JP2000023670A - ファクタ―ｖｉｉｉｃ組成物 - Google Patents
ファクタ―ｖｉｉｉｃ組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発現によ
るヒト−ファクターＶIIIＣ、その前駆体及びサブユニ
ットの製造方法及び組成物を提供すること。 【解決手段】９２．５ｋｄ蛋白質とカルシウム架橋され
た８０ｋｄ及び７７ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファク
ターＶIIIＣの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質
を実質上含有しない蛋白質組成物、ならびに、ヒト−フ
ァクターＶIIIＣのサブユニットをコードするＤＮＡ配
列。
るヒト−ファクターＶIIIＣ、その前駆体及びサブユニ
ットの製造方法及び組成物を提供すること。 【解決手段】９２．５ｋｄ蛋白質とカルシウム架橋され
た８０ｋｄ及び７７ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファク
ターＶIIIＣの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質
を実質上含有しない蛋白質組成物、ならびに、ヒト−フ
ァクターＶIIIＣのサブユニットをコードするＤＮＡ配
列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ヒト−ファクターＶIIIＣ断
片及びサブユニットが実質上純粋な形で提供される。さ
らに、前駆体としての又は活性形でのファクターＶIII
Ｃを製造するため、あるいは天然に得られるサブユニッ
トと組合わせて使用する個々のサブユニットを得るため
のファクターＶIIIＣサブユニット及び断片を発現する
ための方法及び構成物が提供される。このサブユニット
及び断片はファクターＶIIIＣと関連する又は複数の生
物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び免
疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この抗
体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベルさ
れた試薬として使用される。
片及びサブユニットが実質上純粋な形で提供される。さ
らに、前駆体としての又は活性形でのファクターＶIII
Ｃを製造するため、あるいは天然に得られるサブユニッ
トと組合わせて使用する個々のサブユニットを得るため
のファクターＶIIIＣサブユニット及び断片を発現する
ための方法及び構成物が提供される。このサブユニット
及び断片はファクターＶIIIＣと関連する又は複数の生
物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び免
疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この抗
体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベルさ
れた試薬として使用される。
【０００２】
【従来の技術】米国特許第４，３６１，５０９号及びこ
れに引用された文献にはファクターＶIIIＣの精製が記
載されている。さらに、Ｆｕｌｃｈｅｒ及びＺｉｍｍｅ
ｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８２）７９：１６４８−１６５２を参照のこ
と。Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等，Ｊ．ｏｆ Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９７９）９３：４０
−５３にはポリクローナル抗体を用いるファクターＶII
IＣの精製について記載されている。Ａｕｓｔｅｎ，Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９７９）
４３：６６９−６７４にはファクターＶIIIＣの精製の
ためのアミノヘキシル−セファロースの使用について記
載されている。Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）７８：５
１３７−５１４１にはファクターＶIIIＣに対するスロ
ンビンの効果が検討されている。さらに、Ｋｕｏ等，Ａ
ｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ＩＸ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，（コペンハーゲ
ン，１９８３年７月）を参照のこと。
れに引用された文献にはファクターＶIIIＣの精製が記
載されている。さらに、Ｆｕｌｃｈｅｒ及びＺｉｍｍｅ
ｒｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８２）７９：１６４８−１６５２を参照のこ
と。Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等，Ｊ．ｏｆ Ｌａｂ．Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９７９）９３：４０
−５３にはポリクローナル抗体を用いるファクターＶII
IＣの精製について記載されている。Ａｕｓｔｅｎ，Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９７９）
４３：６６９−６７４にはファクターＶIIIＣの精製の
ためのアミノヘキシル−セファロースの使用について記
載されている。Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）７８：５
１３７−５１４１にはファクターＶIIIＣに対するスロ
ンビンの効果が検討されている。さらに、Ｋｕｏ等，Ａ
ｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ＩＸ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，（コペンハーゲ
ン，１９８３年７月）を参照のこと。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ファクターＶIIIＣは
血液凝固の本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺
伝性のＸ染色体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を
有する個体においてはこのファクターは存在せず、又は
不足している。ファクターＶIIIＣの血漿中濃度は極め
て低く、そして一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成
物または最終生成物であると考えられるため、該ファク
ターの単離においては大きな困難に遭遇する。従って、
ファクターＶIIIＣを単離しようとすれば分子量の異る
有意に不均一な複雑な混合物が得られる。
血液凝固の本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺
伝性のＸ染色体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を
有する個体においてはこのファクターは存在せず、又は
不足している。ファクターＶIIIＣの血漿中濃度は極め
て低く、そして一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成
物または最終生成物であると考えられるため、該ファク
ターの単離においては大きな困難に遭遇する。従って、
ファクターＶIIIＣを単離しようとすれば分子量の異る
有意に不均一な複雑な混合物が得られる。
【０００４】生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用す
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中で
のｃＤＮＡ遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を
確立することができる。さらに、アミノ酸配列を決定す
ることにより、特定のアミノ酸配列をコードするコドン
を用いて、メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はｃ
ＤＮＡとハイブリダイズするプローブを開発することが
でき、従って該当する遺伝子の検出、単離及び発現をも
たらし、そして所望の生成物を１種類又は複数種類の宿
主において高収量で製造することができる。
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中で
のｃＤＮＡ遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を
確立することができる。さらに、アミノ酸配列を決定す
ることにより、特定のアミノ酸配列をコードするコドン
を用いて、メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はｃ
ＤＮＡとハイブリダイズするプローブを開発することが
でき、従って該当する遺伝子の検出、単離及び発現をも
たらし、そして所望の生成物を１種類又は複数種類の宿
主において高収量で製造することができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】微生物又は哺乳動物組織
培養細胞での発現によるヒト−ファクターＶIIIＣ、そ
の前駆体及びサブユニットの製造方法及び組成物が提供
される。この方法は、純粋なファクターＶIIIＣ、その
サブユニット及び断片を単離し、そして特にスロンビン
消化を用いてこれらの生理的関連性を決定することを含
む。関連する一連のポリペプチドの各々の少なくとも部
分を配列決定し、そしてこの配列を複合プローブの開発
に使用する。ゲノムＤＮＡ断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟ｍＲＮＡを単離する
ために使用し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る。次に
ＤＮＡ配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。
培養細胞での発現によるヒト−ファクターＶIIIＣ、そ
の前駆体及びサブユニットの製造方法及び組成物が提供
される。この方法は、純粋なファクターＶIIIＣ、その
サブユニット及び断片を単離し、そして特にスロンビン
消化を用いてこれらの生理的関連性を決定することを含
む。関連する一連のポリペプチドの各々の少なくとも部
分を配列決定し、そしてこの配列を複合プローブの開発
に使用する。ゲノムＤＮＡ断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟ｍＲＮＡを単離する
ために使用し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る。次に
ＤＮＡ配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。
【０００６】従って、本発明は以下のものを提供する： １．９２．５ｋｄ蛋白質とカルシウム架橋された８０ｋ
ｄ及び７７ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファクターＶII
IＣの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質を実質上
含有しない蛋白質組成物。
ｄ及び７７ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファクターＶII
IＣの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質を実質上
含有しない蛋白質組成物。
【０００７】２．約６７〜８０ｋｄの１〜２個のポリペ
プチドを主として含んで成り、該ポリペプチドのＮ−端
側の半分に次のアミノ酸配列： Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ を含み、そしてファクターＶIIIＣの生物学的活性を有
するヒト蛋白質組成物。
プチドを主として含んで成り、該ポリペプチドのＮ−端
側の半分に次のアミノ酸配列： Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ を含み、そしてファクターＶIIIＣの生物学的活性を有
するヒト蛋白質組成物。
【０００８】３．約９２．５ｋｄのポリペプチドを主と
して含んで成り、該ポリペプチドのＮ−端側の半分に次
のアミノ酸配列： Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−？−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ を含有し、そしてファクターＶIIIＣの生物学的活性を
有するヒト蛋白質組成物。
して含んで成り、該ポリペプチドのＮ−端側の半分に次
のアミノ酸配列： Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ
−Ａｓｐ−？−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ を含有し、そしてファクターＶIIIＣの生物学的活性を
有するヒト蛋白質組成物。
【０００９】４．項目１に記載の蛋白質組成物を含んで
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
【００１０】５．項目２に記載の蛋白質組成物を含んで
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
【００１１】６．項目３に記載の蛋白質組成物を含んで
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。
【００１２】７．次の式： ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＧ ＣＧＡ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＴＴ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＣＴＡ ＡＴＧ ＣＣＧ ＴＡＣ Ｃ Ｇ で表わされる複合プローブ。
【００１３】８．ファクターＶIIIＣの少なくとも部分
をコードする天然のポリヌクレオチド配列の存在を検出
する方法であって、単鎖形の天然ポリヌクレオチドを項
目７に記載のプローブとハイブリダイズし；そして該プ
ローブとデュプレックスを形成したポリヌクレオチドを
単離する；ことを含んで成る方法。
をコードする天然のポリヌクレオチド配列の存在を検出
する方法であって、単鎖形の天然ポリヌクレオチドを項
目７に記載のプローブとハイブリダイズし；そして該プ
ローブとデュプレックスを形成したポリヌクレオチドを
単離する；ことを含んで成る方法。
【００１４】９．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである
項目８記載の方法。
項目８記載の方法。
【００１５】１０．前記ポリヌクレオチドがＲＮＡであ
る項目８記載の方法。
る項目８記載の方法。
【００１６】１１．全体にわたってオープンリーディン
グフレームを有し、そしてヒト−ファクターＶIIIＣ又
はその前駆体の少なくとも部分をコードする約２００ｂ
ｐ以上のＤＮＡ配列。
グフレームを有し、そしてヒト−ファクターＶIIIＣ又
はその前駆体の少なくとも部分をコードする約２００ｂ
ｐ以上のＤＮＡ配列。
【００１７】１２．実験例に記載したＤＮＡ配列を含有
する項目１１記載のＤＮＡ配列。
する項目１１記載のＤＮＡ配列。
【００１８】１３．ヒト−ファクターＶIIIＣのサブユ
ニットをコードするＤＮＡ配列。
ニットをコードするＤＮＡ配列。
【００１９】１４．ファクターＶIIIＣの８０ｋｄペプ
チドをコードする項目１３記載のＤＮＡ配列。
チドをコードする項目１３記載のＤＮＡ配列。
【００２０】１５．ファクターＶIIIＣの７７ｋｄペプ
チドをコードする項目１３記載のＤＮＡ配列。
チドをコードする項目１３記載のＤＮＡ配列。
【００２１】１６．培養において増殖することができる
宿主細胞と適合性の複製系、及びヒト−ファクターＶII
IＣ、又はその前駆体の少なくとも部分をコードする約
２００ｂｐ以上のＤＮＡ配列を含有する染色体外要素。
宿主細胞と適合性の複製系、及びヒト−ファクターＶII
IＣ、又はその前駆体の少なくとも部分をコードする約
２００ｂｐ以上のＤＮＡ配列を含有する染色体外要素。
【００２２】１７．前記ＤＮＡ配列がファクターＶIII
Ｃの８０ｋｄペプチドをコードする項目１６記載の染色
体外要素。
Ｃの８０ｋｄペプチドをコードする項目１６記載の染色
体外要素。
【００２３】１８．前記ＤＮＡ配列がファクターＶIII
Ｃの７７ｋｄペプチドをコードする項目１６記載の染色
体外要素。
Ｃの７７ｋｄペプチドをコードする項目１６記載の染色
体外要素。
【００２４】１９．前記ＤＮＡ配列の発現のために該Ｄ
ＮＡ配列に並置された、前記宿主と適合性の転写及び翻
訳製御シグナルを含有する項目１６記載の染色体外要
素。
ＮＡ配列に並置された、前記宿主と適合性の転写及び翻
訳製御シグナルを含有する項目１６記載の染色体外要
素。
【００２５】２０．前記宿主が単細胞微生物である項目
１６記載の染色体外要素。
１６記載の染色体外要素。
【００２６】２１．前記宿主が哺乳動物細胞である項目
１６記載の染色体外要素。
１６記載の染色体外要素。
【００２７】２２．ファクターＶIIIＣの少なくとも部
分をコードし、そして項目７記載のプローブとハイブリ
ダイズする、哺乳動物ゲノム由来の約１０〜２５ｋｂｐ
のＤＮＡ配列。
分をコードし、そして項目７記載のプローブとハイブリ
ダイズする、哺乳動物ゲノム由来の約１０〜２５ｋｂｐ
のＤＮＡ配列。
【００２８】２３．単細胞微生物クローニングベクター
と連結された項目２２記載のＤＮＡ配列を含んで成るＤ
ＮＡ構成物。
と連結された項目２２記載のＤＮＡ配列を含んで成るＤ
ＮＡ構成物。
【００２９】
【発明の実施の形態】ヒト−ファクターＶIIIＣは、約
４６０ｋｄの見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形
で単離され得る複合蛋白質である。変性条件下での電気
泳動に際し、種々の分子量、すなわち２４０、１６０、
１４０、１１５、９２．５、８０、及び７７ｋｄの多数
の断片が生じ、後２者はダブレットとして移動する。免
疫的関係を調べるために抗体を用いそして構造的関係を
調べるために切断パターンを用いながら、化学的切断及
びスロンビン切断を含むプロテアーゼ切断により断片を
分析することにより、９２．５ｋｄポリペプチドが２４
０、１６０、１４０及び１１５ポリペプチドと関連して
おり、他方７７／８０ダブレットは他のペプチドと共通
の同定され得る特性を有さず２４０ｋｄポリペプチドと
のみ共通の特性を有することが示される。さらに、７７
／８０ｋｄダブレットはスロンビンにより６７／７０ｋ
ｄダブレットに転換され、他方スロンビンで処理された
精製ファクターＶIIIＣ物質中に存在する９２．５ｋｄ
ポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接的に約
４０及び５２．５ｋｄの２個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された７７／８０ｋｄダブレット
ポリペプチドはそのＮ−端がブロックされており、６７
／７０ｋｄダブレットはそのＮ−端がブロックされてい
ないことが見出される。
４６０ｋｄの見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形
で単離され得る複合蛋白質である。変性条件下での電気
泳動に際し、種々の分子量、すなわち２４０、１６０、
１４０、１１５、９２．５、８０、及び７７ｋｄの多数
の断片が生じ、後２者はダブレットとして移動する。免
疫的関係を調べるために抗体を用いそして構造的関係を
調べるために切断パターンを用いながら、化学的切断及
びスロンビン切断を含むプロテアーゼ切断により断片を
分析することにより、９２．５ｋｄポリペプチドが２４
０、１６０、１４０及び１１５ポリペプチドと関連して
おり、他方７７／８０ダブレットは他のペプチドと共通
の同定され得る特性を有さず２４０ｋｄポリペプチドと
のみ共通の特性を有することが示される。さらに、７７
／８０ｋｄダブレットはスロンビンにより６７／７０ｋ
ｄダブレットに転換され、他方スロンビンで処理された
精製ファクターＶIIIＣ物質中に存在する９２．５ｋｄ
ポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接的に約
４０及び５２．５ｋｄの２個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された７７／８０ｋｄダブレット
ポリペプチドはそのＮ−端がブロックされており、６７
／７０ｋｄダブレットはそのＮ−端がブロックされてい
ないことが見出される。
【００３０】さらに、ファクターＶIIIＣの座は大きな
イントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクタ
ーＶIIIＣと関連する種々の領域を含むことが見出され
る。すなわち、ファクターＶIIIＣ複合体に関する特定
のポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単
離することができる。ファクターＶIIIＣサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離
し、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、
又は合成ＤＮＡにより連結して、ファクタ−ＶIIIＣの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。
イントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクタ
ーＶIIIＣと関連する種々の領域を含むことが見出され
る。すなわち、ファクターＶIIIＣ複合体に関する特定
のポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単
離することができる。ファクターＶIIIＣサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離
し、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、
又は合成ＤＮＡにより連結して、ファクタ−ＶIIIＣの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。
【００３１】便利には、エクソン及びイントロンの両者
を含有するファクターＶIIIＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳
動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿
入し、ｃＤＮＡのクローニングに適するように適切にス
プライスされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを
得、そしてファクターＶIIIＣ、サブユニット又は断片
を製造する。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列
を用いてファクターＶIIIＣをコードする天然メッセン
ジャーＲＮＡとハイブリダイズさせることができる。次
に、このメッセンジャーＲＮＡを用いてファクターＶII
IＣのサブユニットをコードするｄｓ ｃＤＮＡを調製
することができる。ＤＮＡ配列は、これを転写及び翻訳
のために必要な制御がシグナルを有する適当な発現ベク
ターに挿入することによって、発現のために使用するこ
とができる。ファクターＶIIIＣ遺伝子発現ベクター
（ファクターＶIIIＣ、その前駆体、サブユニット又は
断片の全体又は部分をコードする１個又は複数個の遺伝
子を担持する発現ベクター）を適合性の宿主に導入し、
そしてこの宿主をファクターＶIIIＣの発現のために増
殖せしめることができる。宿主を適切に選択することに
より、ファクターＶIIIＣのＤＮＡを分泌リーダー及び
プロセシングシグナルの下流に挿入し、生成物が宿主か
ら分泌され、そしてプロセシングされて完全なポリペプ
チドとなるようにすることができる。適当であれば、こ
のポリペプチドをさらに処理してこれに天然ポリペプチ
ド上に存在する官能基又は置換基を導入することができ
る。
を含有するファクターＶIIIＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳
動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿
入し、ｃＤＮＡのクローニングに適するように適切にス
プライスされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを
得、そしてファクターＶIIIＣ、サブユニット又は断片
を製造する。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列
を用いてファクターＶIIIＣをコードする天然メッセン
ジャーＲＮＡとハイブリダイズさせることができる。次
に、このメッセンジャーＲＮＡを用いてファクターＶII
IＣのサブユニットをコードするｄｓ ｃＤＮＡを調製
することができる。ＤＮＡ配列は、これを転写及び翻訳
のために必要な制御がシグナルを有する適当な発現ベク
ターに挿入することによって、発現のために使用するこ
とができる。ファクターＶIIIＣ遺伝子発現ベクター
（ファクターＶIIIＣ、その前駆体、サブユニット又は
断片の全体又は部分をコードする１個又は複数個の遺伝
子を担持する発現ベクター）を適合性の宿主に導入し、
そしてこの宿主をファクターＶIIIＣの発現のために増
殖せしめることができる。宿主を適切に選択することに
より、ファクターＶIIIＣのＤＮＡを分泌リーダー及び
プロセシングシグナルの下流に挿入し、生成物が宿主か
ら分泌され、そしてプロセシングされて完全なポリペプ
チドとなるようにすることができる。適当であれば、こ
のポリペプチドをさらに処理してこれに天然ポリペプチ
ド上に存在する官能基又は置換基を導入することができ
る。
【００３２】この発明の最初の段階において、高度に精
製したファクターＶIIIＣを得そして特徴付ける。精製
されたファクターＶIIIＣは市販のヒト−抗血友病因子
（ＡＨＦ）から得ることができる。この因子は正状なヒ
トの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるもので
あり約４０倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、
例えばイミダゾール−リジン−ＨＣｌ塩溶液（ｐＨ７．
４）に溶解し、次にファクターＶIIIＣ又はファクター
ＶIIIＲに対するポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体を有するアフィニティーカラム上でクロマトグラ
フ処理することによりファクターＶIIIＣをさらに濃
縮、精製する。便利には、抗体をセファロース支持体に
共有結合せしめる。比較的高濃度のカルシウムイオンと
グリセリンとの組合せを用いてカラムからファクターＶ
IIIＣを溶出することができる。次に、カラムから得ら
れた画分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を
用いて透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロー
スカラムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリ
ウムを含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製す
ることができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼ
ラチンセファロース、ＨＰＬＣ、デキストランサルフェ
ート又はＭｏｎｏ Ｑ上でのイオン交換、レクチン又は
ファクターＶIIIＣに対する抗体を用いるアフィニティ
ーカラム等によりさらに精製することができる。特に、
デキストランサルフェートを使用することにより微量汚
染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロレクチン、Ｉ
ｇＧが標品から除去され、外来性蛋白質を実質上含有し
ない生成物が残る。カラムからの画分の活性は、凝固ア
ッセイ（市販キット）及びファクターＶIIIＣに特異的
な抗体を用いて、生物学的活性及び抗原活性のいずれか
又は両方について監視することができる。血漿中のファ
クターＶIIIの濃度に基いて、上記の方法により約２０
０，０００倍の精製が達成される。 ファクターＶIIIＣの特徴付け ゲルろ過により、ファクターＶIIIＣが約４６０ｋｄの
見かけ分子量を有する複合体として挙動することが示さ
れる。ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子
量を異にする７個の個別のポリペプチドを単離すること
ができる。その分子量により定義される断片は２４０、
１６０、１４０、１１５、９２．５、８０及び７７ｋｄ
断片である。これらの断片を次の方法により特徴付け
た。
製したファクターＶIIIＣを得そして特徴付ける。精製
されたファクターＶIIIＣは市販のヒト−抗血友病因子
（ＡＨＦ）から得ることができる。この因子は正状なヒ
トの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるもので
あり約４０倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、
例えばイミダゾール−リジン−ＨＣｌ塩溶液（ｐＨ７．
４）に溶解し、次にファクターＶIIIＣ又はファクター
ＶIIIＲに対するポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体を有するアフィニティーカラム上でクロマトグラ
フ処理することによりファクターＶIIIＣをさらに濃
縮、精製する。便利には、抗体をセファロース支持体に
共有結合せしめる。比較的高濃度のカルシウムイオンと
グリセリンとの組合せを用いてカラムからファクターＶ
IIIＣを溶出することができる。次に、カラムから得ら
れた画分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を
用いて透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロー
スカラムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリ
ウムを含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製す
ることができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼ
ラチンセファロース、ＨＰＬＣ、デキストランサルフェ
ート又はＭｏｎｏ Ｑ上でのイオン交換、レクチン又は
ファクターＶIIIＣに対する抗体を用いるアフィニティ
ーカラム等によりさらに精製することができる。特に、
デキストランサルフェートを使用することにより微量汚
染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロレクチン、Ｉ
ｇＧが標品から除去され、外来性蛋白質を実質上含有し
ない生成物が残る。カラムからの画分の活性は、凝固ア
ッセイ（市販キット）及びファクターＶIIIＣに特異的
な抗体を用いて、生物学的活性及び抗原活性のいずれか
又は両方について監視することができる。血漿中のファ
クターＶIIIの濃度に基いて、上記の方法により約２０
０，０００倍の精製が達成される。 ファクターＶIIIＣの特徴付け ゲルろ過により、ファクターＶIIIＣが約４６０ｋｄの
見かけ分子量を有する複合体として挙動することが示さ
れる。ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子
量を異にする７個の個別のポリペプチドを単離すること
ができる。その分子量により定義される断片は２４０、
１６０、１４０、１１５、９２．５、８０及び７７ｋｄ
断片である。これらの断片を次の方法により特徴付け
た。
【００３３】第１の研究は、血友病患者から単離された
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は７７／８０ｋｄダブレットと反応し
た。Ｅ抗体は２４０ｋｄポリペプチドと強く反応し、そ
してダブレットと２４０ｋｄポリペプチドとの間の複数
のバンドと弱く反応した。Ｚ抗体は２４０ｋｄポリペプ
チドとも弱く反応した。
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は７７／８０ｋｄダブレットと反応し
た。Ｅ抗体は２４０ｋｄポリペプチドと強く反応し、そ
してダブレットと２４０ｋｄポリペプチドとの間の複数
のバンドと弱く反応した。Ｚ抗体は２４０ｋｄポリペプ
チドとも弱く反応した。
【００３４】免疫沈澱実験において、Ｅ抗体は７７／８
０ｋｄダブレット、並びに１６０、１４０、１１５及び
９２．５ｋｄの高分子量種を沈澱せしめ、ダブレットは
一層強いバンド中にある。ＥＧＴＡを含有せしめること
によりダブレット以外のバンドが消失し、９２．５ｋｄ
種がＣａ++橋に中介されて複合体中で７７ｋｄ及び／又
は８０ｋｄ種と会合することが示される。
０ｋｄダブレット、並びに１６０、１４０、１１５及び
９２．５ｋｄの高分子量種を沈澱せしめ、ダブレットは
一層強いバンド中にある。ＥＧＴＡを含有せしめること
によりダブレット以外のバンドが消失し、９２．５ｋｄ
種がＣａ++橋に中介されて複合体中で７７ｋｄ及び／又
は８０ｋｄ種と会合することが示される。
【００３５】次の研究において、ファクターＶIIIＣに
介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応
するモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは７７／
８０ｋｄダブレット及び２４０ｋｄポリペプチドと反応
し、クラスIIは１６０、１４０、１１５及び９２．５ｋ
ｄポリペプチドと反応する。クラスＩ抗体とスロンビン
消化ファクターＶIIIＣとの免疫沈澱により、生成する
７０／６７ｋｄダブレットはファクターＶIIIＣ中に存
在する７７／８０ｋｄダブレットに由来することが示さ
れる。クラスＩＩモノクローナル抗体は、１６０、１４
０及び１１５ｋｄペプチドが９２．５ｋｄペプチドの前
駆体であることを示した。９２．５ｋｄペプチドの切断
生成物である４０ｋｄペプチドもクラスII抗体により結
合された。ＥＧＴＡの存在下及び非存在下でモノクロー
ナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ測定によりファクターＶII
IＣ複合体の９２．５ｋｄ成分と７７ｋｄ及び／又は８
０ｋｄ成分との間のＣａ++橋会合が確認された。
介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応
するモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは７７／
８０ｋｄダブレット及び２４０ｋｄポリペプチドと反応
し、クラスIIは１６０、１４０、１１５及び９２．５ｋ
ｄポリペプチドと反応する。クラスＩ抗体とスロンビン
消化ファクターＶIIIＣとの免疫沈澱により、生成する
７０／６７ｋｄダブレットはファクターＶIIIＣ中に存
在する７７／８０ｋｄダブレットに由来することが示さ
れる。クラスＩＩモノクローナル抗体は、１６０、１４
０及び１１５ｋｄペプチドが９２．５ｋｄペプチドの前
駆体であることを示した。９２．５ｋｄペプチドの切断
生成物である４０ｋｄペプチドもクラスII抗体により結
合された。ＥＧＴＡの存在下及び非存在下でモノクロー
ナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ測定によりファクターＶII
IＣ複合体の９２．５ｋｄ成分と７７ｋｄ及び／又は８
０ｋｄ成分との間のＣａ++橋会合が確認された。
【００３６】ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターＶ
IIIＣを得るために使用することができ、又はＥＧＴＡ
を用いながら、構成成分である９２．５ｋｄ種と７７／
８０ｋｄ種を分けるために使用することができる。
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターＶ
IIIＣを得るために使用することができ、又はＥＧＴＡ
を用いながら、構成成分である９２．５ｋｄ種と７７／
８０ｋｄ種を分けるために使用することができる。
【００３７】次の研究では、精製されたファクターＶII
IＣ物質のｐＨ６．８又は７．４におけるスロンビン消
化を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそし
てゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は９
２．５ｋｄ種の量の増加及び減少に伴って時間と共に増
加しそして減少することが示された。精製されたファク
ターＶIIIＣ物質の短時間（５〜１５分間）のスロンビ
ン処理により９２．５ｋｄ種の量が増加し、７７／８０
ｋｄダブレットは部分的に６７／７０ｋｄダブレットに
転換される。長時間、例えば１時間スロンビン消化する
場合、９２．５ｋｄ蛋白質が分解され、そして４０ｋｄ
及び５２．５ｋｄの２個の新たなペプチドが生じ、４０
ｋｄペプチドは９２．５ｋｄ種の免疫原性を維持してい
る。５２．５ｋｄペプチドは、化学的及び酵素的分解パ
ターン及び９２．５ｋｄ種に類似する生成物により、切
断生成物であることが示される。
IＣ物質のｐＨ６．８又は７．４におけるスロンビン消
化を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそし
てゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は９
２．５ｋｄ種の量の増加及び減少に伴って時間と共に増
加しそして減少することが示された。精製されたファク
ターＶIIIＣ物質の短時間（５〜１５分間）のスロンビ
ン処理により９２．５ｋｄ種の量が増加し、７７／８０
ｋｄダブレットは部分的に６７／７０ｋｄダブレットに
転換される。長時間、例えば１時間スロンビン消化する
場合、９２．５ｋｄ蛋白質が分解され、そして４０ｋｄ
及び５２．５ｋｄの２個の新たなペプチドが生じ、４０
ｋｄペプチドは９２．５ｋｄ種の免疫原性を維持してい
る。５２．５ｋｄペプチドは、化学的及び酵素的分解パ
ターン及び９２．５ｋｄ種に類似する生成物により、切
断生成物であることが示される。
【００３８】次の研究において、個々のファクターＶII
IＣサブユニット及び前駆体（例えば２４０、７７／８
０、９２．５ｋｄ種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳動によ
り単離し、そして次に単離されたポリペプチドの経時的
スロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離された２
４０ｋｄ断片は１６０、１４０、１１５、及び９２．５
ｋｄのバンドを生成した。８０ｋｄ及び７７ｋｄの断片
はそれぞれ７０ｋｄ及び６７ｋｄの断片を生成した。
IＣサブユニット及び前駆体（例えば２４０、７７／８
０、９２．５ｋｄ種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳動によ
り単離し、そして次に単離されたポリペプチドの経時的
スロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離された２
４０ｋｄ断片は１６０、１４０、１１５、及び９２．５
ｋｄのバンドを生成した。８０ｋｄ及び７７ｋｄの断片
はそれぞれ７０ｋｄ及び６７ｋｄの断片を生成した。
【００３９】７７ｋｄ及び／又は８０ｋｄ種と９２．５
ｋｄポリペプチドとをカルシウム橋複合体として含有す
るファクターＶIIIＣ複合体は高度に精製された形で得
られる。抗−ファクターＶIIIＲイムノソルベントカラ
ム及びアミノヘキシルセファロースカラムで処理した
後、ファクターＶIIIＣ物質（複合体及び前駆体種）の
純度は、全蛋白質を基礎にして、通常は８０％より高
く、しばしば９０％より高く、そして９８％以上であり
え、そして複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして２０
％以上であり、さらに一般的には３０％以上である。追
加のクロマトグラフ段階、例えばデキストランサルフェ
ートの使用により、ファクターＶIIIＣ物質（複合体＋
前駆体）の純度レベルが９０％以上に上昇する。調製用
ＳＤＳゲル電気泳動により単離されたファクターＶIII
Ｃ成分、すなわち９２．５ｋｄ種及び７７／８０ｋｄダ
ブレットの純度は通常９８％以上である。上記のよう
に、ダブレットの１員又は９２．５ｋｄポリペプチドに
特異的なモノクローナル抗体を用いて複合体を得ること
ができる。次に、変性剤又はチャオトロピック（ｃｈａ
ｏｔｒｏｐｉｃ）溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソ
シアナートを用いて複合体を抗体から分離することがで
きる。 プローブの調製 ６７及び７０ｋｄポリペプチドのＮ−端の部分的アミノ
酸配列は次の通りである。
ｋｄポリペプチドとをカルシウム橋複合体として含有す
るファクターＶIIIＣ複合体は高度に精製された形で得
られる。抗−ファクターＶIIIＲイムノソルベントカラ
ム及びアミノヘキシルセファロースカラムで処理した
後、ファクターＶIIIＣ物質（複合体及び前駆体種）の
純度は、全蛋白質を基礎にして、通常は８０％より高
く、しばしば９０％より高く、そして９８％以上であり
え、そして複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして２０
％以上であり、さらに一般的には３０％以上である。追
加のクロマトグラフ段階、例えばデキストランサルフェ
ートの使用により、ファクターＶIIIＣ物質（複合体＋
前駆体）の純度レベルが９０％以上に上昇する。調製用
ＳＤＳゲル電気泳動により単離されたファクターＶIII
Ｃ成分、すなわち９２．５ｋｄ種及び７７／８０ｋｄダ
ブレットの純度は通常９８％以上である。上記のよう
に、ダブレットの１員又は９２．５ｋｄポリペプチドに
特異的なモノクローナル抗体を用いて複合体を得ること
ができる。次に、変性剤又はチャオトロピック（ｃｈａ
ｏｔｒｏｐｉｃ）溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソ
シアナートを用いて複合体を抗体から分離することがで
きる。 プローブの調製 ６７及び７０ｋｄポリペプチドのＮ−端の部分的アミノ
酸配列は次の通りである。
【００４０】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ? Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met この配列に基いて、６７／７０ｋｄダブレット用の（従
って、このダブレットが由来する７７／８０ｋｄダブレ
ット用の）、次の配列を有するプローブを調製すること
ができる。 ５２．５ｋｄ蛋白質のＮ−端アミノ酸配列は実質上次の
通りである。
って、このダブレットが由来する７７／８０ｋｄダブレ
ット用の）、次の配列を有するプローブを調製すること
ができる。 ５２．５ｋｄ蛋白質のＮ−端アミノ酸配列は実質上次の
通りである。
【００４１】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp ? Gly 23 24 25 26 Glu Leu Pro Val このアミノ酸配列に基いて、５２．５ｋｄ蛋白質用の、
次のようなコード鎖を基礎にするプローブを調製するこ
とができる。 5'- GCA ACT AGA AGA TAT TAT TTG GGG GCA GTT A G G A A A GAA TTG TCA TGG GAT TAT - 3' A T ７７／８０ｋｄ蛋白質の３個の断片のアミノ酸配列は次
の通りである。
次のようなコード鎖を基礎にするプローブを調製するこ
とができる。 5'- GCA ACT AGA AGA TAT TAT TTG GGG GCA GTT A G G A A A GAA TTG TCA TGG GAT TAT - 3' A T ７７／８０ｋｄ蛋白質の３個の断片のアミノ酸配列は次
の通りである。
【００４２】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎を置くそれぞ
れ次のようなプローブを調製することができる。
れ次のようなプローブを調製することができる。
【００４３】 プローブ１： 3'- ATA CGT CGT TGA AGT GTT CAA AAC AAC GG - 5' T A T T T プローブ２： 3'- CAA TGA CCT CAA TGA TGA GTT CCT CAA TTT - 5' T T T T T T プローブ３： 3'- TAC CTT CAA AAC CCT ACG CTT CGT GTT T T CTA AAC ATA - 5' T これらのペプチドの配列及び対応するプローブの調製に
ついては実験の部において詳細に後記する。 ＤＮＡの単離 上記のプローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約１０〜２５ｋｂの断片のサ
イズ選択を含む。制限消化は、クローン化される断片が
オーバーラップするように不完全であるべきである。こ
れらの断片は適当なべクターにクローン化して微生物、
例えば細菌、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクロ
ーンの「ライブラリー」を調製することができる。プラ
スミド又はウイルス、例えばｐＢＲ３２２、ラムダ、シ
ャロン４Ａ、ＥＭＢＬ−４等の種々のベクターを使用す
ることができる。
ついては実験の部において詳細に後記する。 ＤＮＡの単離 上記のプローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約１０〜２５ｋｂの断片のサ
イズ選択を含む。制限消化は、クローン化される断片が
オーバーラップするように不完全であるべきである。こ
れらの断片は適当なべクターにクローン化して微生物、
例えば細菌、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクロ
ーンの「ライブラリー」を調製することができる。プラ
スミド又はウイルス、例えばｐＢＲ３２２、ラムダ、シ
ャロン４Ａ、ＥＭＢＬ−４等の種々のベクターを使用す
ることができる。
【００４４】酵素的に放射能ラベルした上記のプローブ
を用いてＤＮＡをスクリーニングし、そして相同な配列
を検出する。１又は複数のプローブとハイブリダイズす
るこれらの配列を再クローン化し、そして１回又は複数
回再ハイブリダイズすることができる。
を用いてＤＮＡをスクリーニングし、そして相同な配列
を検出する。１又は複数のプローブとハイブリダイズす
るこれらの配列を再クローン化し、そして１回又は複数
回再ハイブリダイズすることができる。
【００４５】最初に使用したプローブとは異る１種類又
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜１０ｋ
ｂ、さらに普通には１〜６ｋｂの範囲の大きさを有す
る。次に、これらの断片をサブクローン化し、そしてス
クリーニングして陽性の断片を同定することができる。
次に、ＤＮＡ断片の配列決定のためにプライマーとして
合成プローブを使用することができる。最も便利に配列
決定される断片は、１種類又は複数種類の上記のプロー
ブと相補的な配列を含有する断片であり、ここで相同な
配列は５’−端から約５塩基〜約５００塩基である。注
目される他の断片には最初にクローン化された断片の末
端部の断片が含まれる。なぜなら、これらはライブラリ
ー中の他のクローンにおいて示され、そしてそれ故に完
全な目的遺伝子を回収するまで染色体にそって「歩く」
ために使用されるからである。
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜１０ｋ
ｂ、さらに普通には１〜６ｋｂの範囲の大きさを有す
る。次に、これらの断片をサブクローン化し、そしてス
クリーニングして陽性の断片を同定することができる。
次に、ＤＮＡ断片の配列決定のためにプライマーとして
合成プローブを使用することができる。最も便利に配列
決定される断片は、１種類又は複数種類の上記のプロー
ブと相補的な配列を含有する断片であり、ここで相同な
配列は５’−端から約５塩基〜約５００塩基である。注
目される他の断片には最初にクローン化された断片の末
端部の断片が含まれる。なぜなら、これらはライブラリ
ー中の他のクローンにおいて示され、そしてそれ故に完
全な目的遺伝子を回収するまで染色体にそって「歩く」
ために使用されるからである。
【００４６】ＤＮＡ断片を配列決定した後、決定された
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。適当な位置に
おいて制限部位を容易に用いることができない場合に
は、ＤＮＡ断片を種々の時間にわたってＢａｌ３１切断
（リセクト）により変形し、生じた断片をクローン化
し、そして種々の技法によりＮ−端を決定することがで
きる。便利には、リセクトされた断片が連結される３’
−塩基の適切な選択により特定の制限酵素の認識部位を
設けることができる。この方法において、生ずるクロー
ンをあらかじめ定められた制限部位についてスクリーニ
ングすることができ、この部位は所望の部位へのリセク
トされた断片の存在を示すであろう。
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。適当な位置に
おいて制限部位を容易に用いることができない場合に
は、ＤＮＡ断片を種々の時間にわたってＢａｌ３１切断
（リセクト）により変形し、生じた断片をクローン化
し、そして種々の技法によりＮ−端を決定することがで
きる。便利には、リセクトされた断片が連結される３’
−塩基の適切な選択により特定の制限酵素の認識部位を
設けることができる。この方法において、生ずるクロー
ンをあらかじめ定められた制限部位についてスクリーニ
ングすることができ、この部位は所望の部位へのリセク
トされた断片の存在を示すであろう。
【００４７】好ましくは、エクソン、又は５０ｂｐ以
上、さらに一般的には約１００ｂｐ以上、さらには約２
５０ｂｐ又はこれより大きいエクソン断片を変性し、そ
してヒト細胞、特にファクターＶIIIＣのためのｍＲＮ
Ａを産生するヒト細胞からｍＲＮＡを得るためのプロー
ブとして使用することができる。ハイブリダイズするｍ
ＲＮＡを単離することによって、卵母細胞又は網状赤血
球溶解物中での翻訳、及びファクターＶIIIＣに対する
抗体又はファクターＶIIIＣサブユニットヘの結合に基
く凝固活性を用いるファクターＶIIIＣの産生の検出を
行うことによりｍＲＮＡをスクリーニングすることがで
きる。次に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ
を逆転写することができる。
上、さらに一般的には約１００ｂｐ以上、さらには約２
５０ｂｐ又はこれより大きいエクソン断片を変性し、そ
してヒト細胞、特にファクターＶIIIＣのためのｍＲＮ
Ａを産生するヒト細胞からｍＲＮＡを得るためのプロー
ブとして使用することができる。ハイブリダイズするｍ
ＲＮＡを単離することによって、卵母細胞又は網状赤血
球溶解物中での翻訳、及びファクターＶIIIＣに対する
抗体又はファクターＶIIIＣサブユニットヘの結合に基
く凝固活性を用いるファクターＶIIIＣの産生の検出を
行うことによりｍＲＮＡをスクリーニングすることがで
きる。次に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ
を逆転写することができる。
【００４８】逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌ
クレアーゼ、例えばＳ1ヌクレアーゼにより末端ループ
を除去することにより、種々の方法を用いてｓｓ ｃＤ
ＮＡをｄｓ ｃＤＮＡに転換することができる。不完全
なコピーが得られる場合、ｍＲＮＡの５’−コード配列
がコピーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」、又は
ｃＤＮＡプライム合成を行い、そしてｍＲＮＡの全コー
ド領域をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
ｌｅｎｏｗ断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌ
クレアーゼ、例えばＳ1ヌクレアーゼにより末端ループ
を除去することにより、種々の方法を用いてｓｓ ｃＤ
ＮＡをｄｓ ｃＤＮＡに転換することができる。不完全
なコピーが得られる場合、ｍＲＮＡの５’−コード配列
がコピーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」、又は
ｃＤＮＡプライム合成を行い、そしてｍＲＮＡの全コー
ド領域をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
【００４９】上記の方法に基いて、ファクターＶIIIＣ
の前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ
配列を用いて発現せしめ、又はファクターＶIIIＣの特
定のサブユニット、例えば９２．５ｋｄ、８０ｋｄ又は
７７ｋｄのサブユニットをコードする小断片を用いるこ
とができる。
の前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ
配列を用いて発現せしめ、又はファクターＶIIIＣの特
定のサブユニット、例えば９２．５ｋｄ、８０ｋｄ又は
７７ｋｄのサブユニットをコードする小断片を用いるこ
とができる。
【００５０】前駆体ポリペプチド（プロ−ファクターＶ
IIIＣ）のためには、遺伝子を１端又は両端において平
滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に
挿入することができ、あるいは５’−コード端から下流
で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダ
プターに結合することができる。
IIIＣ）のためには、遺伝子を１端又は両端において平
滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に
挿入することができ、あるいは５’−コード端から下流
で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダ
プターに結合することができる。
【００５１】そして、適当なＮ−端を有する断片（７０
ｋｄ又は８０ｋｄポリペプチドのコード配列にあっても
よく、又は最初の塩基から下流、一般に約３０塩基以下
下流、さらに一般的には約２０塩基以下下流に５’−端
を有してもよい）を、適当であればアダプターを用い
て、適切なベクターに挿入することができる。
ｋｄ又は８０ｋｄポリペプチドのコード配列にあっても
よく、又は最初の塩基から下流、一般に約３０塩基以下
下流、さらに一般的には約２０塩基以下下流に５’−端
を有してもよい）を、適当であればアダプターを用い
て、適切なベクターに挿入することができる。
【００５２】染色体外要素を得るため、特定の宿主、発
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ)、Ｂ．サ
ーモフィルス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ)、Ｓ．
セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等により認
識される転写及び翻訳制御シグナルを有する種々のベク
ターを使用することができる。
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ)、Ｂ．サ
ーモフィルス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ)、Ｓ．
セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等により認
識される転写及び翻訳制御シグナルを有する種々のベク
ターを使用することができる。
【００５３】ベクターは宿主により認識される複製系を
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムヘの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムヘの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。
【００５４】使用される発現ベクターは宿主により認識
される転写及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シ
グナルはプロモーター及びターミネーター、並びに１又
は複数個のエンハンサーのごとき補助シグナルを含むで
あろう。さらに、転写の制御は、オペレーター、アクチ
ベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめること
によって行われるであろう。転写に関する他の配列には
キャップ配列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳
のためには、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開
始コドン、終止コドン等が存在するであろう。
される転写及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シ
グナルはプロモーター及びターミネーター、並びに１又
は複数個のエンハンサーのごとき補助シグナルを含むで
あろう。さらに、転写の制御は、オペレーター、アクチ
ベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめること
によって行われるであろう。転写に関する他の配列には
キャップ配列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳
のためには、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開
始コドン、終止コドン等が存在するであろう。
【００５５】便利には、宿主により認識されるシグナル
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５’−及び３’−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５’−及び３’−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。
【００５６】ベクターは、選択を可能にし、そして宿主
の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複数個の
マーカーを有するであろう。これらのマーカーには、栄
養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒性耐性
等が含まれるであろう。
の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複数個の
マーカーを有するであろう。これらのマーカーには、栄
養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒性耐性
等が含まれるであろう。
【００５７】分泌リーダー及びプロセシングシグナルが
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレ
オチドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及び
プロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
（この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５'
末端を有する）との間に挿入し、こうすることによって
アダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして
遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コ
ドンが整合するようにすることができよう。
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレ
オチドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及び
プロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
（この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５'
末端を有する）との間に挿入し、こうすることによって
アダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして
遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コ
ドンが整合するようにすることができよう。
【００５８】次に、こうして得られた所望の遺伝子を含
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等
により精製することができる。
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等
により精製することができる。
【００５９】哺乳動物細胞での発現のためにはベクター
として哺乳動物ウイルス、例えばＳＶ−４０、乳頭種ウ
イルス、マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）ネズミサルコーマ
ウイルス、アデノウイルス等を使用することができる。
これらのウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベク
ターとして使用するために変性されている。代表的な系
においては、組込まれたＳＶ−４０ゲノムを担持しそし
てＳＶ−４０の複製のために必要なラージＴ抗原を産生
するＣＯＳ細胞が使用される〔Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌ
ｌ（１９８１）２３：１７５〕。ＳＶ−４０地図上のＨ
ｐａＩ部位からＳＶ−４０地図上の０.１４部位にわた
る断片がベクターとして使用される。ファクターＶIII
Ｃ遺伝子又はその部分とＳＶ−４０ベクターとを連結す
ることによって得られる組換プラスミドはモンキーＣＶ
−１細胞のトランスフェクトのために使用することがで
きる。
として哺乳動物ウイルス、例えばＳＶ−４０、乳頭種ウ
イルス、マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）ネズミサルコーマ
ウイルス、アデノウイルス等を使用することができる。
これらのウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベク
ターとして使用するために変性されている。代表的な系
においては、組込まれたＳＶ−４０ゲノムを担持しそし
てＳＶ−４０の複製のために必要なラージＴ抗原を産生
するＣＯＳ細胞が使用される〔Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌ
ｌ（１９８１）２３：１７５〕。ＳＶ−４０地図上のＨ
ｐａＩ部位からＳＶ−４０地図上の０.１４部位にわた
る断片がベクターとして使用される。ファクターＶIII
Ｃ遺伝子又はその部分とＳＶ−４０ベクターとを連結す
ることによって得られる組換プラスミドはモンキーＣＶ
−１細胞のトランスフェクトのために使用することがで
きる。
【００６０】この発明に従えば、ファクターＶIIIＣの
精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定
のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化する
ために使用される。ファクターＶIIIＣはまた医療にお
いて使用される。さらに、この発明によって製造された
ポリペプチドは、ファクターＶIIIＣ、そのサブユニッ
ト及び断片に対するモノクローナル抗体を製造するため
に使用することができる。さらに、サブユニット及び断
片は試薬として使用される。この試薬はラベルされ、そ
して抗体と組合わせて生理的液体、例えば血液又は血清
中の１又は複数のサブユニット又はその分解断片の存在
の診断的測定において使用される。
精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定
のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化する
ために使用される。ファクターＶIIIＣはまた医療にお
いて使用される。さらに、この発明によって製造された
ポリペプチドは、ファクターＶIIIＣ、そのサブユニッ
ト及び断片に対するモノクローナル抗体を製造するため
に使用することができる。さらに、サブユニット及び断
片は試薬として使用される。この試薬はラベルされ、そ
して抗体と組合わせて生理的液体、例えば血液又は血清
中の１又は複数のサブユニット又はその分解断片の存在
の診断的測定において使用される。
【００６１】次に例によりこの発明をさらに具体的に説
明する。
明する。
【００６２】特にことわらない限りＡｂは抗体を意味
し、そしてＡｇは抗原を意味する。
し、そしてＡｇは抗原を意味する。
【００６３】
【実施例】Ｉ．ファクターＶIIIＣの精製 ａ）Ｅ.Ｇ.Ｄ. Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ、Ｎ.Ｃ. Ｔｒａｂ
ｏｌｄ、Ｊ.Ａ. Ｃｏllｉｎｓ及びＬ.Ｗ. Ｈｏｙｅｒ，
Ｊ．ｏｆＬａｂ．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ
（１９７９）９３：４０により最初に記載された方法に
よるポリクローナル抗ＶIIIＲ−セファロースカラムを
用いるイムノソルベントクロマトグラフィー；及びｂ）
Ｄ.Ｅ.Ｇ. Ａｕｓｔｅｎ，ＢｒｉｔｉｓｈＪ，ｏｆＨｅ
ｍｏｔｏｌｏｇｙ（１９７９）４３：６６９により最初
に記載されたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロ
マトグラフ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト
−ファクターＶIIIＣを単離した。
ｏｌｄ、Ｊ.Ａ. Ｃｏllｉｎｓ及びＬ.Ｗ. Ｈｏｙｅｒ，
Ｊ．ｏｆＬａｂ．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ
（１９７９）９３：４０により最初に記載された方法に
よるポリクローナル抗ＶIIIＲ−セファロースカラムを
用いるイムノソルベントクロマトグラフィー；及びｂ）
Ｄ.Ｅ.Ｇ. Ａｕｓｔｅｎ，ＢｒｉｔｉｓｈＪ，ｏｆＨｅ
ｍｏｔｏｌｏｇｙ（１９７９）４３：６６９により最初
に記載されたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロ
マトグラフ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト
−ファクターＶIIIＣを単離した。
【００６４】この方法の詳細を次に記載する。
【００６５】アトランティック・アンチボディー（Ａｔ
ｌａｎｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙ）から得られたヤギ抗−
ヒトファクターＶIII関連抗原（ＶIII：Ｒ）血清（カッ
トＮｏ.０４０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモ
ニウムカットで処理し、次にＤＥＡＥセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、又は同様の０−３３％カッ
トで処理し、次にクロマトグラフィーを行わなかった。
次にこれらの物質をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セファロ
ースＣＬ２Ｂ又は４Ｂ（ファルマシア，１７−０１４０
−０１又は１７−０４３０−０１）と接合せしめ、そし
てカラムに注入した（抗ＶIII：Ｒ−セファロースカラ
ム）。
ｌａｎｔｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙ）から得られたヤギ抗−
ヒトファクターＶIII関連抗原（ＶIII：Ｒ）血清（カッ
トＮｏ.０４０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモ
ニウムカットで処理し、次にＤＥＡＥセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、又は同様の０−３３％カッ
トで処理し、次にクロマトグラフィーを行わなかった。
次にこれらの物質をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セファロ
ースＣＬ２Ｂ又は４Ｂ（ファルマシア，１７−０１４０
−０１又は１７−０４３０−０１）と接合せしめ、そし
てカラムに注入した（抗ＶIII：Ｒ−セファロースカラ
ム）。
【００６６】“ＨＥＭＯＦＩＬ”、すなわち正常なヒト
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（フ
ァクターＶIII、ＡＦＨ、ＡＨＧ）の安定な乾燥標品
（ファクターＶIIIＣについて約４０倍に濃縮されてい
る）を、０.０２Ｍイミダゾール、０.１５ＭＮａＣｌ、
０.１Ｍリジン−ＨＣｌ、０.０２％ＮａＮ3を含むｐＨ
７.４の緩衝液に溶解した。
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（フ
ァクターＶIII、ＡＦＨ、ＡＨＧ）の安定な乾燥標品
（ファクターＶIIIＣについて約４０倍に濃縮されてい
る）を、０.０２Ｍイミダゾール、０.１５ＭＮａＣｌ、
０.１Ｍリジン−ＨＣｌ、０.０２％ＮａＮ3を含むｐＨ
７.４の緩衝液に溶解した。
【００６７】溶解した後、ＨＥＭＯＦＩＬを上記の抗Ｖ
III：Ｒ−セファロースカラムに適用した。非特異的に
結合した蛋白質を０.５ＭＮａＣｌに変性された上記の
緩衝液によって溶出した。次に、０.３５ＭＣａＣｌ2を
含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターＶIIIＣ活
性を安定化する１０％グリセリンを添加して、ファクタ
ーＶIIIＣを溶出した。イムノソルベントカラムからの
活性画分をプールし、緩衝液（０.０２Ｍイミダゾー
ル，０.１５ＭＮａＣｌ，０.１Ｍリジン−ＨＣｌ，０.
０２５ＭＣａＣｌ2，０.０２％ＮａＮ3，１０％グリセ
リン，ｐＨ７.４）に対して透析した。１,１００ユニッ
トのファクターＶIIIＣを含有する透析された画分のア
リコートを、上記の透析緩衝液で平衡化されたアミノヘ
キシル−セファロース４Ｂカラム（１×６ｃｍ）に適用
した。ファクターＶIIIＣを０.３５ＭＣａＣｌ2又は２
ＭＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で溶出した。５００ユ
ニット／ｍｌのファクターＶIIIＣを含有する２ｍｌの
容積中に活性が存在することが見出された。同様にして
行った後続の実験により、抗ＶIII：Ｒカラムにおける
２５％引きの収量及びアミノヘキシルカラムにおける約
９０％引きの収量が得られた。上記の方法に代えて、イ
ムノソルベントカラムから溶出され、プールされ、透析
された物質をまず、上記の透析緩衝溶で平衡化されたデ
キストランサルフェート（ファルマシア）カラムに適用
し、そして同じ緩衝液により溶出する。若干の微量汚染
物、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｉｇ
Ｇはカラム上に保持され、ファクターＶIIIＣは流過液
中に現われる。この液を集め、そして前記のアミノヘキ
シル−セファロースカラムに負荷する。
III：Ｒ−セファロースカラムに適用した。非特異的に
結合した蛋白質を０.５ＭＮａＣｌに変性された上記の
緩衝液によって溶出した。次に、０.３５ＭＣａＣｌ2を
含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターＶIIIＣ活
性を安定化する１０％グリセリンを添加して、ファクタ
ーＶIIIＣを溶出した。イムノソルベントカラムからの
活性画分をプールし、緩衝液（０.０２Ｍイミダゾー
ル，０.１５ＭＮａＣｌ，０.１Ｍリジン−ＨＣｌ，０.
０２５ＭＣａＣｌ2，０.０２％ＮａＮ3，１０％グリセ
リン，ｐＨ７.４）に対して透析した。１,１００ユニッ
トのファクターＶIIIＣを含有する透析された画分のア
リコートを、上記の透析緩衝液で平衡化されたアミノヘ
キシル−セファロース４Ｂカラム（１×６ｃｍ）に適用
した。ファクターＶIIIＣを０.３５ＭＣａＣｌ2又は２
ＭＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で溶出した。５００ユ
ニット／ｍｌのファクターＶIIIＣを含有する２ｍｌの
容積中に活性が存在することが見出された。同様にして
行った後続の実験により、抗ＶIII：Ｒカラムにおける
２５％引きの収量及びアミノヘキシルカラムにおける約
９０％引きの収量が得られた。上記の方法に代えて、イ
ムノソルベントカラムから溶出され、プールされ、透析
された物質をまず、上記の透析緩衝溶で平衡化されたデ
キストランサルフェート（ファルマシア）カラムに適用
し、そして同じ緩衝液により溶出する。若干の微量汚染
物、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｉｇ
Ｇはカラム上に保持され、ファクターＶIIIＣは流過液
中に現われる。この液を集め、そして前記のアミノヘキ
シル−セファロースカラムに負荷する。
【００６８】後続の測定により、精製されたファクター
ＶIIIＣ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原（ｃＡｇ）活性が存在し、ＨＥＭＯＦＩＬ中の４０倍
濃縮よりさらに５,０００倍濃縮されていることが示さ
れた。ゼネラル・ジアグノスティクス（Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製の市販の標準的３成分キッ
ト〔ＡＰＴＴ、ファクターＶIII欠損血漿、ペリファイ
・ノーマル・シトレート（ＶｅｒｉｆｙＮａｒｍａｌＣ
ｉｔｒａｔｅ）〕を用いて凝固測定を行った。ファクタ
ーＶIIIＣの高レベルの生物学的活性が示された。
ＶIIIＣ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原（ｃＡｇ）活性が存在し、ＨＥＭＯＦＩＬ中の４０倍
濃縮よりさらに５,０００倍濃縮されていることが示さ
れた。ゼネラル・ジアグノスティクス（Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製の市販の標準的３成分キッ
ト〔ＡＰＴＴ、ファクターＶIII欠損血漿、ペリファイ
・ノーマル・シトレート（ＶｅｒｉｆｙＮａｒｍａｌＣ
ｉｔｒａｔｅ）〕を用いて凝固測定を行った。ファクタ
ーＶIIIＣの高レベルの生物学的活性が示された。
【００６９】使用する抗体は阻害患者から得た。コート
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。
２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはＨＺａｂをＩ125でラベルし、ＥＬＩ
ＳＡ測定においてはＨＺａｂをホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合せしめる。ＲＩＡのた
めの125Ｉによる抗体ＨＺのラベル化はＨｕｎｔｅｒＷ.
Ｍ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｗｅｉｒ
Ｄ．Ｍ編，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｖｏｌ１，Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，オックスフォード，１９７８に従って行った。
ＨＲＰ−ＨＺ接合はＷｉｌｓｏｎ及びＮａｋａｎｅ，Ｉ
ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅａｎｄＲｅｌａｔ
ｅｄＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｋｎｏｐ
ｐ等編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎ
ｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ，アムステルダム，
１９７８，２１５−２２４頁に従って行った。ＬＺは７
００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの活性を有し、Ｈ
Ｚは１，５００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの活性
を有していた。コート抗体（ＬＺ）は、０.１ＭＮａＨ
ＣＯ3（ｐＨ９.８）中（ＲＩＡ）又は０．０５Ｍイミダ
ゾール，０.１ＭＮａＣｌ，０.０１Ｍチメロサール，
０.０５％トウィーン２０，５％ＢＳＡ中（ＥＬＩＳ
Ａ）、あるいは両方法のためにＰＢＳ−ＣＭＦ（１ｌに
つき、２００ｍｇＫＣｌ，２００ｍｇＫＨ2ＰＯ4，８.
０ｇＮａＣｌ，１.１５ｇ無水Ｎａ2ＨＰ０4，ｐＨ７.
４）中に３.５μｇ／ｍｌに溶解し、そして１ｍｌを各
チューブ（ポリスチレン）に加え、そして室温にて一夜
インキュベートした。この溶液を吸引除去し、そしてチ
ューブを０.０５％のトウィーン２０を含有する０.１５
ＭＮａＣｌ又はＰＢＳ−ＣＭＦ３〜３．５ｍｌで３回洗
浄した。サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノステ
ィクス、べリファイ・ノーマル・シトレート、カタログ
＃３４１１２）を稀釈し、そして全容量がチューブ当り
０.９ｍｌとなるようにチューブに加え、そして室温に
て一夜インキュベートする〔稀釈は、０.０２ＭＴｒｉ
ｓ，０.１５ＭＮａＣｌ，５％ＢＳＡ，０.０５％トウィ
ーン２０，００１％チメロサール，ｐＨ６.５（ＲＩＡ
のため）中に；又は０.０５Ｍイミダゾール，０.１ＭＮ
ａＣｌ，０.０１％チメロサール，０.０５％トウィーン
２０，５％ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡのため）中に；あるいは
ＰＢＳ−ＣＭＦ（両方法のため）中に行った〕。溶液を
吸引除去し、そしてチューブを上記のようにして洗浄し
た。ＲＩＡについては、６００μｌのＲＩＡ稀釈緩衝液
中ファクターＶIIIＣに対する125Ｉ−ラベル抗体（Ｈ
Ｚ）５×１０5ｃｐｍを各チューブに加え、このチュー
ブを３７℃にて１６〜１８時間インキュベートし、溶液
を除去し、チューブを上記のようにして洗浄し、そして
ガンマーカウンターにより計数した。ＥＬＩＳＡについ
ては、抗−ファクターＶIIIＣ（ＨＺ）に接合したパー
オキシダーゼ０.９ｍｌを各チューブに加え、次にこれ
を室温にて一夜インキュベートし、溶液を除去し、そし
てチューブを前記のようにして洗浄し、次に０.９ｍｌ
のＯＰＤ溶液（１００ｍｌについて、０.３７ｇクエン
酸，１.１９ｇ燐酸二ナトリウム，０.１５ｇo−フェニ
レンジアミン、ｐＨ５.０、使用直前に１０％Ｈ2０2を
２５０μｌ添加）を加え、そして暗中、室温にて３０分
間インキュベートした。この反応を停止するために０.
５ｍｌの６ＮＨＣｌ（又は０.９ｍｌの１ＭＨ2Ｓ０4）
を各チューブに加え、そしてＯＤ492を読み取った。 II．ファクターＶIIIＣ複合体の構造 Ａ．免疫沈澱実験 次の条件：０.１％インシュリン（安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として），０.２５ＭＣａＣｌ2，０.０１
％チオメロサール，０.０５Ｍイミダゾール，ｐＨ７.２
のもとで、精製されたファクターＶIIIＣ物質について
ＡｃＡ４４カラムを用いてゲル炉過実験を行った。溶出
液のファクターＶIIIＣ凝固活性及び抗原活性を監視し
た。２つの抗原ピークが観察された。ファクターＶIII
Ｃ凝固活性を有するものはこれらの条件下で約４６０,
０００の見かけ分子量を有する複合体として挙動した
（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪失している）は
６７,０００よりわずかに低い観察された分子量におい
て溶出した。
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。
２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはＨＺａｂをＩ125でラベルし、ＥＬＩ
ＳＡ測定においてはＨＺａｂをホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合せしめる。ＲＩＡのた
めの125Ｉによる抗体ＨＺのラベル化はＨｕｎｔｅｒＷ.
Ｍ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｗｅｉｒ
Ｄ．Ｍ編，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｖｏｌ１，Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，オックスフォード，１９７８に従って行った。
ＨＲＰ−ＨＺ接合はＷｉｌｓｏｎ及びＮａｋａｎｅ，Ｉ
ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅａｎｄＲｅｌａｔ
ｅｄＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｋｎｏｐ
ｐ等編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎ
ｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ，アムステルダム，
１９７８，２１５−２２４頁に従って行った。ＬＺは７
００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの活性を有し、Ｈ
Ｚは１，５００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの活性
を有していた。コート抗体（ＬＺ）は、０.１ＭＮａＨ
ＣＯ3（ｐＨ９.８）中（ＲＩＡ）又は０．０５Ｍイミダ
ゾール，０.１ＭＮａＣｌ，０.０１Ｍチメロサール，
０.０５％トウィーン２０，５％ＢＳＡ中（ＥＬＩＳ
Ａ）、あるいは両方法のためにＰＢＳ−ＣＭＦ（１ｌに
つき、２００ｍｇＫＣｌ，２００ｍｇＫＨ2ＰＯ4，８.
０ｇＮａＣｌ，１.１５ｇ無水Ｎａ2ＨＰ０4，ｐＨ７.
４）中に３.５μｇ／ｍｌに溶解し、そして１ｍｌを各
チューブ（ポリスチレン）に加え、そして室温にて一夜
インキュベートした。この溶液を吸引除去し、そしてチ
ューブを０.０５％のトウィーン２０を含有する０.１５
ＭＮａＣｌ又はＰＢＳ−ＣＭＦ３〜３．５ｍｌで３回洗
浄した。サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノステ
ィクス、べリファイ・ノーマル・シトレート、カタログ
＃３４１１２）を稀釈し、そして全容量がチューブ当り
０.９ｍｌとなるようにチューブに加え、そして室温に
て一夜インキュベートする〔稀釈は、０.０２ＭＴｒｉ
ｓ，０.１５ＭＮａＣｌ，５％ＢＳＡ，０.０５％トウィ
ーン２０，００１％チメロサール，ｐＨ６.５（ＲＩＡ
のため）中に；又は０.０５Ｍイミダゾール，０.１ＭＮ
ａＣｌ，０.０１％チメロサール，０.０５％トウィーン
２０，５％ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡのため）中に；あるいは
ＰＢＳ−ＣＭＦ（両方法のため）中に行った〕。溶液を
吸引除去し、そしてチューブを上記のようにして洗浄し
た。ＲＩＡについては、６００μｌのＲＩＡ稀釈緩衝液
中ファクターＶIIIＣに対する125Ｉ−ラベル抗体（Ｈ
Ｚ）５×１０5ｃｐｍを各チューブに加え、このチュー
ブを３７℃にて１６〜１８時間インキュベートし、溶液
を除去し、チューブを上記のようにして洗浄し、そして
ガンマーカウンターにより計数した。ＥＬＩＳＡについ
ては、抗−ファクターＶIIIＣ（ＨＺ）に接合したパー
オキシダーゼ０.９ｍｌを各チューブに加え、次にこれ
を室温にて一夜インキュベートし、溶液を除去し、そし
てチューブを前記のようにして洗浄し、次に０.９ｍｌ
のＯＰＤ溶液（１００ｍｌについて、０.３７ｇクエン
酸，１.１９ｇ燐酸二ナトリウム，０.１５ｇo−フェニ
レンジアミン、ｐＨ５.０、使用直前に１０％Ｈ2０2を
２５０μｌ添加）を加え、そして暗中、室温にて３０分
間インキュベートした。この反応を停止するために０.
５ｍｌの６ＮＨＣｌ（又は０.９ｍｌの１ＭＨ2Ｓ０4）
を各チューブに加え、そしてＯＤ492を読み取った。 II．ファクターＶIIIＣ複合体の構造 Ａ．免疫沈澱実験 次の条件：０.１％インシュリン（安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として），０.２５ＭＣａＣｌ2，０.０１
％チオメロサール，０.０５Ｍイミダゾール，ｐＨ７.２
のもとで、精製されたファクターＶIIIＣ物質について
ＡｃＡ４４カラムを用いてゲル炉過実験を行った。溶出
液のファクターＶIIIＣ凝固活性及び抗原活性を監視し
た。２つの抗原ピークが観察された。ファクターＶIII
Ｃ凝固活性を有するものはこれらの条件下で約４６０,
０００の見かけ分子量を有する複合体として挙動した
（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪失している）は
６７,０００よりわずかに低い観察された分子量におい
て溶出した。
【００７０】標準的分析用ＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ゲル
電気泳動〔Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）
２２７：６８０−６８５〕により分析した場合、２４
０、１６０、１４０、１１５、９２.５、８０及び７７
ｋｄの種々の蛋白質種が得られた。これらの蛋白質とフ
ァクターＶIIIＣとの関係を標準的免疫沈澱法により決
定した。この免疫沈澱法においては、遊離の125Ｉ−ラ
ベルファクターＶIIIＣから抗原−Ａｂ複合体を分離す
るために、アフィニティー精製された第２抗体（ヤギ抗
−マウスＩｇＧ又は抗−ヒトＩｇＧ）をコートしたポリ
スチレンビーズ〔１／８インチ、プレシジョン・プラス
チック・ボール社（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａｓｔｉｃ
ＢａｌｌＣｏ．）〕又はＳ.アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）蛋白質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂを使用した。
電気泳動〔Ｌｅａｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）
２２７：６８０−６８５〕により分析した場合、２４
０、１６０、１４０、１１５、９２.５、８０及び７７
ｋｄの種々の蛋白質種が得られた。これらの蛋白質とフ
ァクターＶIIIＣとの関係を標準的免疫沈澱法により決
定した。この免疫沈澱法においては、遊離の125Ｉ−ラ
ベルファクターＶIIIＣから抗原−Ａｂ複合体を分離す
るために、アフィニティー精製された第２抗体（ヤギ抗
−マウスＩｇＧ又は抗−ヒトＩｇＧ）をコートしたポリ
スチレンビーズ〔１／８インチ、プレシジョン・プラス
チック・ボール社（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａｓｔｉｃ
ＢａｌｌＣｏ．）〕又はＳ.アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）蛋白質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂを使用した。
【００７１】アフィニティーカラムから溶出した蛋白質
をヨウ素化し、そしてファクターＶIIIＣに特異的な抗
体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離
されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターＶIIIＣ
（Ｚ）及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称
される。
をヨウ素化し、そしてファクターＶIIIＣに特異的な抗
体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離
されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターＶIIIＣ
（Ｚ）及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称
される。
【００７２】この結果は、両抗体が７７／８０ｋｄダブ
レットと反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに２４
０ｋｄバンド強く反応し、そしてダブレットと２４０ｋ
ｄ種との間の複数のバンド（１６０、１４０、１１５、
９２.５ｋｄ）の弱い沈澱をもたらす。“Ｚ”抗体はま
た９２.５ｋｄ及び２４０ｋｄ蛋白質を沈澱せしめる。
“Ｅ”抗体と２４０ｋｄ種との強い反応は、この種がフ
ァクターＶIIIＣの前駆体であることを示唆する。
レットと反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに２４
０ｋｄバンド強く反応し、そしてダブレットと２４０ｋ
ｄ種との間の複数のバンド（１６０、１４０、１１５、
９２.５ｋｄ）の弱い沈澱をもたらす。“Ｚ”抗体はま
た９２.５ｋｄ及び２４０ｋｄ蛋白質を沈澱せしめる。
“Ｅ”抗体と２４０ｋｄ種との強い反応は、この種がフ
ァクターＶIIIＣの前駆体であることを示唆する。
【００７３】抗体カラムで精製したファクターＶIIIＣ
画分をヨウ素化し、そしてＨＧＴＡ〔エチレングリコー
ルビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，
Ｎ'，−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターＶIIIＣポリペプ
チドの会合における２価陽イオン、特にＣａ++の役割の
研究を可能にする。阻害抗体（Ｅ）は７７／８０ｋｄダ
ブレット、並びに１６０、１４０、１１５及び９２.５
ｋｄの一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察さ
れた。ダブレットは常に一層強いバンドの間に存在す
る。（この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用いて
行った。この方法は低いバックグラウンドをもたらし、
ファクターＶIIIＣ標品中のラベルされたＩｇＧは沈澱
しない。） ＥＧＴＡを含有させることにより高分子量バンド（９
２.５〜１６０ｋｄ）は消失するが、タブレットの沈澱
量は影響を受けない。イムノソルベントとしてセファロ
ースに結合したＺ抗体を使用して同様の実験を行った。
精製したファクターＶIIIＣをカラムに適用し、そして
７７／８０ｋｄを介して結合した後、ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）により９２.５ｋｄポリペプチドが
選択的に溶出する。この方法は９２.５ｋｄ種を分画調
製するために使用される。このイムノソルベントカラム
又はこれに類似するものはファクターＶIIIＣに対する
ポリクローナル抗体を用いて調製される。ＥＧＴＡの代
りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、例えばそれぞ
れチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶出する
場合、ファクターＶIIIＣはさらに精製される。これら
の結果は９２.５ｋｄペプチドがＣａ++橋を介して非共
有結合的に７７／８０ｋｄタブレットに会合しているこ
とを示唆する。より分子量の高いバンド（１１５ｋｄ、
１４０ｋｄ、１６０ｋｄ）はおそらく９２.５ｋｄの前
駆体であろう。このことは、９２.５ｋｄポリペプチド
に対するモノクローナル抗体の１１５ｋｄ、１４０ｋｄ
及び１６０ｋｄポリペプチドと交差反応する能力により
示される。
画分をヨウ素化し、そしてＨＧＴＡ〔エチレングリコー
ルビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ'，
Ｎ'，−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターＶIIIＣポリペプ
チドの会合における２価陽イオン、特にＣａ++の役割の
研究を可能にする。阻害抗体（Ｅ）は７７／８０ｋｄダ
ブレット、並びに１６０、１４０、１１５及び９２.５
ｋｄの一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察さ
れた。ダブレットは常に一層強いバンドの間に存在す
る。（この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用いて
行った。この方法は低いバックグラウンドをもたらし、
ファクターＶIIIＣ標品中のラベルされたＩｇＧは沈澱
しない。） ＥＧＴＡを含有させることにより高分子量バンド（９
２.５〜１６０ｋｄ）は消失するが、タブレットの沈澱
量は影響を受けない。イムノソルベントとしてセファロ
ースに結合したＺ抗体を使用して同様の実験を行った。
精製したファクターＶIIIＣをカラムに適用し、そして
７７／８０ｋｄを介して結合した後、ＥＤＴＡ（エチレ
ンジアミン四酢酸）により９２.５ｋｄポリペプチドが
選択的に溶出する。この方法は９２.５ｋｄ種を分画調
製するために使用される。このイムノソルベントカラム
又はこれに類似するものはファクターＶIIIＣに対する
ポリクローナル抗体を用いて調製される。ＥＧＴＡの代
りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、例えばそれぞ
れチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶出する
場合、ファクターＶIIIＣはさらに精製される。これら
の結果は９２.５ｋｄペプチドがＣａ++橋を介して非共
有結合的に７７／８０ｋｄタブレットに会合しているこ
とを示唆する。より分子量の高いバンド（１１５ｋｄ、
１４０ｋｄ、１６０ｋｄ）はおそらく９２.５ｋｄの前
駆体であろう。このことは、９２.５ｋｄポリペプチド
に対するモノクローナル抗体の１１５ｋｄ、１４０ｋｄ
及び１６０ｋｄポリペプチドと交差反応する能力により
示される。
【００７４】アフィニティーカラムからの種々の蛋白質
種の関係を、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ〔Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏl.（１９７５）６：
５１１〕の方法によって調製したモノクローナル抗体に
よる、ヨウ素化され、精製されたファクターＶIIIＣの
免疫沈澱により示した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを液相免疫
吸着されたファクターＶIIIＣにより免疫した。脾臓細
胞（１０8個）を１０11個のＮＳＯ又はＮＳＩマウス骨
髄腫細胞と融合させた。融合生成物を２枚の９６ウエル
ミクロタイタートレイにプレートした。脾臓細胞フィー
ダー層を１０4細胞／ウェルで使用した。コロニーは５
日目から顕微鏡観察でき、そして上清液は数日毎にＥＬ
ＩＳＡ法により測定した。次の層を使用した。第１層：
前記Ｉにおける、ヘキシル−セファロース４Ｂカラムか
ら溶出したファクターＶIIIＣ；第２層：ハイブリドー
マ細胞上清液；第３層：ホースラディッシュ・パーオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）−ラベルしたヤギ抗−マウスＩｇ
Ｇ；第４層：ＨＲＰ−基質。
種の関係を、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ〔Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏl.（１９７５）６：
５１１〕の方法によって調製したモノクローナル抗体に
よる、ヨウ素化され、精製されたファクターＶIIIＣの
免疫沈澱により示した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを液相免疫
吸着されたファクターＶIIIＣにより免疫した。脾臓細
胞（１０8個）を１０11個のＮＳＯ又はＮＳＩマウス骨
髄腫細胞と融合させた。融合生成物を２枚の９６ウエル
ミクロタイタートレイにプレートした。脾臓細胞フィー
ダー層を１０4細胞／ウェルで使用した。コロニーは５
日目から顕微鏡観察でき、そして上清液は数日毎にＥＬ
ＩＳＡ法により測定した。次の層を使用した。第１層：
前記Ｉにおける、ヘキシル−セファロース４Ｂカラムか
ら溶出したファクターＶIIIＣ；第２層：ハイブリドー
マ細胞上清液；第３層：ホースラディッシュ・パーオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）−ラベルしたヤギ抗−マウスＩｇ
Ｇ；第４層：ＨＲＰ−基質。
【００７５】モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同
定され、その２つはファクターＶIIIＣ凝固活性を阻害
した。クラスＩ抗体は８０／７７ｋｄタブレット及び２
４０ｋｄポリペプチドと反応し；そしてクラスII抗体は
２４０、１６０、１４０、１１５、９２.５ｋｄの蛋白
質と反応した。スロンビン消化したファクターＶIIIと
クラスＩモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した
７０／６７ｋｄタブレットが７７／８０ｋｄタブレット
に由来することを示す（下記参照のこと）。クラスIII
モノクローナル抗体は、１６０、１４０及び１１５ｋｄ
ペプチドが９２.５ｋｄペプチドの前駆体であることを
示す。クラスIIIのモノクローナル抗体はさらに、精製
されたファクターＶIIIＣ物質のスロンビン消化により
生成した４０ｋｄペプチドとも反応する。
定され、その２つはファクターＶIIIＣ凝固活性を阻害
した。クラスＩ抗体は８０／７７ｋｄタブレット及び２
４０ｋｄポリペプチドと反応し；そしてクラスII抗体は
２４０、１６０、１４０、１１５、９２.５ｋｄの蛋白
質と反応した。スロンビン消化したファクターＶIIIと
クラスＩモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した
７０／６７ｋｄタブレットが７７／８０ｋｄタブレット
に由来することを示す（下記参照のこと）。クラスIII
モノクローナル抗体は、１６０、１４０及び１１５ｋｄ
ペプチドが９２.５ｋｄペプチドの前駆体であることを
示す。クラスIIIのモノクローナル抗体はさらに、精製
されたファクターＶIIIＣ物質のスロンビン消化により
生成した４０ｋｄペプチドとも反応する。
【００７６】ファクターＶIIIＣ複合体中のＣａ++イオ
ンの役割を研究するため、ＥＧＴＡを用いて上記と同様
の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を用い
て、次の層によるＥＬＩＳＡ法に基いて行った。第１
層：単一特異性抗（マウスＩｇＧ）；第２層：クラスII
Iモノクローナル抗体（抗−９２.５ｋｄ）；第３層：精
製ファクターＶIIIＣ物質；第４層：７７／８０ｋｄに
対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。ＥＧＴＡの添加により、
キレート剤を用いない対照に存在する結合ＨＲＰ活性が
除去された。それぞれ７７／８０ｋｂダブレット及び９
２.５ｋｄ蛋白質に向けられたクラスＩ及びクラスIIIの
モノクローナル抗体がそれぞれファクターＶIIIＣ凝固
活性に対して阻害的である事実は、両者がファクターＶ
IIIＣ複合体の本質的構成成分であることを示唆してい
る。
ンの役割を研究するため、ＥＧＴＡを用いて上記と同様
の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を用い
て、次の層によるＥＬＩＳＡ法に基いて行った。第１
層：単一特異性抗（マウスＩｇＧ）；第２層：クラスII
Iモノクローナル抗体（抗−９２.５ｋｄ）；第３層：精
製ファクターＶIIIＣ物質；第４層：７７／８０ｋｄに
対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。ＥＧＴＡの添加により、
キレート剤を用いない対照に存在する結合ＨＲＰ活性が
除去された。それぞれ７７／８０ｋｂダブレット及び９
２.５ｋｄ蛋白質に向けられたクラスＩ及びクラスIIIの
モノクローナル抗体がそれぞれファクターＶIIIＣ凝固
活性に対して阻害的である事実は、両者がファクターＶ
IIIＣ複合体の本質的構成成分であることを示唆してい
る。
【００７７】Ｂ．ファクターＶIIIＣのスロンビンによ
る活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファク
ターＶIIIＣを、２種類の異るｐＨ条件（６.８及び７.
４）を用いて、スロンビン〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ），ロット＃１０７２３０２〕により活性化
した。
る活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファク
ターＶIIIＣを、２種類の異るｐＨ条件（６.８及び７.
４）を用いて、スロンビン〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ），ロット＃１０７２３０２〕により活性化
した。
【００７８】アリコートを凝固活性について測定し、そ
してさらに、サンプル（それぞれ約２.５ユニット）を
ゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験にお
いて、ＶIIIＣ活性は最初４６ユニット／ｍｌであっ
た。これを、ファクターＶIIIＣ緩衝液（２０ｍＭイミ
ダゾール，ｐＨ６.８，１５０ｍＭＮａＣｌ，１００ｍ
Ｍリジン，２５ｍＭＣａＣｌ2及び１０％グリセリン）
中に最終濃度１１.５ユニット／ｍｌに稀釈した。スロ
ンビンの最終濃度を０.１２ユニット／ｍｌ（ＶIIIＣの
１００凝固ユニット当り約１ユニットのスロンビン）と
した。この結果、凝固活性は約１８０ユニット／ｍｌに
上昇しそして約４０ユニット／ｍｌ（実質上出発値）に
低下し、これは９２.５ｋｄ種の量の同様な増加及び減
少に伴って生じた。従って、９２.５ｋｄ種は活性なフ
ァクターＶIIIＣ複合体の部分であることが示唆され
る。
してさらに、サンプル（それぞれ約２.５ユニット）を
ゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験にお
いて、ＶIIIＣ活性は最初４６ユニット／ｍｌであっ
た。これを、ファクターＶIIIＣ緩衝液（２０ｍＭイミ
ダゾール，ｐＨ６.８，１５０ｍＭＮａＣｌ，１００ｍ
Ｍリジン，２５ｍＭＣａＣｌ2及び１０％グリセリン）
中に最終濃度１１.５ユニット／ｍｌに稀釈した。スロ
ンビンの最終濃度を０.１２ユニット／ｍｌ（ＶIIIＣの
１００凝固ユニット当り約１ユニットのスロンビン）と
した。この結果、凝固活性は約１８０ユニット／ｍｌに
上昇しそして約４０ユニット／ｍｌ（実質上出発値）に
低下し、これは９２.５ｋｄ種の量の同様な増加及び減
少に伴って生じた。従って、９２.５ｋｄ種は活性なフ
ァクターＶIIIＣ複合体の部分であることが示唆され
る。
【００７９】製造的方法においてスロンビン活性化を用
いる目的で、一層濃縮されたファクターＶIIIＣ標品を
用いて追加の実験を行った。９２.５ｋｄポリペプチド
を生成せしめるため、１ユニットのスロンビン活性に対
して約１０００〜２０００凝固ユニットのファクターＶ
IIIＣの比率で、スロンビンを精製ファクターＶIIIＣ物
質に加え、そして短時間（ＦＥＭＯＦＩＬサンプルに依
存して５〜１５分間）のみ反応せしめた。次に、得られ
た生成物を７.５％調製用ゲルに適用し、そしてペプチ
ドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切り出し、そ
して電気溶出した。
いる目的で、一層濃縮されたファクターＶIIIＣ標品を
用いて追加の実験を行った。９２.５ｋｄポリペプチド
を生成せしめるため、１ユニットのスロンビン活性に対
して約１０００〜２０００凝固ユニットのファクターＶ
IIIＣの比率で、スロンビンを精製ファクターＶIIIＣ物
質に加え、そして短時間（ＦＥＭＯＦＩＬサンプルに依
存して５〜１５分間）のみ反応せしめた。次に、得られ
た生成物を７.５％調製用ゲルに適用し、そしてペプチ
ドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切り出し、そ
して電気溶出した。
【００８０】スロンビン消化を短時間行う場合、９２.
５ｋｄ種の量は２倍又は３倍になり、同時に、７７／８
０ｋｄダブレットは部分的にのみ６７／７０ｋｄ種に転
換される。６７／７０ｋｄダブレットを単離するための
条件を最適にするためには、より長時間（１時間以上）
のスロンビン消化を行う。この場合、９２.５ｋｄ種
は、さらに切断されてさらに小さい断片が生ずる。スロ
ンビン処理の後、２種類の新たなペプチドである５２.
５ｋｄ及び４０ｋｄペプチドが生ずる。４０ｋｄペプチ
ドは９２.５ｋｄ種に対するモノクローナル抗体と反応
し、従って切断生成物でなげればならない。５２.５ｋ
ｄペプチドも９２.５ｋｄ蛋白質に由来し、このこと
は、化学的及び酵素的切断パターンの比較により、すな
わち９２.５ｋｄ種及び５２.５ｋｄ種をＣＮＢｒ又はエ
ンドプロテイナーゼＬｙｓＣ切断にかけた場合に多数の
共通の断片が生ずる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）ことに
より証明される。
５ｋｄ種の量は２倍又は３倍になり、同時に、７７／８
０ｋｄダブレットは部分的にのみ６７／７０ｋｄ種に転
換される。６７／７０ｋｄダブレットを単離するための
条件を最適にするためには、より長時間（１時間以上）
のスロンビン消化を行う。この場合、９２.５ｋｄ種
は、さらに切断されてさらに小さい断片が生ずる。スロ
ンビン処理の後、２種類の新たなペプチドである５２.
５ｋｄ及び４０ｋｄペプチドが生ずる。４０ｋｄペプチ
ドは９２.５ｋｄ種に対するモノクローナル抗体と反応
し、従って切断生成物でなげればならない。５２.５ｋ
ｄペプチドも９２.５ｋｄ蛋白質に由来し、このこと
は、化学的及び酵素的切断パターンの比較により、すな
わち９２.５ｋｄ種及び５２.５ｋｄ種をＣＮＢｒ又はエ
ンドプロテイナーゼＬｙｓＣ切断にかけた場合に多数の
共通の断片が生ずる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）ことに
より証明される。
【００８１】エンドプロテイナーゼｌｙｓＣ消化のた
め、ｌｙｓＣと蛋白質との比率を約１：１〜１００、通
常は１：１０とする。この消化において、２０ｐモル
（４.８μｇ）のｌｙｓＣを、約１００μｌの０.０２５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.７，０.００１ＭＥＤＴ
Ａ，０.０８％ＳＤＳ中で２００ｐモル（１４μｇ）の
７０ｋｄポリペプチドと混合し、そして混合物を３７℃
にて６時間〜一夜インキュベートして消化を完結した。
ｌｙｓＣ消化生成物の単離のために、Ｏｒｓｔｅｎ，Ａ
ｎｎ．Ｎ.Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６４）１２
１：３２１−３４９のネイティブ・ポリアクリルアミド
ゲルを使用した。
め、ｌｙｓＣと蛋白質との比率を約１：１〜１００、通
常は１：１０とする。この消化において、２０ｐモル
（４.８μｇ）のｌｙｓＣを、約１００μｌの０.０２５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.７，０.００１ＭＥＤＴ
Ａ，０.０８％ＳＤＳ中で２００ｐモル（１４μｇ）の
７０ｋｄポリペプチドと混合し、そして混合物を３７℃
にて６時間〜一夜インキュベートして消化を完結した。
ｌｙｓＣ消化生成物の単離のために、Ｏｒｓｔｅｎ，Ａ
ｎｎ．Ｎ.Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６４）１２
１：３２１−３４９のネイティブ・ポリアクリルアミド
ゲルを使用した。
【００８２】Ｃ．ゲル単離したＶIIIＣ関連蛋白質のス
ロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、調製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかげた。結
果は次の通りであった。
ロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、調製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかげた。結
果は次の通りであった。
【００８３】１．２４０ｋｄ蛋白質は１６０、１４０、
１１５、９２.５ｋｄを含む多数のバンドを生成する
が、一層小分子量のバンド、すなわち７７／８０ｋｄ又
は６７／７０ｋｄタブレットを生成しない。さらに、２
４０ｋｄ断片を経時消化し、そしてゲル電気泳動パター
ン、凝固活性、及びファクターＶIIIＣ抗原（Ｃａｇ）
活性について分析した。ゲルパターンの結果は上記と同
様であり、そしてＣａｇ活性又は凝固活性は実質上回収
されなかった。
１１５、９２.５ｋｄを含む多数のバンドを生成する
が、一層小分子量のバンド、すなわち７７／８０ｋｄ又
は６７／７０ｋｄタブレットを生成しない。さらに、２
４０ｋｄ断片を経時消化し、そしてゲル電気泳動パター
ン、凝固活性、及びファクターＶIIIＣ抗原（Ｃａｇ）
活性について分析した。ゲルパターンの結果は上記と同
様であり、そしてＣａｇ活性又は凝固活性は実質上回収
されなかった。
【００８４】２．１６０ｋｄ及び９２.５ｋｄゲル分離
ポリペプチドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質
ではないようである。 ３．スロンビンはゲル分離され
た７７ｋｄ及び８０ｋｄ種を、それぞれ６７ｋｄ及び７
０ｋｄの新たなポリペプチドに特異的に切断する。スロ
ンビン処理の後、クラスＩのモノクローナル抗体は７７
／８０ｋｄダブレットのみならず新たな６７及び７０ｋ
ｄ種も沈澱せしめる。
ポリペプチドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質
ではないようである。 ３．スロンビンはゲル分離され
た７７ｋｄ及び８０ｋｄ種を、それぞれ６７ｋｄ及び７
０ｋｄの新たなポリペプチドに特異的に切断する。スロ
ンビン処理の後、クラスＩのモノクローナル抗体は７７
／８０ｋｄダブレットのみならず新たな６７及び７０ｋ
ｄ種も沈澱せしめる。
【００８５】Ｄ．アミノ酸配列分析 調製用ＳＤＳ電気泳動により単離された６７／７０ｋｄ
ペプチド、７７／８０ｋｄペプチド、及び５２．５ｋｄ
ペプチドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配
列情報を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と
相まって、７７／８０ｋｄ、６７／７０ｋｄ、９２．５
ｋｄ及び５２．５ｋｄポリペプチドが９５％以上、通常
は９８％の純度で得られたことを示した。ゲル単離され
たペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライド・ビ
オシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）〕に適用した。ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰＬＣカラム
（ＩＢＭシアノ，２５cm）に適用し、そして得られたク
ロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。６７／７０
ｋｄダブレットのアミノ端（配列表Ｂ中棒により示す）
について次の配列が決定された。
ペプチド、７７／８０ｋｄペプチド、及び５２．５ｋｄ
ペプチドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配
列情報を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と
相まって、７７／８０ｋｄ、６７／７０ｋｄ、９２．５
ｋｄ及び５２．５ｋｄポリペプチドが９５％以上、通常
は９８％の純度で得られたことを示した。ゲル単離され
たペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライド・ビ
オシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）〕に適用した。ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰＬＣカラム
（ＩＢＭシアノ，２５cm）に適用し、そして得られたク
ロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。６７／７０
ｋｄダブレットのアミノ端（配列表Ｂ中棒により示す）
について次の配列が決定された。
【００８６】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ? Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met ６７／７０ｋｄ蛋白質のＮ−端領域のアミノ酸配列によ
り得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブラリーの
スクリーニングに使用するために次のオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成した。Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ等，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）
８０：７４６１−７４６５に記載されているホスホラミ
デート法を使用した。
り得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブラリーの
スクリーニングに使用するために次のオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成した。Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ等，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）
８０：７４６１−７４６５に記載されているホスホラミ
デート法を使用した。
【００８７】 次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配列の領域のス
キームを示す。
キームを示す。
【００８８】
【化１】
【００８９】後記のように９２．５ｋｄ蛋白質に由来す
る５２．５ｋｄ蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ
酸配列が決定された。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp ? Gly 23 24 25 26 Glu Leu Pro Val ５２．５ｋｄペプチドのアミノ酸配列に基いて、次のヌ
クレオチド配列（コード配列）を有する部分変性プロー
ブを合成した。 このプローブは、ゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライ
ブラリーの両者をスクリーニングするために有用であ
る。
る５２．５ｋｄ蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ
酸配列が決定された。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp ? Gly 23 24 25 26 Glu Leu Pro Val ５２．５ｋｄペプチドのアミノ酸配列に基いて、次のヌ
クレオチド配列（コード配列）を有する部分変性プロー
ブを合成した。 このプローブは、ゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライ
ブラリーの両者をスクリーニングするために有用であ
る。
【００９０】７７／８０ｋｄダブレットをエンドプロテ
イナーゼＬｙｓ Ｃ（べーリンガーマンハイム）によっ
て消化することにより得られた２種類のペプチドのアミ
ノ酸配列を決定した。次のようにして消化を行った。７
７／８０ｋｄダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上
で電気泳動し、そしてダブレットに対応するバンドを電
気溶出した。分離された物質を精製し、エンドプロテイ
ナーゼＬｙｓ Ｃにより消化し、そして生成したペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０ｎｍでの吸光
ピークに対応する画分を、自動シーケンサー（アプライ
ド・ビオシステムス，フォスターシティー，カリホルニ
ア，モデルＡ７０Ａ）を用いて配列決定した。第１配列
は次の通りであった。
イナーゼＬｙｓ Ｃ（べーリンガーマンハイム）によっ
て消化することにより得られた２種類のペプチドのアミ
ノ酸配列を決定した。次のようにして消化を行った。７
７／８０ｋｄダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上
で電気泳動し、そしてダブレットに対応するバンドを電
気溶出した。分離された物質を精製し、エンドプロテイ
ナーゼＬｙｓ Ｃにより消化し、そして生成したペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０ｎｍでの吸光
ピークに対応する画分を、自動シーケンサー（アプライ
ド・ビオシステムス，フォスターシティー，カリホルニ
ア，モデルＡ７０Ａ）を用いて配列決定した。第１配列
は次の通りであった。
【００９１】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
【００９２】 第２ペプチドは次の配列を有していた。
【００９３】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
【００９４】 さらに、７７／８０ｋｄダブレットをトリプシンにより
消化した。ダブレット物質を、エンドプロテイナーゼＬ
ｙｓ Ｃによる消化について上記したのと同様にして精
製し、リジンをシトラコニル化（ｃｉｔｒａｃｏｎｙｌ
ａｔｉｏｎ）によりブロックしてアルギニンにおいての
み消化されるようにした。シトラコニル化は、蛋白質を
変性緩衝液に懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそして
カルボキシメチル化し、そしてｐＨを８．５〜９．０に
保持しながら無水シトラコン酸で処理した。シトラコニ
ル化した後、蛋白質をトリプシンで消化し、そして生成
したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０ｎ
ｍにおける吸光ピークに対応する画分を上記のようにし
て配列決定した。配列を次に示す。
消化した。ダブレット物質を、エンドプロテイナーゼＬ
ｙｓ Ｃによる消化について上記したのと同様にして精
製し、リジンをシトラコニル化（ｃｉｔｒａｃｏｎｙｌ
ａｔｉｏｎ）によりブロックしてアルギニンにおいての
み消化されるようにした。シトラコニル化は、蛋白質を
変性緩衝液に懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそして
カルボキシメチル化し、そしてｐＨを８．５〜９．０に
保持しながら無水シトラコン酸で処理した。シトラコニ
ル化した後、蛋白質をトリプシンで消化し、そして生成
したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０ｎ
ｍにおける吸光ピークに対応する画分を上記のようにし
て配列決定した。配列を次に示す。
【００９５】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Met Gly Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。 ８０及び７７ｋｄ種のＮ−端配列を決定するための方法
を実施した際、これらのアミノ端がブロックされている
ことが見出された。従って、Ｎ−端配列は他の精製法に
より得られた物質から決定した。この精製法はイムノア
フィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマ
トグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いない。８０／７７ｋｄダブ
レットの精製を、ファクターＶIIIＣ濃縮物をモノクロ
ーナル抗体カラムに適用し、次にｍｏｎｏ Ｓ陽イオン
交換体でクロマトグラフ処理することにより行った。こ
の物質はブロックされていないＮ−端を有し、ゲルろ過
された８０／７７ｋｄ中に検出されるブロックはゲル電
気泳動により生ずる人為的なものであることが示され
た。８０及び７７ｋｄ種について決定されたアミノ端配
列は次の通りである（配列表Ｂ中棒で示す）。
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。 ８０及び７７ｋｄ種のＮ−端配列を決定するための方法
を実施した際、これらのアミノ端がブロックされている
ことが見出された。従って、Ｎ−端配列は他の精製法に
より得られた物質から決定した。この精製法はイムノア
フィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマ
トグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いない。８０／７７ｋｄダブ
レットの精製を、ファクターＶIIIＣ濃縮物をモノクロ
ーナル抗体カラムに適用し、次にｍｏｎｏ Ｓ陽イオン
交換体でクロマトグラフ処理することにより行った。こ
の物質はブロックされていないＮ−端を有し、ゲルろ過
された８０／７７ｋｄ中に検出されるブロックはゲル電
気泳動により生ずる人為的なものであることが示され
た。８０及び７７ｋｄ種について決定されたアミノ端配
列は次の通りである（配列表Ｂ中棒で示す）。
【００９６】 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Glu Ile Thr ? ? ? Leu Gln ? Asp 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Gln Glu Glu Ile Asp Tyr ? Asp Asp Ile Ｅ．アミノ酸組成 ７７／８０ｋｄペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法
により、次のように決定した。 Ｆ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製 ＧＭ１４１６細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト
−リンパ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から
約３ｍｇのＤＮＡを調製した。
により、次のように決定した。 Ｆ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製 ＧＭ１４１６細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト
−リンパ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から
約３ｍｇのＤＮＡを調製した。
【００９７】このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ ３Ａにより
部分消化し、そして消化されたＤＮＡ（４００〜５００
μｇ）を１０％〜４０％シュークロースグラジエント上
で画分した。１０〜２５ｋｂのサイズの範囲の画分をプ
ールし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で透析し、そしてＳｃｈ
ｌｉｅｃｈｅｒ及びＳｃｈｅｕｌｌのＥｌｕｔｉｐ−ｄ
無菌ジスポーサブルカラムで精製した。このＤＮＡの
アリコートをＥＭＢＬ−４アーム（Ｂａｍ ＨＩ及びＳ
ａｌ Ｉで消化しそしてグラジエント上で単離すること
により得られる）に連結し、そして次に１×１０6ｐｆ
ｕ／μｇのＤＮＡ挿入効率をもってバクテリオファージ
λにパッケージした。使用したベクターＥＭＢＬ−４は
バクテリオファージλの変形物である〔Ｋａｒｎ等，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１０１：
３−１９を参照のこと〕。全ライブラリーは５×１０6
個のファージから成る。
部分消化し、そして消化されたＤＮＡ（４００〜５００
μｇ）を１０％〜４０％シュークロースグラジエント上
で画分した。１０〜２５ｋｂのサイズの範囲の画分をプ
ールし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で透析し、そしてＳｃｈ
ｌｉｅｃｈｅｒ及びＳｃｈｅｕｌｌのＥｌｕｔｉｐ−ｄ
無菌ジスポーサブルカラムで精製した。このＤＮＡの
アリコートをＥＭＢＬ−４アーム（Ｂａｍ ＨＩ及びＳ
ａｌ Ｉで消化しそしてグラジエント上で単離すること
により得られる）に連結し、そして次に１×１０6ｐｆ
ｕ／μｇのＤＮＡ挿入効率をもってバクテリオファージ
λにパッケージした。使用したベクターＥＭＢＬ−４は
バクテリオファージλの変形物である〔Ｋａｒｎ等，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１０１：
３−１９を参照のこと〕。全ライブラリーは５×１０6
個のファージから成る。
【００９８】Ｇ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーのプレー
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリＤＰ５０株に吸着せし
め、そして２０枚のプレートにプレート（大きさ１５０
×１５ｍｍ）当り５０，０００ｐｆｕとしてプレーティ
ングし、合計１×１０6ｐｆｕとした。（プレート、上
層寒天、及びプレーティングの詳細な技法は、Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ，ニューヨーク，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ中に記載されている。） ニトロセルロースフィルターを、ファージプラークを有
する各プレートの表面に２回適用し（こうしてパッケー
ジされていないＤＮＡの分子をフィルターに移す）、そ
して32Ｐ一ラベルされた２５６倍の４８マープローブＤ
ＮＡ（プロ一ブ＃４）とハイブリダイズせしめた。（ニ
トロセルロース移行法の詳細はＭａｎｉａｔｉｓ等、前
掲，に記載されている。）前−ハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションはＷａｌｌａｃｅミックス
（１ｌ中に３１０ｍｌの蒸留水，２００ｍｌの５０％デ
キストランサルフェート，１８０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ８．２，２２５ｍｌの４Ｍ ＮａＣｌ，
２０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ，５０ｍｌの１００×
Ｄｅｎｈａｒｔ溶液，５ｍｌの１００％ＮＰ−４０，及
び１０ｍｌの１０％ＳＤＳを含む）中で行った。
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリＤＰ５０株に吸着せし
め、そして２０枚のプレートにプレート（大きさ１５０
×１５ｍｍ）当り５０，０００ｐｆｕとしてプレーティ
ングし、合計１×１０6ｐｆｕとした。（プレート、上
層寒天、及びプレーティングの詳細な技法は、Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ，ニューヨーク，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ中に記載されている。） ニトロセルロースフィルターを、ファージプラークを有
する各プレートの表面に２回適用し（こうしてパッケー
ジされていないＤＮＡの分子をフィルターに移す）、そ
して32Ｐ一ラベルされた２５６倍の４８マープローブＤ
ＮＡ（プロ一ブ＃４）とハイブリダイズせしめた。（ニ
トロセルロース移行法の詳細はＭａｎｉａｔｉｓ等、前
掲，に記載されている。）前−ハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションはＷａｌｌａｃｅミックス
（１ｌ中に３１０ｍｌの蒸留水，２００ｍｌの５０％デ
キストランサルフェート，１８０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ８．２，２２５ｍｌの４Ｍ ＮａＣｌ，
２０ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ，５０ｍｌの１００×
Ｄｅｎｈａｒｔ溶液，５ｍｌの１００％ＮＰ−４０，及
び１０ｍｌの１０％ＳＤＳを含む）中で行った。
【００９９】プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを触媒として用いて、γーＡＴＰ 32から各ＤＮＡ分子
の５’ホスフェート端に32ＰＯ4を酵素的に移行せしめ
ることによりラべルした。ハイブリダイゼーションの条
件は次の通りとした。１０ｍｌのハイブリダイゼーショ
ン混合物／フィルター×５０００ｃｐｍのラベル化プロ
ーブ＃４（変性）／ｍｌ。ハイブリダイゼーションは３
７℃にて一夜行った。フィルターを、６×ＳＳＣ，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中、５０〜５５℃にて洗浄し、空気乾燥
し、そしてＸ線フィルムに暴露した。
ゼを触媒として用いて、γーＡＴＰ 32から各ＤＮＡ分子
の５’ホスフェート端に32ＰＯ4を酵素的に移行せしめ
ることによりラべルした。ハイブリダイゼーションの条
件は次の通りとした。１０ｍｌのハイブリダイゼーショ
ン混合物／フィルター×５０００ｃｐｍのラベル化プロ
ーブ＃４（変性）／ｍｌ。ハイブリダイゼーションは３
７℃にて一夜行った。フィルターを、６×ＳＳＣ，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中、５０〜５５℃にて洗浄し、空気乾燥
し、そしてＸ線フィルムに暴露した。
【０１００】Ｈ．陽性クローンの特徴付け 第１回スクリーニングにおいて陽性であった２３個のプ
ラークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハ
イブリダイズせしめた（第２回）。１１個の陽性プラー
クを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブ
リダイズせしめた（第３回）。８個の陽性プラークを分
離し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ１００ｍｌず
つの液体培養）。これら８個のクローンのそれぞれに対
応するＤＮＡをＥｃｏ ＲＩで消化し（挿入されたヒト
−ゲノムＤＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめ
るため）、そして生成した断片を０．８％アガロースゲ
ル上での電気泳動によりサイズに従って分離し、変性
し、そしてニトロセルロースに移した。これを４通り行
い、そして各フィルターを32Ｐ一ラべルプローブ＃１、
２、３又は４とハイブリダイズせしめた。フィルターを
Ｘ線フィルムに暴露し、そして約４．４ｋｄサイズの単
一バンドが４種類のすべてのプローブとハイブリダイズ
することが、２個のクローンについて見出された。これ
ら２個のクローンは、１方が他方に比べて大きなＤＮＡ
挿入部を有する点を除き同一であった（１５．２１ｋｂ
の大挿入部を有するクローンを２３Ｄと称し、約１３ｋ
ｂの小挿入部を有するクローンを１１と称する）。４．
４ｋｂのゲル単離されたＥｃｏ ＲＩ断片をベクターＭ
１３及びｐＵＣ−９（ｐＢＲ３２２の誘導体）中にサブ
クローン化した。プライマーとして合成プローブ＃３及
びその逆相補体を用いてＭ１３ＤＮＡ上でジデオキシ法
によりＤＮＡ配列の決定を行った。
ラークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハ
イブリダイズせしめた（第２回）。１１個の陽性プラー
クを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブ
リダイズせしめた（第３回）。８個の陽性プラークを分
離し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ１００ｍｌず
つの液体培養）。これら８個のクローンのそれぞれに対
応するＤＮＡをＥｃｏ ＲＩで消化し（挿入されたヒト
−ゲノムＤＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめ
るため）、そして生成した断片を０．８％アガロースゲ
ル上での電気泳動によりサイズに従って分離し、変性
し、そしてニトロセルロースに移した。これを４通り行
い、そして各フィルターを32Ｐ一ラべルプローブ＃１、
２、３又は４とハイブリダイズせしめた。フィルターを
Ｘ線フィルムに暴露し、そして約４．４ｋｄサイズの単
一バンドが４種類のすべてのプローブとハイブリダイズ
することが、２個のクローンについて見出された。これ
ら２個のクローンは、１方が他方に比べて大きなＤＮＡ
挿入部を有する点を除き同一であった（１５．２１ｋｂ
の大挿入部を有するクローンを２３Ｄと称し、約１３ｋ
ｂの小挿入部を有するクローンを１１と称する）。４．
４ｋｂのゲル単離されたＥｃｏ ＲＩ断片をベクターＭ
１３及びｐＵＣ−９（ｐＢＲ３２２の誘導体）中にサブ
クローン化した。プライマーとして合成プローブ＃３及
びその逆相補体を用いてＭ１３ＤＮＡ上でジデオキシ法
によりＤＮＡ配列の決定を行った。
【０１０１】４．４ｋｂ断片の部分配列を次のように決
定した。この配列は（ ）で示すプローブ＃４の配列、
及び〔 〕で示すはじめに決定された６７／７０ｋｄ断
片の部分アミノ酸配列を含む。
定した。この配列は（ ）で示すプローブ＃４の配列、
及び〔 〕で示すはじめに決定された６７／７０ｋｄ断
片の部分アミノ酸配列を含む。
【０１０２】
【化２】
【０１０３】従って、このクローンは７７／８０ｋｄダ
ブレット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は
前記のごとくヒト−ファクターＶIIIＣ複合体に部分的
に対応する。
ブレット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は
前記のごとくヒト−ファクターＶIIIＣ複合体に部分的
に対応する。
【０１０４】クローン２３ＤをＥｃｏ ＲＩ断片として
ファージＭ１３中にサブクローン化し、そして挿入され
たヒトＤＮＡに対応する配列を決定した。クローン２３
Ｄの完全な１５．１２１ｋｂ配列を第１表（配列表Ａ）
に示す。サブクローンの名称が配列の右側の欄外に示さ
れており、３’−方向に伸びるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
を示している。３．１１０ｋｂのオープンリーディング
フレームが７０−３断片の３’−末端から４．４ｋｂ断
片の中間にわたって存在することが見出された。従っ
て、このオープンリーディングフレームは７７／８０ｋ
ｂダブレット蛋白質のコード領域の少なくとも部分を含
む。
ファージＭ１３中にサブクローン化し、そして挿入され
たヒトＤＮＡに対応する配列を決定した。クローン２３
Ｄの完全な１５．１２１ｋｂ配列を第１表（配列表Ａ）
に示す。サブクローンの名称が配列の右側の欄外に示さ
れており、３’−方向に伸びるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
を示している。３．１１０ｋｂのオープンリーディング
フレームが７０−３断片の３’−末端から４．４ｋｂ断
片の中間にわたって存在することが見出された。従っ
て、このオープンリーディングフレームは７７／８０ｋ
ｂダブレット蛋白質のコード領域の少なくとも部分を含
む。
【０１０５】Ｉ．ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの比較 ３個のｃＤＮＡクローンを次のようにして得た。クロー
ンＣ１は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをクローン２
３Ｄの４．４ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩ断片から構成したプロ
ーブでスクリーニングすることにより得た。クローンＣ
２もまた、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを４．４ｋｂ
プローブでスクリーニングすることにより得た。クロー
ン２−１１は、ヒト腎臓細胞をクローン２３Ｄのオープ
ンリーディングフレームの３’−末端に見出されるＤＮ
Ａ配列（配列表Ａのヌクレオチド９３９１〜９４３５）
に基く合成４５−マープローブでスクリーニングするこ
とによって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列
から成る。
ンＣ１は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをクローン２
３Ｄの４．４ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩ断片から構成したプロ
ーブでスクリーニングすることにより得た。クローンＣ
２もまた、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを４．４ｋｂ
プローブでスクリーニングすることにより得た。クロー
ン２−１１は、ヒト腎臓細胞をクローン２３Ｄのオープ
ンリーディングフレームの３’−末端に見出されるＤＮ
Ａ配列（配列表Ａのヌクレオチド９３９１〜９４３５）
に基く合成４５−マープローブでスクリーニングするこ
とによって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列
から成る。
【０１０６】 クローンを配列決定し、そしてクローン２３Ｄのゲノム
ＤＮＡに対するこれらｃＤＮＡクローンの位置を、配列
を比較することによって決定した。３０４ｂｐの長さを
有するクローンＣＩは配列表Ａ中の番号におけるヌクレ
オチド７７７３から８０７７までのオープンリーディン
グフレームに重なる。８７８ｂｐの長さを有するクロー
ンＣ２はオープンリーディングフレームの３’−端と部
分的に重り、ヌクレオチド９５３８から始まりそしてオ
ープンリーディングフレーム３’−端にあるヌクレオチ
ド９４９７を越えて伸びる。５７２ｂｐの長さを有する
クローン２−１１もオプーンリーディングフレームの
３’−端と重なり、ヌクレオチド９１９０から始まりそ
してその末端を越えて伸びる。これらの知見はオープン
リーディングフレームが転写されることを確認するもの
である。
ＤＮＡに対するこれらｃＤＮＡクローンの位置を、配列
を比較することによって決定した。３０４ｂｐの長さを
有するクローンＣＩは配列表Ａ中の番号におけるヌクレ
オチド７７７３から８０７７までのオープンリーディン
グフレームに重なる。８７８ｂｐの長さを有するクロー
ンＣ２はオープンリーディングフレームの３’−端と部
分的に重り、ヌクレオチド９５３８から始まりそしてオ
ープンリーディングフレーム３’−端にあるヌクレオチ
ド９４９７を越えて伸びる。５７２ｂｐの長さを有する
クローン２−１１もオプーンリーディングフレームの
３’−端と重なり、ヌクレオチド９１９０から始まりそ
してその末端を越えて伸びる。これらの知見はオープン
リーディングフレームが転写されることを確認するもの
である。
【０１０７】４．４ｋｂオープンリーディングフレーム
からのコード情報をクローン２−１１及びＣ２からの追
加のコード情報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべての
コード配列に対応する３．８４１ｋｂの配列を調製しそ
して伸ばすことができる。Ｃ１、Ｃ２、及びＣ２−１１
プローブに対応する領域を枠で囲んである。
からのコード情報をクローン２−１１及びＣ２からの追
加のコード情報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべての
コード配列に対応する３．８４１ｋｂの配列を調製しそ
して伸ばすことができる。Ｃ１、Ｃ２、及びＣ２−１１
プローブに対応する領域を枠で囲んである。
【０１０８】ファクターＶIIIＣを製造するために、ク
ローン２３又はクロ−ン１１からのＤＮＡ配列を、Ｌａ
ｕｂ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）４８：２７
１により記載されているようにＳＶ−４０プロモーター
に挿入してＳＶ−４０初期プロモーターの制御のもとに
おく。得られた組換プラスミドをＣＯＳ細胞（Ｇｕｚｍ
ａｎ，前揚）にトランスフェクトする。この方法に代え
て、コード配列を、Ｍａｌｏｎｅｙネズミサルコーマウ
イルスの長ターミナルレピートが挿入されているｐＢＲ
３２２のごときプラスミドに挿入し、クローン２３又は
１１の配列をウイルス性制御系の転写制御のもとにおく
ことができる。次に、構成物を３Ｔ３マウス線維芽球に
導入して効率的に発現せしめることができる（Ｐｅｒｋ
ｉｎｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３年７月，Ｖｏｌ ３，
Ｎｏ．６，１１２３頁を参照のこと）。
ローン２３又はクロ−ン１１からのＤＮＡ配列を、Ｌａ
ｕｂ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８３）４８：２７
１により記載されているようにＳＶ−４０プロモーター
に挿入してＳＶ−４０初期プロモーターの制御のもとに
おく。得られた組換プラスミドをＣＯＳ細胞（Ｇｕｚｍ
ａｎ，前揚）にトランスフェクトする。この方法に代え
て、コード配列を、Ｍａｌｏｎｅｙネズミサルコーマウ
イルスの長ターミナルレピートが挿入されているｐＢＲ
３２２のごときプラスミドに挿入し、クローン２３又は
１１の配列をウイルス性制御系の転写制御のもとにおく
ことができる。次に、構成物を３Ｔ３マウス線維芽球に
導入して効率的に発現せしめることができる（Ｐｅｒｋ
ｉｎｓ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｏｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３年７月，Ｖｏｌ ３，
Ｎｏ．６，１１２３頁を参照のこと）。
【０１０９】
【発明の効果】上記の結果は、ファクターＶIIIＣ複合
体のサブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離され
たことを示す。このゲノムＤＮＡを使用することによ
り、ＤＮＡをさらに操作してファクターＶIIIＣ複合体
サブユニットをコードする配列を得ることができる。次
に、このＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクター
ＶIIIＣサブユニットを製造することができ、これを種
々の方法で、例えば診断測定のための試薬として、療法
剤として、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体
の製造のために使用することができ、これらの抗体は次
にファクターＶIIIＣ複合体の製造のため、又は他の目
的のために使用することができる。ゲノムＤＮＡ配列は
また、プロ−ファクターＶIIIＣをコードするｍＲＮＡ
の単離のために使用して、前駆体蛋白質を得ることがで
きる。次にこの蛋白質は生体内プロセシングのために用
いることができる。
体のサブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離され
たことを示す。このゲノムＤＮＡを使用することによ
り、ＤＮＡをさらに操作してファクターＶIIIＣ複合体
サブユニットをコードする配列を得ることができる。次
に、このＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクター
ＶIIIＣサブユニットを製造することができ、これを種
々の方法で、例えば診断測定のための試薬として、療法
剤として、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体
の製造のために使用することができ、これらの抗体は次
にファクターＶIIIＣ複合体の製造のため、又は他の目
的のために使用することができる。ゲノムＤＮＡ配列は
また、プロ−ファクターＶIIIＣをコードするｍＲＮＡ
の単離のために使用して、前駆体蛋白質を得ることがで
きる。次にこの蛋白質は生体内プロセシングのために用
いることができる。
【０１１０】この発明の方法は、６７／７０ｋｄダブレ
ットをコードする配列の５’−端に又はそれに隣接して
いる特異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異
的配列はまた、７７／８０ｋｄダブレットのコード配列
中５’−端から約２００〜４００塩基、さらに正確には
約２７５〜３２５塩基下流に存在する。
ットをコードする配列の５’−端に又はそれに隣接して
いる特異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異
的配列はまた、７７／８０ｋｄダブレットのコード配列
中５’−端から約２００〜４００塩基、さらに正確には
約２７５〜３２５塩基下流に存在する。
【０１１１】なお、１４．４３ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含
有するバクテリオファージλＦＶIII ２３Ｄは１９８４
年１月４日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に、Ｎｏ．４００９４と
して寄託された。
有するバクテリオファージλＦＶIII ２３Ｄは１９８４
年１月４日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に、Ｎｏ．４００９４と
して寄託された。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
【表５】
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
【表９】
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】
【表１１】
【０１２３】
【表１２】
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】
【表１４】
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
【表１６】
【０１２８】
【表１７】
【０１２９】
【表１８】
【０１３０】
【表１９】
【０１３１】
【表２０】
【０１３２】
【表２１】
【０１３３】
【表２２】
【０１３４】
【表２３】
【０１３５】
【表２４】
【０１３６】
【表２５】
【０１３７】
【表２６】
【０１３８】
【表２７】
【０１３９】
【表２８】
【０１４０】
【表２９】
【０１４１】
【表３０】
【０１４２】
【表３１】
【０１４３】
【表３２】
【０１４４】
【表３３】
【０１４５】
【表３４】
【０１４６】
【表３５】
【０１４７】
【表３６】
【０１４８】
【表３７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 391032071 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカ ブ ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ ＡＫＴＩＥ ＳＥＬＳＸＡＢ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト ノボ アレ （番地なし) (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国，カリフォルニア，94122, サン フランシスコ，シックスス アベ ニュ 1370 (72)発明者 フランク アール． マシャーズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サン フランシスコ，マービュー ウェ イ 148 (72)発明者 マーサ トゥルート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，ブロードウェイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94117, サン フランシスコ，アッパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国，2100 コペンハーゲン， アビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジェニファー ファバロロ オーストラリア国，ビクトリア，カールト ン 3035，ファラデイ ストリート 108
Claims (2)
- 【請求項１】９２．５ｋｄ蛋白質とカルシウム架橋され
た８０ｋｄ及び７７ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファク
ターＶIIIＣの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質
を実質上含有しない蛋白質組成物。 - 【請求項２】ヒト−ファクターＶIIIＣのサブユニット
をコードするＤＮＡ配列。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US570062 | 1984-01-12 | ||
| US06/570,062 US5004804A (en) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
| US66491984A | 1984-10-26 | 1984-10-26 | |
| US664919 | 1984-10-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Division JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001295193A Division JP2002186487A (ja) | 1984-01-12 | 2001-09-26 | ファクターｖｉｉｉｃ組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000023670A true JP2000023670A (ja) | 2000-01-25 |
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ID=27075219
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Expired - Lifetime JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
| JP3082573A Expired - Lifetime JPH0634760B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-04-15 | ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブ |
| JP5092775A Pending JPH06105688A (ja) | 1984-01-12 | 1993-04-20 | ファクターｖｉｉｉ ｃをコードする遺伝子 |
| JP11160290A Pending JP2000023670A (ja) | 1984-01-12 | 1999-06-07 | ファクタ―ｖｉｉｉｃ組成物 |
| JP2001295193A Pending JP2002186487A (ja) | 1984-01-12 | 2001-09-26 | ファクターｖｉｉｉｃ組成物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Expired - Lifetime JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
| JP3082573A Expired - Lifetime JPH0634760B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-04-15 | ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブ |
| JP5092775A Pending JPH06105688A (ja) | 1984-01-12 | 1993-04-20 | ファクターｖｉｉｉ ｃをコードする遺伝子 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001295193A Pending JP2002186487A (ja) | 1984-01-12 | 2001-09-26 | ファクターｖｉｉｉｃ組成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (5) | JPH0826078B2 (ja) |
| AT (2) | ATE78871T1 (ja) |
| DE (6) | DE10399009I1 (ja) |
| DK (3) | DK165506C (ja) |
| LU (4) | LU91015I2 (ja) |
| NL (4) | NL300118I2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
| JPH07106156B2 (ja) * | 1983-10-28 | 1995-11-15 | ジェネティックス、インスティチュ−ト | ファクタ−▲ｖｉｉｉ▼および関連生産物の製造 |
| US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| IL74909A (en) * | 1984-04-20 | 1992-01-15 | Genentech Inc | Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein |
| EP0182448A3 (en) * | 1984-08-24 | 1987-10-28 | Genetics Institute, Inc. | Production of factor viii and related products |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
| AU5772886A (en) * | 1985-04-12 | 1986-11-05 | Genetics Institute Inc. | Novel procoagulant proteins |
| KR910006424B1 (ko) * | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| FI98829C (fi) * | 1986-01-27 | 1997-08-25 | Chiron Corp | Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta |
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| EP0251843A1 (fr) * | 1986-06-06 | 1988-01-07 | Transgene S.A. | Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères |
| WO1988000210A1 (en) * | 1986-06-24 | 1988-01-14 | Nordisk Gentofte A/S | A process for producing a coagulation active complex of factor viii fragments |
| EP0254076B1 (en) | 1986-07-11 | 1991-05-08 | Miles Inc. | Improved recombinant protein production |
| IL83192A (en) * | 1986-07-18 | 1992-11-15 | Gist Brocades Nv | Method for the preparation of proteins with factor viii activity by microbial host cells;expression vectors,host cells,antibodies |
| IL84168A0 (en) * | 1986-10-15 | 1988-03-31 | Rorer Int Overseas | Human factor viii-c analogs,process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same |
| EP0302925A4 (en) * | 1987-01-30 | 1989-04-24 | Biogen Nv | METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII IN LARGE QUANTITIES. |
| CA1339946C (en) * | 1987-03-31 | 1998-07-07 | Michael J. Griffith | Ultrapurification process for polypeptides |
| EP0690126B1 (en) | 1987-06-12 | 2001-11-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| DE3737239A1 (de) * | 1987-11-03 | 1989-10-12 | Behringwerke Ag | Gentechnische herstellung von anticoagulatorischem protein pp4 |
| US6544771B1 (en) * | 1987-12-11 | 2003-04-08 | Cell Genesys, Inc. | Retroviral gene therapy vectors and therapeutic methods based thereon |
| US6140111A (en) * | 1987-12-11 | 2000-10-31 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Retroviral gene therapy vectors and therapeutic methods based thereon |
| WO1991004059A2 (en) * | 1989-09-14 | 1991-04-04 | Baxter International Inc. | Method and useful apparatus for preparing pharmaceutical compositions |
| US5610033A (en) * | 1990-04-25 | 1997-03-11 | Novo Nordisk A/S | Method of producing proteins with FVIII activity and/or FVIII derivatives |
| DK53792D0 (da) * | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| US5910481A (en) * | 1995-11-13 | 1999-06-08 | Immuno Ag | Hybrid proteins with modified activity |
| EP0965597A4 (en) * | 1996-12-27 | 2003-01-08 | Mochida Pharm Co Ltd | CELL MEMBRANE EFFECTIVE DRUGS |
| CN100553678C (zh) | 1999-02-22 | 2009-10-28 | 巴克斯特国际有限公司 | 新的无白蛋白的因子ⅷ制剂 |
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| AU2003269557A1 (en) * | 2002-10-18 | 2004-05-04 | Lg Life Sciences Ltd. | Gene families associated with cancers |
| EP1707634A1 (en) | 2005-03-29 | 2006-10-04 | Octapharma AG | Method for isolation of recombinantly produced proteins |
| EP1739179A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
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| WO2011095604A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh | Half-life prolongation of proteins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK172036B1 (da) * | 1983-03-31 | 1997-09-22 | Scripps Clinic Res | Faktor VIII:C-koaguleringsmiddel, fremgangsmåde til fremstilling heraf samt fremgangsmåde til udvinding heraf |
| US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
| US4663280A (en) * | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
| JPH07106156B2 (ja) * | 1983-10-28 | 1995-11-15 | ジェネティックス、インスティチュ−ト | ファクタ−▲ｖｉｉｉ▼および関連生産物の製造 |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| IL74909A (en) * | 1984-04-20 | 1992-01-15 | Genentech Inc | Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein |
| JPH0634760A (ja) * | 1992-07-15 | 1994-02-10 | Hamamatsu Photonics Kk | 放射線計測装置及び核医学診断装置 |
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