CZ20031718A3 - Polypeptidická proteáza štěpící von Willebrandův faktor (vWF), nukleová kyselina kódující tento polypeptid a použití tohoto polypeptidu - Google Patents

Description

Polypeptidická proteáza štěpící von Willebrandův faktor (vWT), nukleová kyselina kódující tento polypeptid a použití tohoto polypeptidů

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidů proteasy štěpící vWF (vWF cleaving protease, vWF-cp) nebo jeho parciální sekvence, molekuly nukleové kyseliny kódující sekvenci aminokyselin vWF-cp polypeptidů a kompozice obsahující tento polypeptid. Vynález se také týká využití vWF-cp polypeptidů pro produkci anti-vWF-cp polypeptidických protilátek a pro produkci přípravku pro profylaxi a terapii trombózy a tromboembolického onemocnění.

Dosavadní stav techniky vWF je glykoprotein cirkulující v plazmě jako řada multimerů dosahujících velikosti od kolem 500 do 20 000 kD. Multimerní formy vWF jsou složeny z polypeptidových podjednotek o 250 kD, spojených spolu disulfidickými vazbami. vWF zprostředkovává počáteční adhezi krevních destiček k subendotheliu poškozené stěny cév, i když pouze o největších multimerech se zdá, že projevují hematostatickou aktivitu. Tak jsou vWF multimery, které mají veliké molekulové hmotnosti, ukládány ve Weibelových Paladeových tělískách endotheliálních buněk a má se za to, že endotheliální buňky vylučují tyto velké polymerní formy vWF. O těch formách vWF, které mají nízkou molekulovou hmotnost (nízkomolekulární či LMW vWF) se věří, že vznikají proteolytickým štěpením větších multimerů.

Malá část vWF přítomného v normální plazmě cirkuluje jako fragmenty o 189 kD, 176 kD a 140 kD vznikající proteolytickou degradací vWF in vivo, přičemž fragment 140 kD pochází z N-terminální oblasti a fragment 176 kD z C-terminální oblasti podjednotky. Když jsou z normální lidské plazmy izolovány nízkomolekulární (LMW) formy vWF a po redukci disulfidů podrobeny SDS-PAGE (polyakrylamidovágelová elektroforéza), zjišťuje se neobvykle vysoký podíl vWF fragmentů. Toto zjištění je kompatibilní s názorem, že LMW formy vWF byly částečně nebo převážně odvozeny z velkých multimerů proteolytickou degradací.

Proteolytická degradace vWF je u zdravých jedinců fyziologickým procesem, avšak u pacientů trpících von Willebrandovou chorobou (vWD) typu 2A může být • · · · · · • · · · · ♦ • · · · · ······ · · · zrychlena a následkem toho postrádají tito pacienti vWF multimery s největšími molekulovými hmotnostmi. Nedostatek velkých vWF multimerů a zvýšená úroveň proteoiytických fragmentů byly pozorovány také u získané von Willebrandovy choroby spojené s myeloproliferačním syndromem, což ukazuje u této poruchy rovněž na zvýšenou proteolýzu in vivo.

Na druhé straně jsou u pacientů s trombotickou trombocytopenickou purpurou (TTP) detegovány nezvykle velké vWF multimery a u těchto pacientů bylo prokázáno zvýšené vázání vWF na krevní destičky [Moake a spol., N. Engl. J. Med. 307, 14321435 (1982)]. Dědičná TTP je spojena s vážným vrozeným nedostatkem vWFproteázy, kdežto přítomnost vWF štěpících proteáz inhibujících vlastní protilátky byla pozorována u pacientů s nedědičnou TTP.

Velké multimery spojené s TTP normálně mizí potom, když pacient obdrží transfuzi s normální čerstvě zmraženou plazmou. V současné době je výměna plazmy nejvýznamnějším léčením TTP, třebaže u této terapie byly zaznamenány výrazné vedlejší efekty. Existence vážného vrozeného nedostatku vWF-proteázy byla potvrzena u pacientů s dědičnou TTP a přítomnost vWF štěpících proteas inhibujících vlastní protilátky byla pozorována u pacientů s nedědičnou TTP.

Některé proteázy se prokázaly jako schopné štěpit vWF a tím narušovat jeho vazebnou afinitu na krevní destičky. Avšak štěpení vWF těmito proteázami in vitro poskytuje v každém případě štěpné produkty odlišné od fragmentů pocházejících ze štěpení in vivo.

Tak například zatímco plasmin je schopný štěpit některé peptidové vazby ve vWF, plasminem ošetřený vWF si zachovává oblast vysokomolekulárního jádra, která si podržuje kolem 70 % své aglutinační aktivity krevních destiček (stanoveno jako ristocetinový kofaktor). V počátečních stadiích působení plasminu je odštěpován z N-zakončení jednotlivých vWF podjednotek peptid o 34 kD a mapování epitopů takových plasminem indukovaných fragmentů ukazuje, že tyto fragmenty pocházejí z oblastí podjednotky vWF, které jsou odlišné od vWF fragmentů přítomných v cirkulující plazmě.

Bylo také prokázáno, že prasečí pankreatická elastáza a různé serinové proteázy uvolňované z lidských leukocytů degradují proteolyticky vWF s výslednou ztrátou velkých multimerů. Mapování epitopů degradačních produktů znovu ukazuje, že se tyto fragmenty rovněž liší od těch, které jsou přítomny v normální plazmě a ve vWD typu 2A. Kromě toho se ukázalo, že calpainu podobná proteáza uvolňovaná z • · · · • · · · lidských krevních destiček degraduje velké vWF multimery a vytváří fragmenty podobné těm, co byly pozorovány in vivo.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnout polypeptid proteázy štěpící vWF (vWF-cp) nebo jeho parciální sekvenci.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnout kompozici obsahující vWF-cp polypetid.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující sekvenci aminokyselin vWFcp polypeptidů.

Předmětem vynálezu je také poskytnout rekombinantní vWF-cp polypeptid.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsob produkce rekombinantního vWF-cp polypeptidů.

Předmětem vynálezu je rovněž poskytnout metodu čistění vWF za použití vWF-cp polypeptidů nebo jeho parciální sekvence.

Předmětem vynálezu je také poskytnout ligandy anti-vWF-cp polypeptidů.

Podrobný popis vynálezu

Podle jednoho z předmětů vynálezu je tu poskytován vWF-cp polypeptid, který obsahuje (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a). Polypeptidové molekuly mohou mít i nejméně 90 % nebo nejméně 95 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a). Polypeptid má přednostně na obr. 5 ukázanou sekvenci aminokyselin nebo její parciální sekvenci nejméně 12, nejlépe nejméně 15 aminokyselin. Přednostně má vWF-cp polypeptid aktivitu štěpení vWF. Polypeptid vWF-cp podle vynálezu si přednostně udržuje aktivitu vWF proteázy v přítomnosti inhibitoru serinových proteáz a inhibitoru calpainových proteáz. Inhibitorem serinových proteáz může být diisopropyl-fluorfosfát, nebo kterýkoliv z jeho analogů, který má aktivitu inhibitoru serinových proteáz. Inhibitorem calpainu může být Z-LeuLeu-Tyr-CHN₂ nebo kterýkoliv z jeho analogů, který má aktivitu inhibitoru calpainu.

• · • · · · • · • · · ·

Termínem polypeptid se rozumí řetězec aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami mezi α-uhlíkem karboxylu jedné aminokyseliny a adusíkem následující aminokyseliny a obsahující 10 nebo více aminokyselinových zbytků spojených dohromady. Polypeptid může obsahovat jiné než 20 genem kódovaných aminokyselin. Polypeptid se vztahuje jak ke krátkým řetězcům, jako peptidům, oligopeptidům nebo oligomerům, tak i delším řetězcům obecně nazývaným proteiny. Polypeptid zahrnuje sekvence aminokyselin modifikované bud přírodními procesy, jako jsou posttranslační modifikace nebo chemické modifikace, které jsou v praxi oboru známé. K modifikacím může u peptidu dojít kdekoliv. Modifikace může vést k variantě polypeptidů, která se od sekvence aminokyselin v originálním polypeptidů může lišit jednou nebo více substitucemi, adicemi, vypuštěními, fúzemi či jakoukoli kombinací, anebo k přirozeně se vyskytující variantě, jako je alelická varianta, nebo k variantě přirozeně se nevyskytující, vzniklé mutagenezi nebo genovým inženýrstvím. Polypeptid může být ve formě nezpracovaného nebo částečně zpracovaného prekurzorů, maturovaného polypeptidů anebo fragmentu majícího sekvenci aminokyselin, která je úplně tatáž jako část ze sekvence aminokyselin delšího polypeptidového řetězce, ale ne celá. Fragment může být kratší jednotlivou souvislou oblastí delšího řetězce, nebo obsažen uvnitř delšího polypeptidů, jehož část tvoří. Fragment polypeptidů může zahrnovat například zkrácený polypeptid mající částečnou aminokyselinovou sekvenci vWF-cp. Fragmentem může být biologicky aktivní fragment, který zprostředkovává aktivitu proteázy štěpící vWF, včetně těch s podobnou aktivitou nebo zlepšenou aktivitou anebo se sníženou aktivitou.

Identita znamená identitu sekvence aminokyselin polypeptidů se sekvencí aminokyselin polypeptidů obsahující sekvence SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 nebo SEQ ID NO 5. Nejméně 80 % identity značí, že sekvence aminokyselin je identická s tou výjimkou, že sekvence polypeptidů se liší ne méně než ve 20 aminokyselinách na 100 aminokyselin. Nejméně 90 % nebo nejméně 95 % identity znamená rozdíl ne méně než v 10 nebo ne méně než v 5 aminokyselinách na 100 aminokyselin.

Termín vWF štěpící proteáza (vWF-cp) znamená protein nebo polypeptid mající aktivitu vWF štěpení a štěpící vWF vysokomolekulární vWF multimery na molekuly nižší molekulové hmotnosti, které ještě mají vWF aktivitu a vlastnosti.

· ···· ···· '“, ······· ·· · ·· ··

Termín polypeptid proteázy štěpící vWF znamená polypeptid mající nejméně 10 aminokyselinových zbytků. Úplná sekvence aminokyselin nezpracovaného polypeptidů obsahuje 1427 aminokyselin. Maturovaný polypeptid, který je částí většího nezpracovaného polypeptidů, by měl normálně začínat u nebo blízko u aminokyseliny 75, počínaje u AAGGILH a pokračovat ke karboxylovému zakončení. Proteáza štěpící maturovaný vWF má vypočtenou hmotnost polypeptidů kolem 145 kD. Obsaženy mohou být další aminokyseliny, které obsahují sekreční nebo vedoucí sekvence, pro-sekvence, sekvence, které napomáhají čistění nebo identifikaci, jako jsou násobné His zbytky, FLAG přívěsek nebo další sekvence kvůli stabilitě během rekombinantní produkce.

Termín aktivita Štěpení vWF znamená fyziologickou aktivitu štěpení vWF, kterou definuje (1) štěpení vWF na peptidové vazbě 842Tyr-843Met, (2) vlastnost přímé proteolytické aktivity, která konvertuje vWF mající singletovou strukturu na vWF mající satelitní strukturu a (3) zachování aktivity v přítomnosti inhibitoru serinové proteázy jako je diisopropyl-fluorfosfát (DFP) a v přítomnosti inhibitoru calpainové proteasy jako je inhibitor karbobenzyloxy-(Z)-peptidyl-diazomethylketon (Z-Leu-LeuTyr-CHN₂). Proteolytické entity, které tento vynález poskytuje, mohou působit také nepřímo, cestou jiného proteinu jako efektoru, například proteázy. Tento polypeptid může tvořit aktivní, vWF štěpící komplex spolu s iontem kovu vybraného ze skupiny, kterou tvoří Ca⁺⁺, Sr⁺⁺, Mg⁺⁺ a Ba⁺⁺. Preferovaným iontem kovu je Ca⁺⁺. Jak popsáno výše, je tento aktivní komplex schopen štěpit vWF fýziologickým způsobem. Aktivita polypeptidů podle předkládaného vynálezu při štěpení vWF může být stanovena kteroukoliv, v oboru popsanou metodou, jako je způsob podle Furlana a spol. [Blood 87, 4223-4234 (1996)] nebo jak je popsáno ve WO 00/5094. Jako testovací systém může být alternativně využita také analýza vázání kolagenu, jak je např. popsána v EP 0 816 852.

Podle jednoho hlediska poskytuje vynález izolovaný polypeptid, obsahující sekvenci aminokyselin, která má nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 nebo SEQ ID NO 5. Podle jednoho provedení z tohoto hlediska vynálezu obsahuje izolovaný polypeptid sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny, kterou tvoří SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 nebo SEQ ID NO 5.

Termín izolovaný představuje změněný od přírodního stavu a/nebo odstraněný ze svého původního prostředí.

• ·

Vynález poskytuje rovněž v podstatě čistý vWF-cp polypeptid, který obsahuje (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID

NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně % identity se sekvencí aminokyselin pod (a).

Termín v podstatě čistý představuje čistotu tak vysokou jako poměrné podíly polypeptidových řetězců s vWF-cp aktivitou, přítomnými v množství 50 %, zejména 80 % a přednostně 90 % z celkového proteinu, ve srovnání s aktivitou vWF proteázy v plazmě. Čistota se určuje jako čistota stanovená pomocí SDS-PAGE (barveno stříbrem nebo Commassie barvivý) a westernového přenosu a poměrem polypeptidu vWF proteázy k celkovému množství proteinu a řečená čistota je přednostně větší než kolem 98 %. Je-li vyčištěný vWF-cp polypeptid vyčištěn z plazmy, obsahuje preparát mezi 0,001 % a 1 %, přednostně 0,002 % původního množství proteinu plazmy a nejméně 1 %, přednostně nejméně 2,3 % původní enzymatické aktivity, která může být během čistícího postupu částečně inaktivována. Přípravek obsahující vWF-cp polypeptid podle předloženého vynálezu je v podstatě prostý vWF nebo vWF fragmentů, tj. má obsah vWF pod 5 %, přednostně pod limit detekce analýzy používané k detekci vWF, jako je analýza kolagenu popsaná v EP 0 816 852.

V podstatě čistý vWF-cp polypeptid jeví při SDS-PAGE analýze za redukujících podmínek zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 180 kD, 170 kD 160 kD nebo 120 kD.

V podstatě čistý vWF-cp polypeptid jeví při SDS-PAGE analýze za neredukujících podmínek zdánlivou molekulovou hmotnost kolem 150 kD, 140 kD 130 kD nebo 110 kD.

SDS-PAGE se provádí za redukujících podmínek nebo za neredukujících podmínek. V praxi oboru je obecně známo, že při určování molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE je výsledkem detekce zdánlivých molekulových hmotností, které se mohou lišit od molekulových hmotností nativního, nedenaturovaného proteinu.

Analýza nedetanurovaného materiálu hmotnostní spektrometrií vykázala velmi široké peaky vysoké molekulové hmotnosti. Tento nález je v souhlase s pozorováním při experimentech gelové filtrace nasvědčujícím, že proteiny v tomto preparátu jsou náchylné k polymerizování za fyziologických podmínek (vlastnost clusterinu).

Polypeptid podle vynálezu může být izolován z jakéhokoliv zdroje, který obsahuje vWF-cp polypeptid.

· ···· ···· * ······· ·· · ·· ··

Termínem zdroj se míní lidská plazma, supernatant buněčné kultury exprimující vWF-cp polypeptid, mléko nebo jiné tělesné kapaliny transgenních zvířat exprimujících polypeptid podle vynálezu.

Čistění vWF-cp polypeptidu může být uskutečňováno kombinací chromatografických kroků, počítaje v to imunoafinitní chromatografií, gelovou filtraci a chromatografií iontově výměnnou. Prvním rafmačním krokem může být například imunoafinitní chromatografie, druhým krokem může být gelová filtrace, následovaná jedním nebo více dalšími kroky imunoafitnitní chromatografie. Rafinace může být prováděna dále za použití iontově výměnné chromatografie, přednostně aniontové výměnné chromatografie a alespoň jedné afinitní chromatografie. Další rafinační kroky mohou být provedeny za použití iontově výměnné chromatografie, gelové filtrace a dalších kroků afinitní chromatografie.

Podle jednoho aspektu vynálezu je tu poskytována kompozice obsahující vWF-cp polypeptid, který zahrnuje (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a)

Kompozice podle vynálezu obsahující polypeptid může obsahovat dále iont dvojmocného kovu vybraného ze skupiny Ca²⁺, Sr²*, Ba²⁺ a Mg²⁺.

Jiný aspekt předloženého vynálezu se týká komplexu izolovaného vWF-cp polypeptidu majícího vWF-cp aktivitu, vWF a kovového iontu vybraného ze skupiny Ca²⁺, Sr²*, Ba²⁺ a Mg²⁺. Preparát může obsahovat ionty dvojmocného kovu v koncentraci od kolem 1 do 10⁶ iontů na molekulu polypeptidu s aktivitou vWF proteázy a může obsahovat vWF-cp polypeptid ve v podstatě vyčištěné formě.

Kompozice může obsahovat clusterin nebo jeho analog anebo derivát, které mají aktivitu clusterinu. Ve vztahu k aktivitě proteinu se termín derivát nebo analog clusterinu týká polypeptidu, který vykazuje tytéž charakteristiky jako protein nativního clusterinu.

Clusterin je heterodimerní glykoprotein sestávající ze dvou neidentických podjednotek s molekulovou hmotností přibližně 80 kD [Rosenberg a spol., Int. J. Biochem. Cell Biol. 27, 633-645 (1995); Tschop a spol., Clin. Exp. Immunol. 97 (Suppl. 2), 11-14 (1994)]. Je produkován širokou řadou tkání a nalézá se ve většině biologických kapalin. Fyziologické funkce popisované v dosavadním stavu techniky zahrnují regulaci komplementu, transport lipidů, zrání spermatu, iniciaci apoptózy, • · • · endokrinní sekreci, ochranu membrány a podporu buněčných interakcí. Bylo zjištěno, že s přítomností clusterinu v cirkulující plazmě je spojena neobvykle vysoká stabilita vWF-cp polypeptidů podle předkládaného vynálezu, a že poločas aktivity proteázy štěpící vWF in vivo je mezi 1 a 4 dny, zatímco jiné proteázy v plazmě mají poločas v rozsahu od sekund do hodin. Poměr clusterinu k polypeptidů vWF proteázy v kompozici podle předkládaného vynálezu je přednostně v rozsahu od 10M : 1M až 1M : 10M a preferovanější poměr clusterinu a vWF je v rozmezí ekvimolekulárním. V lidské plazmě je koncentrace vWF štěpící proteasy 1 až 10 mg/litr, zatímco u clusterinu je 50 až 400 mg/litr plazmy (molární poměr vWF štěpící proteasy vůči clusterinu v lidské plazmě je asi 1 : 20 až 1:100).

Podle jednoho z předmětů vynálezu se zde poskytuje molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující vWF-cp polypeptid, který má (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a)

Termín molekula nukleové kyseliny se vztahuje obecně na každou DNA nebo RNA a znamená póly nukleotid, který zahrnuje rovněž varianty DNA nebo RNA, DNA nebo RNA, které mohou být modifikovány nebo nemodifikovány, jednořetězcové nebo dvouřetězcové nebo jejich směs, anebo krátký polynukleotid obecně uváděný jako oligonukleotidy. Typická varianta polynukleotidu se liší v nukleotidové sekvenci od sekvence v původním polynukleotidu a může nebo nemusí měnit sekvenci aminokyselin peptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Výsledkem změn nukleotidu mohou být substituce aminokyselin, adice, vypuštění, fúze nebo zkracování v polypeptidové sekvenci polypeptidů. Polynukleotidová sekvence může být modifikována, aby se zlepšila rekombinantní exprese. Takové modifikace zahrnují používání vysoce translatovaných kodónů. Do rámce předkládaného vynálezu patří sekvence nukleové kyseliny, která hybridizuje s DNA sekvencí, jak je ukázáno na obr. 5 nebo parciální sekvence kódující aminokyselinu nejméně 12 aminokyselin. Hybridizační techniky jsou zkušeným odborníkům dobře známy.

Podle jiného aspektu vynálezu je tu poskytován vektor obsahující molekuly nukleové kyseliny zahrnující sekvenci nukleové kyseliny kódující vWF-cp polypeptid mající (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2,

SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a)

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu může být využita ke konstrukci expresních systémů poskytujících vhodné elementy pro replikaci vektoru uvnitř hostitelských buněk a pro expresi polypeptidu majícího aktivitu proteasy štěpící vWF podle předkládaného vynálezu. Aby se zlepšila exprese, může být sekvence nukleové kyseliny modifikována, například adicí Kozákovy sekvence.

Expresní vektor může ve směru transkripce obsahovat například transkripční regulační oblast a oblast translační iniciace funkční v hostitelské buňce, DNA sekvenci obsahující polynukleotid exprimující vWF-cp polypeptid podle předkládaného vynálezu a translační a transkripční terminační oblast funkční v řečené hostitelské buňce, kde je exprese nukleové sekvence regulována iniciační a terminační oblastí. Expresivní vektor může rovněž obsahovat elementy pro replikaci nukleotidu. Příklady vektorů exprese DNA jsou pBPV, pSVL, pRc/CMV, pRc/RSV, myogenní vektorové systémy, na pcDNA3 založený vektor (Invitrogen) nebo vektory pocházející z virálních systémů, například z vakciniaviru, adenovirů, adenoasociovaných virů, herpesvirů, retrovirů nebo bakulovirů. Vhodné savčí expresivní vektory obvykle obsahují jednu nebo více eukaryotických transkripčních jednotek, které jsou schopny exprese v savčích buňkách. Pro zprostředkovávání transkripce cizích DNA sekvencí pozůstává transkripční jednotka alespoň z elementu promotoru. Vhodné promotory pro savčí buňky jsou v oboru známy a zahrnují virální promotory jako například ze simianviru 40 (SV40), cytomegaloviru (CMV), viru Rousova sarkomu (RSV), adenovirů (ADV), hovězího papilomaviru (BPV) nebo jiných promotorů vybraných ze skupiny promotoru methallothioneinu a promotoru β-aktinu. Další v praxi známé promotory jsou pro expresi rovněž použitelné.

Expresní vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje vWF-cp polypeptid podle předkládaného vynálezu, může být využit k transformaci hostitelských buněk, které potom polypeptid produkují. Transformované hostitelské buňky mohou být pěstovány v buněčném kultivačním systému pro produkci polypeptidu in vitro. Hostitelské buňky mohou vylučovat polypeptid mající aktivitu vWF proteázy do buněčného kultivačního media, z něhož může být připraven anebo polypeptid může být izolován z buněčného lyzátu.

Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid obsahující (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, • ·· ·

SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající nejméně 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a), může být transformován nebo transfektován do hostitelských buněk pro expresi rekombinantního polypeptidů. Vhodné hostitelské buňky zahrnují každou buňku schopnou produkovat vWF-cp poté, když byla transformována nebo transfektována. Preferované buňky představují bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky nebo živočišné buňky. Hostitelskou buňkou může být buňka pocházející z těla savce, například fibroblasty, keratinocyty, hematopoetické buňky, hepatocyty nebo myoblasty, které se transformují in vitro expresním vektorovým systémem nesoucím nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu a reimplantují do savce. Polypeptid podle předkládaného vynálezu, kódovaný řečenou nukleovou kyselinou, bude syntetizován těmito buňkami in vivo a ony budou u savce vyvíjet žádanou biologickou aktivitu.

Řady savčích buněk, které jsou použitelné jako hostitelé pro expresi jsou v praxi známé a zahrnují mnohé řady imortalizovaných buněk dosažitelných z American Type Culture Collection (ATCC). Příkladné savčí hostitelské buňky zahrnují zejména buněčné řady primátů a buněčné řady hlodavců včetně transformovaných buněčných řad. Přednostně, i pro stabilní integraci vektoru DNA i následující ampiifikaci integrovaného vektoru DNA konvenčními metodami, jsou jako preferované savčí hostitelské buňky používány buňky z vaječníků čínského křečka (CHO). Další vhodné buněčné řady zahrnují HeLa buňky, ledvinové buňky z mláděte křečka (BHK), opičí ledvinové buňky (COS-1), buňky z lidského hepatocelulárního karcinomu (např. Hep G2), transformované 293 buňky lidského adenoviru, HEK 293buňky, SKHep buňky, myší L-929 buňky, HaK buněčné řady křečka, myší 3T3 buňky pocházející od myší Swiss, Balb-c nebo NIH a množství dalších buněčných řad, ale není to na ně omezeno. Jiná vhodná řada savčích buněk je buněčná řada CV-1. Normální diploidní buňky, buněčné kmeny pocházející z kultivace primární tkáně in vitro, stejně jako primární expiantáty, jsou rovněž vhodné. V úvahu přicházející buňky mohou být genotypicky deficientní na selekční gen nebo mohou obsahovat dominantně působící selekční gen.

Hostitelskými buňkami mohou být buď transformované buňky nebo netransformované buňky. Hostitelskými buňkami jsou přednostně ty, které exprimují furin bud přirozeně nebo potom, když byly geneticky zpracovány, aby exprimovaly rekombinantní furin.

« *· · ·«· ·· · · 1» *

A fc · * · # · * · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 l

4 · 9 9 9 9 9 9 9 9 || 9999994 99 9 9 9 99

Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, screening i produkci a čistění produktu jsou v praxi oboru známé.

Hostitelská buňka transformovaná vektorem nesoucím nukleovou kyselinu kódující vWF-cp polypeptid, může být potom, pokud se to žádá, pěstována za vhodných podmínek s geny zavádějícími amplifikaci. Efektivní podmínky zahrnují patřičná media, bioreaktor, teplotu, pH a kyslíkové podmínky, které dovolují produkci proteinu, ale není to omezeno jen na ně. Způsob podle tohoto předkládaného vynálezu tedy zahrnuje kultivaci vhodné buňky nebo buněčné řady, která byla transformována sekvencí nukleové kyseliny kódující sekvenci aminokyselin vWF-cp polypeptidů, kódující sekvenci ovládanou transkripční regulační oblastí. Pokud je exprimovaný polypeptid exprimován intracelulárně, pak se příslušnými, odborníkovi známými prostředky znovu získává, izoluje a čistí od kultivačního media, pokud byl vylučován buňkami nebo z buňky.

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu nebo její fragment může být exprimována v systému eukaryotického nebo prokaryotického mikroorganizmu jako hub, včetně kvasinek nebo bakterií. Fragmenty mohou představovat zkrácené formy proteázy štěpící vWF. Příklady zkracování zahrnují N- nebo C-terminální vypouštění, ale není to jen takto omezeno.

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu může být využita také ke generování transgenních živočichů, kteří řečený polypeptid exprimují in vivo. Při jednom provedení této specifické aplikace mohou transgenní živočichové exprimovat vWF-cp polypeptid v endogenních žlázách, například mléčných žlázách, ze kterých se řečený protein vylučuje. V případě mléčných žláz je řečený polypeptid vWF proteázy vylučován do mléka živočichů, z něhož může být řečený protein preparován. Živočichy mohou být myši, skot, prasata, kozy, ovce, králíci nebo kterékoliv ekonomicky užitečné zvíře.

vWF-cp polypeptid podle vynálezu může být využit ve způsobu čistění vWF poskytnutím vWF-cp polypeptidů podle vynálezu jako ligandu, spojením roztoku obsahujícího vWF s vWF-cp polypeptidem jako ligandem za podmínek, při nichž je vWF vázán k ligandu a z řečeného ligandu znovu získáním vyčištěného vWF. vWFcp polypeptidový ligand může být vázán na tuhém nosiči.

Navíc dále může být vWF-cp polypeptid podle vynálezu pomocí v oboru běžných technik využit také k vyvinutí vWFcp polypeptid vázajících molekul.

·· ···· ·· ···· ·»*· »·** « c * » · · * · « • ··· · » · » · · • «*··· « « * w • · · · 1 9 9 11

....... .......

Vázajícími molekulami mohou být protilátky anti-vWF-cp polypeptidu, které mohou být produkovány imunizací zvířete polypeptidem podle vynálezu a izolací protilátek anti-vWF-cp polypeptidu ze zvířete.

Protilátky jak je zde používáno, představují polyklonální a monoklonální protilátky, chimérické protilátky, jednořetězové a humanizované protilátky, stejně jako Fab fragmenty, včetně produktů Fab nebo jiné knihovny exprese imunoglobulinu, peptidů nebo peptidomimetik. Monoklonální protilátky mohou být produkovány v oboru běžnými způsoby. Jiné vázající molekuly mohou být deriváty protilátky, jako jednořetězové protilátka, Fab- nebo Fab' 2-fragment, chimérická protilátka nebo peptid anebo peptidomimetikum, které mohou být získány známými metodami jako např. metodou displeje fágu.

Molekula vázající vWF-cp polypeptid, vybraná ze skupiny jednořetězových protilátek, Fab- nebo Fab' 2-fragment nebo polypeptidy s místem vázání vWF proteasy mohou být z hlediska vynálezu produkovány metodou, při níž je knihovna displeje fágu screeningována na molekulu vázající anti-vWF-cp polypeptid, stanoví se sekvence nukleové kyseliny pozitivních klonů a molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci se klonuje v expresivním vektoru.

Vývoj protilátek, derivátů protilátek, peptidomimetik nebo jiné molekuly, která váže vWF-cp polypeptid může být uskutečněn podle metod známých v oboru dříve [Greer a spol., J. Med. Chem. 37, 1035-1054 (1994); Kemp, Trends Biotechnol. 8, 249-255 (1990)].

Molekula vázající vWF-cp polypeptid podle vynálezu může být využita jako ligand pro čistění vWF-cp. Takový postup může být prováděn spojením roztoku obsahujícím vWF-cp polypeptid s molekulou vázající vWF-cp polypeptid za podmínek, při nichž vWF-cp polypeptid se váže k vázající molekule a vyčištěný vWFcp polypeptid se získává selektivní elucí vWF-cp polypeptidu z vWF-cp polypeptid vázající molekuly. Molekula vázající vWF-cp polypeptid může být vázána na tuhý nosič.

Molekula vázající vWF-cp polypeptid může být rovněž využita při způsobu detekce vWFcp polypeptidu ve vzorku. Při tom je roztok s tušeným obsahem vWF-cp polypeptidu uveden do styku s molekulou vázající vWF-cp polypeptid, jak uvedeno shora, za podmínek umožňujících tvorbu komplexu vWF-cp polypeptid / molekula vázající vWF-cp polypeptid a detekci komplexu.

vWF-cp polypeptid podle vynálezu může být na příklad použit ke zpracovávání plazmaticky nebo rekombinantně produkovaného vWF. Rekombinantní vWF (r-vWF) může být produkován v CKO buňkách, např. podle Fishera a spol. [FEBS Lett. 375, 259-262 (1995)]. r-vWF získaný tímto způsobem je dostupný jako vyvinutý vWF a má singletovou strukturu, tj. liší se od vWF pocházejícího z plazmy, který má vždy charakteristickou satelitní strukturu, když je zkoušen na 2 % SDS agarosových gelech. U. S. patent 5,854,403 uvádí, že r-vWF je složen z multimerů v vysokou strukturální integritou, která zůstává zachována i po čistění a ošetření pro inaktivaci viry. Neporušená struktura r-vWF je určena výsledkem analýzy elektroforézou skládající se z pásů multimerů s absencí satelitních pásů. Aby se připravil r-vWF preparát mající strukturu přesněji odpovídající oné, z plazmy odvozeného vWF od rvWF se singletovou strukturou, se r-vWF ošetří polypeptidem vWF proteasy nebo kompozicí obsahující polypeptid vWF proteasy podle předloženého vynálezu a případně ionty kovu a/nebo clusterinem.

Z jistého hlediska vynálezu může být vWF polypeptid využit pro výrobu přípravku pro profylaxi a terapii chorob, které vykazují supranormální obsah vWF nebo u pacientů se zvýšenou úrovní vWF s vysokou molekulovou hmotností, jako je tromboembolická choroba. To může vyústit na trombosy a tromboembolická onemocnění. Například trombotická trombocytová purpura (TTP), HenochovaSchónleinova purpura, preeklampsie, neonatální trombocytopenie nebo hemolytickouremický syndrom. Při podání efektivní dávky polypeptidu podle vynálezu a majícího aktivitu vWF proteázy, může toto u pacientů vést ke snížení obsahu vWF multimerů s vysokou molekulovou hmotností vyúsťující v efektivní terapii těchto chorob. Choroba, jež může být vybrána z tromboembolických onemocnění, je trombotická trombocytová purpura (TTP), Henochova-Schónleinova purpura, preeklampsie, neonatální trombocytopenie nebo hemolyticko-uremický syndrom.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 schematicky zobrazuje postup čistění vWF-cp z plazmy.

Obr. 2 ukazuje SDS-PAGE vyčištěných vWF-cp polypeptidů za neredukujících (A) a redukujících podmínek v přítomnosti DTT (B).

Obr. 3 ukazuje parciální sekvenci nukleotidů a aminokyselin vWF-cp polypeptidu.

Obr. 4 ukazuje schematický nákres genomické lokalizace genu proteasy štěpící vWF.

Obr. 5 ukazuje úplnou sekvenci aminokyselin a nukleotidů proteasy štěpící vWF. Začátek a konec signálního peptidu, metaloproteázu, oblast bohatou na cystein (ACR), motiv thromspondinu typu 1 (TSP 1) a domény disintegrinu podobného motivu (RGS) jsou označeny šipkami. Místo štěpení furinu, katalytické místo a Met-ohyb jsou podtrženy. Předpokládaná místa N-glykosylace jsou označena hvězdičkami.

Obr. 6 ukazuje schematické znázornění organizace domén proteázy štěpící vWF a lidských členů rodiny ADAM-TS. Jsou ukázány struktury domén proteázy štěpící vWF (ADAMTS 13) a všech známých lidských ADAMTS proteinů. V databázích nemohl být nalezen ADAMTS 10 a ADAMTS 11 je identický s ADAMTS

5.

Obr. 7 ukazuje analýzu western přenosu buněk transfektovaných vektorem obsahujícím kódující sekvence vWF-cp polypeptidu, v pásu 1: značkovač standardní molekulové hmotnosti, pás 2: kontrolní vektor cDNA3.1(+) a pás 3 : vektor pCMVvWFcp. Specifický pás vWF-cp polypeptidu je označen šipkou.

Obr. 8 ukazuje SDS-Page aktivitu vWF-cp na vWF, v pásu 1: vyčištěný plazmatický vWF jako kontrola, pás 2: vWF inkubovaný s normální lidskou plazmou, pás 3: vWF inkubovaný s pufrem jako kontrola, pás 4: vWF inkubovaný s buněčným lyzátem SK-Hep buněk transfektovaných s kontrolním vektorem cDNA3.1(+) a pás 5: vWF inkubovaný s buněčným lyzátem SK-Hep buněk transfektovaných s expresním vektorem pCMV-vWFcp.

Vynález je popsán následujícími příklady, aniž by se na ně omezoval.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace vWF-cp polypeptidu

1.1. Příprava IgG-eTTP-spojeného afinitního gelu.

IgG-eTTP se izoluje pomocí 20 ml protein A-Sepharose® (průměr 1,6 cm) v TBS, pH 7,4. Pheresis plazma pacienta trpícího získanou TPP (erworbenes TTP; eTTP), která byla předtím analyzována na obsah inhibitoru vzhledem k vWF štěpící • ·

proteáze, se v objemu 50 ml aplikuje na kolonu. Po následujícím promytí s TBS, pH

7,4 jsou vázané IgG postupně eluovány citrátem 0,1 M, pH 4,0 a glycinem 0,1 M, pH

2,7. Frakce se bezprostředně uvedou na fysiologické pH přidáním Tris, 1,5 m, pH 8,8 a dialyzují se proti TBS, pH 7,4. Podle instrukcí výrobce se Affi-Gel® spojí s IgGeTTP, který byl vymyt z protein A-Sepharose® při pH 4,0. Tímto způsobem se nejprve preparovaný materiál kolony promyje jak předepsáno, pak postupně třikrát promyje střídavě s 50 ml pufru B a 200 ml pufru A (kapitola 1,7). Před použitím se v každém případě provede intenzivní promytí pufrem A.

1.2. První krok

Jako výchozí materiál se použije po 5 min centrifugaci při 2.500 ot/min (1.100

g) 100 ml sebrané CPD plazmy, která pocházela nejméně od tří dárců a byla uchovávána při -20°C. Při poměrně nízké rychlosti průtoku (FR: 30 ml / h) se plazma nanese na 200 ml chromatografickou kolonu s IgG-eTTP Affi-Gel® Hz (hydrazid, průměr 2,6 cm), která byla ekvilibrována v pufru A. Po promytí nejméně 400 ml pufru A přes noc při téže rychlosti průtoku se k tomu připojí 200 ml odsolovací kolona gelové filtrace (Bio-Gel® P-6DG, průměr 2,6 cm), která byla předtím propláchnuta pufrem A. Po zvýšení rychlosti průtoku na 100 ml / h se proteiny vázané na Affi-Gel Hz přímo eluují s 50 ml pufru B na Bio-Gel® tak, aby se z proteinů odstranil NaSCN, který byl v pufru B. Proteiny, které byly eluovány z odsolovací kolony před NaSCN se bez přerušení vedou přes protein G Sepharose®, kde jsou zbavovány IgG. Zde se rychlost průtoku snižuje na 50 ml / h tak, aby se prodloužila doba prodlevy proteinů v 10 ml koloně. K regeneraci se protein G Sepharose® krátce promyje pufrem C a eluovaná IgG frakce se uchová pro analýzu.

První krok se provede osmkrát před tím než se sebrané frakce, které byly zmrazený na -20 °C, dají dohromady a dále zpracovávají.

1.3. Druhý krok

Frakce shromážděné z osmi chromatografií z prvního kroku se 1:1 zředí vodou tak, aby se získala iontová síla, při které by se žádané proteiny vázaly na kolonu aniontové výměny (High Q Support®). U vzorku, jehož objem je od 1.500 do 1.800 ml podle použité násady, se analyzuje pH a iontová síla a přes noc se aplikuje při FR 90 ml / h přes 50 ml kolonu s Therasorbem® (průměr 1,6 cm) nahoře nad kolonou s 5 ml High Q Supportu® (průměr 1,6 cm). Jak Therasorb® tak High Q

...· ’ ·..· · ·..· *

Support® byly předtím ekvilibrovány v pufru D. Po promytí přibližně 150 ml pufru D se Therasorb® odpojí a za High Q Support® se připojí 25 ml kolona s Lentil LectinSepharose® (průměr 1,6), která byla ekvilibrována v pufru E. Při FR 60 ml/h se proteiny vázané na High Q Support® okamžitě eluují pufrem E přímo do Lentil LectinSepharose®. Proteiny, které jsou vázány na Lentil Lectin-Sepharose® mohou být eluovány ve dvou krocích s pufry G a H a mohou být shromážděny. Proteiny, které zůstaly vázány na Therasorb® a High Q Support® se vymyji pufrem C respektive F a po anylýze se zahodí.

Pro regeneraci před použitím je v každém případě Lentil Lectin-Sepharose® propláchnuta podle instrukcí výrobce třikrát alternativně pokaždé s 20 ml pufrů I a J a High Q Support® postupně pokaždé s 10 ml 1N NaOH a 1 M NaCl.

1.4. Třetí krok

Sebrané frakce, které byly eluovány z Lentil Lectin-Sepharose® pufrem H, se třikrát dialyzují celkem 4 h, pokaždé proti pufru D a znovu aplikují na High Q Support® rychlostí průtoku 60 ml / h. Vpředu je připojena 5 ml kolona s heparinSepharose (průměr 1,4), která byla podobně ekvilibrována v pufru D. Po aplikaci vzorku se to propláchne přibližně 50 ml pufru D, heparin-Sepharose se odpojí a k tomu se připojí 500 ml kolona s Sephacryl® S-300 HR (průměr 2,6), která byla ekvilibrována v pufru L. Proteiny vázané na High Q Support® se s 10 ml pufru K eluují přímo na kolonu gelové filtrace. Vylučovací chromatografie se uskuteční rychlostí průtoku 42 ml / h a frakce se odebírají každá po 7 ml. Proteiny, které jsou silněji vázány na High Q Support® se znovu eluují pufrem F a pufrem K ty, které zůstaly ulpělé na heparin-Sepharose.

1.5. Čtvrtý krok

Sebrané aktivní frakce ze třetího kroku se bez ošetření aplikuji s FR 10 ml / h na 1 ml kolonu s anti-a2-makroglobulinem (rychlost průtoku 0,7 cm), která byla ekvilibrována v pufru L. Kolona s anti-a2-makroglobulinem se podle instrukcí připraví imobilizací protilátek z králičího anti-a2-makroglobulinu o koncentraci 4,9 mg / ml na CNBr-aktivované Sepharose. Proteiny na ní vázané se eluují s NaSCN 3M v pufru L a s pufrem C a uchovávají se pro analýzu.

Tabulka 1

Seznam pufrů

PufrA	Tris NaCl Na3-citrát Na kyselina	10mM 0,15 M 1 mM 0,02 %	pH 7,4
PufrB	NaSCN v pufru A	3,0 M	pH 7,4
PufrC	glycin Na kyselina	0,1 M 0,02 %	pH 2,7
PufrD	Tris NaCl	10 mM 75 mM	pH 7,4
PufrE	Tris NaCl MnCb	20 mM 0,5 M 1 mM	pH 7,4
PufrF	Tris NaCl	10 mM 1,0 M	pH 7,4
PufrG	Tris NaCl Methyl-a-D- mannopyranosid	20 mM 0,5 M 30 mM	pH 7,4
PufrH	Tris NaCl Methyl-a-D- mannopyranosid	20 mM 0,5 M 0,3 M	pH 7,4
Pufrl	Tris NaCl	20 mM 0,5 M	pH 8,5
Pufr J	Na-acetát NaCl	20 mM 0,5 M	pH 5,5
PufrK	Tris NaCl	10 mM 0,5 M	pH 7,4
Pufr L (TBS)	Tris NaCl	10 mM 0,15 M	pH 7,4

• · • · · · • ·

Tabulka 2

Seznam chromatografických materiálů

MATERIÁL	DODAVATEL / SPOLEČNOST
Affi-gel hydrazid gel®: pro imobilizaci specifických IgG	Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Anti-a2-globulin kolona: izolace ot2- makroglobulinu	Vlastní produkce přihlašovatele (viz 1.5.): protilátka králičího-anti-human-a2- makroglobulinu na CNR aktivované Sepharose 4B®, 4,9 mg/ml
Bio-Gel® P6-DG, medium: gelová filtrace s limitem vyloučení > kDa	Biorad
CNR aktivovaná Sepharose 4B®: pro imobilizování proteinů	Amersham Pharmacia Biotech., Uppsala, Sveden
Heparin-Sepharose, HITrap® 5 ml: afinitní chromatografie, váže různé proteiny	Amersham Pharmacia
High Q Support®, Macro-Prep: silný aniontoměnič	Bio-Rad
IgG-eTTP Affi-gel Hz: pro vazbu vWF proteasy	Vlastní produkce přihlašovatele (viz 1.1.): IgG-eTTP na Affi-gel Hz hydrazidu
Lentil Lectin-Sepharose® 4B: afinitní chromatografie: váže se k cukerným zbytkům proteinů	Amersham Pharmacia
Protein A Sepharose® CL-4B: váže IgG typu 1,2 a 4	Amersham Pharmacia
Protein G Sepharose® 4FF: izolace IgG všech typů	Amersham Pharmacia
Sephacryl® S-300 HR: gelová filtrace pro mol. hmotnosti 10.000 až 1,500.000	Amersham Pharmacia
Therasorb: spojený s ovčími-anti-humanIg-protilátkami: izolace lidských imunoglobulinů	Serag-Wiessner, Naila, DBR

• · · ·

1.6. Pátý krok

Jako další krok může být alternativně nebo navíc ke čtvrtému kroku aplikována sloupcová chromatografie s anti-clusterinem. Vzorky se připravují identicky jako pro kolonu s anti-cc2-globulinem za použití anti-clusterinových protilátek.

1.7. SDS-PAGE redukovaná/neredukovaná

Konečný preparát ze třetího kroku izolace se podrobí elektroforéze na SDSpolyakrylovém gelu o tloušce 1, 5 mm podle Laemli-ho [Nátuře 227, 680-685 (1970)]. Pro frakcionaci proteinů se použije gradient 4 až 12 % polyakrylamidu. Po elektroforéze za neredukujících nebo redukujících podmínek (finální koncentrace 65 mmol / I dithiotreitolu DDT) se proteiny učiní viditelnými obarvením stříbrem nebo Commassie modří (Obr. 2). Za neredukujících podmínek jsou detegovatelné pásy mající molekulovou hmotnost (MW) kolem 150 kD, 140 kD 130 kD nebo 110 kD a za redukujících podmínek kolem 180 kD, 170 kD 160 kD nebo 120 kD.

1.8. Stanovení aktivity vWF proteasy

Různé frakce izolované čistícím postupem jak je popsáno shora, se testují na aktivitu štěpení vWF způsobem, který popsal Furlan a spol. [Blood 87, 4223-4234 (1996)].

Příklad 2

Sekvencování aminokyselin a analýza aminokyselin polypeptidu vWF-cp

Konečný preparát proteinu ze třetího kroku izolace se podrobí elektroforéze na SDS-polyakrylovém gelu o tloušťce 1, 5 mm podle Laemliho [Nátuře 227, 680-685 (1970)]. Pro frakcionaci proteinů s vysokou molekulární hmotností se použije gradient od 4 do 12 % polyakrylamidu a pro proteiny s nízkou molekulární hmotností gradient od 8 do 12 % polyakrylamidu. Po elektroforéze za neredukujících nebo redukujících podmínek (finální koncentrace 65 mmol/l dithiothreitolu), se proteiny natečkovaly na PVDF-membrány a 2 min vybarvovaly 0,25 % Coomassie modří ve 45 % methanolu, 9 % kyseliny octové a 46 % vody. Po propláchnutí směsí 50 % methanolu,10 % kyseliny octové a 40 % vody se viditelné pásy proteinů vyřízly a .:.....· ·..· :

analyzovaly na Procise-cLC Sequencer-u (Foster City, CA) v Chemickém ústavu university v Bernu.

Sekvence aminokyselin polypeptidových pásů oddělených pomocí SDS-PAGE z vyčištěné vWF-štěpící proteasy je uváděna v Tabulce 3.

Tabulka 3

Stanovení N-terminální sekvence aminokyselin vWF-cp

Molekulová hmotnost	Sekvence aminokyselin
350 kD neredukováno	Ser-Val-SerGIy-Lys-Pro-GIn-Tyr-Met-Val
150 kD neredukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle
140 kD neredukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle
130 kD neredukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle
110 kD neredukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle-Leu-His-Leu-Glu
70 kD neredukováno	Asp / Ser-GIn / Leu-Thr / Met-Val / Pro-Ser / Phe
180 kD redukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle-Leu-His-Leu-Glu
170 kD redukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle
160 kD redukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle-Leu-His-Leu-Glu- Leu-Leu-Val-Ala-Val-Gly
120 kD redukováno	Ala-Ala-Gly-Gly-lle-Leu-His-Leu-Glu- Leu-Leu-Val-Ala-Val-Gly
40 kD redukováno	Asp-GIn-Thr-Val-Ser

identifikováno jako a2-makroglobulin ** identifikováno jako clusterin

Analýza směsi aminokyselin byla provedena u stejného vzorku, jak byl použit k sekvencování aminokyselin. Proteinové pásy se hydrolyzují v plynné fázi nad 6 N HCI po 22 hodin při 110°C a aminokyseliny se stanovují vysoce účinnou kapalinovou chromatografií. Analyzují se čtyři neredukované polypeptidové pásy z SDS-PAGE vyčištěného vWF-cp s M_r 150, 140, 130 a 110 kD. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce

4.

Tabulka 4

Složení aminokyselin v izolovaném vWF-cp polypeptidu

Aminokyselina	Počet zbytků /100 zbytků z
	150 kD	140 kD	130 kD	110 kD
Asx	6,7	7,0	7,4	8,3
Glx	12,2	12,0	12,8	11,8
Ser	8,4	8,9	8,8	9,2
Gly	11,8	12,1	12,1	12,9
His	2,5	2,3	2,5	2,4
Arg	8,3	7,6	8,1	7,2
Thr	5,6	5,5	5,6	5,7
Ala	10,1	9,5	9,6	8,2
Pro	8,9	8,5	8,3	8,1
Tyr	2,1	2,7	2,3	2,4
Val	7,0	6,9	6,7	6,5
lle	2,7	2,9	2,6	3,0
Leu	10,0	9,9	9,1	9,7
Phe	2,6	2,8	2,6	3,2
Lys	1,0	1,3	1,3	1,4

Příklad 3

Identifikace vWF-cp genu

Stanovila se sekvence kódující nukleovou kyselinu ze sekvence aminokyselin peptidu AAGGILHLELLVAVG (SEQ. ID. NO. 2) N-terminálních 15 zbytků vyčištěného lidského vWF-cp a ta odpovídá sekvenci nukleové kyseliny GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ. ID. NO. 9). Rešerše databáze v NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ukázala umístění odpovídající sekvence nukleové kyseliny GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ. ID. NO. 9) na chromozomu 9 klon RP11-244N20 (AL158826, GI11544459). Nukleotidové sekvence od báze 150001 do 185911 se tedy prověřila na potenciální exony. Následná překrývání genomových • · · · • · · ·

segmentů s různými délkami (1500 bází-5000 bází) se analyzovala za použití vyhledávacích nástrojů, kdy se kladou dotazy cestou internetového průzkumu. Segmenty genomické sekvence, její translace a výsledky vyhledávání se zvládly za použiti počítačového programu Vectors NTI Suitel v. 5,2 (Informax lne., USA). Sekvence RP11-244N20 má velikost přibližně 185 kb a identifikovaná sekvence nukleové kyseliny začíná v poloze 156.653. Využití vyhledávacího programu exonů (Grail, http://combio.ornl.gOv/Grail-1.3) umožnilo identifikaci kolem 30 údajných exonů po směru a proti směru od polohy 156.653. První čtyři exony z vyhledávání se translatují do odpovídající sekvence aminokyselin a vyhledávají se homologie. Toto vyhledávání odhalilo, že každá sekvence projevuje vysokou homologii se sekvencí aminokyselin disintegrinu lidského druhu a metaloproteinázami s motivy thrombospondinu (ADAM-TS).

Aby se spojily údajné exony, přepisuje se reverzně polyA-RNA z jater a cDNA se potom pomocí PCR amplifikuje s primery specifickými pro některé z údajných exonů (Tabulka 5). Produkty PCR primerů 6142 (SEQ ID NO 16) - 6277 (SEQ ID NO 17), 6142 (SEQ ID NO 16) - 6546 (SEQ ID NO 18), 6351 (SEQ ID NO 19) - 66546 (SEQ ID NO 18), 6278 (SEQ ID NO 21) - 6407 (SEQ ID NO 20), 6346 (SEQ ID NO 23) - 6395 (SEQ ID NO 24) a 6406 (SEQ ID NO 25) - 6506 (SEQ ID NO. 26) (pocházejících od údajných exonů 1-6, 3-11, 6-11, 10-14. 13-16 respektive 14-23) projevily pásy očekávané velikosti. Po sekvencování otevřeného čtecího rámce z exonu 1 až exonu 23 blízko konce 3', může být identifikován klon RP11-244N20. Konec 3' sekvence cDNA se vyšetřil PCR amplifikaci cDNA při použití původního primeru 6548 (SEQ. ID. NO. 27) exonu 22 a specifické MC18 sekvence RT primeru spdT. Vznikající fragment o velikosti přibližně do 1,8 kb se sekvencoval a po vyhledání v databázi může být 3' část nové cDNA sekvence umístěna do oblasti q34 (AC002325) na chromozomu 9.

Neznámá sekvence genu na konci 5' byla identifikována pomocí 5'-RACE a sekvencování vznikajícího PCR produktu odhalilo dva další exony. Žádný z nejbližších pěti exonů proti směru exonu 1-2 nemůže být pomocí PCR spojen s již známou CDNA sekvencí. Stanovilo se všech dohromady 29 exonů s velikostí cDNA

4,6 kb. Gen vWF štěpící proteasy má rozpětí přibližně 37 kb, schematický nákres lokalizace exonů je ukázán na obrázku 4. Kompletní cDNA sekvence je zobrazena na obrázku 5.

a · · a • · · ·

• · · · · · ·

Tabulka 5

·· · · · · · · • · · » » · · · · · • ·

Stanovení podobností s jinými proteiny SMART programem (http://smart.eml-heidelberg.de) se vyhledávala architektura domén proteázy a identifikovaly se proteinové moduly včetně signálního peptidu s jeho transmembránovou oblastí, místo štěpení furinu, metaloproteasová doména, tj. sekvence konsensuální katalytickému místu Zn-proteasy (HEXXH), Met otáčky, domény disintegrinu, cysteinem bohaté oblasti a motivu thrombospondinového typu 1 (TSP-1) (Obrázek 6). Tyto moduly jsou rovněž sdíleny členy nového ADAMTS druhu metaloproteinázy (pro disintegrin a metaloproteas s motivem typu 1 thrombospondinu) [Tang, FEBS Letí. 445, 223-225 (1999); Tang, Int. J. Biochem. Cell Biol. 33, 33-34 (2001)]. Sekvence aminokyselin proteázy štěpící vWF se řadí ke všem lidským ADAMTS proteinovým sekvencím, které jsou uváděny komitétem genové nomenklatury organizace pro lidský genom (HUGO), http//www.gene.ucl. ac.uk/nomenclature/genefamily/adamts.html. Schematické zobrazení domén je uvedeno na obrázku 6. Na rozdíl od ADAMTS proteinů náš údajný nový člen tohoto druhu postrádá prodoménu. Nicméně zkoumání sekvence aminokyselin nejbližších údajných exonů proti směru exonu 1-2 neukázalo sekvenční homologie k ADAMTS proteinům. Navíc se na těchto exonech nezjistily sekvence signálních peptidů. A tak jsme proteázu štěpící vWF pojmenovali ADAMTS13. Odvozená sekvence aminokyselin se rovněž porovnala s databází EMBL proteinu (http://ww2.ebi.ac.uk). Exony 6 až 16 částečně odpovídají k již navrženému hypotetickému proteinu 39,9 kD umístěnému na chromozomu 9 a zakončenému otevřeným čtecím rámcem 8 (C9ORF8, XM 005647, G112735207). Kromě toho exon 26 až 29 odpovídá hypotetickému proteinu DKFZp434C2322 (NM032252, GI14149974) [Wiemann a spol., Genome Res. 11,422-435 (2001)].

Příklad 4

Afinitní čistění von Willebrandova faktoru (vWF)

Peptid se sekvencí AAGGILHLELLV (SEQ ID NO 1) se syntetizoval na nosiči z tuhé fáze podle metody Barany-ho a spol. [Solid-phase Peptide Synthesis v The Peptides, sv. 2, vydavatelé Gross E. a Meienhofer J., Academie, New York 1980, SEITENj. Po štěpení a deprotekci peptidu se peptid vyčistil iontově výměnnou chromatografií. Peptid byl charakterizován pomocí HPLC na obrácených fázích na

koloně s C8 křemelinou s gradientovou elucí v kyselině trifluoroctové s acetonitrilem. Peptid nevykázal větší vedlejší produkty.

Peptid byl v koncentraci 5 mg / ml solubilizován v 0,1 molárním fosfátovém pufru pH 7,5 a inkubován s předem aktivovaným gelem, vhodném pro afinitní chromatografii (Actigel, ALD-Superflow, Sterogene). Před smísením peptidu s gelem se předem aktivovaná matrice nadměrně promyla týmž fosfátovým pufrem. Tentýž objem předem promytého gelu se potom smísil s týmž objemem roztoku peptidu kvůli imobilizaci a potom s 0,1 objemových podílů roztoku 0,1 molárního kyanoborohydridu (NaCNBH₃) v 0,1 molárním fosfátovém pufru pH 7,5. Gel se suspendoval v tomto roztoku a třepal 15 hodin při teplotě místnosti. Následně se gel v nálevce s filtrem ze slinutého skla promýval desetinásobným objemem fosfátového pufru obsahujícího 150 mmol NaCl a pěti objemy fosfátového pufru obsahujícího 2 mol NaCl. Poté se gel ekvilibroval s přídavkem 0,1 molárního fosfátového pufru pH 7,0.

Gel se potom přenesl do chromatografické kolony mající rozměr průměru k výšce gelového lože 1: 4. Množství peptidu spojeného s afinitní matricí se vypočítá stanovením koncentrace peptidu roztoku inkubačního supernatantu po separaci od gelu a promývacích roztoků. Míra spojení je 85 %.

Gel se pak použil k čistění vWF od komplexu Faktoru Vlil (FVIII). Komplexní koncentrát FVIII/vWF byl produkován podle US 4,814,435 obsahující vWF v koncentraci 260 U vWF ; Ag / ml a se specifickou aktivitou 13,5 U vWF : Ag / ml proteinu. Koncentrát byl zředěn 20 mM fosfátového pufru pH 7,0 na finální vWF koncentaci 6 U vWF : Ag / ml. Objem 20 ml tohoto roztoku se vnesl do shora popsané afinitní kolony s imobilizovaným peptidem. Po promytí kolony 10 ml fosfátového pufru se vWF, specificky vázaný na peptidový ligand, eluuoval lineárním gradientem od 0-2 mol /1 NaCl ve fosfátovém pufru průtokovou rychlostí 1 ml / min. Sbíraly se frakce o 1 ml a při 280 nm se stanovila jejich optická hustota. Všechny frakce se měřily na jejich obsah vWF antigenu stanovovaného speciální ELISA metodou (Asserachrom vWF, Boehringer, Mannheim). Měření vykázalo specifický peak vWF eluujícího z peptidu při koncentraci NaCl 100 mmol / I, zatímco většina proteinu měřeného UV absorpcí eluovala s promývacím pufrem před frakcí vWF. vWF obsahující frakce se shromáždily a změřila se jejich vWF aktivita. vWF v tomto sběru měl specifickou aktivitu 95 U vWF / mg proteinu a je v podstatě prostý jiných proteinů.

• 44* • 4 • * · ·

Příklad 5

Protilátky anti-vWF-cp polypeptidu

Syntetizoval se peptid se sekvencí AAGGILHLELLV (SEQ ID NO 1) a vyčistil se jak se popisuje v příkladu 4. Peptid se potom využil k imunizaci 3 měsíce starých BALB / c myší podle následujícího protokolu: primární subkutánní injekce 100 pg peptidového antigenu emulzifikovaného ve 100 μί Freundova kompletního adjuvantu, následovaná intraperitoneálním zvyšováním dávek 100 pg peptidového antigenu ve fosfátem pufrované solance v měsíčních intervalech.

Antipeptidový titr se testoval rutinní metodou ELISA za použití vyčištěného peptidu jako screeningového antigenu. Po přidání konečné dávky se z myší odebrala slezina pro buněčnou fúzi. Buněčná fúze se provedla podle standardního protokolu původně popsaného Kohlerem a spol. [Nátuře 256, 495-497 (1975)]. Antipeptidové protilátky produkující buněčné řady hybridomů, se s vyčištěným peptidem jako screeningovým antigenem, podrobily screeningu standardními technikami, v podstatě založenými na konvenční ELISA metodologii. Po klonování může být izolována buněčná řada s vysokou úrovní exprese protilátky specifické pro screeningový peptid se sekvencí AAGGILHLELLV. Tato buněčná řada se kultivovala v séra prostém kultivačním mediu a vypěstovala do vysoké hustoty. Supernatant buněčné kultury se podrobil centrifugování, aby se odstranily buňky a monoklonální protilátka obsahující supernatant se koncentrovala ultradiafiltrací a upravila pro další použití.

Získaná monoklonální protilátka má vysokou selektivitu pro vWF štěpící proteázu jak popsal Furlan a spol. [Blood 87, 4223-4234 (1996)]. Tato monoklonální protilátka se přes noc (16 hodin) při 4°C imobilizovala na polystyrénové ELISA destičce v karbonát / bikarbonátovém pufru, 0,05 mol, pH 9,6, při koncentraci 5 pg imunoglobulinu / ml, se 100 pl krycího roztoku na jamku. Krycí roztok se z jamek odstranil a na 2 hodiny zaměnil roztokem albuminu hovězího séra (BSA) o koncentraci 100 pg / ml, při objemu 100 pl na jamku. BSA roztok se odstranil a jamky se promyly fosfátem pufrovanou solankou. Předem pokryté destičky se potom inkubovaly buď se vzorky na krevní destičky chudé plazmy od zdravých dárců lidské plazmy nebo na krevní destičky chudé plazmy od pacientů s nejasnou diagnózou • * · » • · · · • · · r « · · · • · · · · • · · · · · buď trombotické trombocytopenní purpury (TTP) nebo hemolytického uremického syndromu (HUS). Po inkubaci vzorků plazmy s protilátkou pokrytými ELISA destičkami jako při rutinním sendvičovém ELISA systému, se z jamek po 3 hodinách odstranila plazma. Jamky se promyly fosfátem pufrovanou solankou a inkubovaly s monoklonální protilátkou zaměřenou proti peptidu se sekvencí AAGGILHLELLV, spojenou s peroxidázou křene podle metody Wilsona a spol. (v : Immunofluorescence and Related Staining Techniques, editoři Knapp W., Holubař K. a Wick G., str. 215, Elsevier/North Holland, Amsterdam 1978) a detegovaly se pomocí OPT reagentu, jak popsal Cathy a spol. ( ELISA and related enzyme immunoassays, v Antibodies II a practical approach, editor Cathy D., str. 97, IRL Press Eynsham Oxford England).

Na základě úrovně vzorků od zdravých dárců lidské plazmy se stanovil normální rozsah. Plazmy od pacientů s HUS měly aktivitu vWF proteasy ekvivalentní zdravým lidem, zatímco pacienti s TTP měli sníženou aktivitu proteasy, jak bylo potvrzeno analýzou založenou na odlišném principu eseje, jak se popisuje v WO 00/50904.

Příklad 6

Klonování genu proteázy štěpící vWF

Póly A+ RNA lidské slinné žlázy byla zakoupena u Clontech. První řetězec cDNA byl získán za použití Expand reverzní transkriptázy (Hoffmann La Roche) a oligo d (T) primeru podle instrukcí výrobce. PCR se provedla za použití 5'-CGGCGGGATCCTACACCTGG-3' (SEQ ID NO 10) a

5'-AATGGTGACTCCCAGGTCGA-3' (SEQ ID NO 11) jako primerů s 10 ng cDNA slinné žlázy jako templátu a 10 U Hot Star Taq polymerasy (Qiagen). Parametry termického cyklování byly počáteční inkubace při 94°C, po 15 minutách následovaná 45 cykly 94°C (50 s), 50°C (50 s), 72°C (2 min). PCR produkty se přímo sekvencovaly v obou směrech za použití BigDye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PerkinElmer Life Science).

Získaná DNA sekvence se použila ke skenování genomické databáze při aplikaci programu BLAST (basic local aligment search tool, základní vyhledávací pomůcky lokálního seřazení) a porovnával se chromozom 9 klon RP11-224N20. DNA sekvence se translatovala do sekvence aminokyselin pomocí ExPASy

0·*· ·· ··« · proteomických pomůcek. DNA a translatovaná sekvence aminokyselin odpovídající 4 údajným exonům chromozomu 9q34 je uvedena na obr. 5.

RT-PCR fragmenty zahrnující buď pre-prosekvenci nebo vyvinuté domény proteázy štěpící vWF, se klonovaly ve vektoru pDrive (Qiagen) pomocí PCR klonování. Pro amplifikaci vyvinuté vWF-cp se použily primer # 6601 (5'AGCGGTCTCTATGGCTGCAGGCGGCATCCTACACC-3') (SEQ ID NO 30) a # 6617 (5'-AGCCTCGAGCTGGCCAGACACGGAACAAAT-3') (SEQ ID NO 31). Vznikající fragment DNA je připojen k T-překryvům vektoru pDrive. Konstrukt obsahující vyvinutou vWF-cp se nazývá pFP H251/8. Pro amplifikaci preprosekvence se používají primery # 66128 (5-GGCGAATTCATGCYCCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO 32) a # 6787 (5'-ACAGCATTAAACTAAGCCGCC-3') (SEQ ID NO 33). Vznikající fragment DNA se vloží do vektoru pDrive. Vznikající konstrukt se nazývá pFP H262-35/14.

Příklad 7

Exprese vWF štěpící proteasy

Pro expresi úplné délky vWF štěpící proteázy (vWF-cp) se použije eukaryotický expresní vektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen) za kontroly lidským CMV promotorem.

Z plazmidů pFP H251/8 se vyřízne fragment EcoRI / Xhol 4,12 kB, fragment zahrnující cDNA sekvenci kódující vyvinutou vWF-cp z nukleotidu nt 223 až 4284 (bez pre-prosekvence od nt 1 do nt 222) a vloží do EcoRI / Xhol míst v pcDNA3.1(+). Ke zkompletování 5'-konce, aby se přidala vedoucí a propeptidová sekvence, se provede PCR za použití plazmidů pFP H262-35/14, který obsahuje cDNA sekvenci vWF-cp od nt -10 (10 nt proti směru od počátečního kodónu AFG) do nt +824 ve vektoru pDrive (Qiagen) jako templát a přímý primer 6839 (5'-GATCGAATTCGCCGGCCACCATGCACCAGCGTCACCC CCG-3') (SEQ ID NO 34), obsahující v sobě shodu s Kozákovou sekvencí (podtrženo) pro optimální souvislost k rozeznávání počátečního kodónu a reverzního primeru 3113 (5'-CGGATAACAATTTCACACAGG-3') (SEQ ID NO 35), který se váže v lacZ oblasti vektoru pDrive. PCR se uskutečňuje za standardních reakčních podmínek za použití HotStar DNA polymerázy (Qiagen) a Q-roztoku (Qiagen). Amplifikovaný fragment obsahující nt -10 až +824 byl krácen s EcoRI a Ascl a použit k náhradě EcoRI / Ascl «_ν »··· .» ···· *· ···· «». *· .»· · • ««· · · · < · fragmentu neúplného klonu obsahujícího pouze vyvinutou sekvenci vWF-cp. Tento konstrukt kódující kompletní sekvenci vWF-cp, nazývaný pCMV-vWFcp se dále použije k transfekčním a expresivním studiím v savčích buňkách.

Pro expresi vWF-cp se SKHep buňky (ATCC) buňky přechodně transfektovaly plazmidem pCMV-vWFcp a jako kontrola paralelně matečným vektorem cDNA3.1(+) za použití Lipofectamine 2000 (Life Technologies, lne.). Transfektované buňky se za standardních podmínek kultivovaly v mediu DMEM / HAM F12 (1:1) (GIBCO) s 10 % plodovým telecím sérem při teplotě 37°C a 5 % CO2.

Exprese vWF se analyzovala westernovým přenosem, pomocí něhož vzorky kondiciovaného media a sklizených buněk byly podrobeny SDS-PAGE na gelu 4 % ukládání / 6 % separace a analýza westernového přenosu se prováděla za použití anti-vWF-cp z plazmy pacienta s TTP, obsahující polyklonální anti-vWF-cp protilátky a kozí-anti-hu-lgG (Fab-specifické AB, SIGMA). vWF specifické pásy byly vizualizovány pomocí BCIP / NBT detekce.

vWF-cp by mohla být detegována ve vzorku buněčného lyzátu a zdá se, že je převážně asociována k buňce. Výsledky analýzy westernového přenosu jsou uvedeny na obrázku 7, ukazujícího proteinové pásy vWF-cp kolem molekulové hmotnosti zhruba 170 kD, reagující s pacientovým sérem.

Buněčné lyzáty buněk exprimujících vWF-cp se dále testovaly na vWF-cp aktivitu podle metody, kterou popsal Furlan a spol. [Blood 87, 4235-4244 (1996)] a analýza vWF multimerů se provedla na 1 % SDS agarosovém gelu, jak popsal Ruggeri a spol. [Blood 57, 1140-1143 (1981)] (Obr. 8). Biologická aktivita vWF-cp exprimované v savčích buňkách může být jasně prokázána, když se vysokomolekulární vWF degraduje na vWF molekuly mající nižší molekulovou hmotnost (Obr. 8, pruh 5).

Claims (24)

1. Patentové nároky

   1. Polypeptid vWF-cp, zahrnující (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající alespoň 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a).
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kódující polypeptid, který má sekvenci aminokyselin znázorněnou na obr. 5 nebo její částečnou sekvenci alespoň 12 aminokyselin.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, mající aktivitu vWF-cp.
4. 4. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde tento polypeptid si zachovává aktivitu proteázy štěpící vWF v přítomnosti inhibitoru serinové proteázy šeřinu a inhibitoru calpainové proteázy.
5. 5. Izolovaný polypeptid, zahrnující sekvenci aminokyselin, která má alespoň 80 % identity se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.
6. 6. Izolovaný polypeptid, zahrnující sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.
7. 7. V podstatě čistý vWF-cp polypeptid, vybraný ze skupiny polypeptidu zahrnujícího (a) sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5, nebo (b) sekvenci aminokyselin mající alespoň 80 % identity se sekvencí aminokyselin pod (a).
8. 8. V podstatě čistý vWF-cp polypeptid podle nároku 7, kde tento polypeptid vykazuje při SDS-PAGE analýze za redukujících podmínek zdánlivou molekulovou hmotnost asi 180 kD, 170 kD 160 kD nebo 120 kD.

   ···· ·· · · · ·
9. 9. V podstatě čistý vWF-cp polypeptid podle nároku 7, kde tento polypeptid vykazuje při SDS-PAGE analýze za neredukujících podmínek zdánlivou molekulovou hmotnost asi 150 kD, 140 kD 130 kD nebo 110 kD.
10. 10. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje obsahující polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 9. χ
11. 11. Kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále zahrnuje iont dvojmocného kovu vybraného ze skupiny Ca²⁺, Sr²*, Ba²⁺ a Mg²⁺.
12. 12. Kompozice podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že zahrnuje clusterin nebo jeho analog či derivát mající aktivitu clusterinu.
13. 13. Molekula nukleové kyseliny, zahrnující sekvenci nukleové kyseliny kódující vWF-cp polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
14. 14. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 13, kódující vWF-cp polypeptid podle obr. 5 nebo jeho částečnou sekvenci.
15. 15. Expresní vektor, zahrnující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 13.
16. 16. Hostitelská buňka, zahrnující expresní vektor podle nároku 15.
17. 17. Způsob produkce polypeptidu vWF-cp proteázy, vyznačující se tím, že

    - se pěstují hostitelské buňky podle nároku 16 v živném mediu za podmínek pro expresi uvedeného polypeptidu,

    - exprimovaný polypeptid se sklízí,

    - uvedený polypeptid se izoluje.
18. 18. Způsob čistění vWF, vyznačující se tím, že

    - se poskytne vWF-cp polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 jako ligand,

    - s tímto polypeptidovým ligandem se uvede do styku roztok zahrnující vWF za podmínek, při nichž se vWF váže na tento ligand a

    - z ligandu se získá vyčištěný vWF.
19. 19. Způsob produkce protilátek proti vWF-cp polypeptidu, vyznačující se tím, že se zvíře imunizuje vWF-cp polypeptidem podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 a ze zvířete se izolují protilátky proti vWF-cp polypeptidu.
20. 20. Molekula vázající vWF-cp polypeptid, vybraná ze skupiny protilátek, jednořetězových protilátek, Fab- nebo Fab' 2-fragment, peptid nebo polypeptidy s místem vázání vWF proteázy, připravitelná způsobem, při němž je knihovna fágového zobrazení screeningována na molekulu vázající anti-vWF-cp polypeptid, je určena sekvence nukleové kyseliny pozitivních klonů a molekula nukleové kyseliny obsahující tuto sekvenci se klonuje v expresním vektoru.
21. 21. Způsob čistění vWF-cp polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje krok uvedení roztoku obsahujícího vWF-cp polypeptid do styku s molekulou vázající polypeptid vWF proteasy podle nároku 20 za podmínek, při nichž je vWF-cp polypeptid vázán k této vWF-cp polypeptid vázající molekule, selektivní eluování vWF-cp polypeptidu z této vázající molekuly a získání vyčištěného vWF.
22. 22. Způsob detekce vWF-cp polypeptidu ve vzorku, vyznačující se tím, že roztok s předpokládaným obsahem vWF-cp je uveden do styku s molekulou vázající vWF-cp polypeptid podle nároku 20, aby se umožnila tvorba komplexu vWFcp polypeptid / vázající molekula, a detekuje se tento komplex.
23. 23. Použití vWF-cp polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro produkci preparátu pro profylaxi a terapii trombózy a tromboembolického onemocnění.
24. 24. Použití podle nároku 23, kde tromboembolickým onemocněním je trombotická trombocytová purpura (TTP), Henochova-Schónleinova purpura, preemklapsie, neonatální trombocytopenie nebo hemolytický syndrom.

    SCHÉMA CISTENI