JPH0826078B2 - フアクタ−v▲iii▼c組成物 - Google Patents
フアクタ−v▲iii▼c組成物Info
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- JPH0826078B2 JPH0826078B2 JP60002269A JP226985A JPH0826078B2 JP H0826078 B2 JPH0826078 B2 JP H0826078B2 JP 60002269 A JP60002269 A JP 60002269A JP 226985 A JP226985 A JP 226985A JP H0826078 B2 JPH0826078 B2 JP H0826078B2
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- factor
- protein
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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Description
【発明の詳細な説明】 (発明の分野) ファクターVIIICは血液凝固の本質的経路に関与する
血漿蛋白質である。遺伝性のX染色体連鎖劣性出血性疾
患であるA型血友病を有する個体においてはこのファク
ターは存在せず、又は不足している。ファクターVIIIC
の血漿中濃度は極めて低く、そして一層大形の蛋白質前
駆体の中間分解生成物または最終生成物であると考えら
れるため、該ファクターの単離においては大きな困難に
遭遇する。従って、ファクターVIIICを単離しようとす
れば分子量の異る有意に不均一な複雑な混合物が得られ
る。
血漿蛋白質である。遺伝性のX染色体連鎖劣性出血性疾
患であるA型血友病を有する個体においてはこのファク
ターは存在せず、又は不足している。ファクターVIIIC
の血漿中濃度は極めて低く、そして一層大形の蛋白質前
駆体の中間分解生成物または最終生成物であると考えら
れるため、該ファクターの単離においては大きな困難に
遭遇する。従って、ファクターVIIICを単離しようとす
れば分子量の異る有意に不均一な複雑な混合物が得られ
る。
生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用することがで
きる方法の1つに精製された形での目的蛋白質の単離が
含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造のための組
換DNA技法の開発において非常に大きな助けとなる。目
的蛋白質を手にすることによって、該蛋白質に特異的な
モノクローナル抗体を製造することができ、この抗体を
用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメッセンジャーRN
Aからの発現、又は単細胞微生物中でのcDNA遺伝子から
の発現において、蛋白質の製造を確立することができ
る。さらに、アミノ酸配列を決定することにより、特定
のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、メッセン
ジャーRNA、染色体DNA又はcDNAとハイブリダイズするプ
ローブを開発することができ、従って該当する遺伝子の
検出、単離及び発現をもたらし、そして所望の生成物を
1種類又は複数種類の宿主において高収量で製造するこ
とができる。
きる方法の1つに精製された形での目的蛋白質の単離が
含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造のための組
換DNA技法の開発において非常に大きな助けとなる。目
的蛋白質を手にすることによって、該蛋白質に特異的な
モノクローナル抗体を製造することができ、この抗体を
用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメッセンジャーRN
Aからの発現、又は単細胞微生物中でのcDNA遺伝子から
の発現において、蛋白質の製造を確立することができ
る。さらに、アミノ酸配列を決定することにより、特定
のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、メッセン
ジャーRNA、染色体DNA又はcDNAとハイブリダイズするプ
ローブを開発することができ、従って該当する遺伝子の
検出、単離及び発現をもたらし、そして所望の生成物を
1種類又は複数種類の宿主において高収量で製造するこ
とができる。
(従来技術) 米国特許第4,361,509号及びこれに引用された文献に
はファクターVIIICの精製が記載されている。さらに、F
ulcher及びZimmerman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)
79:1648−1652を参照のこと。Tuddenham等,J.of.Lab.C
linical Medicine(1979)93:40−53にはポリクローナ
ル抗体を用いるファクターVIIICの精製について記載さ
れている。Austen,British J.Hematology(1979)43:66
9−674にはファクターVIIICの精製のためのアミノヘキ
シル−セファロースの使用について記載されている。We
instein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:5137−
5141にはファクターVIIICに対するスロンビンの効果が
検討されている。さらに、Kuo等,Abstracts for IX Int
ernational Congress of Thrombosis and Hemostasis,
(コペンハーゲン,1983年7月)を参照のこと。
はファクターVIIICの精製が記載されている。さらに、F
ulcher及びZimmerman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)
79:1648−1652を参照のこと。Tuddenham等,J.of.Lab.C
linical Medicine(1979)93:40−53にはポリクローナ
ル抗体を用いるファクターVIIICの精製について記載さ
れている。Austen,British J.Hematology(1979)43:66
9−674にはファクターVIIICの精製のためのアミノヘキ
シル−セファロースの使用について記載されている。We
instein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:5137−
5141にはファクターVIIICに対するスロンビンの効果が
検討されている。さらに、Kuo等,Abstracts for IX Int
ernational Congress of Thrombosis and Hemostasis,
(コペンハーゲン,1983年7月)を参照のこと。
(発明の概要) 微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発現によるヒト
−ファクターVIIIC、その前駆体及びサブユニットの製
造方法及び組成物が提供される。この方法は、純粋なフ
ァクターVIIIC、そのサブユニット及び断片を単離し、
そして特にスロンビン消化を用いてこれらの生理的関連
性を決定することを含む。関連する一連のポリペプチド
の各々の少なくとも部分を配列決定し、そしてこの配列
を複合プローブの開発に使用する。ゲノムDNA断片を相
同配列について探索し、ハイブリダイズする断片を単離
し、そして完全なサブユニット又は断片をコードするDN
A断片を得るためにさらに操作し、そして/又は成熟mRN
Aを単離するために使用し、このmRNAからcDNAを得る。
次にDNA配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、
そしてこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペ
プチドを発現せしめる。
−ファクターVIIIC、その前駆体及びサブユニットの製
造方法及び組成物が提供される。この方法は、純粋なフ
ァクターVIIIC、そのサブユニット及び断片を単離し、
そして特にスロンビン消化を用いてこれらの生理的関連
性を決定することを含む。関連する一連のポリペプチド
の各々の少なくとも部分を配列決定し、そしてこの配列
を複合プローブの開発に使用する。ゲノムDNA断片を相
同配列について探索し、ハイブリダイズする断片を単離
し、そして完全なサブユニット又は断片をコードするDN
A断片を得るためにさらに操作し、そして/又は成熟mRN
Aを単離するために使用し、このmRNAからcDNAを得る。
次にDNA配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、
そしてこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペ
プチドを発現せしめる。
(特定の態様の記載) ヒト−ファクターVIIIC断片及びサブユニットが実質
上純粋な形で提供される。さらに、前駆体としての又は
活性形でのファクターVIIICを製造するため、あるいは
天然に得られるサブユニットと組合わせて使用する個々
のサブユニットを得るためのファクターVIIICサブユニ
ット及び断片を発現するための方法及び構成物が提供さ
れる。このサブユニット及び断片はファクターVIIICと
関連する又は複数の生物学的性質、例えばエピトープ部
位、凝固活性、及び免疫原性を有し、抗体を製造するた
めに使用され、この抗体は試薬として、特にイムノアッ
セイにおけるラベルされた試薬として使用される。
上純粋な形で提供される。さらに、前駆体としての又は
活性形でのファクターVIIICを製造するため、あるいは
天然に得られるサブユニットと組合わせて使用する個々
のサブユニットを得るためのファクターVIIICサブユニ
ット及び断片を発現するための方法及び構成物が提供さ
れる。このサブユニット及び断片はファクターVIIICと
関連する又は複数の生物学的性質、例えばエピトープ部
位、凝固活性、及び免疫原性を有し、抗体を製造するた
めに使用され、この抗体は試薬として、特にイムノアッ
セイにおけるラベルされた試薬として使用される。
ヒト−ファクターVIIICは、約460kdの見かけ分子量を
示しそして実質上純粋な形で単離され得る複合蛋白質で
ある。変性条件下での電気泳動に際し、種々の分子量、
すなわち240、160、140、115、92.5、80、及び77kdの多
数の断片が生じ、後2者はダブレットとして移動する。
免疫的関係を調べるために抗体を用いそして構造的関係
を調べるために切断パターンを用いながら、化学的切断
及びスロンビン切断を含むプロテアーゼ切断により断片
を分析することにより、92.5kdポリペプチドが240、16
0、140及び115ポリペプチドと関連しており、他方77/80
ダブレットは他のペプチドと共通の同定され得る特性を
有さず240kdポリペプチドとのみ共通の特性を有するこ
とが示される。さらに、77/80kdダブレットはスロンビ
ンにより67/70kdダブレットに転換され、他方スロンビ
ンで処理された精製ファクターVIIIC物質中に存在する9
2.5kdポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接
的に約40及び52.5kdの2個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された77/80kdダブレットポリペ
プチドはそのN−端がブロックされており、67/70kdダ
ブレットはそのN−端がブロックされていないことが見
出される。
示しそして実質上純粋な形で単離され得る複合蛋白質で
ある。変性条件下での電気泳動に際し、種々の分子量、
すなわち240、160、140、115、92.5、80、及び77kdの多
数の断片が生じ、後2者はダブレットとして移動する。
免疫的関係を調べるために抗体を用いそして構造的関係
を調べるために切断パターンを用いながら、化学的切断
及びスロンビン切断を含むプロテアーゼ切断により断片
を分析することにより、92.5kdポリペプチドが240、16
0、140及び115ポリペプチドと関連しており、他方77/80
ダブレットは他のペプチドと共通の同定され得る特性を
有さず240kdポリペプチドとのみ共通の特性を有するこ
とが示される。さらに、77/80kdダブレットはスロンビ
ンにより67/70kdダブレットに転換され、他方スロンビ
ンで処理された精製ファクターVIIIC物質中に存在する9
2.5kdポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接
的に約40及び52.5kdの2個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された77/80kdダブレットポリペ
プチドはそのN−端がブロックされており、67/70kdダ
ブレットはそのN−端がブロックされていないことが見
出される。
さらに、ファクターVIIICの座は大きなイントロンと
共にエクソンを含み、エクソンはファクターVIIICと関
連する種々の領域を含むことが見出される。すなわち、
ファクターVIIIC複合体に関する特定のポリペプチド及
びその断片に係る個々のエクソンを単離することができ
る。ファクターVIIICサブユニット及びその断片に関す
る特定のアミノ酸配列を同定することにより、ゲノムDN
Aからエクソンを選択的に単離し、そしてそのエクソン
をそれ自体として組合わせて、又は合成DNAにより連結
して、ファクターVIIICのポリペプチドサブユニット又
はその断片をコードする配列を得、これらを製造するこ
とができる。
共にエクソンを含み、エクソンはファクターVIIICと関
連する種々の領域を含むことが見出される。すなわち、
ファクターVIIIC複合体に関する特定のポリペプチド及
びその断片に係る個々のエクソンを単離することができ
る。ファクターVIIICサブユニット及びその断片に関す
る特定のアミノ酸配列を同定することにより、ゲノムDN
Aからエクソンを選択的に単離し、そしてそのエクソン
をそれ自体として組合わせて、又は合成DNAにより連結
して、ファクターVIIICのポリペプチドサブユニット又
はその断片をコードする配列を得、これらを製造するこ
とができる。
便利には、エクソン及びイントロンの両者を含有する
ファクターVIIICゲノムDNA配列を哺乳動物細胞中での転
写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿入し、cDNAのクロ
ーニングに適するように適切にスプライスされた実質的
な量のメッセンジャーRNAを得、そしてファクターVIII
C、サブユニット又は断片を製造する。さらに、ゲノム
から単離されたDNA配列を用いてファクターVIIICをコー
ドする天然メッセンジャーRNAとハイブリダイズさせる
ことができる。次に、このメッセンジャーRNAを用いて
ファクターVIIICのサブユニットをコードするds cDNAを
調製することができる。DNA配列は、これを転写及び翻
訳のために必要な制御がシグナルを有する適当な発現ベ
クターに挿入することによって、発現のために使用する
ことができる。ファクターVIIIC遺伝子発現ベクター
(ファクターVIIIC、その前駆体、サブユニット又は断
片の全体又は部分をコードする1個又は複数個の遺伝子
を担持する発現ベクター)を適合性の宿主に導入し、そ
してこの宿主をファクターVIIICの発現のために増殖せ
しめることができる。宿主を適切に選択することによ
り、ファクターVIIICのDNAを分泌リーダー及びプロセシ
ングシグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌さ
れ、そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとな
るようにすることができる。適当であれば、このポリペ
プチドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存
在する官能基又は置換基を導入することができる。
ファクターVIIICゲノムDNA配列を哺乳動物細胞中での転
写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿入し、cDNAのクロ
ーニングに適するように適切にスプライスされた実質的
な量のメッセンジャーRNAを得、そしてファクターVIII
C、サブユニット又は断片を製造する。さらに、ゲノム
から単離されたDNA配列を用いてファクターVIIICをコー
ドする天然メッセンジャーRNAとハイブリダイズさせる
ことができる。次に、このメッセンジャーRNAを用いて
ファクターVIIICのサブユニットをコードするds cDNAを
調製することができる。DNA配列は、これを転写及び翻
訳のために必要な制御がシグナルを有する適当な発現ベ
クターに挿入することによって、発現のために使用する
ことができる。ファクターVIIIC遺伝子発現ベクター
(ファクターVIIIC、その前駆体、サブユニット又は断
片の全体又は部分をコードする1個又は複数個の遺伝子
を担持する発現ベクター)を適合性の宿主に導入し、そ
してこの宿主をファクターVIIICの発現のために増殖せ
しめることができる。宿主を適切に選択することによ
り、ファクターVIIICのDNAを分泌リーダー及びプロセシ
ングシグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌さ
れ、そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとな
るようにすることができる。適当であれば、このポリペ
プチドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存
在する官能基又は置換基を導入することができる。
この発明の最初の段階において、高度に精製したファ
クターVIIICを得そして特徴付ける。精製されたファク
ターVIIICは市販のヒト−抗血友病因子(AHF)から得る
ことができる。この因子は正状なヒトの新鮮な血漿から
冷却沈澱物として調製されるものであり約40倍に濃縮さ
れている。これを適当な緩衝液、例えばイミダゾール−
リジン−HCl塩溶液(pH7.4)に溶解し、次にファクター
VIIIC又はファクターVIIIRに対するポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体を有するアフィニティーカラム
上でクロマトグラフ処理することによりファクターVIII
Cをさらに濃縮、精製する。便利には、抗体をセファロ
ース支持体に共有結合せしめる。比較的高濃度のカルシ
ウムイオンとグリセリンとの組合せを用いてカラムから
ファクターVIIICを溶出することができる。次に、カラ
ムから得られた画分を低いカルシウム濃度の上記の適当
な緩衝液を用いて透析し、そして次にアミノヘキシル−
セファロースカラムを用い高濃度の塩化カルシウム又は
塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出することにより、さ
らに精製することができる。追加のクロマトグラフ段
階、例えばゼラチンセファロース、HPLC、デキストラン
サルフェート又はMono Q上でのイオン交換、レクチン又
はファクターVIIICに対する抗体を用いるアフィニティ
ーカラム等によりさらに精製することができる。特に、
デキストランサルフェートを使用することにより微量汚
染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロレクチン、Ig
Gが標品から除去され、外来性蛋白質を実質上含有しな
い生成物が残る。カラムからの画分の活性は、凝固アッ
セイ(市販キット)及びファクターVIIICに特異的な抗
体を用いて、生物学的活性及び抗原活性のいずれか又は
両方について監視することができる。血漿中のファクタ
ーVIIIの濃度に基いて、上記の方法により約200,000倍
の精製が達成される。
クターVIIICを得そして特徴付ける。精製されたファク
ターVIIICは市販のヒト−抗血友病因子(AHF)から得る
ことができる。この因子は正状なヒトの新鮮な血漿から
冷却沈澱物として調製されるものであり約40倍に濃縮さ
れている。これを適当な緩衝液、例えばイミダゾール−
リジン−HCl塩溶液(pH7.4)に溶解し、次にファクター
VIIIC又はファクターVIIIRに対するポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体を有するアフィニティーカラム
上でクロマトグラフ処理することによりファクターVIII
Cをさらに濃縮、精製する。便利には、抗体をセファロ
ース支持体に共有結合せしめる。比較的高濃度のカルシ
ウムイオンとグリセリンとの組合せを用いてカラムから
ファクターVIIICを溶出することができる。次に、カラ
ムから得られた画分を低いカルシウム濃度の上記の適当
な緩衝液を用いて透析し、そして次にアミノヘキシル−
セファロースカラムを用い高濃度の塩化カルシウム又は
塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出することにより、さ
らに精製することができる。追加のクロマトグラフ段
階、例えばゼラチンセファロース、HPLC、デキストラン
サルフェート又はMono Q上でのイオン交換、レクチン又
はファクターVIIICに対する抗体を用いるアフィニティ
ーカラム等によりさらに精製することができる。特に、
デキストランサルフェートを使用することにより微量汚
染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロレクチン、Ig
Gが標品から除去され、外来性蛋白質を実質上含有しな
い生成物が残る。カラムからの画分の活性は、凝固アッ
セイ(市販キット)及びファクターVIIICに特異的な抗
体を用いて、生物学的活性及び抗原活性のいずれか又は
両方について監視することができる。血漿中のファクタ
ーVIIIの濃度に基いて、上記の方法により約200,000倍
の精製が達成される。
ファクターVIIICの特徴付け ゲル過により、ファクターVIIICが約460kdの見かけ
分子量を有する複合体として挙動することが示される。
SDS−ゲル電気泳動(変性条件)を用いて分子量を異に
する7個の個別のポリペプチドを単離することができ
る。その分子量により定義される断片は240、160、14
0、115、92.5、80及び77kd断片である。これらの断片を
次の方法により特徴付けた。
分子量を有する複合体として挙動することが示される。
SDS−ゲル電気泳動(変性条件)を用いて分子量を異に
する7個の個別のポリペプチドを単離することができ
る。その分子量により定義される断片は240、160、14
0、115、92.5、80及び77kd断片である。これらの断片を
次の方法により特徴付けた。
第1の研究は、血友病患者から単離された阻害抗体を
用いることを含む。これらの抗体をZ及びEと称する。
両抗体は77/80kdダブレットと反応した。E抗体は240kd
ポリペプチドと強く反応し、そしてダブレットと240kd
ポリペプチドとの間の複数のバンドと弱く反応した。Z
抗体は240kdポリペプチドとも弱く反応した。
用いることを含む。これらの抗体をZ及びEと称する。
両抗体は77/80kdダブレットと反応した。E抗体は240kd
ポリペプチドと強く反応し、そしてダブレットと240kd
ポリペプチドとの間の複数のバンドと弱く反応した。Z
抗体は240kdポリペプチドとも弱く反応した。
免疫沈澱実験において、E抗体は77/80kdダブレッ
ト、並びに160、140、115及び92.5kdの高分子量種を沈
澱せしめ、ダブレットは一層強いバンド中にある。EGTA
を含有せしめることによりダブレット以外のバンドが消
失し、92.5kd種々がCa++橋に中介されて複合体中で77kd
及び/又は80kd種と会合することが示される。
ト、並びに160、140、115及び92.5kdの高分子量種を沈
澱せしめ、ダブレットは一層強いバンド中にある。EGTA
を含有せしめることによりダブレット以外のバンドが消
失し、92.5kd種々がCa++橋に中介されて複合体中で77kd
及び/又は80kd種と会合することが示される。
次の研究において、ファクターVIIICに介在される凝
固活性を阻害しそして複合体の成分と反応するモノクロ
ーナル抗体を調製した。クラスIは77/80kdダブレット
及び240kdポリペプチドと反応し、クラスIIは160、14
0、115及び92.5kdポリペプチドと反応する。クラスI抗
体とスロンビン消化ファクターVIIICとの免疫沈澱によ
り、生成する70/67kdダブレットはファクターVIIIC中に
存在する77/80kdダブレットに由来することが示され
る。クラスIIモノクローナル抗体は、160、140及び115k
dペプチドが92.5kdペプチドの前駆体であることを示し
た。92.5kdペプチドの切断生成物である40kdペプチドも
クラスII抗体により結合された。EGTAの存在下及び非存
在下でモノクローナル抗体を用いるELISA測定によりフ
ァクターVIIIC複合体の92.5kd成分と77kd及び/又は80k
d成分との間のCa++橋会合が確認された。
固活性を阻害しそして複合体の成分と反応するモノクロ
ーナル抗体を調製した。クラスIは77/80kdダブレット
及び240kdポリペプチドと反応し、クラスIIは160、14
0、115及び92.5kdポリペプチドと反応する。クラスI抗
体とスロンビン消化ファクターVIIICとの免疫沈澱によ
り、生成する70/67kdダブレットはファクターVIIIC中に
存在する77/80kdダブレットに由来することが示され
る。クラスIIモノクローナル抗体は、160、140及び115k
dペプチドが92.5kdペプチドの前駆体であることを示し
た。92.5kdペプチドの切断生成物である40kdペプチドも
クラスII抗体により結合された。EGTAの存在下及び非存
在下でモノクローナル抗体を用いるELISA測定によりフ
ァクターVIIIC複合体の92.5kd成分と77kd及び/又は80k
d成分との間のCa++橋会合が確認された。
ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両者は、イム
ノソルベントカラム法においてファクターVIIICを得る
ために使用することができ、又はEGTAを用いながら、構
成成分である92.5kd種と77/80kd種を分けるために使用
することができる。
ノソルベントカラム法においてファクターVIIICを得る
ために使用することができ、又はEGTAを用いながら、構
成成分である92.5kd種と77/80kd種を分けるために使用
することができる。
次の研究では、精製されたファクターVIIIC物質のpH
6.8又は7.4におけるスロンビン消化を用いた。アリコー
トを凝固活性について測定しそしてゲル分析のためにTC
A沈澱せしめた。凝固活性は92.5kd種の量の増加及び減
少に伴って時間と共に増加しそして減少することが示さ
れた。精製されたファクターVIIIC物質の短時間(5〜1
5分間)のスロンビン処理により92.5kd種の量が増加
し、77/80kdダブレットは部分的に67/70kdダブレットに
転換される。長時間、例えば1時間スロンビン消化する
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び52.5kd
の2個の新たなペプチドが生じ、40kdペプチドは92.5kd
種の免疫原性を維持している。52.5kdペプチドは、化学
的及び酵素的分解パターン及び92.5kd種に類似する生成
物により、切断生成物であることが示される。
6.8又は7.4におけるスロンビン消化を用いた。アリコー
トを凝固活性について測定しそしてゲル分析のためにTC
A沈澱せしめた。凝固活性は92.5kd種の量の増加及び減
少に伴って時間と共に増加しそして減少することが示さ
れた。精製されたファクターVIIIC物質の短時間(5〜1
5分間)のスロンビン処理により92.5kd種の量が増加
し、77/80kdダブレットは部分的に67/70kdダブレットに
転換される。長時間、例えば1時間スロンビン消化する
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び52.5kd
の2個の新たなペプチドが生じ、40kdペプチドは92.5kd
種の免疫原性を維持している。52.5kdペプチドは、化学
的及び酵素的分解パターン及び92.5kd種に類似する生成
物により、切断生成物であることが示される。
次の研究において、個々のファクターVIIICサブユニ
ット及び前駆体(例えば240、77/80、92.5kd種)を調製
用SDSゲル電気泳動により単離し、そして次に単離され
たポリペプチドの経時的スロンビン消化を行った。調製
用ゲルから単離された240kd断片は160、140、115、及び
92.5kdのバンドを生成した。80kd及び77kdの断片はそれ
ぞれ70kd及び67kdの断片を生成した。
ット及び前駆体(例えば240、77/80、92.5kd種)を調製
用SDSゲル電気泳動により単離し、そして次に単離され
たポリペプチドの経時的スロンビン消化を行った。調製
用ゲルから単離された240kd断片は160、140、115、及び
92.5kdのバンドを生成した。80kd及び77kdの断片はそれ
ぞれ70kd及び67kdの断片を生成した。
77kd及び/又は80kd種と92.5kdポリペプチドとをカル
シウム橋複合体として含有するファクターVIIIC複合体
は高度に精製された形で得られる。抗−ファクターVIII
Rイムノソルベントカラム及びアミノヘキシルセファロ
ースカラムで処理した後、ファクターVIIIC物質(複合
体及び前駆体種)の純度は、全蛋白質を基礎にして、通
常は80%より高く、しばしば90%より高く、そして98%
以上でありえ、そして複合体の純度は、全蛋白質を基礎
にして20%以上であり、さらに一般的には30%以上であ
る。追加のクロマトグラフ段階、例えばデキストランサ
ルフェートの使用により、ファクターVIIIC物質(複合
体+前駆体)の純度レベルが90%以上に上昇する。調製
用SDSゲル電気泳動により単離されたファクターVIIIC成
分、すなわち92.5kd種及び77/80kdダブレットの純度は
通常98%以上である。上記のように、ダブレットの1員
又は92.5kdポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体
を用いて複合体を得ることができる。次に、変性剤又は
チャオトロピック(chaotropic)溶剤、例えば尿素水溶
液又はチオイソシアナートを用いて複合体を抗体から分
離することができる。
シウム橋複合体として含有するファクターVIIIC複合体
は高度に精製された形で得られる。抗−ファクターVIII
Rイムノソルベントカラム及びアミノヘキシルセファロ
ースカラムで処理した後、ファクターVIIIC物質(複合
体及び前駆体種)の純度は、全蛋白質を基礎にして、通
常は80%より高く、しばしば90%より高く、そして98%
以上でありえ、そして複合体の純度は、全蛋白質を基礎
にして20%以上であり、さらに一般的には30%以上であ
る。追加のクロマトグラフ段階、例えばデキストランサ
ルフェートの使用により、ファクターVIIIC物質(複合
体+前駆体)の純度レベルが90%以上に上昇する。調製
用SDSゲル電気泳動により単離されたファクターVIIIC成
分、すなわち92.5kd種及び77/80kdダブレットの純度は
通常98%以上である。上記のように、ダブレットの1員
又は92.5kdポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体
を用いて複合体を得ることができる。次に、変性剤又は
チャオトロピック(chaotropic)溶剤、例えば尿素水溶
液又はチオイソシアナートを用いて複合体を抗体から分
離することができる。
プローブの調製 67及び70kdポリペプチドのN−端の部分的アミノ酸配
列は次の通りである。
列は次の通りである。
この配列に基いて、67/70kdダブレット用の(従っ
て、このダブレットが由来する77/80kdダブレット用
の)、次の配列を有するプローブを調製することができ
る。
て、このダブレットが由来する77/80kdダブレット用
の)、次の配列を有するプローブを調製することができ
る。
52.5kd蛋白質のN−端アミノ酸配列は実質上次の通り
である。
である。
このアミノ酸配列に基いて、52.5kd蛋白質用の、次の
ようなコード鎖を基礎にするプローブを調製することが
できる。
ようなコード鎖を基礎にするプローブを調製することが
できる。
77/80kd蛋白質の3個の断片のアミノ酸配列は次の通
りである。
りである。
これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎を置くそれ
ぞれ次のようなプローブを調製することができる。
ぞれ次のようなプローブを調製することができる。
これらのペプチドの配列及び対応するプローブの調製
については実験の部において詳細に後記する。
については実験の部において詳細に後記する。
DNAの単離 上記のプローブを用いてゲノムDNA又はメッセンジャ
ーRNAの検出及び単離を行うことができる。ゲノムDNAの
クローニングは、1種又は複数種の制限酵素によるゲノ
ムDNAの切断及び約10〜25kdの断片のサイズ選択を含
む。制限消化は、クローン化される断片がオーバーラッ
プするように不完全であるべきである。これらの断片は
適当なベクターにクローン化して微生物、例えば細菌、
例えばE.コリ(E.col;)中にクローンの「ライブラリー」
を調製することができる。プラスミド又はウイルス、例
えばpBR322、ラムダ、シャロン4A、EMBL−4等の種々の
ベクターを使用することができる。
ーRNAの検出及び単離を行うことができる。ゲノムDNAの
クローニングは、1種又は複数種の制限酵素によるゲノ
ムDNAの切断及び約10〜25kdの断片のサイズ選択を含
む。制限消化は、クローン化される断片がオーバーラッ
プするように不完全であるべきである。これらの断片は
適当なベクターにクローン化して微生物、例えば細菌、
例えばE.コリ(E.col;)中にクローンの「ライブラリー」
を調製することができる。プラスミド又はウイルス、例
えばpBR322、ラムダ、シャロン4A、EMBL−4等の種々の
ベクターを使用することができる。
酵素的に放射能ラベルした上記のプローブを用いてDN
Aをスクリーニングし、そして相同な配列を検出する。
1又は複数のプローブとハイブリダイズするこれらの配
列を再クローン化し、そして1回又は複数回再ハイブリ
ダイズすることができる。
Aをスクリーニングし、そして相同な配列を検出する。
1又は複数のプローブとハイブリダイズするこれらの配
列を再クローン化し、そして1回又は複数回再ハイブリ
ダイズすることができる。
最初に使用したプローブとは異る1種類又は複数種類
の制限酵素を用いて一層小さい断片を得ることができ
る。これらの小断片は一般には約1〜10kb、さらに普通
には1〜6kbの範囲の大きさを有する。次に、これらの
断片をサブクローン化し、そしてスクリーニングして陽
性の断片を同定することができる。次に、DNA断片の配
列決定のためにプライマーとして合成プローブを使用す
ることができる。最も便利に配列決定される断片は、1
種類又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含
有する断片であり、ここで相同な配列は5′−端から約
5塩基〜約500塩基である。注目される他の断片には最
初にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。
なぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにお
いて示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収す
るまで染色体にそって「歩く」ために使用されるからで
ある。
の制限酵素を用いて一層小さい断片を得ることができ
る。これらの小断片は一般には約1〜10kb、さらに普通
には1〜6kbの範囲の大きさを有する。次に、これらの
断片をサブクローン化し、そしてスクリーニングして陽
性の断片を同定することができる。次に、DNA断片の配
列決定のためにプライマーとして合成プローブを使用す
ることができる。最も便利に配列決定される断片は、1
種類又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含
有する断片であり、ここで相同な配列は5′−端から約
5塩基〜約500塩基である。注目される他の断片には最
初にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。
なぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにお
いて示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収す
るまで染色体にそって「歩く」ために使用されるからで
ある。
DNA断片を配列決定した後、決定された配列に基いて
さらに操作する。この配列に基いて、決定されたアミノ
酸配列を含むオープンリーディングフレームを同定する
ことができる。制限部位を決定することにより、コード
配列を失うことなく断片のサイズをさらに小さくするこ
とができる。但し、N−端の短い配列を除去することは
許容される。これは適当なアダプターを用いて置き換え
ることができるからである。適当な位置において制限部
位を容易に用いることができない場合には、DNA断片を
種々の時間にわたってBal31切断(リセクト)により変
形し、生じた断片をクローン化し、そして種々の技法に
よりN−端を決定することができる。便利には、リセク
トされた断片が連結される3′−塩基の適切な選択によ
り特定の制限酵素の認識部位を設けることができる。こ
の方法において、生ずるクローンをあらかじめ定められ
た制限部位についてスクリーニングすることができ、こ
の部位は所望の部位へのリセクトされた断片の存在を示
すであろう。
さらに操作する。この配列に基いて、決定されたアミノ
酸配列を含むオープンリーディングフレームを同定する
ことができる。制限部位を決定することにより、コード
配列を失うことなく断片のサイズをさらに小さくするこ
とができる。但し、N−端の短い配列を除去することは
許容される。これは適当なアダプターを用いて置き換え
ることができるからである。適当な位置において制限部
位を容易に用いることができない場合には、DNA断片を
種々の時間にわたってBal31切断(リセクト)により変
形し、生じた断片をクローン化し、そして種々の技法に
よりN−端を決定することができる。便利には、リセク
トされた断片が連結される3′−塩基の適切な選択によ
り特定の制限酵素の認識部位を設けることができる。こ
の方法において、生ずるクローンをあらかじめ定められ
た制限部位についてスクリーニングすることができ、こ
の部位は所望の部位へのリセクトされた断片の存在を示
すであろう。
好ましくは、エクソン、又は50bp以上、さらに一般的
には約100bp以上、さらには約250bp又はこれより大きい
エクソン断片を変性し、そしてヒト細胞、特にファクタ
ーVIIICのためのmRNAを産生するヒト細胞からmRNAを得
るためのプローブとして使用することができる。ハイブ
リダイズするmRNAを単離することによって、卵母細胞又
は網状赤血球溶解物中での翻訳、及びファクターVIIIC
に対する抗体又はファクターVIIICサブユニットへの結
合に基く凝固活性を用いるファクターVIIICの産生の検
出を行うことによりmRNAをスクリーニングすることがで
きる。次に、例えばAMV逆転写酵素を用いてmRNAを逆転
写することができる。
には約100bp以上、さらには約250bp又はこれより大きい
エクソン断片を変性し、そしてヒト細胞、特にファクタ
ーVIIICのためのmRNAを産生するヒト細胞からmRNAを得
るためのプローブとして使用することができる。ハイブ
リダイズするmRNAを単離することによって、卵母細胞又
は網状赤血球溶解物中での翻訳、及びファクターVIIIC
に対する抗体又はファクターVIIICサブユニットへの結
合に基く凝固活性を用いるファクターVIIICの産生の検
出を行うことによりmRNAをスクリーニングすることがで
きる。次に、例えばAMV逆転写酵素を用いてmRNAを逆転
写することができる。
逆転写酵素又はDNAポリメラーゼI(Klenow断片)第
2鎖を形成しそして適当であればヌクレアーゼ、例えば
S1ヌクレアーゼにより末端ループを除去することによ
り、種々の方法を用いてss cDNAをds cDNAに転換するこ
とができる。不完全なコピーが得られる場合、mRNAの
5′−コード配列がコピーされるまでメッセンジャーを
「歩かせ」、又はcDNAプライム合成を行い、そしてmRNA
の全コード領域をコードするDNA配列を得ることができ
る。
2鎖を形成しそして適当であればヌクレアーゼ、例えば
S1ヌクレアーゼにより末端ループを除去することによ
り、種々の方法を用いてss cDNAをds cDNAに転換するこ
とができる。不完全なコピーが得られる場合、mRNAの
5′−コード配列がコピーされるまでメッセンジャーを
「歩かせ」、又はcDNAプライム合成を行い、そしてmRNA
の全コード領域をコードするDNA配列を得ることができ
る。
上記の方法に基いて、ファクターVIIICの前駆体又は
該ファクターの大断片をコードするDNA配列を用いて発
現せしめ、又はファクターVIIICの特定のサブユニッ
ト、例えば92.5kd、80kd又は77kdのサブユニットをコー
ドする小断片を用いることができる。
該ファクターの大断片をコードするDNA配列を用いて発
現せしめ、又はファクターVIIICの特定のサブユニッ
ト、例えば92.5kd、80kd又は77kdのサブユニットをコー
ドする小断片を用いることができる。
前駆体ポリペプチド(プローファクターVIIIC)のた
めには、遺伝子を1端又は両端において平滑末端化し、
そして相補末端を有する発現ベクター中に挿入すること
ができ、あるいは5′−コード端から下流で切断し、そ
してベクターに挿入するために適当なアダプターに連結
することができる。
めには、遺伝子を1端又は両端において平滑末端化し、
そして相補末端を有する発現ベクター中に挿入すること
ができ、あるいは5′−コード端から下流で切断し、そ
してベクターに挿入するために適当なアダプターに連結
することができる。
そして、適当なN−端を有する断片(70kd又は80kdポ
リペプチドのコード配列にあってもよく、又は最初の塩
基から下流、一般に約30塩基以下下流、さらに一般的に
は約20塩基以下下流に5′−端を有してもよい)を、適
当であればアダプターを用いて、適切なベクターに挿入
することができる。
リペプチドのコード配列にあってもよく、又は最初の塩
基から下流、一般に約30塩基以下下流、さらに一般的に
は約20塩基以下下流に5′−端を有してもよい)を、適
当であればアダプターを用いて、適切なベクターに挿入
することができる。
染色体外要素を得るため、特定の宿主、発現の態様、
構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌が好ましい
か否か等に依存して種々のベクターを使用することがで
きる。(ここで、ベクターとは無傷の複製系を意味す
る。)現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細胞、又は
原核性微生物及び真核性微生物、例えばE.コリ、B.ス゛フ゛チリス
(B.subtilis)、B.サ-モフィルス(B.thermophilus)、S.セレヒ゛
シエ-(S.cerevisiae)等により認識される転写及び翻訳
制御シグナルを有する種々のベクターを使用することが
できる。
構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌が好ましい
か否か等に依存して種々のベクターを使用することがで
きる。(ここで、ベクターとは無傷の複製系を意味す
る。)現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細胞、又は
原核性微生物及び真核性微生物、例えばE.コリ、B.ス゛フ゛チリス
(B.subtilis)、B.サ-モフィルス(B.thermophilus)、S.セレヒ゛
シエ-(S.cerevisiae)等により認識される転写及び翻訳
制御シグナルを有する種々のベクターを使用することが
できる。
ベクターは宿主により認識される複製系を有するであ
ろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの翻訳及び転
写制御シグナル並びに注目のシストロンを有する構成物
の組み込みが望ましいであろう。このような場合には、
構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の配列が付加
されるであろう。
ろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの翻訳及び転
写制御シグナル並びに注目のシストロンを有する構成物
の組み込みが望ましいであろう。このような場合には、
構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の配列が付加
されるであろう。
使用される発現ベクターは宿主により認識される転写
及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シグナルはプ
ロモーター及びターミネーター、並びに1又は複数個の
エンハンサーのごとき補助シグナルを含むであろう。さ
らに、転写の制御は、オペレーター、アクチベーター、
抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめることによって行
われるであろう。転写に関する他の配列にはキャップ配
列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳のために
は、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開始コド
ン、終止コドン等が存在するであろう。
及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シグナルはプ
ロモーター及びターミネーター、並びに1又は複数個の
エンハンサーのごとき補助シグナルを含むであろう。さ
らに、転写の制御は、オペレーター、アクチベーター、
抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめることによって行
われるであろう。転写に関する他の配列にはキャップ配
列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳のために
は、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開始コド
ン、終止コドン等が存在するであろう。
便利には、宿主により認識されるシグナルが適切な関
連において存在するように、宿主にとって本来的である
遺伝子由来の非コード5′−及び3′−フランク領域が
用いられるであろう。遺伝子のリーディングフレームが
開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止コドンを有
し又は1又は複数の終止コドンのすぐ上流に挿入される
ように、上記のフランク領域を遺伝子に連結することが
できる。
連において存在するように、宿主にとって本来的である
遺伝子由来の非コード5′−及び3′−フランク領域が
用いられるであろう。遺伝子のリーディングフレームが
開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止コドンを有
し又は1又は複数の終止コドンのすぐ上流に挿入される
ように、上記のフランク領域を遺伝子に連結することが
できる。
ベクターは、選択を可能にし、そして宿主の増殖中に
連続的な選択圧をもたらす1個又は複数個のマーカーを
有するであろう。これらのマーカーには、栄養要求宿主
における原栄養性、抗生物質耐性、毒性耐性等が含まれ
るであろう。
連続的な選択圧をもたらす1個又は複数個のマーカーを
有するであろう。これらのマーカーには、栄養要求宿主
における原栄養性、抗生物質耐性、毒性耐性等が含まれ
るであろう。
分泌リーダー及びプロセシングシグナルが設けられる
場合、通常アダプターを使用する必要があろう。分泌リ
ーダー及びプロセンシングシグナルをコードするDNA配
列の末端又はその上流に適当な制限部位を設けることに
より、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオチドアダプター
を合成し、これを、分泌リーダー及びプロセシングシグ
ナル又はその切断部位と注目の遺伝子(この遺伝子は遺
伝子の開始コドン又はその下流に5′末端を有する)と
の間に挿入し、こうすることによってアダプターが必要
な喪失塩基のすべてを修復し、そして遺伝子のリーディ
ングフレームとリーダー配列の開始コドンが整合するよ
うにすることができよう。
場合、通常アダプターを使用する必要があろう。分泌リ
ーダー及びプロセンシングシグナルをコードするDNA配
列の末端又はその上流に適当な制限部位を設けることに
より、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオチドアダプター
を合成し、これを、分泌リーダー及びプロセシングシグ
ナル又はその切断部位と注目の遺伝子(この遺伝子は遺
伝子の開始コドン又はその下流に5′末端を有する)と
の間に挿入し、こうすることによってアダプターが必要
な喪失塩基のすべてを修復し、そして遺伝子のリーディ
ングフレームとリーダー配列の開始コドンが整合するよ
うにすることができよう。
次に、こうして得られた所望の遺伝子を含有する構成
物を、常法、例えばトランスホーメーション、接合、ト
ランスフェクション等によって、培養において増殖する
ことができる宿主に導入することができる。次に、宿主
を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そして生成物を常法
に従って単離することができる。生成物が細胞内に維持
される場合、細胞を集め、そして溶解する。分泌される
場合には、生成物を培地から単離する。生成物にクロマ
トグラフィーにより、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等により精製すること
ができる。
物を、常法、例えばトランスホーメーション、接合、ト
ランスフェクション等によって、培養において増殖する
ことができる宿主に導入することができる。次に、宿主
を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そして生成物を常法
に従って単離することができる。生成物が細胞内に維持
される場合、細胞を集め、そして溶解する。分泌される
場合には、生成物を培地から単離する。生成物にクロマ
トグラフィーにより、例えばアフィニティークロマトグ
ラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等により精製すること
ができる。
哺乳動物細胞での発現のためにはベクターとして哺乳
動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウイルス、マロニ
ー(Maloney)ネズミサルコーマウイルス、アデノウイ
ルス等を使用することができる。これらのウイルスは哺
乳動物細胞の培養物中で発現ベクターとして使用するた
めに変性されている。代表的な系においては、組込まれ
たSV−40ゲノムを担持しそしてSV−40の複製のために必
要なラージT抗原を産生するCOS細胞が使用される〔Glu
zman,Cell(1981)23:175〕。SV−40地図上のHpaI部位
からSV−40地図上の0.14部位にわたる断片がベクターと
して使用される。ファクターVIIIC遺伝子又はその部分
とSV−40ベクターとを連結することによって得られる組
換プラスミドはモンキーCV−1細胞のトランスフェクト
のために使用することができる。
動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウイルス、マロニ
ー(Maloney)ネズミサルコーマウイルス、アデノウイ
ルス等を使用することができる。これらのウイルスは哺
乳動物細胞の培養物中で発現ベクターとして使用するた
めに変性されている。代表的な系においては、組込まれ
たSV−40ゲノムを担持しそしてSV−40の複製のために必
要なラージT抗原を産生するCOS細胞が使用される〔Glu
zman,Cell(1981)23:175〕。SV−40地図上のHpaI部位
からSV−40地図上の0.14部位にわたる断片がベクターと
して使用される。ファクターVIIIC遺伝子又はその部分
とSV−40ベクターとを連結することによって得られる組
換プラスミドはモンキーCV−1細胞のトランスフェクト
のために使用することができる。
この発明に従えば、ファクターVIIICの精製されたサ
ブユニット及び断片が得られ、そして特定のサブユニッ
トを必要とする個体の凝固能力を強化するために使用さ
れる。ファクターVIIICはまた医療において使用され
る。さらに、この発明によって製造されたポリペプチド
は、ファクターVIIIC、そのサブユニット及び断片に対
するモノクローナル抗体を製造するために使用すること
ができる。さらに、サブユニット及び断片は試薬として
使用される。この試薬はラベルされ、そして抗体と組合
わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の1又は複数
のサブユニット又はその分解断片の存在の診断的測定に
おいて使用される。
ブユニット及び断片が得られ、そして特定のサブユニッ
トを必要とする個体の凝固能力を強化するために使用さ
れる。ファクターVIIICはまた医療において使用され
る。さらに、この発明によって製造されたポリペプチド
は、ファクターVIIIC、そのサブユニット及び断片に対
するモノクローナル抗体を製造するために使用すること
ができる。さらに、サブユニット及び断片は試薬として
使用される。この試薬はラベルされ、そして抗体と組合
わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の1又は複数
のサブユニット又はその分解断片の存在の診断的測定に
おいて使用される。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
特にことわらない限りAbは抗体を意味し、そしてAgは
抗原を意味する。
抗原を意味する。
実験 I.ファクターVIIICの精製 a)E.G.D.Tuddenham、N.C.Trabold、J.A.Collins及び
L.W.Hoyer,J.of.Lab.Clinical Medicine(1979)93:40
により最初に記載された方法によるポリクローナル抗VI
IIR−セファロースカラムを用いるイムノソルベントク
ロマトグラフィー;及びb)D.E.G.Austen,British J.o
f Hemotology(1979)43:669により最初に記載されたア
ミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグラフ的分
離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファクターVI
IICを単離した。
L.W.Hoyer,J.of.Lab.Clinical Medicine(1979)93:40
により最初に記載された方法によるポリクローナル抗VI
IIR−セファロースカラムを用いるイムノソルベントク
ロマトグラフィー;及びb)D.E.G.Austen,British J.o
f Hemotology(1979)43:669により最初に記載されたア
ミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグラフ的分
離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファクターVI
IICを単離した。
この方法の詳細を次に記載する。
アトランティック・アンチボディー(Atlantic Antib
ody)から得られたヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗
原(VIII:R)血清(カットNo.040−01)を、標準0−50
%硫酸アンモニウムカットで処理し、次にDEAEセルロー
スカラムクロマトグラフィーにかけ、又は同様の0−33
%カットで処理し、次にクロマトグラフィーを行わなか
った。次にこれらの物質をそれぞれCNBr−活性化セファ
ロースCL2B又は4B(ファルマシア,17−0140−01又は17
−0430−01)と接合せしめ、そしてカラムに注入した
(抗VIII:R−セファロースカラム)。
ody)から得られたヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗
原(VIII:R)血清(カットNo.040−01)を、標準0−50
%硫酸アンモニウムカットで処理し、次にDEAEセルロー
スカラムクロマトグラフィーにかけ、又は同様の0−33
%カットで処理し、次にクロマトグラフィーを行わなか
った。次にこれらの物質をそれぞれCNBr−活性化セファ
ロースCL2B又は4B(ファルマシア,17−0140−01又は17
−0430−01)と接合せしめ、そしてカラムに注入した
(抗VIII:R−セファロースカラム)。
“HEMOFIL",すなわち正常なヒトの新鮮な血漿から調
製された濃縮形の抗血友病因子(ファクターVIII、AF
H、AHG)の安定な乾燥標品(ファクターVIIICについて
約40倍に濃縮されている)を、0.02Mイミダゾール、0.1
5M NaCl、0.1Mリジン−HCl、0.02%NaN3を含むpH7.4の
緩衝液に溶解した。
製された濃縮形の抗血友病因子(ファクターVIII、AF
H、AHG)の安定な乾燥標品(ファクターVIIICについて
約40倍に濃縮されている)を、0.02Mイミダゾール、0.1
5M NaCl、0.1Mリジン−HCl、0.02%NaN3を含むpH7.4の
緩衝液に溶解した。
溶解した後、HEMOFILを上記の抗VIII:R−セファロー
スカラムに適用した。非特異的に結合した蛋白質を0.5M
NaClに変性された上記の緩衝液によって溶出した。次
に、0.35M CaCl2を含有する上記の緩衝液を用いて、フ
ァクターVIIIC活性を安定化する10%グリセリンを添加
して、ファクターVIIICを溶出した。イムノソルベント
カラムからの活性画分をプールし、緩衝液(0.02Mイミ
ダゾール,0.15M NaCl,0.1Mリジン−HCl,0.025M CaCl2,
0.02%NaN3,10%グリセリン,pH7.4)に対して透析し
た。1,100ユニットのファクターVIIICを含有する透析さ
れた画分のアリコートを、上記の透析緩衝液で平衡化さ
れたアミノヘキシル−セファロース4Bカラム(1×6c
m)に適用した。ファクターVIIICを0.3M CaCl2又は2M N
aClを含有する同じ緩衝液で溶出した。500ユニット/ml
のファクターVIIICを含有する2mlの容積中に活性が存在
することが見出された。同様にして行った後続の実験に
より、抗VIII:Rカラムにおける25%引きの収量及びアミ
ノヘキシルカラムにおける約90%引きの収量が得られ
た。上記の方法に代えて、イムノソルベントカラムから
溶出され、プールされ、透析された物質をまず、上記の
透析緩衝溶で平衡化されたデキストランサルフェート
(ファルマシア)カラムに適用し、そして同じ緩衝液に
より溶出する。若干の微量汚染物、例えばフィブリノー
ゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上に保持され、
ファクターVIIICは流過液中に現われる。この液を集
め、そして前記のアミノヘキシル−セファロースカラム
に負荷する。
スカラムに適用した。非特異的に結合した蛋白質を0.5M
NaClに変性された上記の緩衝液によって溶出した。次
に、0.35M CaCl2を含有する上記の緩衝液を用いて、フ
ァクターVIIIC活性を安定化する10%グリセリンを添加
して、ファクターVIIICを溶出した。イムノソルベント
カラムからの活性画分をプールし、緩衝液(0.02Mイミ
ダゾール,0.15M NaCl,0.1Mリジン−HCl,0.025M CaCl2,
0.02%NaN3,10%グリセリン,pH7.4)に対して透析し
た。1,100ユニットのファクターVIIICを含有する透析さ
れた画分のアリコートを、上記の透析緩衝液で平衡化さ
れたアミノヘキシル−セファロース4Bカラム(1×6c
m)に適用した。ファクターVIIICを0.3M CaCl2又は2M N
aClを含有する同じ緩衝液で溶出した。500ユニット/ml
のファクターVIIICを含有する2mlの容積中に活性が存在
することが見出された。同様にして行った後続の実験に
より、抗VIII:Rカラムにおける25%引きの収量及びアミ
ノヘキシルカラムにおける約90%引きの収量が得られ
た。上記の方法に代えて、イムノソルベントカラムから
溶出され、プールされ、透析された物質をまず、上記の
透析緩衝溶で平衡化されたデキストランサルフェート
(ファルマシア)カラムに適用し、そして同じ緩衝液に
より溶出する。若干の微量汚染物、例えばフィブリノー
ゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上に保持され、
ファクターVIIICは流過液中に現われる。この液を集
め、そして前記のアミノヘキシル−セファロースカラム
に負荷する。
後続の測定により、精製されたファクターVIIIC中に
両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原(cAg)活
性が存在し、HEMOFIL中の40倍濃縮よりさらに5,000倍濃
縮されていることが示された。ゼネラル・ジアグノステ
ィクス(General Diagnostics)製の市販の標準的3成
分キット〔APTT、ファクターVIII欠損血漿、ベリファイ
・ノーマル・シトレート(Verify Narmal Citrate)〕
を用いて凝固測定を行った。ファクターVIIICの高レベ
ルの生物学的活性が示された。
両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原(cAg)活
性が存在し、HEMOFIL中の40倍濃縮よりさらに5,000倍濃
縮されていることが示された。ゼネラル・ジアグノステ
ィクス(General Diagnostics)製の市販の標準的3成
分キット〔APTT、ファクターVIII欠損血漿、ベリファイ
・ノーマル・シトレート(Verify Narmal Citrate)〕
を用いて凝固測定を行った。ファクターVIIICの高レベ
ルの生物学的活性が示された。
使用する抗体は阻害患者から得た。コート抗体(ab)
としての低力価(LZ)を有するものと、ラベルされるab
としての高力価を有するものである。2つの異るタイプ
の測定において抗体を使用した。RIA測定においてはHZa
bをI125でラベルし、ELISA測定においてはHZabをホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP)と接合せしめ
る。RIAのための125Iによる抗体HZのラベル化はHunter
W.M.,Radioimmunoassay,Weir D.M編,Hand book of Expe
rimental Immunology,第3版、Vol 1,Blackwell Scient
ific Publications,オックスフォード,1978に従って行
った。HRP−HZ接合はWilson及びNakane,Immunofluoresc
ense and Related Staining Techniques,Knopp等編、El
sevier,North−Holland Biomedical Press,アムステル
ダム,1978,215−224頁に従って行った。LZは700Bethesd
aユニット/mlの活性を有し、HZは1,500Bethesdaユニッ
ト/mlの活性を有していた。コート抗体(LZ)は、0.1M
NaHCO3(pH9.8)中(RIA)又は0.05Mイミダゾール,0.1M
NaCl,0.01Mチメロサール,0.05%トウィーン20,5%BSA
中(ELISA)、あるいは両方法のためにPBS−CMF(1
につき、200mgKCl,200mgKH2PO4,8.0gNaCl,1.15g無水Na2
HPO4,pH7.4)中に3.5μg/mlに溶解し、そして1mlを各チ
ューブ(ポリスチレン)に加え、そして室温にて一夜イ
ンキュベートした。この溶液を吸引除去し、そしてチュ
ーブを0.05%のトウィーン20を含有する0.15M NaCl又は
PBS−CMF3〜3.5mlで3回洗浄した。サンプル又は標準
(ゼネラル・ディアグノスティクス、ベリファイ・ノー
マル・シトレート、カタログ#34112)を稀釈し、そし
て全容量がチューブ当り0.9mlとなるようにチューブに
加え、そして室温にて一夜インキュベートする〔稀釈
は、0.02M Tris,0.15M NaCl,5%BSA,0.05%トウィーン2
0,0.01%チメロサール,pH6.5(RIAのため)中に;又は
0.05Mイミダゾール,0.1M NaCl,0.01%チメロサール,0.0
5%トウィーン20,5%BSA(ELISAのため)中に;あるい
はPBS−CMF(両方法のため)中に行った〕。溶液を吸引
除去し、そしてチューブを上記のようにして洗浄した。
RIAについては、600μlのRIA稀釈緩衝液中ファクターV
IIICに対する125I−ラベル抗体(HZ)5×105cpmを各チ
ューブに加え、このチューブを37℃にて16〜18時間イン
キュベートし、溶液を除去し、チューブを上記のように
して洗浄し、そしてガンマーカウンターにより計数し
た。ELISAについては、抗−ファクターVIIIC(HZ)に接
合したパーオキシダーゼ0.9mlを各チューブに加え、次
にこれを室温にて一夜インキュベートし、溶液を除去
し、そしてチューブを前記のようにして洗浄し、次に0.
9mlのOPD溶液(100mlについて、0.37gクエン酸,1.19g燐
酸二ナトリウム,0.15go−フェニレンジアミン、pH5.0、
使用直前に10%H2O2を250μl添加)を加え、そして暗
中、室温にて30分間インキュベートした。この反応を停
止するために0.5mlの6N HCl(又は0.9mlの1M H2SO4)を
各チューブに加え、そしてOD492を読み取った。
としての低力価(LZ)を有するものと、ラベルされるab
としての高力価を有するものである。2つの異るタイプ
の測定において抗体を使用した。RIA測定においてはHZa
bをI125でラベルし、ELISA測定においてはHZabをホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP)と接合せしめ
る。RIAのための125Iによる抗体HZのラベル化はHunter
W.M.,Radioimmunoassay,Weir D.M編,Hand book of Expe
rimental Immunology,第3版、Vol 1,Blackwell Scient
ific Publications,オックスフォード,1978に従って行
った。HRP−HZ接合はWilson及びNakane,Immunofluoresc
ense and Related Staining Techniques,Knopp等編、El
sevier,North−Holland Biomedical Press,アムステル
ダム,1978,215−224頁に従って行った。LZは700Bethesd
aユニット/mlの活性を有し、HZは1,500Bethesdaユニッ
ト/mlの活性を有していた。コート抗体(LZ)は、0.1M
NaHCO3(pH9.8)中(RIA)又は0.05Mイミダゾール,0.1M
NaCl,0.01Mチメロサール,0.05%トウィーン20,5%BSA
中(ELISA)、あるいは両方法のためにPBS−CMF(1
につき、200mgKCl,200mgKH2PO4,8.0gNaCl,1.15g無水Na2
HPO4,pH7.4)中に3.5μg/mlに溶解し、そして1mlを各チ
ューブ(ポリスチレン)に加え、そして室温にて一夜イ
ンキュベートした。この溶液を吸引除去し、そしてチュ
ーブを0.05%のトウィーン20を含有する0.15M NaCl又は
PBS−CMF3〜3.5mlで3回洗浄した。サンプル又は標準
(ゼネラル・ディアグノスティクス、ベリファイ・ノー
マル・シトレート、カタログ#34112)を稀釈し、そし
て全容量がチューブ当り0.9mlとなるようにチューブに
加え、そして室温にて一夜インキュベートする〔稀釈
は、0.02M Tris,0.15M NaCl,5%BSA,0.05%トウィーン2
0,0.01%チメロサール,pH6.5(RIAのため)中に;又は
0.05Mイミダゾール,0.1M NaCl,0.01%チメロサール,0.0
5%トウィーン20,5%BSA(ELISAのため)中に;あるい
はPBS−CMF(両方法のため)中に行った〕。溶液を吸引
除去し、そしてチューブを上記のようにして洗浄した。
RIAについては、600μlのRIA稀釈緩衝液中ファクターV
IIICに対する125I−ラベル抗体(HZ)5×105cpmを各チ
ューブに加え、このチューブを37℃にて16〜18時間イン
キュベートし、溶液を除去し、チューブを上記のように
して洗浄し、そしてガンマーカウンターにより計数し
た。ELISAについては、抗−ファクターVIIIC(HZ)に接
合したパーオキシダーゼ0.9mlを各チューブに加え、次
にこれを室温にて一夜インキュベートし、溶液を除去
し、そしてチューブを前記のようにして洗浄し、次に0.
9mlのOPD溶液(100mlについて、0.37gクエン酸,1.19g燐
酸二ナトリウム,0.15go−フェニレンジアミン、pH5.0、
使用直前に10%H2O2を250μl添加)を加え、そして暗
中、室温にて30分間インキュベートした。この反応を停
止するために0.5mlの6N HCl(又は0.9mlの1M H2SO4)を
各チューブに加え、そしてOD492を読み取った。
II.ファクターVIIIC複合体の構造 A.免疫沈澱実験 次の条件:0.1%インシュリン(安定化のめのキャリヤ
ー蛋白質として),0.25M CaCl2,0.01%チオメロサール,
0.05Mイミダゾール,pH7.2のもとで、精製されたファク
ターVIIIC物質についてAcA44カラムを用いてゲル過実
験を行った。溶出液のファクターVIIIC凝固活性及び抗
原活性を監視した。2つの抗原ピークが観察された。フ
ァクターVIIIC凝固活性を有するものはこれらの条件下
で約460,000の見かけ分子量を有する複合体として挙動
した(天然物)。他のピーク(凝固活性を喪失してい
る)は67,000よりわずかに低い観察された分子量におい
て溶出した。
ー蛋白質として),0.25M CaCl2,0.01%チオメロサール,
0.05Mイミダゾール,pH7.2のもとで、精製されたファク
ターVIIIC物質についてAcA44カラムを用いてゲル過実
験を行った。溶出液のファクターVIIIC凝固活性及び抗
原活性を監視した。2つの抗原ピークが観察された。フ
ァクターVIIIC凝固活性を有するものはこれらの条件下
で約460,000の見かけ分子量を有する複合体として挙動
した(天然物)。他のピーク(凝固活性を喪失してい
る)は67,000よりわずかに低い観察された分子量におい
て溶出した。
標準的分析用Laemmli SDS−ゲル電気泳動〔Leammli,N
ature(1970)227:680−685〕により分析した場合、24
0、160、140、115、92.5、80及び77kdの種々の蛋白質種
が得られた。これらの蛋白質とファクターVIIICとの関
係を標準的免疫沈澱法により決定した。この免疫沈澱法
においては、遊離の125I−ラベルファクターVIIICから
抗原−Ab複合体を分離するために、アフィニティー精製
された第2抗体(ヤギ抗−マウスIgG又は抗−ヒトIgG)
をコートしたポリスチレンビーズ〔1/8インチ、プレシ
ジョン・プラスチック・ボール社(Precision Plastic
Ball Co.)〕又はS.アウレウス(S.aureus)蛋白質A−
セファロースCL4Bを使用した。
ature(1970)227:680−685〕により分析した場合、24
0、160、140、115、92.5、80及び77kdの種々の蛋白質種
が得られた。これらの蛋白質とファクターVIIICとの関
係を標準的免疫沈澱法により決定した。この免疫沈澱法
においては、遊離の125I−ラベルファクターVIIICから
抗原−Ab複合体を分離するために、アフィニティー精製
された第2抗体(ヤギ抗−マウスIgG又は抗−ヒトIgG)
をコートしたポリスチレンビーズ〔1/8インチ、プレシ
ジョン・プラスチック・ボール社(Precision Plastic
Ball Co.)〕又はS.アウレウス(S.aureus)蛋白質A−
セファロースCL4Bを使用した。
アフィニティーカラムから溶出した蛋白質をヨウ素化
し、そしてファクターVIIICに特異的な抗体と反応せし
めた。これらの抗体は血友病患者から単離されたヒト阻
害抗体であり、抗−ファクターVIIIC(Z)及び
(E)、又は阻害抗体(Z)及び(E)と称される。
し、そしてファクターVIIICに特異的な抗体と反応せし
めた。これらの抗体は血友病患者から単離されたヒト阻
害抗体であり、抗−ファクターVIIIC(Z)及び
(E)、又は阻害抗体(Z)及び(E)と称される。
この結果は、両抗体が77/80kdダブレットと反応する
ことを示す。“E"抗体はさらに240kdバンド強く反応
し、そしてダブレットと240kd種との間の複数のバンド
(160、140、115、92.5kd)の弱い沈澱をもたらす。
“Z"抗体はまた92.5kd及び240kd蛋白質を沈澱せしめ
る。“E"抗体と240kd種との強い反応は、この種がファ
クターVIIICの前駆体であることを示唆する。
ことを示す。“E"抗体はさらに240kdバンド強く反応
し、そしてダブレットと240kd種との間の複数のバンド
(160、140、115、92.5kd)の弱い沈澱をもたらす。
“Z"抗体はまた92.5kd及び240kd蛋白質を沈澱せしめ
る。“E"抗体と240kd種との強い反応は、この種がファ
クターVIIICの前駆体であることを示唆する。
抗体カラムで精製したファクターVIIIC画分をヨウ素
化し、そしてEGTA〔エチレングリコールビス(β−アミ
ノエチルエーテル)N,N,N′,N′−四酢酸〕の存在下及
び非存在下でヒト阻害抗体と反応せしめた。これは、フ
ァクターVIIICポリペプチドの会合における2価陽イオ
ン、特にCa++の役割の研究を可能にする。阻害抗体
(E)は77/80kdダブレット、並びに160、140、115及び
92.5kdの一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察
された。ダブレットは常に一層強いバンドの間に存在す
る。(この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用いて
行った。この方法は低いバックグラウンドをもたらし、
ファクターVIIIC標品中のラベルされたIgGは沈澱しな
い。)EGTAを含有させることにより高分子量バンド(9
2.5〜160kd)は消失するが、ダブレットの沈澱量は影響
を受けない。イムノソルベントとしてセファロースに結
合したZ抗体を使用して同様の実験を行った。精製した
ファクターVIIICをカラムに適用し、そして77/80kdを介
して結合した後、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)によ
り92.5kdポリペプチドが選択的に溶出する。この方法は
92.5kd種を分画調製するために使用される。このイムノ
ソルベントカラム又はこれに類似するものはファクター
VIIICに対するポリクローナル抗体を用いて調製され
る。EGTAの代りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、
例えばそれぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用
いて溶出する場合、ファクターVIIICはさらに精製され
る。これらの結果は92.5kdペプチドがCa++橋を介して非
共有結合的に77/80kdダブレットに会合していることを
示唆する。より分子量の高いバンド(115kd、140kd、16
0kd)はおそらく92.5kdの前駆体であろう。このこと
は、92.5kdポリペプチドに対するモノクローナル抗体の
115kd、140kd及び160kdポリペプチドと交差反応する能
力により示される。
化し、そしてEGTA〔エチレングリコールビス(β−アミ
ノエチルエーテル)N,N,N′,N′−四酢酸〕の存在下及
び非存在下でヒト阻害抗体と反応せしめた。これは、フ
ァクターVIIICポリペプチドの会合における2価陽イオ
ン、特にCa++の役割の研究を可能にする。阻害抗体
(E)は77/80kdダブレット、並びに160、140、115及び
92.5kdの一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察
された。ダブレットは常に一層強いバンドの間に存在す
る。(この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用いて
行った。この方法は低いバックグラウンドをもたらし、
ファクターVIIIC標品中のラベルされたIgGは沈澱しな
い。)EGTAを含有させることにより高分子量バンド(9
2.5〜160kd)は消失するが、ダブレットの沈澱量は影響
を受けない。イムノソルベントとしてセファロースに結
合したZ抗体を使用して同様の実験を行った。精製した
ファクターVIIICをカラムに適用し、そして77/80kdを介
して結合した後、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)によ
り92.5kdポリペプチドが選択的に溶出する。この方法は
92.5kd種を分画調製するために使用される。このイムノ
ソルベントカラム又はこれに類似するものはファクター
VIIICに対するポリクローナル抗体を用いて調製され
る。EGTAの代りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、
例えばそれぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用
いて溶出する場合、ファクターVIIICはさらに精製され
る。これらの結果は92.5kdペプチドがCa++橋を介して非
共有結合的に77/80kdダブレットに会合していることを
示唆する。より分子量の高いバンド(115kd、140kd、16
0kd)はおそらく92.5kdの前駆体であろう。このこと
は、92.5kdポリペプチドに対するモノクローナル抗体の
115kd、140kd及び160kdポリペプチドと交差反応する能
力により示される。
アフィニティーカラムからの種々の蛋白質種の関係
を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J.of Immunol.(197
5)6:511〕の方法によって調製したモノクローナル抗体
による、ヨウ素化され、精製されたファクターVIIICの
免疫沈澱により示した。Balb/cマウスを液相免疫吸着さ
れたファクターVIIICにより免疫した。脾臓細胞(10
8個)を1011個のNSO又はNSIマウス骨髄腫細胞と融合さ
せた。融合生成物を2枚の96ウエルミクロタイタートレ
イにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を104細胞/
ウエルで使用した。コロニーは5日目から顕微鏡観察で
き、そして上清液は数日毎にELISA法により測定した。
次の層を使用した。第1層:前記Iにおける、ヘキシル
−セファロース4Bカラムから溶出したファクターVIIIC;
第2層:ハイブリドーマ細胞上清液;第3層:ホースラ
ディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP)−ラベルしたヤ
ギ抗−マウスIgG;第4層:HRP−基質。
を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J.of Immunol.(197
5)6:511〕の方法によって調製したモノクローナル抗体
による、ヨウ素化され、精製されたファクターVIIICの
免疫沈澱により示した。Balb/cマウスを液相免疫吸着さ
れたファクターVIIICにより免疫した。脾臓細胞(10
8個)を1011個のNSO又はNSIマウス骨髄腫細胞と融合さ
せた。融合生成物を2枚の96ウエルミクロタイタートレ
イにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を104細胞/
ウエルで使用した。コロニーは5日目から顕微鏡観察で
き、そして上清液は数日毎にELISA法により測定した。
次の層を使用した。第1層:前記Iにおける、ヘキシル
−セファロース4Bカラムから溶出したファクターVIIIC;
第2層:ハイブリドーマ細胞上清液;第3層:ホースラ
ディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP)−ラベルしたヤ
ギ抗−マウスIgG;第4層:HRP−基質。
モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同定され、そ
の2つはファクターVIIIC凝固活性を阻害した。クラス
I抗体は80/77kdダブレット及び240kdポリペプチドと反
応し;そしてクラスII抗体は240、160、140、115、92.5
kdの蛋白質と反応した。スロンビン消化したファクター
VIIIとクラスIモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生
成した70/67kdダブレットが77/80kdダブレットに由来す
ることを示す(下記参照のこと)。クラスIIIモノクロ
ーナル抗体は、160、140及び115kdペプチドが92.5kdペ
プチドの前駆体であることを示す。クラスIIIのモノク
ローナル抗体はさらに、精製されたファクターVIIIC物
質のスロンビン消化により生成した40kdペプチドとも反
応する。
の2つはファクターVIIIC凝固活性を阻害した。クラス
I抗体は80/77kdダブレット及び240kdポリペプチドと反
応し;そしてクラスII抗体は240、160、140、115、92.5
kdの蛋白質と反応した。スロンビン消化したファクター
VIIIとクラスIモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生
成した70/67kdダブレットが77/80kdダブレットに由来す
ることを示す(下記参照のこと)。クラスIIIモノクロ
ーナル抗体は、160、140及び115kdペプチドが92.5kdペ
プチドの前駆体であることを示す。クラスIIIのモノク
ローナル抗体はさらに、精製されたファクターVIIIC物
質のスロンビン消化により生成した40kdペプチドとも反
応する。
ファクターVIIIC複合体中のCa++イオンの役割を研究
するため、EGTAを用いて上記と同様の実験を行った。こ
の実験はモノクローナル抗体を用いて、次の層によるEL
ISA法に基いて行った。第1層:単一特異性抗(マウスI
gG);第2層:クラスIIIモノクローナル抗体(抗−92.
5kd);第3層:精製ファクターVIIIC物質;第4層:77/
80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体。EGTAの添加により、
キレート剤を用いない対照に存在する結合HRP活性が除
去された。それぞれ77/80kdダブレット及び92.5kd蛋白
質に向けられたクラスI及びクラスIIIのモノクローナ
ル抗体がそれぞれファクターVIIIC凝固活性に対して阻
害的である事実は、両者がファクターVIIIC複合体の本
質的構成成分であることを示唆している。
するため、EGTAを用いて上記と同様の実験を行った。こ
の実験はモノクローナル抗体を用いて、次の層によるEL
ISA法に基いて行った。第1層:単一特異性抗(マウスI
gG);第2層:クラスIIIモノクローナル抗体(抗−92.
5kd);第3層:精製ファクターVIIIC物質;第4層:77/
80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体。EGTAの添加により、
キレート剤を用いない対照に存在する結合HRP活性が除
去された。それぞれ77/80kdダブレット及び92.5kd蛋白
質に向けられたクラスI及びクラスIIIのモノクローナ
ル抗体がそれぞれファクターVIIIC凝固活性に対して阻
害的である事実は、両者がファクターVIIIC複合体の本
質的構成成分であることを示唆している。
B.ファクターVIIICのスロンビンによる活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファ
クターVIIICを、2種類の異るpH条件(6.8及び7.4)を
用いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringer),ロ
ット#1072302〕により活性化した。
クターVIIICを、2種類の異るpH条件(6.8及び7.4)を
用いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringer),ロ
ット#1072302〕により活性化した。
アリコートを凝固活性について測定し、そしてさら
に、サンプル(それぞれ約2.5ユニット)をゲル分析の
ためにTCA沈澱せしめた。第1の実験において、VIIIC活
性は最初46ユニット/mlであった。これを、ファクターV
IIIC緩衝液(20mMイミダゾール,pH6.8,150mM NaCl,100m
Mリジン,25mM CaCl2及び10%グリセリン)中に最終濃度
11.5ユニット/mlに稀釈した。スロンビンの最終濃度を
0.12ユニット/ml(VIIICの100凝固ユニット当り約1ユ
ニットのスロンビン)とした。この結果、凝固活性は約
180ユニット/mlに上昇しそして約40ユニット/ml(実質
上出発値)に低下し、これは92.5kd種の量の同様な増加
及び減少に伴って生じた。従って、92.5kd種は活性なフ
ァクターVIIIC複合体の部分であることが示唆される。
に、サンプル(それぞれ約2.5ユニット)をゲル分析の
ためにTCA沈澱せしめた。第1の実験において、VIIIC活
性は最初46ユニット/mlであった。これを、ファクターV
IIIC緩衝液(20mMイミダゾール,pH6.8,150mM NaCl,100m
Mリジン,25mM CaCl2及び10%グリセリン)中に最終濃度
11.5ユニット/mlに稀釈した。スロンビンの最終濃度を
0.12ユニット/ml(VIIICの100凝固ユニット当り約1ユ
ニットのスロンビン)とした。この結果、凝固活性は約
180ユニット/mlに上昇しそして約40ユニット/ml(実質
上出発値)に低下し、これは92.5kd種の量の同様な増加
及び減少に伴って生じた。従って、92.5kd種は活性なフ
ァクターVIIIC複合体の部分であることが示唆される。
製造的方法においてスロンビン活性化を用いる目的
で、一層濃縮されたファクターVIIIC標品を用いて追加
の実験を行った。92.5kdポリペプチドを生成せしめるた
め、1ユニットのスロンビン活性に対して約1000〜2000
凝固ユニットのファクターVIIICの比率で、スロンビン
を精製ファクターVIIIC物質に加え、そして短時間(FEM
OFILサンプルに依存して5〜15分間)のみ反応せしめ
た。次に、得られた生成物を7.5%調製用ゲルに適用
し、そしてペプチドを電気泳動により分離し、ゲルバン
ドを切り出し、そして電気溶出した。
で、一層濃縮されたファクターVIIIC標品を用いて追加
の実験を行った。92.5kdポリペプチドを生成せしめるた
め、1ユニットのスロンビン活性に対して約1000〜2000
凝固ユニットのファクターVIIICの比率で、スロンビン
を精製ファクターVIIIC物質に加え、そして短時間(FEM
OFILサンプルに依存して5〜15分間)のみ反応せしめ
た。次に、得られた生成物を7.5%調製用ゲルに適用
し、そしてペプチドを電気泳動により分離し、ゲルバン
ドを切り出し、そして電気溶出した。
スロンビン消化を短時間行う場合、92.5kd種の量は2
倍又は3倍になり、同時に、77/80kdダブレットは部分
的にのみ67/70kd種に転換される。67/70kdダブレットを
単離するための条件を最適にするためには、より長時間
(1時間以上)のスロンビン消化を行う。この場合、9
2.5kd種は、さらに切断されてさらに小さい断片が生ず
る。スロンビン処理の後、2種類の新たなペプチドであ
る52.5kd及び40kdペプチドが生ずる。40kdペプチドは9
2.5kd種に対するモノクローナル抗体と反応し、従って
切断生成物でなければならない。52.5kdペプチドも92.5
kd蛋白質に由来し、このことは、化学的及び酵素的切断
パターンの比較により、すなわち92.5kd種及び52.5kd種
をCNBr又はエンドプロテイナーゼLysC切断にかけた場合
に多数の共通の断片が生ずる(SDS−PAGEによる)こと
により証明される。
倍又は3倍になり、同時に、77/80kdダブレットは部分
的にのみ67/70kd種に転換される。67/70kdダブレットを
単離するための条件を最適にするためには、より長時間
(1時間以上)のスロンビン消化を行う。この場合、9
2.5kd種は、さらに切断されてさらに小さい断片が生ず
る。スロンビン処理の後、2種類の新たなペプチドであ
る52.5kd及び40kdペプチドが生ずる。40kdペプチドは9
2.5kd種に対するモノクローナル抗体と反応し、従って
切断生成物でなければならない。52.5kdペプチドも92.5
kd蛋白質に由来し、このことは、化学的及び酵素的切断
パターンの比較により、すなわち92.5kd種及び52.5kd種
をCNBr又はエンドプロテイナーゼLysC切断にかけた場合
に多数の共通の断片が生ずる(SDS−PAGEによる)こと
により証明される。
エンドプロテイナーゼlysC消化のため、lysCと蛋白質
との比率を約1:1〜100、通常は1:10とする。この消化に
おいて、20pモル(4.8μg)のlysCを、約100μlの0.0
25M Tris−HCl,pH7.7,0.001M EDTA,0.08%SDS中で200p
モル(14μg)の70kdポリペプチドと混合し、そして混
合物を37℃にて6時間〜一夜インキュベートして消化を
完結した。lysC消化生成物の単離のために、Orsten,An
n.N.Y.Acad.Sci.(1964)121:321−349のネイティブ・
ポリアクリルアミドゲルを使用した。
との比率を約1:1〜100、通常は1:10とする。この消化に
おいて、20pモル(4.8μg)のlysCを、約100μlの0.0
25M Tris−HCl,pH7.7,0.001M EDTA,0.08%SDS中で200p
モル(14μg)の70kdポリペプチドと混合し、そして混
合物を37℃にて6時間〜一夜インキュベートして消化を
完結した。lysC消化生成物の単離のために、Orsten,An
n.N.Y.Acad.Sci.(1964)121:321−349のネイティブ・
ポリアクリルアミドゲルを使用した。
C.ゲル単離したVIIIC関連蛋白質のスロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、調製用SDSゲル電気泳動により多数のバンドを分離
し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結果
は次の通りであった。
め、調製用SDSゲル電気泳動により多数のバンドを分離
し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結果
は次の通りであった。
1.240kd蛋白質は160、140、115、92.5kdを含む多数のバ
ンドを生成するが、一層小分子量のバンド、すなわち77
/80kd又は67/70kdダブレットを生成しない。さらに、24
0kd断片を経時消化し、そしてゲル電気泳動パターン、
凝固活性、及びファクターVIIIC抗原(Cag)活性につい
て分析した。ゲルパターンの結果は上記と同様であり、
そしてCag活性又は凝固活性は実質上回収されなかっ
た。
ンドを生成するが、一層小分子量のバンド、すなわち77
/80kd又は67/70kdダブレットを生成しない。さらに、24
0kd断片を経時消化し、そしてゲル電気泳動パターン、
凝固活性、及びファクターVIIIC抗原(Cag)活性につい
て分析した。ゲルパターンの結果は上記と同様であり、
そしてCag活性又は凝固活性は実質上回収されなかっ
た。
2.160kd及び92.5kdゲル分離ポリペプチドは、ゲルから
分離した後スロンビンの基質ではないようである。
分離した後スロンビンの基質ではないようである。
3.スロンビンはゲル分離された77kd及び80kd種を、それ
ぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに特異的に切断
する。スロンビン処理の後、クラスIのモノクローナル
抗体は77/80kdダブレットのみならず新たな67及び70kd
種も沈澱せしめる。
ぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに特異的に切断
する。スロンビン処理の後、クラスIのモノクローナル
抗体は77/80kdダブレットのみならず新たな67及び70kd
種も沈澱せしめる。
D.アミノ酸配列分析 調製用SDS電気泳動により単離された67/70kdペプチ
ド、77/80kdペプチド、及び52.5kdペプチドについて、
標準的方法により部分的アミノ酸配列情報を得た。電気
泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まって、77/80k
d、67/70kd、92.5kd及び52.5kdポリペプチドが95%以
上、通常は98%の純度で得られたことを示した。ゲル単
離されたペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライ
ド・ビオシステムス(Applied Biosystems)〕に適用し
た。PTH−アミノ酸をHPLCカラム(IBMシアノ,25cm)に
適用し、そして得られたクロマトグラムからアミノ酸配
列を決定した。
ド、77/80kdペプチド、及び52.5kdペプチドについて、
標準的方法により部分的アミノ酸配列情報を得た。電気
泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まって、77/80k
d、67/70kd、92.5kd及び52.5kdポリペプチドが95%以
上、通常は98%の純度で得られたことを示した。ゲル単
離されたペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライ
ド・ビオシステムス(Applied Biosystems)〕に適用し
た。PTH−アミノ酸をHPLCカラム(IBMシアノ,25cm)に
適用し、そして得られたクロマトグラムからアミノ酸配
列を決定した。
67/70kdダブレットのアミノ端(配列表B中棒により
示す)について次の配列が決定された。
示す)について次の配列が決定された。
67/70kd蛋白質のN−端領域のアミノ酸配列により得
られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブラリーのスク
リーニングに使用するために次のオリゴヌクレオチドプ
ローブを合成した。M.S.Urdea等,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(1983)80:7461−7465に記載されているホスホラミ
デート法を使用した。
られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブラリーのスク
リーニングに使用するために次のオリゴヌクレオチドプ
ローブを合成した。M.S.Urdea等,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA(1983)80:7461−7465に記載されているホスホラミ
デート法を使用した。
次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配列の領域の
スキームを示す。
スキームを示す。
後記のように92.5kd蛋白質に由来する52.5kd蛋白質に
ついて、N−端の下記のアミノ酸配列が決定された。
ついて、N−端の下記のアミノ酸配列が決定された。
52.5kdペプチドのアミノ酸配列に基いて、次のヌクレ
オチド配列(コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
オチド配列(コード配列)を有する部分変性プローブを
合成した。
このプローブは、ゲノムライブラリー及びcDNAライブ
ラリーの両者をスクリーニングするために有用である。
ラリーの両者をスクリーニングするために有用である。
77/80kdダブレットをエンドプロテイナーゼLys C(ベ
ーリンガーマンハイム)によって消化することにより得
られた2種類のペプチドのアミノ酸配列を決定した。次
のようにして消化を行った。77/80kdダブレットをアク
リルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動し、そしてダブレッ
トに対応するバンドを電気溶出した。分離された物質を
精製し、エンドプロテイナーゼLys Cにより消化し、そ
して生成したペプチドを逆相HPLCにより分離した。280n
mでの吸光ピークに対応する画分を、自動シーケンサー
(アプライド・ビオシステムス,フォスターシティー,
カリホルニア,モデルA70A)を用いて配列決定した。第
1配列は次の通りであった。
ーリンガーマンハイム)によって消化することにより得
られた2種類のペプチドのアミノ酸配列を決定した。次
のようにして消化を行った。77/80kdダブレットをアク
リルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動し、そしてダブレッ
トに対応するバンドを電気溶出した。分離された物質を
精製し、エンドプロテイナーゼLys Cにより消化し、そ
して生成したペプチドを逆相HPLCにより分離した。280n
mでの吸光ピークに対応する画分を、自動シーケンサー
(アプライド・ビオシステムス,フォスターシティー,
カリホルニア,モデルA70A)を用いて配列決定した。第
1配列は次の通りであった。
このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
第2ペプチドは次の配列を有していた。
このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
さらに、77/80kdダブレットをトリプシンにより消化
した。ダブレット物質を、エンドプロテイナーゼLys C
による消化について上記したのと同様にして精製し、リ
ジンをシトラコニル化(citraconylation)によりブロ
ックしてアルギニンにおいてのみ消化されるようにし
た。シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に懸濁し、
懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメチル化
し、そしてpHを8.5〜9.0に保持しながら無水シトラコン
酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋白質をトリプ
シンで消化し、そして生成したペプチドを逆相HPLCによ
り分離した。280nmにおける吸光ピークに対応する画分
を上記のようにして配列決定した。配列を次に示す。
した。ダブレット物質を、エンドプロテイナーゼLys C
による消化について上記したのと同様にして精製し、リ
ジンをシトラコニル化(citraconylation)によりブロ
ックしてアルギニンにおいてのみ消化されるようにし
た。シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に懸濁し、
懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメチル化
し、そしてpHを8.5〜9.0に保持しながら無水シトラコン
酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋白質をトリプ
シンで消化し、そして生成したペプチドを逆相HPLCによ
り分離した。280nmにおける吸光ピークに対応する画分
を上記のようにして配列決定した。配列を次に示す。
このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
(非コード配列)を有する部分変性プローブを合成し
た。
80及び77kd種のN−端配列を決定するための方法を実
施した際、これらのアミノ端がブロックされていること
が見出された。従って、N−端配列は他の精製法により
得られた物質から決定した。この精製法はイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグ
ラフィーを含み、そして調製用SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いない。80/77kdダブレットの精製
を、ファクターVIIIC濃縮物をモノクローナル抗体カラ
ムに適用し、次にmonoS陽イオン交換体でクロマトグラ
フ処理することにより行った。この物質はブロックされ
ていないN−端を有し、ゲル過された80/77kd中に検
出されるブロックはゲル電気泳動により生ずる人為的な
ものであることが示された。80及び77kd種について決定
されたアミノ端配列は次の通りである(配列表B中棒で
示す)。
施した際、これらのアミノ端がブロックされていること
が見出された。従って、N−端配列は他の精製法により
得られた物質から決定した。この精製法はイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグ
ラフィーを含み、そして調製用SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いない。80/77kdダブレットの精製
を、ファクターVIIIC濃縮物をモノクローナル抗体カラ
ムに適用し、次にmonoS陽イオン交換体でクロマトグラ
フ処理することにより行った。この物質はブロックされ
ていないN−端を有し、ゲル過された80/77kd中に検
出されるブロックはゲル電気泳動により生ずる人為的な
ものであることが示された。80及び77kd種について決定
されたアミノ端配列は次の通りである(配列表B中棒で
示す)。
E.アミノ酸組成 77/80kdペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法によ
り、次のように決定した。
り、次のように決定した。
アミノ酸 80K 77K Asp 58 54 Glu 74 76 Cys 12 14 Ser 47 44 Gly 51 46 His 8 12 Arg 32 29 Thr 35 29 Ala 35 33 Pro 33 30 Tyr 25 25 Val 46 44 Met 17 17 Ile 33 35 Leu 49 48 Phe 32 31 Lys 47 41 合計アミノ酸数 634 608 計算分子量 82K 79K F.ヒト4Xゲノムライブラリーの調製 GM1416細胞(4コピーのX染色体を含有するヒト−リ
ンパ芽球様セルライン)の細胞培養物の溶解物から約3m
gのDNAを調製した。
ンパ芽球様セルライン)の細胞培養物の溶解物から約3m
gのDNAを調製した。
このDNAを制限酵素Sau3Aにより部分消化し、そして消
化されたDNA(400〜500μg)を10%〜40%シュークロ
ースグラジエント上で画分した。10〜25kdのサイズの範
囲の画分をプールし、Tris−EDTA中で透析し、そしてSc
hliecher及びScheullのElutip−d無菌ジスポーサブル
カラムで精製した。このDNAのアリコートをEMBL−4ア
ーム(BamHI及びSalIで消化しそしてグラジエント上で
単離することにより得られる)に連結し、そして次に1
×106pfu/μgのDNA挿入効率をもってバクテリオファー
ジλにパッケージした。使用したベクターEMBL−4はバ
クテリオファージλの変形物である〔Karn等,Methods
Enzymol.(1983)101:3−19を参照のこと〕。全ライブ
ラリーは5×106個のファージから成る。
化されたDNA(400〜500μg)を10%〜40%シュークロ
ースグラジエント上で画分した。10〜25kdのサイズの範
囲の画分をプールし、Tris−EDTA中で透析し、そしてSc
hliecher及びScheullのElutip−d無菌ジスポーサブル
カラムで精製した。このDNAのアリコートをEMBL−4ア
ーム(BamHI及びSalIで消化しそしてグラジエント上で
単離することにより得られる)に連結し、そして次に1
×106pfu/μgのDNA挿入効率をもってバクテリオファー
ジλにパッケージした。使用したベクターEMBL−4はバ
クテリオファージλの変形物である〔Karn等,Methods
Enzymol.(1983)101:3−19を参照のこと〕。全ライブ
ラリーは5×106個のファージから成る。
G.ヒト4Xゲノムライブラリーのプレーティング及びスク
リーニング バクテリオファージをE.コリDP50株に吸着せしめ、そし
て20枚のプレートにプレート(大きさ150×15mm)当り5
0,000pfuとしてプレーティングし、合計1×106pfuとし
た。(プレート、上層寒天、及びプレーティングの詳細
な技法は、T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook;Col
d Spring Harbor Lab,ニューヨーク,1982,Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual中に記載されている。) ニトロセルロースフィルターを、ファージプラークを
有する各プレートの表面に2回適用し(こうしてパッケ
ージされていないDNAの分子をフィルターに移す)、そ
して32P−ラベルされた256倍の48マープローブDNA(プ
ローブ#4)とハイブリダイズせしめた。(ニトロセル
ロース移行法の詳細はManiatis等、前掲,に記載されて
いる。)前−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイ
ゼーションはWallaceミックス(1中に310mlの蒸留
水,200mlの50%デキストランサルフェート,180mlの1M T
ris−HCl,pH8.2,225mlの4M NaCl,20mlの0.25M EDTA,50m
lの100×Denhart溶液,5mlの100%NP−40,及び10mlの10
%SDSを含む)中で行った。
リーニング バクテリオファージをE.コリDP50株に吸着せしめ、そし
て20枚のプレートにプレート(大きさ150×15mm)当り5
0,000pfuとしてプレーティングし、合計1×106pfuとし
た。(プレート、上層寒天、及びプレーティングの詳細
な技法は、T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook;Col
d Spring Harbor Lab,ニューヨーク,1982,Molecular Cl
oning,A Laboratory Manual中に記載されている。) ニトロセルロースフィルターを、ファージプラークを
有する各プレートの表面に2回適用し(こうしてパッケ
ージされていないDNAの分子をフィルターに移す)、そ
して32P−ラベルされた256倍の48マープローブDNA(プ
ローブ#4)とハイブリダイズせしめた。(ニトロセル
ロース移行法の詳細はManiatis等、前掲,に記載されて
いる。)前−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイ
ゼーションはWallaceミックス(1中に310mlの蒸留
水,200mlの50%デキストランサルフェート,180mlの1M T
ris−HCl,pH8.2,225mlの4M NaCl,20mlの0.25M EDTA,50m
lの100×Denhart溶液,5mlの100%NP−40,及び10mlの10
%SDSを含む)中で行った。
プローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを触媒とし
て用いて、γ−ATP32から各DNA分子の5′ホスフェート
端に32PO4を酵素的に移行せしめることによりラベルし
た。ハイブリダイゼーションの条件は次の通りとした。
10mlのハイブリダイゼーション混合物/フィルター×50
00cpmのラベル化プローブ#4(変性)/ml。ハイブリダ
イゼーションは37℃にて一夜行った。フィルターを、6
×SSC,1mM EDTA中、50〜55℃にて洗浄し、空気乾燥し、
そしてX線フィルムに暴露した。
て用いて、γ−ATP32から各DNA分子の5′ホスフェート
端に32PO4を酵素的に移行せしめることによりラベルし
た。ハイブリダイゼーションの条件は次の通りとした。
10mlのハイブリダイゼーション混合物/フィルター×50
00cpmのラベル化プローブ#4(変性)/ml。ハイブリダ
イゼーションは37℃にて一夜行った。フィルターを、6
×SSC,1mM EDTA中、50〜55℃にて洗浄し、空気乾燥し、
そしてX線フィルムに暴露した。
H.陽性クローンの特徴付け 第1回スクリーニングにおいて陽性であった23個のプ
ラークを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロー
スに移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイ
ブリダイズせしめた(第2回)。11個の陽性プラークを
再プレートし、ファージDNAをニトロセルロースに移
し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイブリダ
イズせしめた(第3回)。8個の陽性プラークを分離
し、そしてDNAを調製した(それぞれ100mlずつの液体培
養)。これら8個のクローンのそれぞれに対応するDNA
をEcoRIで消化し(挿入されたヒト−ゲノムDNAをラムダ
ベクターDNAから遊離せしめるため)、そして生成した
断片を0.8%アガロースゲル上での電気泳動によりサイ
ズに従って分離し、変性し、そしてニトロセルロースに
移した。これを4通り行い、そして各フィルターを32P
−ラベルプローブ#1、2、3又は4とハイブリダイズ
せしめた。フィルターをX線フィルムに暴露し、そして
約4.4kdサイズの単一バンドが4種類のすべてのプロー
ブとハイブリダイズすることが、2個のクローンについ
て見出された。これら2個のクローンは、1方が他方に
比べて大きなDNA挿入部を有する点を除き同一であった
(15.21kbの大挿入部を有するクローンを23Dと称し、約
13kbの小挿入部を有するクローンを11と称する)。4.4k
bのゲル単離されたEcoRI断片をベクターM13及びpUC−9
(pBR322の誘導体)中にサブクローン化した。プライマ
ーとして合成プローブ#3及びその逆相補体を用いてM1
3DNA上でジデオキシ法によりDNA配列の決定を行った。
ラークを再プレートし、ファージDNAをニトロセルロー
スに移し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイ
ブリダイズせしめた(第2回)。11個の陽性プラークを
再プレートし、ファージDNAをニトロセルロースに移
し、そして新たにラベルしたプローブ#4とハイブリダ
イズせしめた(第3回)。8個の陽性プラークを分離
し、そしてDNAを調製した(それぞれ100mlずつの液体培
養)。これら8個のクローンのそれぞれに対応するDNA
をEcoRIで消化し(挿入されたヒト−ゲノムDNAをラムダ
ベクターDNAから遊離せしめるため)、そして生成した
断片を0.8%アガロースゲル上での電気泳動によりサイ
ズに従って分離し、変性し、そしてニトロセルロースに
移した。これを4通り行い、そして各フィルターを32P
−ラベルプローブ#1、2、3又は4とハイブリダイズ
せしめた。フィルターをX線フィルムに暴露し、そして
約4.4kdサイズの単一バンドが4種類のすべてのプロー
ブとハイブリダイズすることが、2個のクローンについ
て見出された。これら2個のクローンは、1方が他方に
比べて大きなDNA挿入部を有する点を除き同一であった
(15.21kbの大挿入部を有するクローンを23Dと称し、約
13kbの小挿入部を有するクローンを11と称する)。4.4k
bのゲル単離されたEcoRI断片をベクターM13及びpUC−9
(pBR322の誘導体)中にサブクローン化した。プライマ
ーとして合成プローブ#3及びその逆相補体を用いてM1
3DNA上でジデオキシ法によりDNA配列の決定を行った。
4.4kb断片の部分配列を次のように決定した。この配
列は( )で示すプローブ#4の配列、及び〔 〕で示
すはじめに決定された67/70kd断片の部分アミノ酸配列
を含む。
列は( )で示すプローブ#4の配列、及び〔 〕で示
すはじめに決定された67/70kd断片の部分アミノ酸配列
を含む。
従って、このクローンは77/80kdダブレット蛋白質の
遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前記のごとくヒト
−ファクターVIIIC複合体に部分的に対応する。
遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前記のごとくヒト
−ファクターVIIIC複合体に部分的に対応する。
クローン23DをEcoRI断片としてファージM13中にサブ
クローン化し、そして挿入されたヒトDNAに対応する配
列を決定した。クローン23Dの完全な15.121kb配列を第
1表(配列表A)に示す。サブクローンの名称が配列の
右側の欄外に示されており、3′−方向に伸びるEcoRI
−EcoRIを示している。3.110kbのオープンリーディン
グフレームが70−3断片の3′−末端から4.4kb断片の
中間にわたって存在することが見出された。従って、こ
のオープンリーディングフレームは77/80kbダブレット
蛋白質のコード領域の少なくとも部分を含む。
クローン化し、そして挿入されたヒトDNAに対応する配
列を決定した。クローン23Dの完全な15.121kb配列を第
1表(配列表A)に示す。サブクローンの名称が配列の
右側の欄外に示されており、3′−方向に伸びるEcoRI
−EcoRIを示している。3.110kbのオープンリーディン
グフレームが70−3断片の3′−末端から4.4kb断片の
中間にわたって存在することが見出された。従って、こ
のオープンリーディングフレームは77/80kbダブレット
蛋白質のコード領域の少なくとも部分を含む。
I.ゲノムDNAとcDNAの比較 3個のcDNAクローンを次のようにして得た。クローン
C1は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン23Dの4.4kb
EcoRI断片から構成したプローブでスクリーニングする
ことにより得た。クローンC2もまた、ヒト肝臓cDNAライ
ブラリーを4.4kbプローブでスクリーニングすることに
より得た。クローン2−11は、ヒト腎臓細胞をクローン
23Dのオープンリーディングフレームの3′−末端に見
出されるDNA配列(配列表Aのヌクレオチド9391〜943
5)に基く合成45−マープローブでスクリーニングする
ことによって得た。このプローブは次の非コード鎖の配
列から成る。
C1は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン23Dの4.4kb
EcoRI断片から構成したプローブでスクリーニングする
ことにより得た。クローンC2もまた、ヒト肝臓cDNAライ
ブラリーを4.4kbプローブでスクリーニングすることに
より得た。クローン2−11は、ヒト腎臓細胞をクローン
23Dのオープンリーディングフレームの3′−末端に見
出されるDNA配列(配列表Aのヌクレオチド9391〜943
5)に基く合成45−マープローブでスクリーニングする
ことによって得た。このプローブは次の非コード鎖の配
列から成る。
非コード鎖(プローブ)… クローンを配列決定し、そしてクローン23DのゲノムD
NAに対するこれらcDNAクローンの位置を、配列を比較す
ることによって決定した。304bpの長さを有するクロー
ンC1は配列表A中の番号におけるヌクレオチド7773から
8077までのオープンリーディングフレームに重なる。87
8bpの長さを有するクローンC2はオープンリーディング
フレームの3′−端と部分的に重り、ヌクレオチド9538
から始まりそしてオープンリーディングフレームの3′
−端にあるヌクレオチド9497を越えて伸びる。572bpの
長さを有するクローン2−11もオープンリーディングフ
レームの3′−端と重なり、ヌクレオチド9190から始ま
りそしてその末端を越えて伸びる。これらの知見はオー
プンリーディングフレームが転写されることを確認する
ものである。
NAに対するこれらcDNAクローンの位置を、配列を比較す
ることによって決定した。304bpの長さを有するクロー
ンC1は配列表A中の番号におけるヌクレオチド7773から
8077までのオープンリーディングフレームに重なる。87
8bpの長さを有するクローンC2はオープンリーディング
フレームの3′−端と部分的に重り、ヌクレオチド9538
から始まりそしてオープンリーディングフレームの3′
−端にあるヌクレオチド9497を越えて伸びる。572bpの
長さを有するクローン2−11もオープンリーディングフ
レームの3′−端と重なり、ヌクレオチド9190から始ま
りそしてその末端を越えて伸びる。これらの知見はオー
プンリーディングフレームが転写されることを確認する
ものである。
4.4kbオープンリーディングフレームからのコード情
報をクローン2−11及びC2からの追加のコード情報と組
合わせて、配列表Bに示すすべてのコード配列に対応す
る3.841kbの配列を調製しそして伸ばすことができる。C
1、C2、及びC2−11プローブに対応する領域を枠で囲ん
である。
報をクローン2−11及びC2からの追加のコード情報と組
合わせて、配列表Bに示すすべてのコード配列に対応す
る3.841kbの配列を調製しそして伸ばすことができる。C
1、C2、及びC2−11プローブに対応する領域を枠で囲ん
である。
ファクターVIIICを製造するために、クローン23又は
クローン11からのDNA配列を、Laub等,J.Virology(198
3)48:271により記載されているようにSV−40プロモー
ターに挿入してSV−40初期プロモーターの制御のもとに
おく。得られた組換プラスミドをCOS細胞(Guzman,前
揚)にトランスフェクトする。この方法に代えて、コー
ド配列を、Maloneyネズミサルコーマウイルスの長ター
ミナルレピートが挿入されているpBR322のごときプラス
ミドに挿入し、クローン23又は11の配列をウイルス性制
御系の転写制御のもとにおくことができる。次に、構成
物を3T3マウス線維芽球に導入して効率的に発現せしめ
ることができる(Perkins等,Molecular and Collular
Biology,1983年7月,Vol3,No.6,1123頁を参照のこ
と)。
クローン11からのDNA配列を、Laub等,J.Virology(198
3)48:271により記載されているようにSV−40プロモー
ターに挿入してSV−40初期プロモーターの制御のもとに
おく。得られた組換プラスミドをCOS細胞(Guzman,前
揚)にトランスフェクトする。この方法に代えて、コー
ド配列を、Maloneyネズミサルコーマウイルスの長ター
ミナルレピートが挿入されているpBR322のごときプラス
ミドに挿入し、クローン23又は11の配列をウイルス性制
御系の転写制御のもとにおくことができる。次に、構成
物を3T3マウス線維芽球に導入して効率的に発現せしめ
ることができる(Perkins等,Molecular and Collular
Biology,1983年7月,Vol3,No.6,1123頁を参照のこ
と)。
上記の結果は、ファクターVIIIC複合体のサブユニッ
トをコードするゲノムDNAが単離されたことを示す。こ
のゲノムDNAを使用することにより、DNAをさらに操作し
てファクターVIIIC複合体サブユニットをコードする配
列を得ることができる。次に、このDNAを発現ベクター
中で使用し、ファクターVIIICサブユニットを製造する
ことができ、これを種々の方法で、例えば診断測定のた
めの試薬として、療法剤として、モノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体の製造のために使用することがで
き、これらの抗体は次にファクターVIIIC複合体の製造
のため、又は他の目的のために使用することができる。
ゲノムDNA配列はまた、プロ−ファクターVIIICをコード
するmRNAの単離のために使用して、前駆体蛋白質を得る
ことができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシングの
ために用いることができる。
トをコードするゲノムDNAが単離されたことを示す。こ
のゲノムDNAを使用することにより、DNAをさらに操作し
てファクターVIIIC複合体サブユニットをコードする配
列を得ることができる。次に、このDNAを発現ベクター
中で使用し、ファクターVIIICサブユニットを製造する
ことができ、これを種々の方法で、例えば診断測定のた
めの試薬として、療法剤として、モノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体の製造のために使用することがで
き、これらの抗体は次にファクターVIIIC複合体の製造
のため、又は他の目的のために使用することができる。
ゲノムDNA配列はまた、プロ−ファクターVIIICをコード
するmRNAの単離のために使用して、前駆体蛋白質を得る
ことができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシングの
ために用いることができる。
この発明の方法は、67/70kdダブレットをコードする
配列の5′−端に又はそれに隣接している特異的配列を
含むDNA配列を提供した。この特異的配列はまた、77/80
kdダブレットのコード配列中5′−端から約200〜400塩
基、さらに正確には約275〜325塩基下流に存在する。
配列の5′−端に又はそれに隣接している特異的配列を
含むDNA配列を提供した。この特異的配列はまた、77/80
kdダブレットのコード配列中5′−端から約200〜400塩
基、さらに正確には約275〜325塩基下流に存在する。
なお、14.43kbEcoRI断片を含有するバクテリオファー
ジλFVIII23Dは1984年1月4日にA.T.C.C.に、No.40094
として寄託された。
ジλFVIII23Dは1984年1月4日にA.T.C.C.に、No.40094
として寄託された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12Q 1/68 A 9453−4B (72)発明者 フランク アール.マシヤーズ アメリカ合衆国,カリフオルニア 94131, サン フランシスコ,マービユー ウエイ 148 (72)発明者 マーサ トウルート アメリカ合衆国,カリフオルニア 94611, オークランド,ブロードウエイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国,カリフオルニア 94117, サン フランシスコ,アツパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国,2100 コペンハーゲン,ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジエニフアー フアバロロ オーストラリア国,ビクトリア,カールト ン 3035,フアラデイ ストリート 108
Claims (1)
- 【請求項1】92.5kd蛋白質とカルシウム架橋された80kd
及び77kd蛋白質の複合体を含み、ファクターVIIICの生
物学的活性を有し、そして他の蛋白質を実質上含有しな
い蛋白質組成物。
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US06/570,062 US5004804A (en) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
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US664919 | 1984-10-26 |
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JP5092775A Division JPH06105688A (ja) | 1984-01-12 | 1993-04-20 | ファクターviii cをコードする遺伝子 |
JP11160290A Division JP2000023670A (ja) | 1984-01-12 | 1999-06-07 | ファクタ―viiic組成物 |
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JP11160290A Pending JP2000023670A (ja) | 1984-01-12 | 1999-06-07 | ファクタ―viiic組成物 |
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US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
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EP0182448A3 (en) * | 1984-08-24 | 1987-10-28 | Genetics Institute, Inc. | Production of factor viii and related products |
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AU5772886A (en) * | 1985-04-12 | 1986-11-05 | Genetics Institute Inc. | Novel procoagulant proteins |
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EP0690126B1 (en) | 1987-06-12 | 2001-11-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
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