNA in ds-cDNA umgewandelt werden, wobei die Reverse Transkriptase oder die DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zur Herstellung des zweiten Stranges verwendet werden, gefolgt von Entfernung der terminalen Loop, je nach Eignung mit einer Nuclease, z. B. Si-Nuclease. Erhält man eine unvollständige Kopie, kann die mRNA „abgeschritten" werden, oder es kann die Synthese von cDNA mit Primern benützt werden, bis die 5'-codierende Sequenz der mRNA kopiert wurde und eine DNA-Sequenz erhalten wurde, die die gesamte codierende Region der mRNA codiert.
Auf der Basis der vorstehenden Verfahren können entweder DNA-Sequenzen für die Expression verwendet werden, die den (die) Polypeptidvorläufer des Faktors VIIIC oder seiner größeren Fragmente codieren, oder kleinere Fragmente, die spezifische Untereinheiten des Faktors VIIIC codieren, z. B. 92,5 kd, 80 kd oder 77 kd.
Das Gen des Vorläuferpolypeptids (proFaktor VIIIC) kann an einer oder an beiden Seiten mit glatten Enden versehen werden und in einen Expressionsvektor mit komplementären Enden eingeschleust werden, oder es kann stromabwärts vom 5'-codierenden Ende geschnitten und zur richtigen Insertion in den Vektor an einen Adapter gebunden werden.
Fragmente, die das richtige N-Ende aufweisen, das an der Codierungssequenz für das 70 kd- oder das 80 kd-Polypeptid sein kann oder ein 5'-Ende stromabwärts von der ursprünglichen Base haben kann (gewöhnlich nicht mehr als etwa 30, meist nicht mehr als etwa 20 Basen stromabwärts), kann dann mit den geeigneten Adaptern in einen geeigneten Vektor insertiert werden.
Zur Bereitstellung extrachromosomaler Elemente können verschiedene Vektoren verwendet werden, je nach Wirt, Expressionsweise (konstitutiv oder induziert), gewünschten Markern, ob eine Sekretion erwünscht ist usw. (Unter einem Vektor wird ein intaktes Replikationssystem verstanden.) Derzeit sind zahlreiche Vektoren erhältlich, die die regulatorischen Signale für Transkription und Translation liefern, die entweder von Säugetierwirten, z. B. Zellgewebekulturen, oder von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtsmikroorganismen, z. B. E. coli, B. subtilis, B. thermophilus, S. cerevisiae usw. erkannt werden.
Die Vektoren haben ein Replikationssystem, das vom Wirt erkannt wird, jedoch kann in manchen Fällen der Einbau eines Konstruktes mit regulatorischen Signalen für Transkription und Translation und des Cistrons von Interesse in das Wirtsgenom wünschenswert sein. In diesen Fällen wird das Konstrukt gewöhnlich von Sequenzen flankiert sein, die den Sequenzen im Wirtsgenom homolog sind.
Die verwendeten Vektoren haben Transkriptions- und Translationssignale, die vom Wirt erkannt werden. Die Transkriptionssignale beinhalten den Promoter und den Terminator ebenso wie Hilfssignale, wie einen oder mehrere Enhancer. Weiterhin können zur Steuerung der Transkription Operatoren, Aktivatoren, Repressionsgene usw. vorhanden sein. Andere Sequenzen, die an der Transkription beteiligt sind, dienen dem Abschluß (capping), der Polyadenylierung usw. Zur Translation kann je nach Wirt eine Ribosomenbindungsstelle, ein Initiationscodon, Stopcodons usw. vorhanden sein.
Bequemerweise werden nichtcodierende 5'- und 3'-flankierende Regionen von nativen Genen des Wirtes verwendet, so daß die vom Wirt erkannten Signale in geeigneter Beziehung vorhanden sind. Diese flankierenden Regionen können an das Gen, das Faktor VIIIC-Vorläufer, Untereinheiten oder Fragmente davon codiert, gebunden werden, so daß das Gen in einem Leserahmen mit dem Initiationscodon ist, und entweder sein eigenes Stopcodon trägt oder unmittelbar stromaufwärts von einem oder mehreren Stopcodons insertiert wird.
Normalerweise hat ein Vektor einen oder mehrere Marker, die für Selektion sorgen, und die einen anhaltenden Selektionsdruck während des Wirtswachstums ermöglichen. Diese Marker können unter anderem sein: Prototrophie in einem auxotrophen Wirt, Antibiotikaresistenz, Toxinresistenz, usw.
Sind ein sekretorisches Signal (Leader) und Verarbeitungssignale vorhanden, wird es gewöhnlich erforderlich sein, einen Adapter bereitzustellen. Man kann einen oligonucleotiden Adapter, meist von etwa 10–15 bp synthetisieren, indem man für eine geeignete Restriktionsstelle am Ende der DNA-Sequenz, die das sekretorische Signal (Leader) und die Verarbeitungssignale codiert, sorgt oder stromaufwärts davon. Er kann zwischen das sekretorische Signal (Leader) und die Verarbeitungssignale oder einen gekürzten Teil derselben einerseits und das Gen von Interesse andererseits insertiert werden, welches ein 5'-Ende am ursprünglichen Codon des Gens oder stromabwärts davon hat, so daß der Adapter alle notwendigen fehlenden Basen ergänzt und dafür sorgt, daß das Gen in einen Leserahmen mit dem Initiationscodon der Signal(Leader)sequenz ist.
Das resultierenden Konstrukte die das gewünschte Gen beinhalten, können dann nach den herkömmlichen Verfahren, z. B. Transformation, Konjugation, Transfektion usw. in einen Wirt eingeschleust werden, der in Kulturen zu wachsen vermag. Dieser kann dann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und das Produkt nach den herkömmlichen Verfahren isoliert werden. Verbleibt das Produkt intrazellulär, so werden die Zellen geerntet und lysiert, wird das Produkt hingegen sekretiert, so wird es aus dem Nährmedium isoliert. Das Produkt kann durch Chromatographie gereinigt werden, z. B. durch Affinitätschromatographie, Elektrophorese, Extraktion, HPLC usw.
Zur Expression in einer Säugetierzelle kann ein Säugetiervirus als Vektor verwendet werden, z. B. SV-40, Papillomvirus, Maloneys murines Sarkomvirus, Adenovirus usw. Diese Viren sind zur Verwendung als Expressioinsvektoren in Säugetierzellkulturen modifiziert worden. Als Beispiel dient ein System von COS-Zellen, die ein integriertes SV-40 Genom tragen und das große T-Antigen produzieren, das für die SV-40-Replikation erforderlich ist (Gluzman, Cell (1981) 23: 175). Ein Fragment, das von der HpaI-Stelle bei 0,76 auf der SV-40-Karte bis zur BamHI-Stelle bei 0,14 auf der SV-40-Karte reicht, kann als Vektor verwendet werden. Das rekombinante Plasmid, das man durch Zusammenfügen der Faktor VIIIC-Gene oder Teilen davon mit dem SV-40-Vektor erhält, kann dazu verwendet werden, CV-1- Affenzellen zu transfizieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung können gereinigte Untereinheiten und Fragmente von Faktor VIIIC erhalten und dazu verwendet werden, die Gerinnungsfähigkeit bei Individuen zu erhöhen, die die bestimmte Untereinheit benötigen. Der Faktor VIIIC kann auch in der Therapie angewandt werden. Weiterhin können die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Polypeptide zur Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen Faktor VIIIC, seine Untereinheiten und Fragmente verwendet werden. Auch können die Untereinheiten und Fragmente als Reagentien benützt werden, die markiert und in Kombination mit den Antikörpern in diagnostischen Tests auf die Gegenwart einer oder mehrerer Untereinheiten oder Degradationsfragmenten davon in physiologischen Flüssigkeiten, z. B. Blut oder Serum eingesetzt werden können.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Endung und nicht zu ihrer Einschränkung gegeben. Im folgenden bedeutet Ak Antikörper und Ag Antigen.
EXPERIMENTELLER TEIL
I. Reinigung von Faktor VIIIC
Aus handelsüblichen Kryopräzipitatzubereitungen wurde menschlicher Faktor VIIIC auf zwei Wegen isoliert: a) durch Immunabsorptionschromatographie unter Verwendung einer polyclonalen anti-VIIIR-Sepharosesäule, nach einem zuerst von E. G. D. Tuddenham, N. C. Trabold, J. A. Collins und L. W. Hoyer, J. of Lab. Clinical Medicine (1979) 93: 40 beschriebenen Verfahren; und b) durch eine chromatographische Separation auf Aminohexylsubstituierter Agarose, wie ursprünglich von D. E. G. Austen, British J. of Hematology (1979) 43: 669 beschrieben.
Details der Vorgehensweisen sind nachfolgend beschrieben.
Von Ziegen stammendes Antiserum gegen das mit dem menschlichen Faktor VIII verwandte Antigen (VIII:R), das von Atlantic Antibody (Kat.-Nr. 040-01) bezogen wurde, wurde entweder mit einer Standard 0–50%igen Ammoniumsulfat Fällung (cut) und anschließender DEAE-Säulenchromatographie oder mit einer ähnlichen 0–33%igen Fällung (cut) ohne nachfolgender Chromatographie behandelt. Diese Stoffe wurden dann mit CNBr-aktivierter Sepharose CL2B bzw. 4B (Pharmacia, 17-0140-01 oder 17-0430-01) konjugiert und in Säulenform gegossen (anti-VIII:R-Sepharosesäule).
„Hemofil", eine stabile, getrocknete Zubereitung von antihämophilem Faktor (Faktor VIII, AHF, AHG) in konzentrierter Form, die aus frischem, normalem menschlichem Plasma hergestellt wird eine eine etwa 40-fache Anreicherung von Faktor VIIIC darstellt, wurde im folgenden Puffer aufgelöst: 0,02 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, 0,02% NaN₃, pH 7,4.
Nach seiner Auflösung wurde die beschriebene anti-VIII:R-Sepharosesäule mit dem Hemofil beschickt. Nichtspezifisch gebundenes Protein wurde mit dem vorstehend beschriebenen Puffer, jedoch mit auf 0,5 M abgeändertem NaCl-Gehalt, eluiert. Anschließend wurde Faktor VIIIC mit dem vorstehend beschriebenen Puffer, jedoch 0,35 M CaCl₂ und 10% Glycerolzusatz, der die Aktivität des Faktors VIIIC stabilisiert, eluiert. Die aktiven Fraktionen aus der Immunabsorptionssäule wurden vereinigt und gegen Puffer (0,02 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, 0,025 M CaCl₂, 0,02% NaN₃, 10% Glycerol, pH 7,4) dialysiert. Eine mit dem vorstehend beschriebenen Dialysepuffer äquilibrierte Aminohexyl-Sepharosesäule 4B (1 × 6 cm) wurde mit einem Aliquot der dialysierten Fraktionen, das 1100 Einheiten Faktor VIIIC enthielt, beschickt. Die Faktor VIIIC-Aktivität wurde mit dem gleichen Puffer mit entweder 0,35 M CaCl₂ oder 2 M NaCl eluiert. Es zeigte sich, daß die Aktivität in einem Volumen von 2 ml mit 500 Einheiten Faktor VIIIC pro ml enthalten war. Nachfolgende, in der gleichen Weise ausgeführte Versuche, führten zu einer Wiedergewinnung von 25% aus der anti-VIII:R-Säule und von ungefähr 90% aus der Aminohexylsäule. Alternativ wird vereinigtes, dialysiertes Material, das aus der Immunabsorptionssäule eluiert wurde, zuerst in eine mit dem vorstehenden Dialysepuffer äquilibrierte Dextransulfat-Säule (Pharmacia; 1,5 × 6 cm) geladen und mit dem gleichen Puffer eluiert. Mehrere kleinere Verunreinigungen, z. B. Fibrinogen, Fibronectin, IgG werden in der Säule zurückgehalten, während der herausfließende Faktor VIIIC gesammelt und wie vorstehend beschrieben auf die Aminohexyl-Sepharosesäule geladen wird.
Es wurde gezeigt, daß im gereinigten Faktor VIII sowohl biologische (d. h. Gerinnung) als auch Antigenaktivität (cAg) vorhanden waren, wie dies die nachfolgenden Tests bewiesen, die eine 5000-fache Reinigung gegenüber der 40-fachen Konzentration in Hemofil zeigten. Mittels eines handelsüblichen Standard-Dreikomponentenkits von General Diagnostics (APTT, Factor VIII deficient plasma, Verify Normal Citrate), wurde ein Koagulationstest ausgeführt, der hohe Spiegel biologischer Aktivität von Faktor VIII aufzeigte.
Die verwendeten Antikörper waren von Inhibitor-Patienten abgeleitet, einer mit einem niedrigen Titer (LZ) als Beschichtungs-Ak und einer mit einem hohen Titer (HZ) als markierter Ak. Die Antikörper wurden in zwei verschiedenen Arten von Tests verwendet. In einem RIA-Test wird der HZ-Ak mit ¹²⁵I markiert, in einem ELISA-Test wird der HZ-Ak an Meerrettichperoxidase gekuppelt. Die Markierung der HZ-Antikörper mit ¹²⁵I wurde gemäß Hunter, W. M., in Radioimmunoassay, Hrsg. Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 3. Aufl., Bd. 1, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978, vorgenommen, die Meerrettichperoxidase-HZ-Konjugation gemäß Wilson und Nakane, in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Hrsg. Knapp et al., Elsevier, North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978 S. 215–224. LZ hatte eine Aktivität von 700 Bethesda-Einheiten/ml, HZ eine Aktivität von 1500 Bethesda-Einheiten/ml. Die Beschichtungs-Ak (LZ) wurden auf 3,5 μg/ml verdünnt, und zwar mit 0,1 M NaHCO₃, pH 9,8 (RIA), oder mit 0,05 M Imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA (ELISA), oder für beide Verfahren mit PBS-CMF (für 1 Liter: 200 mg KCl, 200 mg KH₂PO₄, 8,0 g NaCl, 1,15 g wasserfreies Na₂HPO₄, pH 7,4). Jeweils 1 ml wurde zu jedem Röhrchen (Polystyren) hinzugefügt und über Nacht bei Zimmertemperatur bebrütet. Diese Lösung wird durch Absaugen entfernt, und die Röhrchen werden drei Mal mit 3–3,5 ml 0,15 M NaCl oder PBS-CMF mit 0,05% Tween 20 gewaschen. Die Proben oder die Standards (General Diagnostics, Verify Normal Citrate, Katalog-Nr. 34112) werden verdünnt, bis zu einem Gesamtvolumen von 0,9 ml pro Röhrchen in die Röhrchen gegeben, und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. (Die Verdünnungen wurden mit 0,02M Tris, 0,15 M NaCl, 5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01% Thimerosal, pH 6,5 für RIA oder mit 0,05 M Imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA für ELISA oder mit PBS-CMF für beide Verfahren vorgenommen.) Die Lösungen wurden durch Absaugen entfernt und die Röhrchen wie vorstehend beschrieben gewaschen. Für RIA wurden 5 × 10⁵ cpm ¹²⁵I-markierte Antikörper gegen Faktor VIIIC (HZ) in 600 μl RIA-Verdünnungspuffer zu jedem Röhrchen hinzugefügt, dann wurden die Röhrchen 16–18 Stunden bei 37°C inkubiert; die Lösungen wurden entfernt, die Röhrchen wie vorstehend beschrieben gewaschen und mit einem Gammazähler gemessen. Für ELISA wurden zu jedem Röhrchen 0,9 ml peroxidasekonjugierter anti-Faktor VIIIC (HZ) hinzugefügt, das Röhrchen über Nacht bei Zimmertemperatur bebrütet; die Lösungen wurden entfernt und die Röhrchen wie vorstehend beschrieben gewaschen, dann wurden 0,9 ml OPD-Lösung hinzugefügt (auf 100 ml: 0,73 g Zitronensäure, 1,19 g Dinatriumsäurephosphat, 0,15 g o-Phenylendiamin, pH 5,0, mit 250 μl 10% H₂O₂, unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt), und 30 Minuten lang im Dunklen bei Zimmertemperatur inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden in jedes Röhrchen 0,5 ml 6 N HCl (oder 0,9 ml 1 M H₂SO₄) hinzugefügt. Die OD₄₉₂ wurde abgelesen.
II. Struktur des Faktor VIII-Komplexes
A. Immunfällungsversuche
Die Gelfiltrationsversuche wurden mit einer AcA 44-Säule auf dem gereinigten Faktor VIIIC-Material unter folgenden Bedingungen ausgeführt: 0,1% Insulin (als Trägerprotein zur Stabilisierung), 0,25 CaCl₂, 0,01% Thiomerosal, 0,05 M Imidazol, pH 7,2. Die Faktor VIIIC-Gerinnungsaktivität und die antigenen Aktivitäten des Eluats wurden verfolgt. Es wurden zwei antigene Peaks beobachtet. Der eine, mit Faktor VIIIC-Gerinnungsaktivität, verhielt sich unter diesen Bedingungen (nativ) wie ein Komplex mit apparentem Molekulargewicht von etwa 460.000. Der andere Peak (ohne Gerinnungsaktivität) eluierte bei einem apparentem Molekulargewicht von etwas über 67.000.
Eine Untersuchung mit einer analytischen Standard-Laemmli-SDS-Gelelektrophorese (Laemmli, Nature (1970) 227: 680–685), ergab verschiedene Proteinspezies von 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 und 72 kd. Die Verwandtschaft dieser Proteine mit Faktor VIIIC wurde durch Standard-Immunfällungsverfahren bestimmt. In diesem Verfahren wurden S. aureus-Protein A-Sepharose CL4B oder Polystyrenkügelchen (¹/₈ Zoll, Precision Plastic Ball Co.), die mit affinitätsgerinigten zweiten Antikörpern beschichtet waren (anti-Maus IgG von Ziegen oder anti-Mensch IgG), dazu verwendet, Antigen-Ak-Komplexe von freiem 125I-markiertem Faktor VIIIC abzutrennen.
Die aus der Affinitätssäule eluierten Proteine wurden iodiert und reagierten dann mit für den Faktor VIIIC spezifischen Antikörpern. Diese Antikörper waren menschliche Inhibitorantikörper, die aus hämophilen Patienten isoliert worden waren, und die als anti-Faktor VIIIC (Z) und (E) oder Inhibitor-Antikörper VIIIC (Z) und (E) bezeichnet wurden.
Die Ergebnisse zeigten, daß beide Antikörper mit der 77/80 kd-Doppelbande reagierten. Der Antikörper „E" reagierte auch heftig mit der 240 kd-Bande und ergab schwache Niederschläge von mehreren Banden zwischen der Doppelbande und der 240 kd-Spezies (160, 140, 115, 92,5 kd). Auch der Antikörper „Z" fällte die 92,5- und die 240 kd-Proteine. Die heftige Reaktion des Antikörpers „E" mit der 240 kd-Spezies legt die Vermutung nahe, daß diese Spezies ein Vorläufer von Faktor VIIIC ist.
Die in der Antikörpersäule gereinigte Faktor VIIIC-Fraktion wurde iodiert und reagierte in Gegenwart und in Abwesenheit von EGTA (Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) mit den menschlichen Inhibitorantikörpern. Dies erlaubt eine Untersuchung der Rolle von zweiwertigen Kationen, besonders von Ca²⁺, bei der Assoziierung der Fak tor VIIIC-Polypeptide. Es wurde beobachtet, daß der Inhibitorantikörper (E) die 77/80 kd-Doppelbande ebenso fällte, wie Spezies von höherem Molekulargewicht von 160, 140, 115 und 92,5 kd. Die Doppelbande ist immer unter den stärkeren Banden. (Dieser Immunfällungversuch wurde mit Polystyrenkügelchen ausgeführt. Dieses Verfahren ergibt einen niedrigeren Hintergrund, und der markierte IgG in der Faktor VIIIC-Zubereitung wird nicht gefällt.) Die Gegenwart von EGTA führt zum Verlust der Banden von höherem Molekulargewicht (92,5–160 kd), hat jedoch keine Auswirkung auf die Menge der gefällten Doppelbanden. Ein ähnlicher Versuch verwendete an Sepharose gekoppelte Z-Antikörper als Immunabsorbens: Die Säule wird mit gereinigtem Faktor VIIIC beschickt und nach Bindung via 77/80kd wird das 92,5 kd-Polypeptid selektiv mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) eluiert. Dieses Verfahren wird vorbereitend verwendet, um die 92,5 kd-Spezies zu fraktionieren. Die Immunabsorptionssäule oder eine ähnliche Säule werden mit polyclonalen Antikörpern gegen Faktor VIIIC vorbereitet. Wird der Faktor VIIIC statt mit EGTA mit chaotropen oder denaturierenden Lösungsmitteln, z. B. Thiocyanatlösungen bzw. wässrigem Harnstoff eluiert, so erreicht man einen noch höheren Reinigungsgrad. Diese Befunde lassen vermuten, daß das 92,5 kd-Peptid über eine Ca²⁺-Brücke nichtkovalent mit der 77/80 kd-Doppelbande verbunden ist. Die Inhibitor-Antikörper scheinen nur mit der Doppelbande direkt zu reagieren. Die Banden der höheren Molekulargewichte (die 115 kd, 140 kd, 160 kd) sind wahrscheinlich Vorläufer des 92,5 kd-Polypeptids, worauf die Fähigkeit der gegen das 92,5 kd-Polypeptid gerichteten monoclonalen Antikörper hinweist, mit den die 115 kd-, 140 kd-, 160 kd-Polypeptiden kreuzzureagieren.
Die Verwandtschaft verschiedener Proteinspezies aus der Affinitätssäule wurde durch die Immunfällung von jodiertem, gereinigtem Faktor VIIIC mit monoclonalen Antikörpern demonstriert, die nach dem Verfahren von G. Kohler und C. Milstein (Eur. J. of Immunol. (1975) 6: 511) hergestellt worden waren. Balb/c-Mäuse wurden mit an flüssiger Phase immunadsorbiertem Faktor VIIIC immunisiert. Milzzellen (10⁸) wurden mit 10⁷ NSO- oder NSI-Mäusemyelomzellen fusioniert. Die Fusionsprodukte wurden auf zwei Mikrotiterplatten mit je 96 Vertiefungen ausplattiert. Es wurde eine Milzzellennährschicht in einer Konzentration von 10⁴ Zellen/Vertiefung angewandt. Die Kolonien wurden vom fünften Tag an mikroskopisch sichtbar, und die Überstände wurden alle paar Tage mit einem ELISA-Test überprüft. Folgende Schichten wurden verwendet: 1.) Aus der hexyl-Sepharose 4B-Säule eluierter Faktor VIIIC, wie vorstehend in Abschnitt I beschrieben; 2.) Hybridzellenüberstand; 3.) Meerrettichperoxidase (HRP)-markierter anti-Maus IgG von Ziegen; 4.) HRP-Substrat.
Es wurden mehrere Klassen von monoclonalen Antikörpern identifiziert, von denen zwei die Gerinnungsaktivität von Faktor VIIIC hemmten: Antikörper Klasse I reagierten mit der 77/80 kd-Doppelbande und dem 240 kd-Polypeptid, Antikörper Klasse II reagierten mit Proteinen von 240, 160, 140, 115 und 92,5 kd. Die Immunfällung thrombinverdauten Faktors VIIIC mit monoclonalen Antikörpern der Klasse I zeigt, daß die 70/67 kd-Doppelbande aus der 77/80 kd-Doppelbande abgeleitet ist (siehe nachstehend). Die monoclonalen Antikörper Klasse III zeigen an, daß die 160-, 140- und 115 kd-Peptide Vorläufer des 92,5 kd-Peptids sind. Weiterhin reagierten die monoclonalen Antikörper Klasse III mit einem 40 kd-Peptid, das durch Thrombinverdauung des gereinigten Faktor VIIIC-Materials hergestellt wurde.
Ein dem vorstehend beschriebenen ähnlicher Versuch, der EGTA zur Untersuchung der Rolle von Ca²⁺-Ionen im Faktor VIIIC-Komplex verwendet, wurde ebenfalls mit einem auf monoclonalen Antikörpern basierenden ELISA-Test mit den folgenden Schichten durchgeführt: 1.) Monospezifische antimurine IgG; 2.) Monoclonale Antikörper Klasse III (anti-92,5 kd); 3.) gereinigtes Faktor VIIIC-Material; 4.) HRP-menschlicher Inhibitorantikörper gegen 77/80 kd. Die Zugabe von EGTA entfernte gebundene HRP-Aktivität in der Kontrolle ohne Chelator. Die Tatsache, daß die gegen die 77/80 kd-Doppelbande bzw. das 92,5 kd-Polypeptid gerichteten monoclonalen Antikörper der Klassen I und III beide auf die Gerinnungsaktivität des Faktors VIIIC hemmend wirken, impliziert, daß beide wesentliche Bestandteile des Faktor VIIIC-Komplex sind.
B. Thrombinaktivierung von Faktor VIIIC
Aminohexylkonzentrierter, affinitätsgereinigter Faktor VIIIC wurde durch Thrombin (Boehringer, Chargen-Nr. 1072302) bei zwei verschiedenen pH-Werten (6,8 und 7,4) aktiviert.
Aliquote davon wurden auf ihre Gerinnungsaktivität getestet, und zusätzlich wurden Proben (jeweils etwa 2,5 Einheiten) für die Gelanalyse TCA-gefällt. In den ersten Versuchen betrug die VIIIC-Aktivität anfänglich 46 Einheiten/ml. Sie wurde in Faktor VIIIC-Puffer (20 mM Imidazol, pH 6,8, 150 mM NaCl, 100 mM Lysin, 25 mM CaCl₂ und 10% Glycerol) auf eine Endkonzentration von 11,5 Einheiten/ml herunterverdünnt. Die Thrombin-Endkonzentration betrug 0,12 Einheiten/ml (etwa 1 Einheit Thrombin auf 100 Gerinnungseinheiten von VIIIC). Die Ergebnisse zeigten, daß die Gerinnungsaktivität bis etwa 180 Einheiten/ml ansteigt und dann auf etwa 40 Einheiten/ml abfällt, was im wesentlichen der Startaktivität entspricht. Sie geht mit einem ähnlichen Anstieg und Abfall in der Menge der 92,5 kd-Spezies einher. Somit ist die 92,5 kd-Spezies als Teil des aktiven Faktor VIIIC-Komplexes mitbetroffen.
Es wurden weitere Versuche mit höher konzentrierten Faktor VIIIC-Ansätzen ausgeführt, um die Thrombinaktivierung in vorbereitender Weise anzuwenden. Um 92,5 kd-Polypeptid zu erzeugen, wurde Thrombin im Verhältnis von etwa 1000–2000 Gerinnungseinheiten von Faktor VIIIC zu einer Einheit von Thrombinaktivität zum gereinigten Faktor VIIIC-Material (pH 7,4) hinzugefügt und nur kurzzeitig (5–15 Minuten, je nach der Hemofil-Charge) miteinander reagieren gelassen. Mit dem resultierenden Produkt wurde dann ein präparatives 7,5%-Gel beschickt und die Peptide durch Elektrophorese getrennt, die Gelbanden ausgeschnitten und elektoeluiert.
Wenn die Thrombinverdauung kurzzeitig durchgeführt wird, kann die Menge der 92,5 kd-Spezies verdoppelt oder verdreifacht werden, gleichzeitig wird die 77/80 kd-Doppelbande nur teilweise in 67/70 kd-Spezies konvertiert. Um die Bedingungen für die Isolation der 67/70 kd-Doppelbande zu optimieren, wurde eine längere Thrombinverdauung (>1 Stunde) durchgeführt. In diesem Fall wird die 92,5 kd-Spezies weiter gespaltet und ergibt kleinere Fragmente. Nach der Thrombinbehandlung erscheinen zwei neue Peptide, 52,5 kd und 40 kd. Das 40 kd-Peptid reagiert mit den gegen die 92,5 kd-Spezies gerichteten monoclonalen Antikörpern und muß deshalb ein Spaltprodukt sein. Auch das 52,5 kd-Peptid ist aus dem 92,5 kd-Protein abgeleitet, wie ein Vergleich von chemischen und enzymatischen Spaltungsmustern zeigt, d. h. sowohl die 92,5 kd-als auch die 52,5 kd-Spezies zeigen eine Anzahl gemeinsamer Fragmente, wenn sie der CNBr- oder lys C-Endoproteinase-Spaltung unterworfen werden (durch SDS-PAGE).
Für lys C-Endoproteinase-Verdauung wird ein Gewichtsverhältnis lys C : Protein von ungefähr 1 : 1 bis 1: 100, meist 1 : 10 verwendet. Im vorliegenden Fall wurden 20 pM (Pikomol) (4,8 μg) lys C mit 200 pM (14 μg) 70 kd-Polypeptid in etwa 100 μl 0,025 M Tris-HCl, pH 7,7; 0,001 M EDTA; 0,08% SDS und das Gemisch von 6 Stunden bis über Nacht bei 37°C bebrütet, um vollständige Verdauung zu erreichen. Native Polyacrylamidgele nach Orstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1964) 121: 321–349 wurden zur Isolation der lys C-Verdauungsprodukte benützt.
C. Thrombinverdauung von gelisolierten, VIIIC-verwandten Proteinen
Um das Vorläufer-Produkt-Verwandtschaftsverhältnis dieser Peptide zu bestätigen, wurde eine Anzahl Banden durch vorbereitende SDS-Gelelektrophorese isoliert, elektroeluiert und der Thrombinverdauung unterworfen. Die Ergebnisse waren folgende:

1.) Das 240 kd-Protein rief mehrere Banden hervor, darunter 160, 140, 115 und 92,5 kd, aber keine niedrigere als 92,5 kd, d. h. keine 77/80 kd- oder 67/70 kd-Doppelbande. Zusätzlich wurde ein Zeitverlauf für die Verdauung des 240 kd-Fragments durchgeführt und auf sein Gelelektrophoresemuster, seine Gerinnungsaktivität und Faktor VIIIC-Antigenaktivität (Cag) untersucht. Die Gelresultate waren die gleichen wie vorstehend, und es wurde im wesentlichen keine Cag oder Gerinnungsaktivität wiedergewonnen.
2.) Die gelisolierten 160 kd- und 92,5 kd-Polypeptide scheinen nach der Isolation vom Gel keine Substrate für Thrombin zu sein.
3.) Thrombin spaltet spezifisch gelisolierte 70 kd- und 80 kd-Spezies und erzeugt neue Polypeptide von 67 kd bzw. 70 kd. Nach Thrombinbehandlung fällen monoclonale Antikörper der Klasse I nicht nur die 77/80 kd-Doppelbande, sondern auch die neuen 67 kd- und 70 kd-Spezies.

D. Sequenzanalyse der Aminosäuren
Mit Hilfe von Standardverfahren wurde eine teilweise Aminosäuren-Sequenzinformation der 67/70 kd-Peptide, 77/80 kd-Peptide und des durch präparative SDS-Gelelektrophorese gewonnenen 52,5 kd-Peptids erhalten. Zusammen mit den Ergebnissen der Aminosäuresequenzierung ergab die elektrophoretische Analyse, daß die gelisolierten 77/80 kd-, 67/70 kd-, 92,5 kd- und 52,5 kd-Polypeptide mit einem Reinheitsgrad von >95%, meist 98% gewonnen wurden. Mit den gelisolierten Peptiden wurde ein Gasphasen-Proteinsequenzierer (Applied Biosystems) beschickt. Die PTH-Aminosäuren wurden auf eine HPLC-Säule (IBM cyano, 25 cm) geladen und die Aminosequenz aus den resultierenden Chromatogrammen bestimmt.
Für die 67/70 kd-Doppelbande und ihr Aminoende (in Anhang B mit einem Balken bezeichnet) wurde folgende Sequenz bestimmt:
Unter Verwendung der Information der Aminosäuresequenz der N-terminalen Region des 67/70 kd-Proteins wurden die folgenden Oligonucleotidsonden synthetisiert, um damit menschliche Genbanken abzusuchen. Es wurde das von M. S. Urdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461–7465 beschriebene Phosphoramiditverfahren benützt.
Nachstehend wird ein Schema der Aminosäureregionen gezeigt, aus denen die einzelnen Sonden abgeleitet sind:
Für das 52,5 kd-Protein, das, wie nachstehend gezeigt wird, aus dem 92,5 kd-Protein abgeleitet ist, wurde folgende Aminosäuresequenz des N-Endes bestimmt:
Auf der Basis der Aminosäuresquenz des 52,5 kd-Peptids wurde eine teilweise degenerierte Sonde mit den folgenden (codierenden) Nucleotidsequenzen synthetisiert:
Diese Sonde ist sowohl zum Absuchen von genomischen als auch von cDNA-Bibliotheken geeignet.
Die Aminosäuresequenzen von zwei durch LysC-Endoproteinase (Boehringer-Mannheim)-Verdauung der 77/80 kd-Doppelbande erhaltenen Peptiden wurden bestimmt. Die Verdauung wurde folgendermaßen ausgeführt: Die 77/80 kd-Doppelbande wurde auf einem Acrylamid-Proteingel elektrophoresiert und die der Doppelbande entsprechenden Banden elektroeluiert. Das getrennte Material wurde gereinigt und mit LysC-Endoproteinase verdaut, und die resultierenden Peptide wurden durch Reversphasen-HPLC separiert. Die den Absorptionsspitzen bei 280 nm entsprechenden Fraktionen wurden mit einem automatischen Sequenzierer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Modell A70A) sequenziert. Die erste Sequenz lautete folgendermaßen:
Auf der Basis dieser Aminosäuresquenz wurde eine teilweise degenerierte Sonde mit folgendem (nichtcodierenden) Nucleotidsequenzenstrang synthetisiert:
Das zweite Peptid hatte folgende Sequenz:
Auf der Basis dieser Aminosäuresquenz wurde eine teilweise degenerierte Sonde mit den folgenden (nichtcodierenden) Nucleotidsequenzen synthetisiert:
Auch die 77/80 kd-Doppelbande wurde mit Trypsin verdaut. Das Doppelbandenmaterial wurde zur Verdauung mit Endoproteinase LysC wie vorstehend beschrieben gereinigt. Die Lysine wurden durch Citraconylbehandlung blockiert, um eine Verdauung nur bei den Argininen zuzulassen. Zur Citraconylbehandlung wurden die Proteine in einem denaturierenden Puffer suspendiert, die suspendierten Proteine reduziert und carboxymethyliert und mit Citraconylanhydrid behandelt, wobei der pH-Wert zwischen 8,5 und 9,0 gehalten wurde. Nach der Citraconylbehandlung wurden die Proteine mit Trypsin verdaut und die resultierenden Peptide mit Reversphasen-HPLC getrennt. Die den Absorptionsspitzen bei 280 nm entsprechenden Fraktionen wurden wie vorstehend sequenziert. Die Sequenz lautete
Auf der Basis dieser Aminosäuresquenz wurde eine teilweise degenerierte Sonde mit folgendem (nichtcodierenden) Nucleotidsequenzenstrang synthetisiert:
Im Zug der Bestimmung der N-terminalen Sequenzen der 80- und der 77 kd-Spezies wurde festgestellt, daß ihre Aminoenden blockiert waren. Deshalb wurde die Sequenz der Aminoenden aufgrund von Material bestimmt, das mit einem anderen Reinigungsverfahren erhalten worden war. Dieses Verfahren beinhaltete Immunaffinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie und schloß die Verwendung von vorbereitender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aus. Die Reinigung der 77/80 kd-Doppelbande beinhaltete die Beschickung einer Antikörpersäule mit Faktor VIIIC-Konzentrat und nachfolgende Chromatographie auf einem mono-S-Kationenaustauscher. Dieses Material hatte nichtblockierte N-Enden, was darauf schließen ließ, daß die im gelgereinigten 77/80 kd Peptid angetroffene Blockade ein von der Gelelektrophorese herrührendes Artefakt war. Die sowohl für die 80-als auch die 77 kd-Spezies bestimmten aminoterminalen Sequenzen sind folgende (im Anhang B mit einem Balken markiert):
E. Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung der 77/80 kd-Peptide wurde mit Standardverfahren bestimmt und ist folgende:
F. Herstellung einer menschlichen 4X-Genbank
Aus Zellkulturlysaten von GM1416-Zellen (menschliche Lymphoblastoid-Zellinie mit 4 Kopien des X-Chromosoms) wurden etwa 3 mg DNA isoliert.
Diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise verdaut, und die verdaute DNA (400–500 μg) wurde auf 10%–40%-Sucrosegradienten fraktioniert. Die Fraktionen in der Größenordnung von 10–25 kb werden vereinigt, in Tris-EDTA dialysiert und durch sterile Einwegsäulen (Schleicher und Schüll Elutip-d) gereinigt. Aliquote dieser DNA werden mit EMBL-4-Armen ligiert, die nach Verdauung mit BamHI und SaII und Isolierung an einem Gradienten erhalten worden waren, und dann mit einer Wirksamkeit von 1 × 10⁶ pfu/μg Insert-DNA in einen Lambda-Bakteriophagen gepackt. Der verwendete Vektor, EMBL-4, ist eine modifizierte Form des Lambda-Bakteriophagen (vgl. Kern et al., Methods Enzymol. (1983) 101: 3–19). Die gesamte Genbank umfaßte 5 × 10⁶ Phagen.
G. Ausplattieren und Absuchen der menschlichen 4X-Genbank
Die Bakteriophagen wurden an E. coli vom Stamm DP50 adsorbiert und in 20 Schalen (150 × 15 mm) bei 50.000 pfu pro Schale ausplattiert, was insgesamt 1 × 10⁶ pfu ergab. (Details zu Schalen, top Agar, Adsorption und Ausplattieren finden sich in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Lab, New York (1982).
Auf die Oberflächen aller Schalen mit Phagenplaques wurden je zwei Nitrocellulosefilter gelegt, so daß die Moleküle der nichtgepackten Phagen-DNA von diesen Filtern aufgenommen wurden. Sie wurden mit ³²P-markierter, 256-fach degenerierter, 48-merer Sonden-DNA (Sonde Nr. 4) hybridisiert. (Details zur Nitrocellulose-Transfertechnik finden sich bei Maniatis et al., vorst.)
Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden in Wallace-Gemisch ausgeführt, das folgende Bestandteile pro Liter enthält: 310 ml destilliertes Wasser; 200 ml 50% Dextransulfat; 180 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0; 225 ml 4 M NaCl; 20 ml 0,25 M EDTA; 50 ml 100 × Denhardt'sche Lösung; 5 ml 100% NP-40 und 10 ml 10% SDS.
Die Sonde wurde durch enzymatische Übertragung von ³²PO₄ von γ-ATP³² an das 5'-Phosphatende eines jeden Sonden-DNA-Moleküls markiert, die von T4-Polynucleotidkinase katalysiert wurde. Die Hybridisierungsbedingungen waren folgende: 10 ml Hybridisierungsgemisch/Filter × 5000 cpm markierter Sonde Nr. 4/Degenerierungsgrad/ml. Die Hybridisierung geschah bei 37°C über Nacht. Die Filter wurden in 6XSSC, 1 mM EDTA bei 50-55°C gewaschen, luftgetrocknet und dann zum Belichten von Röntgenfilm verwendet.
H. Charakterisierung positiver Clone
23 Plaques, die im ersten Suchgang positive Signale gaben, wurden erneut ausplattiert, die Phagen-DNS auf Nitrocellulose transferiert und mit frisch markierter Sonde Nr. 4 hybridisiert (Sekundärproben). 11 Plaques, die positive Signale gaben, wurden erneut ausplattiert, die Phagen-DNS auf Nitrocellulose transferiert und mit frisch markierter Sonde Nr. 4 hybridisiert (Tertiärproben). 8 Plaques, die positive Signale gaben, wurden isoliert und DNA wurde präpariert (100 ml flüssige Kultur für jede Probe). Die jedem dieser 8 Clone entsprechende DNA wurde mit EcoRI verdaut (um insertierte menschliche genomische DNA aus der DNA des Lambda-Vektors freizusetzen), und die resultierenden Fragmente wurden mit einem 0,8% Agarosegel anhand ihrer Größe getrennt, denaturiert und auf Nitrocellulose transferiert. Dies geschah vierfach, und jeder Filter wurde mit ³²P-markierten Sonden Nr. 1, 2, 3 oder 4 hybridisiert. Die Filter wurden verwendet, um Röntgenfilm zu belichten, und es fand sich, daß eine einzelne Bande von etwa 4,4 kb Größe mit allen vier Proben für zwei Clone hybridisierte. Diese beiden Clone waren identisch, außer daß einer mehr Insert-DNA aufwies als der andere (die Bezeichnungen der Clone sind 23 D für die größere Insertion von 15,21 kb und 11 für die kleinere Insertion von etwa 13 kb. Das gelisolierte EcoRI-Fragment von 4,4 kb wurde in den Vektoren M13 und pUC-9 (ein Derivat von pBR322) subcloniert. Es wurde die DNA- Sequenzierung der M13-DNA mit der Dideoxytechnik mittels der synthetischen Sonde Nr. 3 und ihrem reversen Komplement als Primer ausgeführt.
Das 4,4 kb-Fragment wurde teilweise sequenziert. Es hat folgende Sequenz, die die Sequenz der Sonde Nr. 4 (in runden Klammern) sowie die teilweise Aminosäuresequenz des ursprünglich bestimmten 67/70 kd-Fragments (in eckigen Klammer) mit einschließt:
Dieser Clon entspricht somit dem Gen des 77/80 kd-Doppelbandenproteins das, wie vorstehend gezeigt, teilweise dem menschlichen Faktor VIIIC-Komplex entspricht.
Der Clon 23D wurde im Phagen M13 als EcoRI-Fragmente subcloniert, und die der insertierten menschlichen DNA entsprechende Sequenz wurde bestimmt. Die komplette 15.121 kb-Sequenz des Clons 23D ist im Anhang A dieses Dokumentes dargelegt. Die Subclonbezeichnungen stehen am rechten Rand der Sequenz und beziehen sich auf das EcoRI-EcoRI-Fragment in 3'-Richtung. Es fand sich ein offener Leserahmen von 3110 kb vom 3'-Ende des 70-3-Fragments bis zur Mitte des 4,4 kb-Fragments. Der offene Leserahmen umfaßt somit wenigstens einen Teil der codierenden Region des 77/80 kd-Doppelbandenproteins.
7. Vergleich der genomischen DNA mit cDNA
Drei DNA-Clone wurden folgendermaßen erzeugt: Der Clon C1 wurde erhalten, indem man eine menschliche Leber-cDNA-Bibliothek mit einer Sonde absuchte, die aus dem 4,4 kb-EcoRI-Fragment des Clons 23D konstruiert worden war. Auch der Clon C2 wurde erhalten, indem man eine menschliche Leber-cDNA-Bibliothek mit der 4,4 kb-Sonde absuchte. Der Clon 2–11 wurde erhalten, indem man eine menschliche Nieren-cDNA-Bibliothek mit einer synthetischen 45-meren Sonde absuchte, die auf der DNA-Sequenz vom 3'-Ende des offenen Leserahmens des Clons 23D (Nucleotide 9391–9435 in Anhang A) basiert. Die Sonde umfaßt den nichtcodierenden Strang der folgenden Sequenz:
Die Clone wurden sequenziert und ihre Orte relativ zur genomischen DNA des Clons 23D durch Vergleich der Sequenzen bestimmt. Der Clon C1, 304 bp lang, überlappt mit dem offenen Leserahmen von Nucleotid 7773 bis Nucleotid 8077, nach der Numerierung im Anhang A. Der Clon C2, 878 bp lang, überlappt teilweise mit dem 3'-Ende des offenen Leserahmens beginnend beim Nucleotid 9538 und bis über das Nucleotid 9497 hinaus, das am 3'-Ende des offenen Leserahmens liegt. Der Clon 2–11, 572 bp lang, überlappt ebenfalls das 3'-Ende des offenen Leserahmens beginnend beim Nucleotid 9190 und reicht bis über dessen Ende hinaus. Diese Befunde bestätigen, daß der offene Leserahmen transkribiert wurde.
Die aus dem offenen 4,4 kb-Leserahmen abgeleitete Codierungsinformation kann mit der zusätzlichen Codierungsinformation kombiniert werden, die aus den Clones 2–11 und C2 abgeleitet wird, um eine Sequenz von 3841 kb zu präparieren und auszudehnen, die der gesam ten bekannten Codierungssequenz, wie im Anhang B dargelegt, entspricht. Die Regionen, die den Sonden C1, C2 und 2–11 entsprechen, sind eingerahmt.
Um den Faktor VIIIC herzustellen, werden die DNA-Sequenzen von Clon 23 oder Clon 11, wie bei Laub et al., J. Virology (1983) 48: 271 beschrieben, in einen SV-40-Promoter insertiert, so daß sie unter der Kontrolle des frühen SV-40-Promoters stehen. Das resultierende rekombinante Plasmid kann in COS-Zellen transfiziert werden (Guzman, vorst.). Alternativ kann die codierende Sequenz in ein Plasmid insertiert werden, z. B. in pBR322, in das vorher die langen endständigen Wiederholungen (long terminal repeats) von Maloneys murinem Sarkomvirus insertiert wurden, so daß die Clone 23- oder Clone 11-Sequenzen unter der Transkriptionskontrolle des viralen Regulationssystems stehen. Die Konstrukte können dann für eine wirkungsvolle Expression in 3T3-Mäusefibroblasten eingeschleust werden (vgl. Perkins et al., Molecular and Cellular Biology, Juni 1983, Bd. 3, Nr. 6, S. 1123).
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß genomische DNA isoliert wurde, die Untereinheiten des Faktor VIIIC-Komplexes codiert. Durch die Verwendung dieser genomischen DNA kann die DNA weiter manipuliert werden, um eine Sequenz zu erzeugen, die Faktor VIIIC-Komplex-Untereinheiten codiert. Die DNA kann dann in einem Expressionsvektor zur Herstellung von Faktor VIIIC-Untereinheiten benützt werden, die ihrerseits eine Vielzahl von Anwendungen finden können, zum Beispiel als Reagentien in diagnostischen Tests, als therapeutische Stoffe, zur Produktion von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, die dann zur Reinigung von Faktor VIIIC-Komplex benützt werden können oder für andere Zwecke. Die genomischen DNA-Sequenzen können auch zur Isolation von mRNA verwendet werden, die proFaktor VIIIC codiert, um das Vorläuferprotein herzustellen. Dieses Protein kann dann zur in-vivo-Prozessierung verabreicht werden.
Die vorliegenden Verfahren haben eine DNA-Sequenz geliefert, die am 5'-Ende oder an dieses anschließend die spezifische Sequenz beinhaltet, die die 67/70 kd-Doppelbande codiert. Diese spezifische Sequenz ist auch in der 77/80 kd-Doppelbande vorhanden, und zwar etwa 200 bis 400, genauer gesagt etwa 275 bis 325 Basen stromabwärts des 5'-Endes.
Der Bakteriophage λFVIII23D, der das 14,43 kb-EcoRI-Fragment enthält, wurde am 4. Januar 1984 in der A.T.C.C. hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 40094. Anhang A

Anhang B

Claims

Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein menschliches Faktor VIII:C-Protein mit voller Länge oder einen Teil davon codiert, das eine anticoagulierende Aktivität besitzt, wobei das Nucleinsäuremolekül umfasst: a) die Nucleotidsequenz:
b) eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu der Sequenz in Teil a) ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz codiert:
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nucleinsäure DNA ist.
Nucleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das die exprimierte Nucleotidsequenz des 14,43 kb-EcoRl-Fragments des menschlichen Genomfaktor-VIII:C-Inserts des Bakteriophagen λFV11123D (ATCC-Hinterlegungsnummer 40094) umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die exprimierte Nucleinsequenz des EcoRI-Fragments, mit einer Größe von etwa 4,4 kb, des menschlichen Genomfaktor-VIII:C-Inserts des Bakteriopagen λFV11123D (ATCC Hinterlegungsnummer 40094) umfasst.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst.
Vektor nach Anspruch 6, der ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 6, der ein rekombinantes Säugervirus ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz PHE-GLN-LYS-LYS-THR-ARG-HIS-TYR-PNE-ILE-ALA-ALA-VAL-GLU-ARG-LEU-TRP-ASP-TYR-GLY-MET umfasst, umfassend das Einführen eines rekombinanten Nucleinsäuremoeküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in eine Wirtszelle.
Wirtszellzusammensetzung, die hergestellt wird durch das Einführen eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in eine Wirtszelle und das Züchten der Wirtszelle.
Wirtszellzusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Wirtszelle eine E. coli-Wirtszelle oder eine Säugerwirtszelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Vektors, das das Einführen eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einen Vektor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, das außerdem das Einführen des rekombinanten Nucleinsäurevektors in eine Wirtszelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, das außerdem das Züchten der Wirtszelle umfasst, um eine Zusammensetzung von Wirtszellen zu erhalten, die den rekombinanten Vektor umfassen.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 8 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder die Diagnose von Hämophilie A.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 8 für die Exprimierung eines menschlichen Faktor VIII:C-Proteins mit voller Länge oder eines Teils davon.