SK288119B6 - Von Willebrand Factor (vWF) cleaving protease polypeptide, nucleic acid encoding the polypeptide and use of polypeptide - Google Patents

Abstract

The invention relates to von Willebrand factor (vWF) cleaving protease polypeptide, a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of a vWF-cp polypeptide and a composition comprising the polypeptide. The invention also relates to the use of the vWF cleaving protease polypeptide for production of vWF cleaving protease polypeptide binding molecules and for production of a preparation for prophylaxis and therapy of thrombosis and thromboembolic disease.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka polypeptidu proteázy štiepiacej vWF (vWF cleaving protease, vWF-cp) alebo jeho parciálnej sekvencie, molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej sekvenciu aminokyselín vWF-cp polypeptidu a kompozície obsahujúcej tento polypeptid. Vynález sa tiež týka využitia vWF-cp polypeptidu na produkciu anti-vWF-cp polypeptidických protilátok a na produkciu prípravku na profylaxiu a terapiu trombózy a tromboembolického ochorenia.

Doterajší stav techniky vWF je glykoproteín cirkulujúci v plazme ako rad multimérov dosahujúcich veľkosť od okolo 500 do 20 000 kD. Multiméme formy vWF sú zložené z polypeptidových podjednotiek o 250 kD, spojených spolu disulfidickými väzbami. vWF sprostredkováva počiatočnú adhéziu krvných doštičiek k subendotéliu poškodenej steny ciev, aj keď len pri najväčších multiméroch sa zdá, že prejavujú hematostatickú aktivitu. Tak sú vWF multiméry, ktoré majú veľké molekulové hmotnosti, ukladané vo Weibelovych Paladeových telieskach endoteliálnych buniek a má sa za to, že endoteliálne bunky vylučujú tieto veľké polyméme formy vWF. O tých formách vWF, ktoré majú nízku molekulovú hmotnosť (nízkomolekuláme či LMW vWF), sa verí, že vznikajú proteolytickým štiepením väčších multimérov.

Malá časť vWF prítomného v normálnej plazme cirkuluje ako fragmenty o 189 kD, 176 kD a 140 kD vznikajúce proteolytickou degradáciou vWF in vivo, pričom fragment 140 kD pochádza z N-terminálnej oblasti a fragment 176 kD z C-terminálnej oblasti podjednotky. Keď sú z normálnej ľudskej plazmy izolované nízkomolekuláme (LMW) formy vWF a po redukcii disulfidov podrobené SDS-PAGE (polyakrylamidová - gélová elektroforéza), zisťuje sa neobvykle vysoký podiel vWF fragmentov. Toto zistenie je kompatibilné s názorom, že LMW formy vWF boli čiastočne alebo prevažne odvodené z veľkých multimérov proteolytickou degradáciou.

Proteolytická degradácia vWF je u zdravých jedincov fyziologickým procesom, ale u pacientov trpiacich von Willebrandovou chorobou (vWD) typu 2A môže byť zrýchlená a následkom toho chýbajú týmto pacientom vWF multiméry s najväčšími molekulovými hmotnosťami. Nedostatok veľkých vWF multimérov a zvýšená úroveň proteolytických fragmentov boli pozorované tiež pri získanej von Willebrandovej chorobe spojenej s myeloproliferačným syndrómom, čo ukazuje pri tejto poruche rovnako na zvýšenú proteolýzu in vivo.

Na druhej strane sú u pacientov s trombotickou trombocytopenickou purpurou (TTP) detegované neobvykle veľké vWF multiméry a u týchto pacientov bolo preukázané zvýšené viazanie vWF na krvné doštičky [Moake a spol., N. Engl. J. Med. 307, 1432-1435 (1982)]. Dedičná TTP je spojená s vážnym vrodeným nedostatkom vWF-proteázy, pričom prítomnosť vWF štiepiacich proteáz inhibujúcich vlastné protilátky bola pozorovaná u pacientov s nededičnou TTP.

Veľké multiméry spojené s TTP normálne miznú potom, keď pacient dostane transfúziu s normálnou čerstvo zmrazenou plazmou. V súčasnej dobe je výmena plazmy najvýznamnejším liečením TTP, hoci pri tejto terapii boli zaznamenané výrazné vedľajšie efekty. Existencia vážneho vrodeného nedostatku vWF-proteázy bola potvrdená u pacientov s dedičnou TTP a prítomnosť vWF štiepiacich proteáz inhibujúcich vlastné protilátky bola pozorovaná u pacientov s nededičnou TTP.

Niektoré proteázy sa dokázali ako schopné štiepiť vWF a tým narušovať jeho väzobnú afinitu na krvné doštičky. Ale štiepenie vWF týmito proteázami in vitro poskytuje v každom prípade štiepne produkty odlišné od fragmentov pochádzajúcich zo štiepenia in vivo.

Tak napríklad zatiaľ čo plazmín je schopný štiepiť niektoré peptidové väzby vo vWF, plazmínom ošetrený vWF si zachováva oblasť vysokomolekulárneho jadra, ktorá si uchováva okolo 70 % svojej aglutinačnej aktivity krvných doštičiek (stanovené ako ristocetínový kofaktor). V počiatočných štádiách pôsobenia plazmínu je odštepovaný z N-zakončení jednotlivých vWF podjednotiek peptid s 34 kD a mapovanie epitopov takých plazmínom indukovaných fragmentov ukazuje, že tieto fragmenty pochádzajú z oblastí podjednotky vWF, ktoré sú odlišné od vWF fragmentov prítomných v cirkulujúcej plazme.

Bolo tiež dokázané, že pankreatická elastáza prasiat a rôzne serínové proteázy uvoľňované z ľudských leukocytov degradujú proteolyticky vWF s výslednou stratou veľkých multimérov. Mapovanie epitopov degradačných produktov znovu ukazuje, že sa tieto fragmenty rovnako líšia od tých, ktoré sú prítomné v normálnej plazme a vo vWD typu 2A. Okrem toho sa ukázalo, že calpaínu podobná proteáza uvoľňovaná z ľudských krvných doštičiek degraduje veľké vWF multiméry a vytvára fragmenty podobné tým, čo boli pozorované in vivo.

SK 288119 Β6

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je poskytnúť polypeptid proteázy štiepiaci vWF (vWF-cp) alebo jeho parciálnu sekvenciu.

Iným predmetom vynálezu je poskytnúť kompozíciu obsahujúcu vWF-cp polypeptid.

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnúť molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu sekvenciu aminokyselín vWF-cp polypeptide.

Predmetom vynálezu je tiež poskytnúť rekombinantný vWF-cp polypeptid.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť spôsob produkcie rekombinantného vWF-cp polypeptidu.

Predmetom vynálezu je rovnako poskytnúť metódu čistenia vWF s použitím vWF-cp polypeptidu alebo jeho parciálnej sekvencie.

Predmetom vynálezu je tiež poskytnúť ligandy anti-vWF-cp polypeptidu.

Podrobný opis vynálezu

Podľa jedného z predmetov vynálezu je tu poskytovaný vWF-cp polypeptid zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín AAGGILHLELLV (SEQ ID NO. 1), kde aktivita vWF-cp je definovaná (1) štiepením vWF v mieste peptidovej väzby 845Tyr-843Met, (2) tým, že má priamu proteolytickú aktivitu, ktorá konvertuje vWF so singletovou štruktúrou na vWF so satelitnou štruktúrou, a (3) zachovaním aktivity v prítomnosti, individuálne, inhibítora serínovej proteázy diizopropylfluórfosfátu (DFP) a inhibítora calpaínovej proteázy karbobenzyloxy(Z) peptidyl diazometylketónu (Z-Leu-Leu-Tyr-CHN₂).

Výhodne má polypeptid molekulovú hmotnosť približne 180 kD, približne 170 kD, približne 160 kD alebo približne 120 kD zistenú pomocou SDS PAGE za redukujúcich podmienok.

Polypeptid podľa tohto aspektu vynálezu môže obsahovať aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO. 2 alebo SEQ ID NO. 3. Taktiež sú opísané polypeptidy obsahujúce sekvenciu aminokyselín SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, alebo sekvenciu aminokyselín majúcu najmenej 80 %, najmenej 90 % alebo najmenej 95 % identity so sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.

Tiež je opísaný polypeptid, ktorý má na obr. 5 ukázanú sekvenciu aminokyselín alebo jej parciálnu sekvenciu najmenej 12, najlepšie najmenej 15 aminokyselín. Polypeptid vWF-cp podľa vynálezu si prednostne udržuje aktivitu vWF proteázy v prítomnosti inhibítora serínových proteáz a inhibítora calpaínových proteáz. Inhibítorom serínových proteáz môže byť diizopropyl-fluórfosfát, alebo ktorýkoľvek z jeho analógov, ktorý má aktivitu inhibítora serínových proteáz. Inhibítorom calpaínu môže byť Z-Leu-Leu-Tyr-CHN₂ alebo ktorýkoľvek z jeho analógov, ktorý má aktivitu inhibítora calpaínu.

Termínom „polypeptid“ sa rozumie reťazec aminokyselinových zvyškov spojených peptidovými väzbami medzi α-uhlíkom karboxylu jednej aminokyseliny a α-dusíkom nasledujúcej aminokyseliny a obsahujúci 10 alebo viac aminokyselinových zvyškov spojených dohromady. Polypeptid môže obsahovať iné než 20 génom kódovaných aminokyselín. „Polypeptid“ sa vzťahuje ako ku krátkym reťazcom, tak peptidom, oligopeptidom alebo oligomérom, ako i dlhším reťazcom všeobecne nazývaným proteíny. „Polypeptid“ zahrnuje sekvencie aminokyselín modifikované buď prírodnými procesmi, ako sú posttranslačné modifikácie, alebo chemické modifikácie, ktoré sú v praxi odboru známe. K modifikáciám môže pri peptide dôjsť kdekoľvek. Modifikácia môže viesť k variantu polypeptidu, ktorý sa od sekvencie aminokyselín v originálnom polypeptide môže líšiť jednou alebo viacerými substitúciami, adíciami, vypusteniami, fúziami či akoukoľvek kombináciou, alebo k prirodzene sa vyskytujúcemu variantu, ako je alelický variant, alebo k variantu prirodzene sa nevyskytujúcemu, vzniknutému mutagenézou alebo génovým inžinierstvom. „Polypeptid“ môže byť vo forme nespracovaného alebo čiastočne spracovaného prekurzora, „maturovaného“ polypeptidu alebo fragmentu majúceho sekvenciu aminokyselín, ktorá je úplne tá istá ako časť zo sekvencie aminokyselín dlhšieho polypeptidového reťazca, ale nie celá. Fragment môže byť kratší jednotlivou súvislou oblasťou dlhšieho reťazca, alebo obsiahnutý vnútri dlhšieho polypeptidu, ktorého časť tvorí. Fragment polypeptidu môže zahrnovať napríklad skrátený polypeptid majúci čiastočnú aminokyselinovú sekvenciu vWF-cp. „Fragmentom“ môže byť biologicky aktívny fragment, ktorý sprostredkováva aktivitu proteázy štiepiacej vWF, vrátane tých s podobnou aktivitou alebo zlepšenou aktivitou, alebo so zníženou aktivitou.

„Identita“ znamená identitu sekvencie aminokyselín polypeptidu so sekvenciou aminokyselín polypeptidu obsahujúcou sekvencie SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 alebo SEQ ID NO 5. „Najmenej 80 % identity“ znamená, že sekvencia aminokyselín je identická s tou výnimkou, že sekvencia polypeptidu sa líši nie menej než v 20 aminokyselinách na 100 aminokyselín. „Najmenej 90 %“ alebo „najmenej 95 % identity“ znamená rozdiel nie menej než v 10 alebo nie menej než v 5 aminokyselinách na 100 aminokyselín.

Termín „vWF štiepiaca proteáza“ (vWF-cp) znamená proteín alebo polypeptid majúci aktivitu vWF štiepenia a štiepiace vWF vysokomolekulárne vWF multiméry na molekuly nižšej molekulovej hmotnosti, ktoré ešte majú vWF aktivitu a vlastnosti.

SK 288119 Β6

Termín „polypeptid proteázy štiepiace vWF“ znamená polypeptid majúci najmenej 10 aminokyselinových zvyškov. Úplná sekvencia aminokyselín nespracovaného polypeptidu obsahuje 1 427 aminokyselín. „Maturovaný“ polypeptid, ktorý je časťou väčšieho nespracovaného polypeptidu, by mal normálne začínať pri alebo blízko pri aminokyseline 75, počínajúc AAGGILH a pokračovať ku karboxylovému zakončeniu. Proteáza štiepiaca maturovaný vWF má vypočítanú hmotnosť polypeptidu okolo 145 kD. Obsiahnuté môžu byť ďalšie aminokyseliny, ktoré obsahujú sekrečné alebo vedúce sekvencie, prosekvencie, sekvencie, ktoré napomáhajú čisteniu alebo identifikácii, ako sú násobné His zvyšky, FLAG prívesok alebo ďalšie sekvencie kvôli stabilite počas rekombinantnej produkcie.

Termín „aktivita štiepenia vWF“ znamená fyziologickú aktivitu štiepenia vWF, ktorú definuje (1) štiepenie vWF na peptidovej väzbe 842Tyr-843Met, (2) vlastnosť priamej proteolytickej aktivity, ktorá konvertuje vWF majúci singletovú štruktúru na vWF majúcom satelitnú štruktúru a (3) zachovanie aktivity v prítomnosti inhibítora serínovej proteázy, ako je diizopropyl-fluórfosfát (DFP), a v prítomnosti inhibítora calpaínovej proteázy, ako je inhibítor karbobenzyloxy-(Z)-peptidyl-diazometylketón (Z-Leu-Leu-Tyr- CHN₂). Proteolytické entity, ktoré tento vynález poskytuje, môžu pôsobiť tiež nepriamo, cestou iného proteínu ako efektora, napríklad proteázy. Tento polypeptid môže tvoriť aktívny, vWF štiepiaci komplex spolu s iónom kovu vybraným zo skupiny, ktorú tvorí Ca⁺⁺, Sr**, Mg⁺⁺ a Ba**. Preferovaným iónom kovu je Ca**. Ako je opísané skôr, je tento aktívny komplex schopný štiepiť vWF fyziologickým spôsobom. Aktivita polypeptidu podľa predkladaného vynálezu pri štiepení vWF môže byť stanovená ktoroukoľvek, v odbore opísanou metódou, ako je spôsob podľa Furlana a spol. [Blood 87,4223-4234 (1996)] alebo ako je opísané vo WO 00/5094. Ako testovací systém môže byť alternatívne využitá tiež analýza viazania kolagénu, ako je napr. opísaná v EP 0 816 852.

Polypeptid podľa vynálezu môže byť izolovaný.

Termín „izolovaný“ predstavuje zmenený od prírodného stavu a/alebo odstránený zo svojho pôvodného prostredia.

Polypeptid podľa vynálezu môže byť v podstate čistý.

Termín „v podstate čistý“ predstavuje čistotu tak vysokú ako pomerné podiely polypeptidových reťazcov s vWF-cp aktivitou, prítomných v množstve 50 %, najmä 80 % a prednostne 90 % z celkového proteínu, v porovnaní s aktivitou vWF proteázy v plazme. Čistota sa určuje ako čistota stanovená pomocou SDS-PAGE (farbené striebrom alebo Commassie farbivami) a westemového prenosu a pomerom polypeptidu vWF proteázy k celkovému množstvu proteínu a zmienená čistota je prednostne väčšia než okolo 98 %. Ak je vyčistený vWF-cp polypeptid vyčistený z plazmy, obsahuje preparát medzi 0,001 % a 1 %, prednostne 0,002 % pôvodného množstva proteínu plazmy a najmenej 1 %, prednostne najmenej 2,3 % pôvodnej enzymatickej aktivity, ktorá môže byť počas čistiaceho postupu čiastočne inaktivovaná. Prípravok obsahujúci vWF-cp polypeptid podľa predloženého vynálezu je v podstate zbavený vWF alebo vWF fragmentov, t. j. má obsah vWF pod 5 %, prednostne pod limit detekcie analýzy používanej na detekciu vWF, ako je analýza kolagénu opísaná v EP 0 816 852.

V podstate čistý vWF-cp polypeptid javí pri SDS-PAGE analýze za redukujúcich podmienok zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 180 kD, 170 kD 160 kD alebo 120 kD.

V podstate čistý vWF-cp polypeptid javí pri SDS-PAGE analýze za neredukujúcich podmienok zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 150 kD, 140 kD 130 kD alebo 110 kD.

SDS-PAGE sa uskutočňuje za redukujúcich podmienok alebo za neredukujúcich podmienok. V praxi odboru je všeobecne známe, že pri určovaní molekulovej hmotnosti pomocou SDS-PAGE je výsledkom detekcia zdanlivých molekulových hmotností, ktoré sa môžu líšiť od molekulových hmotností natívneho, nedenaturovaného proteínu.

Analýza nedetanurovaného materiálu hmotnostnou spektrometriou preukázala veľmi široké peaky vysokej molekulovej hmotnosti. Tento nález je v súhlase s pozorovaním pri experimentoch gélovej filtrácie nasvedčujúcim, že proteíny v tomto preparáte sú náchylné k polymerizovaniu za fyziologických podmienok (vlastnosť clusterínu).

Polypeptid podľa vynálezu môže byť izolovaný z akéhokoľvek zdroja, ktorý obsahuje vWF-cp polypeptid.

Termínom „zdroj“ sa mieni ľudská plazma, supematant bunkovej kultúry exprimujúci vWF-cp polypeptid, mlieko alebo iné telesné kvapaliny transgénnych zvierat exprimujúcich polypeptid podľa vynálezu.

Čistenie vWF-cp polypeptidu môže byť uskutočňované kombináciou chromatografických krokov, počítajúc do toho imunoafinitnú chromatografiu, gélovú filtráciu a chromatografiu iónovo výmennou. Prvým rafinačným krokom môže byť napríklad imunoafmitná chromatografia, druhým krokom môže byť gélová filtrácia, nasledovaná jedným alebo viacerými ďalšími krokmi imunoafitnitnej chromatografie. Rafinácia môže byť uskutočňovaná ďalej s použitím iónovo výmennej chromatografie, prednostne aniónovo výmennej chromatografie a aspoň jednej afinitnej chromatografie. Ďalšie rafinačné kroky môžu byť uskutočnené s použitím iónovo výmennej chromatografie, gélovej filtrácie a ďalších krokov afinitnej chromatografie.

Podľa druhého aspektu vynálezu je tu poskytovaná kompozícia obsahujúca vWF-cp polypeptid podľa vy4 nálezu. Taktiež sa opisuje kompozícia obsahujúca polypeptid, ktorý zahrnuje sekvenciu aminokyselín vybranú zo skupiny SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5 a sekvenciu aminokyselín majúcu najmenej 80 % identity so sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.

Kompozícia podľa vynálezu obsahujúca polypeptid môže obsahovať ďalej ión dvojmocného kovu vybraného zo skupiny Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ a Mg²⁺.

Iný aspekt predloženého vynálezu sa týka komplexu izolovaného vWF-cp polypeptidu majúceho vWF-cp aktivitu, vWF a kovového iónu vybraného zo skupiny Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ a Mg²⁺. Preparát môže obsahovať ióny dvojmocného kovu v koncentrácii od okolo 1 do 10⁶ iónov na molekulu polypeptidu s aktivitou vWF proteázy a môže obsahovať vWF-cp polypeptid podstate v vyčistenej forme.

Kompozícia môže obsahovať clusterín alebo jeho analóg, alebo derivát, ktoré majú aktivitu clusterínu. Vo vzťahu k aktivite proteínu sa termín „derivát“ alebo „analóg“ clusterínu týka polypeptidu, ktorý má tie isté charakteristiky ako protein natívneho clusterínu.

Clusterín je heterodimémy glykoproteín pozostávajúci z dvoch neidentických podjednotiek s molekulovou hmotnosťou približne 80 kD [Rosenberg a spol., Int. J. Biochem. Celí Biol. 27, 633-645 (1995); Tschop a spol., Clin. Exp. Immunol. 97 (Suppl. 2), 11-14 (1994)]. Je produkovaný širokým radom tkanív a nachádza sa vo väčšine biologických kvapalín. Fyziologické funkcie opisované v doterajšom stave techniky zahrnujú reguláciu komplementu, transport lipidov, zrenie spermie, iniciáciu apoptózy, endokrinnú sekréciu, ochranu membrány a podporu bunkových interakcií. Bolo zistené, že s prítomnosťou clusterínu v cirkulujúcej plazme je spojená neobvykle vysoká stabilita vWF-cp polypeptidu podľa predkladaného vynálezu, a že polčas aktivity proteázy štiepiacej vWF in vivo je medzi 1 a 4 dňami, zatiaľ čo iné proteázy v plazme majú polčas v rozsahu od sekúnd do hodín. Pomer clusterínu k polypeptidu vWF proteázy v kompozícii podľa predkladaného vynálezu je prednostne v rozsahu od 10M : IM až IM : 10M a preferovanejší pomer clusterínu a vWF je v rozmedzí ekvimolekulámom. V ľudskej plazme je koncentrácia vWF štiepiacej proteázy 1 až 10 mg/liter, zatiaľ čo pri clusteríne je 50 až 400 mg/liter plazmy (molárny pomer vWF štiepiacej proteázy proti clusterínu v ľudskej plazme je asi 1 : 20 až 1: 100).

Podľa tretieho aspektu vynálezu sa tu poskytuje molekula nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu polypepeptid podľa vynálezu. Tiež sa tu opisuje molekula nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu polypeptid, ktorý má sekvenciu aminokyselín vybranú zo skupiny SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5 a sekvenciu aminokyselín majúcu najmenej 80 % identity so sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.

Termín „molekula nukleovej kyseliny“ sa vzťahuje všeobecne na každú DNA alebo RNA a znamená polynukleotid, ktorý zahrnuje rovnako varianty DNA alebo RNA, DNA alebo RNA, ktoré môžu byť modifikované alebo nemodifikované, jednoreťazové alebo dvojreťazové, alebo ich zmes, alebo krátky polynukleotid všeobecne uvádzaný ako oligonukleotidy. Typický variant polynukleotidu sa líši v nukleotidovej sekvencií od sekvencie v pôvodnom polynukleotide a môže alebo nemusí meniť sekvenciu aminokyselín peptidu kódovaného referenčným polynukleotidom. Výsledkom zmien nukleotidu môžu byť substitúcie aminokyselín, adícia, vypustenie, fúzia alebo skracovanie v polypeptidovej sekvencií polypeptidu. Polynukleotidová sekvencia môže byť modifikovaná, aby sa zlepšila rekombinantná expresia. Také modifikácie zahrnujú používanie vysoko translatovaných kodónov. Do rámca predkladaného vynálezu patrí sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá hybridizuje s DNA sekvenciou, ako je ukázané na obr. 5 alebo parciálna sekvencia kódujúca aminokyselinu najmenej 12 aminokyselín. Hybridizačné techniky sú skúseným odborníkom dobre známe.

Podľa štvrtého aspektu vynálezu je tu poskytovaný expresný vektor obsahujúci molekuly nukleovej kyseliny podľa tretieho aspektu vynálezu. Tiež sa tu opisuje expresný vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny zahrnujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu polypeptid majúci SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5 a sekvenciu aminokyselín majúcu najmenej 80 % identity so sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5.

Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu môže byť využitá na konštrukciu expresných systémov poskytujúcich vhodné elementy na replikáciu vektora vnútri hostiteľských buniek a na expresiu polypeptidu majúceho aktivitu proteázy štiepiacej vWF podľa predkladaného vynálezu. Aby sa zlepšila expresia, môže byť sekvencia nukleovej kyseliny modifikovaná, napríklad adíciou Kozákovej sekvencie.

Expresný vektor môže v smere transkripcie obsahovať napríklad transkripčnú regulačnú oblasť a oblasť translačnej iniciácie funkčnú v hostiteľskej bunke, DNA sekvenciu obsahujúcu polynukleotid exprimujúci vWF-cp polypeptid podľa predkladaného vynálezu a translačnú a transkripčnú terminačnú oblasť fimkčnú v zmienenej hostiteľskej bunke, kde je expresia nukleovej sekvencie regulovaná iniciačnou a terminačnou oblasťou. Expresívny vektor môže rovnako obsahovať elementy na replikáciu nukleotidu. Príklady vektorov expresie DNA sú pBPV, pSVL, pRc/CMV, pRc/RSV, myogénne vektorové systémy, na pcDNA3 založený vektor (Invitrogén) alebo vektory pochádzajúce z virálnych systémov, napríklad z vakciniavírusu, adenovírusov, adeno-asociovaných vírusov, herpesvírusov, retrovírusov alebo bakulovírusov. Vhodné cicavčie expresívne vektory obvykle obsahujú jednu alebo viac eukaryotických transkripčných jednotiek, ktoré sú schopné expresie v cicavčích bunkách. Na sprostredkovávanie transkripcie cudzích DNA sekvencií pozostáva trans5

SK 288119 Β6 kripčná jednotka aspoň z elementu promótora. Vhodné promotóry pre cicavčie bunky sú v odbore známe a zahrnujú vírusové promótory ako napríklad zo simianvírusu 40 (SV40), cytomegalovírusu (CMV), vírusu Rousovho sarkómu (RSV), adenovírusu (ADV), hovädzieho papilomavírusu (BPV) alebo iných promótorov vybraných zo skupiny promótora metallotioneínu a promótora β-aktínu. Ďalšie v praxi známe promótory sú pre expresiu rovnako použiteľné.

Expresný vektor obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje vWF-cp polypeptid podľa predkladaného vynálezu, môže byť využitý na transformáciu hostiteľských buniek, ktoré potom polypeptid produkujú. Transformované hostiteľské bunky môžu byť pestované v bunkovom kultivačnom systéme na produkciu polypeptidu in vitro. Hostiteľské bunky môžu vylučovať polypeptid majúci aktivitu vWF proteázy do bunkového kultivačného média, z ktorého môže byť pripravený alebo polypeptid môže byť izolovaný z bunkového lyzátu.

Podľa piateho aspektu vynálezu sa tu poskytuje hostiteľská bunka obsahujúca expresný vektor podľa štvrtého aspektu vynálezu.

Tiež sa tu opisuje hostiteľská bunka obsahujúca expresný vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid obsahujúci SEQ ID NO 4 a SEQ IĎ NO 5 a sekvenciu aminokyselín majúcu najmenej 80 % identity so sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO 5. Expresný vektor môže byť transformovaný alebo transfektovaný do hostiteľských buniek na expresiu rekombinantného polypeptidu. Vhodné hostiteľské bunky zahrnujú každú bunku schopnú produkovať vWF-cp potom, keď bola transformovaná alebo transfektovaná. Preferované bunky predstavujú bakteriálne bunky, kvasinky, hmyzie bunky alebo živočíšne bunky. Hostiteľskou bunkou môže byť bunka pochádzajúca z tela cicavca, napríklad fibroblasty, keratinocyty, hematopoetické bunky, hepatocyty alebo myoblasty, ktoré sa transformujú in vitro expresným vektorovým systémom nesúcim nukleovú kyselinu podľa predkladaného vynálezu a reimplantujú do cicavca. Polypeptid podľa predkladaného vynálezu, kódovaný zmienenou nukleovou kyselinou, bude syntetizovaný týmito bunkami in vivo a oni budú u cicavca vyvíjať žiadanú biologickú aktivitu.

Rad cicavčích buniek, ktoré sú použiteľné ako hostitelia na expresiu, sú v praxi známe a zahrnujú mnohé rady imortalizovaných buniek dosiahnuteľných z American Type Culture Collection (ATCC). Príkladné cicavčie hostiteľské bunky zahrnujú najmä bunkové rady primátov a bunkové rady hlodavcov vrátane transformovaných bunkových radov. Prednostne, na stabilnú integráciu vektora DNA i nasledujúcu amplifikáciu integrovaného vektora DNA konvenčnými metódami sú ako preferované cicavčie hostiteľské bunky používané bunky z vaječníka čínskeho škrečka (CHO). Ďalšie vhodné bunkové rady zahrnujú HeLa bunky, ľadvinové bunky z mláďaťa škrečka (BHK), opičie ľadvinové bunky (COS-1), bunky z ľudského hepatocelulámeho karcinómu (napr. Hep G2), transformované 293 bunky ľudského adenovírusu, HEK 293bunky, SKHep bunky, myšie L-929 bunky, HaK bunkové rady škrečka, myšie 3T3 bunky pochádzajúce z myší Swiss, Balbc alebo NIH a množstvo ďalších bunkových radov, ale nie je to na ne obmedzené. Iný vhodný rad cicavčích buniek je bunkový rad CV-1. Normálne diploidné bunky, bunkové kmene pochádzajúce z kultivácie primárneho tkaniva in vitro, rovnako ako primáme explantáty, sú rovnako vhodné. Do úvahy prichádzajúce bunky môžu byť genotypicky deficientné na selekčný gén alebo môžu obsahovať dominantne pôsobiaci selekčný gén.

Hostiteľskými bunkami môžu byť buď transformované bunky, alebo netransformované bunky. Hostiteľskými bunkami sú prednostne tie, ktoré exprimujú fúrín buď prirodzene, alebo potom, keď boli geneticky spracované, aby exprimovali rekombinantný furín.

Výber vhodných cicavčích hostiteľských buniek a spôsobov na transformáciu, kultiváciu, amplifikáciu, skríning i produkciu a čistenie produktu sú v praxi odboru známe.

Hostiteľská bunka transformovaná vektorom nesúcim nukleovú kyselinu kódujúcu vWF-cp polypeptid, môže byť potom, pokiaľ sa to žiada, pestovaná za vhodných podmienok s génmi zavádzajúcimi amplifikáciu. Efektívne podmienky zahrnujú patričné médiá, bioreaktor, teplotu, pH a kyslíkové podmienky, ktoré dovoľujú produkciu proteínu, ale nie je to obmedzené len na ne. Spôsob podľa tohto predkladaného vynálezu teda zahrnuje kultiváciu vhodnej bunky (alebo bunkového radu), ktorá bola transformovaná sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej sekvenciu aminokyselín vWF-cp polypeptidu, kódujúcu sekvenciu ovládanú transkripčnou regulačnou oblasťou. Pokiaľ je exprimovaný polypeptid exprimovaný intraceluláme, potom sa príslušnými, odborníkovi známymi, prostriedkami znovu získava, izoluje a čistí od kultivačného média, pokiaľ bol vylučovaný bunkami alebo z bunky.

Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu alebo jej fragment môže byť exprimovaná v systéme eukaryotického alebo prokaryotického mikroorganizmu ako húb, vrátane kvasiniek alebo baktérií. Fragmenty môžu predstavovať skrátené formy proteázy štiepiacej vWF. Príklady skracovania zahrnujú N- alebo C-terminálne vypustenie, ale nie je to len takto obmedzené.

Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu môže byť využitá tiež na generovanie transgénnych živočíchov, ktoré zmienený polypeptid exprimujú in vivo. Pri jednom uskutočnení tejto špecifickej aplikácie môžu transgénne živočíchy exprimovať vWF-cp polypeptid v endogénnych žľazách, napríklad mliečnych žľazách, z ktorých sa zmienený proteín vylučuje. V prípade mliečnych žliaz je zmienený polypeptid vWF proteázy vylučovaný do mlieka živočíchov, z ktorého môže byť zmienený proteín preparovaný. Živočíchy môžu byť myši, dobytok, prasatá, kozy, ovce, králiky alebo ktorékoľvek ekonomicky užitočné zviera.

vWF-cp polypeptid podľa vynálezu môže byť využitý v spôsobe čistenia vWF poskytnutím vWF-cp polypeptidu podľa vynálezu ako lligandu, spojením roztoku obsahujúceho vWF s vWF-cp polypeptidom ako ligandom za podmienok, pri ktorých je vWF viazaný k ligandu a zo zmieneného ligandu znovu získaním vyčisteného vWF. vWF-cp polypeptidový ligand môže byť viazaný na tuhom nosiči.

Navyše ďalej môže byť vWF-cp polypeptid podľa vynálezu pomocou v odbore bežných techník využitý tiež na vyvinutie vWFcp polypeptid viažucich molekúl. Viažucimi molekulami môžu byť protilátky antivWF-cp polypeptidu, ktoré môžu byť produkované imunizáciou zvieraťa polypeptidom podľa vynálezu a izoláciou protilátok anti-vWF-cp polypeptidu zo zvieraťa.

„Protilátky“, ako je tu používané, predstavujú polyklonálne a monoklonálne protilátky, chimerické protilátky, jednoreťazové a humanizované protilátky, rovnako ako Fab fragmenty, vrátane produktov Fab alebo iné knižnice expresie imunoglobulínu, peptidov alebo peptidomimetík. Monoklonálne protilátky môžu byť produkované v odbore bežnými spôsobmi. Iné viažuce molekuly môžu byť deriváty protilátky, ako jednoreťazová protilátka, Fab- alebo Fab' 2-fŕagment, chimerická protilátka alebo peptid alebo peptidomimetikum, ktoré môžu byť získané známymi metódami, ako napr. metódou displeja fágu.

Molekula viažuca vWF-cp polypeptid, vybraná zo skupiny j ednoreťazových protilátok, Fab- alebo Fab' 2-fragment alebo polypeptidy s miestom viazania vWF proteázy môžu byť z hľadiska vynálezu produkované metódou, pri ktorej je knižnica displeja fágu skríningovaná na molekulu viažucu anti-vWF-cp polypeptid, stanoví sa sekvencia nukleovej kyseliny pozitívnych klonov a molekula nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu sa klonuje v expresívnom vektore.

Vývoj protilátok, derivátov protilátok, peptidomimetík alebo inej molekuly, ktorá viaže vWF-cp polypeptid, môže byť uskutočnený podľa metód známych v odbore skôr [Greer a spol., J. Med. Chem. 37, 1035-1054 (1994); Kemp, Trends Biotechnol. 8, 249-255 (1990)].

Molekula viažuca vWF-cp polypeptid podľa vynálezu môže byť využitá ako ligand na čistenie vWF-cp. Taký postup môže byť uskutočňovaný spojením roztoku obsahujúceho vWF-cp polypeptid s molekulou viažucou vWF-cp polypeptid za podmienok, pri ktorých vWF-cp polypeptid sa viaže k viažucej molekule a vyčistený vWF-cp polypeptid sa získava selektívnou elúciou vWF-cp polypeptide z vWF-cp polypeptid viažucej molekuly. Molekula viažuca vWF-cp polypeptid môže byť viazaná na tuhý nosič.

Molekula viažuca vWF-cp polypeptid môže byť rovnako využitá pri spôsobe detekcie vWFcp polypeptidu vo vzorke. Pritom je roztok s tušeným obsahom vWF-cp polypeptidu uvedený do styku s molekulou viažucou vWF-cp polypeptid, ako je uvedené skôr, za podmienok umožňujúcich tvorbu komplexu vWF-cp polypeptid/molekula viažuci vWF-cp polypeptid a detekciu komplexu.

vWF-cp polypeptid podľa vynálezu môže byť napríklad použitý na spracovávanie plazmatický alebo rekombinantne produkovaného vWF. Rekombinantný vWF (r-vWF) môže byť produkovaný v CHO bunkách, napr. podľa Fishera a spol. [FEBS Lett. 375, 259-262 (1995)]. r-vWF získaný týmto spôsobom je dostupný ako vyvinutý vWF a má singletovú štruktúru, t. j. líši sa od vWF pochádzajúceho z plazmy, ktorý má vždy charakteristickú satelitnú štruktúru, keď je skúšaný na 2 % SDS agarozových géloch. U. S. patent 5 854 403 uvádza, že r-vWF je zložený z multimérov s vysokou štrukturálnou integritou, ktorá zostáva zachovaná i po čistení a ošetrení na inaktiváciu vírusmi. Neporušená štruktúra r-vWF je určená výsledkom analýzy elektroforézou skladajúcej sa z pásov multimérov s absenciou satelitných pásov. Aby sa pripravil r-vWF preparát majúci štruktúru presnejšie zodpovedajúcu tej, z plazmy odvodeného vWF od r-vWF so singletovou štruktúrou, sa r-vWF ošetrí polypeptidom vWF proteázy alebo kompozíciou obsahujúcou polypeptid vWF proteázy podľa predloženého vynálezu a prípadne iónmi kovu a/alebo clusterínom.

Z istého hľadiska vynálezu môže byť vWF polypeptid využitý na výrobu prípravku na profylaxiu a terapiu chorôb, ktoré majú supranormálny obsah vWF alebo u pacientov so zvýšenou úrovňou vWF s vysokou molekulovou hmotnosťou, ako je tromboembolická choroba. To môže vyústiť na trombózy a tromboembolických ochorení. Napríklad trombotická trombocytová purpura (TTP), Henochova-Schônleinova purpura, preeklampsia, neonatálna trombocytopénia alebo hemolyticko-uremický syndróm. Pri podaní efektívnej dávky polypeptidu podľa vynálezu a majúceho aktivitu vWF proteázy môže toto u pacientov viesť k zníženiu obsahu vWF multimérov s vysokou molekulovou hmotnosťou vyúsťujúcou v efektívnu terapiu týchto chorôb. Choroba, ktorá môže byť vybraná z tromboembolických ochorení, je trombotická trombocytová purpura (TTP), Henochova-Schônleinova purpura, preeklampsia, neonatálna trombocytopénia alebo hemolyticko-uremický syndróm.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. la schematicky zobrazuje 1. krok čistenia vWF-cp z plazmy, kde sa plazma podrobí imunoafmitnej

SK 288119 Β6 chromatografii na IcG-eTTP Affi-Gel® (200 ml), vWF proteáza sa eluuje 3M Na SCN, na gélovú filtráciu sa použije BioGel® P6DG (200 ml) a na odstránenie IgG sa použije Protein G-Sepharose® (10 ml).

Obr. lb schematicky zobrazuje 2. krok čistenia vWF-cp z plazmy, kde sa eluát z kroku 1 podrobí imunoafmitnej chromatografii na Therasorb® (50 ml) aniónovo výmennej chromatografii na High Q Support® (5 ml) a afinitnej chromatografii na Lentil Lectin-Sepharose® (25 ml) a vWF proteáza sa eluuje 0,3 M metyl-a-D-mannopyranozidom.

Obr. lc schematicky zobrazuje 3. krok čistenia vWF-cp z plazmy, kde sa eluát z kroku 2 podrobí afinitnej hromatografii na Heparin-Sepharose® (5 ml) dialýze, aniónovo výmennej chromatografii na High Q Support® (5 ml) a gélovej filtrácii na Sephacryl® (25 ml) a vWF proteáza sa eluuje 0,5 M NaCl.

Obr. ld schematicky zobrazuje voliteľný 4. krok čistenia vWF-cp z plazmy, kde sa eluát z kroku 3 podrobí afinitnej chromatografii na kolóne s anti-a-makroglobulínom (1 ml) a/alebo voliteľne afinitnej chromatografii na kolóne s anti-clusterínom.

Obr. 2 ukazuje SDS-PAGE vyčistených vWF-cp polypeptidov za neredukujúcich (A) a redukujúcich podmienok v prítomnosti DTT (B).

Obr. 3 ukazuje parciálnu sekvenciu nukleotidov a aminokyselín vWF-cp polypeptidu.

Obr. 4 ukazuje schematický nákres genomickej lokalizácie génu proteázy štiepiacej vWF.

Obr. 5 ukazuje úplnú sekvenciu aminokyselín a nukleotidov proteázy štiepiacej vWF. Začiatok a koniec signálneho peptidu, metaloproteázu, oblasť bohatú na cysteín (ACR), motív tromspondínu typu 1 (TSP 1) a domény disintegrínu podobného motívu (RGS) sú označené šípkami. Miesto štiepenia fúrínu, katalytické miesto a Met-ohyb sú podčiarknuté. Predpokladané miesta N-glykozylácie sú označené hviezdičkami.

Obr. 6 ukazuje schematické znázornenie organizácie domén proteázy štiepiacej vWF a ľudských členov rodiny ADAM-TS. Sú ukázané štruktúry domén proteázy štiepiacej vWF (ADAMTS 13) a všetkých známych ľudských ADAMTS proteínov. V databázach nemohol byť nájdený ADAMTS 10 a ADAMTS 11 je identický s ADAMTS 5.

Obr. 7 ukazuje analýzu westem prenosu buniek transfektovaných vektorom obsahujúcim kódujúce sekvencie vWF-cp polypeptide, v páse 1: značkovač štandardnej molekulovej hmotnosti, pás 2: kontrolný vektor cDNA3.1(+) a pás 3 : vektor pCMV-vWFcp. Špecifický pás vWF-cp polypeptidu je označený šípkou.

Obr. 8 ukazuje SDS-Page aktivitu vWF-cp na vWF, v páse 1: vyčistený plazmatický vWF ako kontrola, pás 2: vWF inkubovaný s normálnou ľudskou plazmou, pás 3: vWF inkubovaný s pufrom ako kontrola, pás 4: vWF inkubovaný s bunkovým lyzátom SK-Hep buniek transfektovaných s kontrolným vektorom cDNA3.1(+) a pás 5: vWF inkubovaný s bunkovým lyzátom SK-Hep buniek transfektovaných s expresným vektorom pCMV-vWFcp.

Vynález je opísaný nasledujúcimi príkladmi, bez toho, aby sa na ne obmedzoval.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia vWF-cp polypeptidov

1.1. Príprava IgG-eTTP-spojeného afmitného gélu

IgG-eTTP sa izoluje pomocou 20 ml proteín A-Sepharose® (priemér 1,6 cm) v TBS, pH 7,4. Pheresis plazma pacienta trpiaceho získanou TPP („erworbenes“ TTP; eTTP), ktorá bola predtým analyzovaná na obsah inhibítora vzhľadom na vWF štiepiacu proteázu, sa v objeme 50 ml aplikuje na kolónu. Po nasledujúcom premytí s TBS, pH 7,4 sú viazané IgG postupne eluované citrátom 0,1 M, pH 4,0 a glycínom 0,1 M, pH 2,7. Frakcie sa bezprostredne uvedú na fyziologické pH pridaním Tris, 1,5 m, pH 8,8 a dialyzujú sa proti TBS, pH 7,4. Podľa inštrukcií výrobcu sa Affi-Gel® spojí s IgG-eTTP, ktorý bol vymytý z proteín A-Sepharose® pri pH 4,0. Týmto spôsobom sa najprv preparovaný materiál kolóny premyje, ako je predpísané, potom postupne trikrát premyje striedavo s 50 ml pufra B a 200 ml pufra A (kapitola 1,7). Pred použitím sa v každom prípade uskutoční intenzívne premytie pufrom A.

1.2. Prvý krok

Ako východiskový materiál sa použije po 5 min. centriíúgácie pri 2 500 ot./min. (1 100 g) 100 ml zozbieranej CPD plazmy, ktorá pochádzala najmenej od troch darcov a bola uchovávaná pri -20°C. Pri pomerne nízkej rýchlosti prietoku (FR: 30 ml/h) sa plazma nanesie na 200 ml chromatografickú kolónu s IgG-eTTP Affi-Gel® Hz (hydrazid, priemer 2,6 cm), ktorá bola ekvilibrovaná v pufri A. Po premytí najmenej 400 ml pufra A cez noc pri tej istej rýchlosti prietoku sa k tomu pripojí 200 ml odsoľovacia kolóna gélovej filtrácie (Bio-Gel® P-6DG, priemer 2,6 cm), ktorá bola predtým prepláchnutá pufrom A. Po zvýšení rýchlosti prietoku na 100 ml/h sa proteíny viazané na Affi-Gel Hz priamo eluujú s 50 ml pufra B na Bio-Gel® tak, aby sa z proteínov odstránil NaSCN, ktorý bol v pufri B. Proteíny, ktoré boli eluované z odsoľovacej kolóny pred Na8

SK 288119 Β6

SCN sa bez prerušenia vedú cez proteín G Sepharose®, kde sú zbavované IgG. Tu sa rýchlosť prietoku znižuje na 50 ml/h tak, aby sa predĺžila doba zdržiavania sa proteínov v 10 ml kolóne. K regenerácii sa proteín G Sepharose® krátko premyje pufrom C a eluovaná IgG frakcia sa uchová na analýzu.

Prvý krok sa uskutoční osemkrát pred tým, než sa zozbierané frakcie, ktoré boli zmrazené na -20 °C, dajú dohromady a ďalej spracovávajú.

1.3. Druhý krok

Frakcie zhromaždené z ôsmich chromatografii z prvého kroku sa 1 : 1 zriedia vodou tak, aby sa získala iónová sila, pri ktorej by sa žiadané proteíny viazali na kolónu aniónovej výmeny (High Q Support®). Pri vzorke, ktorej objem je od 1 500 do 1 800 ml podľa použitej násady, sa analyzuje pH a iónová sila a cez noc sa aplikuje pri FR 90 ml/h cez 50 ml kolónu s Therasorbom® (priemer 1,6 cm) hore nad kolónou s 5 ml High Q Supportu® (priemer 1,6 cm). Ako Therasorb® tak High Q Support® boli predtým ekvilibrované v pufŕi D. Po premytí približne 150 ml pufra D sa Therasorb® odpoja a za High Q Support® sa pripojí 25 ml kolóna s Lentil Lectin-Sepharose® (priemer 1,6), ktorá bola ekvilibrovaná v pufŕi E. Pri FR 60 ml/h sa proteíny viazané na High Q Support® okamžite eluujú pufrom E priamo do Lentil Lectin-Sepharose®. Proteíny, ktoré sú viazané na Lentil Lectin-Sepharose®, môžu byť eluované v dvoch krokoch s puframi G a H a môžu byť zhromaždené. Proteíny, ktoré zostali viazané na Therasorb® a High Q Support®, sa vymyjú pufrom C, respektíve F, a po analýze sa zahodia.

Na regeneráciu pred použitím je v každom prípade Lentil Lectin-Sepharose® prepláchnutá podľa inštrukcií výrobcu trikrát alternatívne vždy s 20 ml pufrov I a J a High Q Support® postupne vždy s 10 ml IN NaOH a 1 M NaCl.

1.4. Tretí krok

Zozbierané frakcie, ktoré boli eluované z Lentil Lectin-Sepharose® pufrom H, sa trikrát dialyzujú celkom 4 h, vždy proti pufru D a znovu aplikujú na High Q Support® rýchlosťou prietoku 60 ml/h. Vpredu je pripojená 5 ml kolóna s heparín-Sepharose (priemer 1,4), ktorá bola podobne ekvilibrovaná v pufŕi D. Po aplikácii vzorky sa to prepláchne približne 50 ml pufra D, heparín-Sepharose sa odpojí a k tomu sa pripojí 500 ml kolóna s Sephacryí® S-300 HR (priemer 2,6), ktorá bola ekvilibrovaná v pufŕi L. Proteíny viazané na High Q Support® sa s 10 ml pufra K eluujú priamo na kolónu gélovej filtrácie. Vylučovacia chromatografia sa uskutoční rýchlosťou prietoku 42 ml/h a frakcie sa odoberajú každá po 7 ml. Proteíny, ktoré sú silnejšie viazané na High Q Support®, sa znovu eluujú pufrom F a pufrom K tie, ktoré zostali lipnúť na heparín-Sepharose.

1.5. Štvrtý krok

Zozbierané aktívne frakcie z tretieho kroku sa bez ošetrenia aplikujú s FR 10 ml/h na 1 ml kolónu s anti-a2-makroglobulínom (rýchlosť prietoku 0,7 cm), ktorá bola ekvilibrovaná v pufŕi L. Kolóna s anti-a₂-makroglobulínom sa podľa inštrukcií pripraví imobilizáciou protilátok z králičieho anti-a₂- makroglobulínu koncentrácie 4,9 mg/ml na CNBr-aktivovanej Sepharose. Proteíny na nej viazané sa eluujú s NaSCN 3M v pufŕi L a s pufrom C a uchovávajú sa na analýzu.

Tabuľka 1 Zoznam pufrov

Pufer A	Tris NaCl Na3-citrát Na kyselina	10 mM 0,15 M 1 mM 0,02 %	pH 7,4
Pufer B	NaSCN v pufŕi A	3,0 M	pH 7,4
Pufer C	Glycín Na kyselina	0,1 M 0,02 %	pH 2,7
Pufer D	Tris NaCl	10 mM 75 mM	PH 7,4
Pufer E	Tris NaCl MnCl2	20 mM 0,5 M 1 mM	pH 7,4
Pufer F	Tris NaCl	10 mM 1,0 M	pH 7,4
Pufer G	Tris NaCl Metyl-a-D- -mannopyranozid	20 mM 0,5 M 30 mM	PH 7,4

SK 288119 Β6

Pufer H	Tris NaCl Metyl-a-D- -mannopyranozid	20 mM 0,5 M 0,3 M	pH 7,4
Pufer I	Tris NaCl	20 mM 0,5 M	pH 8,5
Pufer J	Na-acetát NaCl	20 mM 0,5 M	PH 5,5
Pufer K	Tris NaCl	10 mM 0,5 M	PH 7,4
Pufer L (TBS)	Tris NaCl	10 mM 0,15 M	pH 7,4

Tabuľka 2 Zoznam chromatografických materiálov

MATERIÁL	DODÁVATEĽ/SPOLOČNOSŤ
Affi-gél hydrazid gél®: na imobilizáciu špecifických IgG	Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Anti-a2-makroglobulín kolóna: izolácie a2-makroglobulínu	Vlastná produkcia prihlasovateľa (pozri 1.5.): protilátka králičieho-anti-human-a2-makroglobulínu na CNR aktivovanej Sepharose 4B®, 4,9 mg/ml
Bio-Gel* P6-DG, médium: gélová filtrácia s limitom vylúčenia > kDa	Biorad
CNR aktivovaná Sepharose 4B®: na imobilizovanie proteínov	Amersham Pharmacia Biotech., Uppsala, Sveden
Heparín-Sepharose, HITrap* 5 ml: afinitnej chromatografie, viaže rôzne proteiny	Amersham Pharmacia
High Q Support*, Macro-Prep: silný aniónomenič	Bio-Rad
IgG-eTTP Affi-gél Hz: na väzbu vWF proteázy	Vlastná produkcia prihlasovateľa (pozri 1.1.): IgG-eTTP na Affi-gél Hz hydrazidu
Lentil Lectin-Sepharose* 4B: afinitná chromatografia: viaže sa k cukornatým zvyškom proteínov	Amersham Pharmacia
Protein A Sepharose* CL-4B: viaže IgG typu 1,2 a 4	Amersham Pharmacia
Protein G Sepharose® 4FF: izolácia IgG všetkých typov	Amersham Pharmacia
Sephacryl® S-300 HR: gélová filtrácia pre mol. hmotnosti 10 000 až 1 500 000	Amersham Pharmacia
Therasorb: spojený s ovčími-anti- human-lg-protilátkami: izolácia ľudských imunoglobulínov	Serag-Wiessner, Naila, DBR

1.6. Piaty krok

Ako ďalší krok môže byť alternatívne alebo navyše k štvrtému kroku aplikovaná stĺpcová chromatografia s anti-clusterínom. Vzorky sa pripravujú identicky ako pre kolónu s anti-a₂-globulínom s použitím anti-clusterínových protilátok.

1.7. SDS-PAGE redukovaná/neredukovaná

Konečný preparát z tretieho kroku izolácie sa podrobí elektroforéze na SDS-polyakrylovom gély hrúbkou 1,5 mm podľa Laemliho [Náture 227, 680 - 685 (1970)]. Na frakcionáciu proteínov sa použije gradient 4 až 12 % poiyakrylamidu. Po elektroforéze za neredukujúcich alebo redukujúcich podmienok (finálna koncentrá10 cia 65 mmol/1 ditiotreitolu DDT) sa proteíny urobia viditeľnými zafarbením striebrom alebo Commassie modrou (obr. 2). Za neredukujúcich podmienok sú detegovateľné pásy majúce molekulovú hmotnosť (MW) okolo 150 kD, 140 kD 130 kD alebo 110 kD a za redukujúcich podmienok okolo 180 kD, 170 kD 160 kD alebo 120 kD.

1.8. Stanovenie aktivity vWF proteázy

Rôzne frakcie izolované čistiacim postupom, ako je opísané skôr, sa testujú na aktivitu štiepenia vWF spôsobom, ktorý opísal Furlan a spol. [Blood 87, 4223-4234 (1996)].

Príklad 2

Sekvencovanie aminokyselín a analýza aminokyselín polypeptidu vWF-cp

Konečný preparát proteínu z tretieho kroku izolácie sa podrobí elektroforéze na SDS-polyakrylovom géli s hrúbkou 1,5 mm podľa Laemliho [Náture 227, 680-685 (1970)]. Pre frakcionáciu proteínov s vysokou molekulárnou hmotnosťou sa použije gradient od 4 do 12 % polyakrylamidu a pre proteíny s nízkou molekulárnou hmotnosťou gradient od 8 do 12 % polyakrylamidu. Po elektroforéze za neredukujúcich alebo redukujúcich podmienok (finálna koncentrácia 65 mmol/1 ditiotreitolu), sa proteíny napustili na PVDF-membrány a 2 min. vyfarbovali 0,25 % Coomassie modrou v 45 % metanole, 9 % kyseliny octovej a 46 % vody. Po prepláchnutí zmesou 50 % metanolu, 10 % kyseliny octovej a 40 % vody sa viditeľné pásy proteínov vyrezali a analyzovali na Procise-cLC Sequencer-u (Foster City, CA) v Chemickom ústave univerzity v Berne.

Sekvencia aminokyselín polypeptidových pásov oddelených pomocou SDS-PAGE z vyčistenej vWF-štiepiacej proteázy je uvedená v tabuľke 3.

Tabuľka 3 Stanovenie N-terminálnej sekvencie aminokyselín wWF-cp

Molekulová hmotnosť	Sekvencia aminokyselín
350 kD neredukované	Ser-V al-SerGly-Ly s-Pro-Gln-T yr-Met-V al ’
150 kD neredukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile
140 kD neredukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile
130 kD neredukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile
110 kD neredukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu
70 kD neredukované	Asp / Ser-Gln / Leu-Thr / Met-Val / Pro-Ser / Phe ”
180 kD redukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu
170 kD redukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile
160 kD redukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-GluLeu-Leu-V al-Ala-V al-Gly
120 kD redukované	Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-GluLeu-Leu-V al-Ala-V al-Gly
40 kD redukované	Asp-Gln-Thr-Val-Ser

* identifikované ako a₂-makroglobulín ** identifikované ako clusterín

Analýza zmesi aminokyselín bola uskutočnená na rovnakej vzorke, ako bola použitá na sekvencovanie aminokyselín. Proteínové pásy sa hydrolyzujú v plynnej fáze nad 6 N HCI po 22 hodín pri 110 °C a aminokyseliny sa stanovujú vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou. Analyzujú sa štyri neredukované polypeptidové pásy z SDS-PAGE vyčisteného vWF-cp s M_r 150, 140, 130 a 110 kD. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4 Zloženie aminokyselín v izolovanom vWF-cp polypeptide

Aminokyselina	Počet zvyškov/100 zvyškov
	150 kD	140 kD	130 kD	HOkD
Asx	6,7	7,0	7,4	8,3
Glx	12,2	12,0	12,8	11,8
Ser	8,4	8,9	8,8	9,2
Gly	11,8	12,1	12,1	12,9

SK 288119 Β6

Aminokyselina	Počet zvyškov/100 zvyškov
His	2,5	2,3	2,5	2,4
Arg	8,3	7,6	8,1	7,2
Thr	5,6	5,5	5,6	5,7
Ala	10,1	9,5	9,6	8,2
Pro	8,9	8,5	8,3	8,1
Tyr	2,1	2,7	2,3	2,4
Val	7,0	6,9	6,7	6,5
íle	2,7	2,9	2,6	3,0
Leu	10,0	9,9	9,1	9,7
Phe	2,6	2,8	2,6	3,2
Lys	1,0	1,3	1,3	1,4

Príklad 3

Identifikácia vWF-cp génu

Stanovila sa sekvencia kódujúca nukleovú kyselinu zo sekvencie aminokyselín peptidu AAGGILHLELLVAVG (SEQ. ID. NO. 2) N-terminálnych 15 zvyškov vyčisteného ľudského vWF-cp a tá zodpovedá sekvencií nukleovej kyseliny GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ. ID. NO. 9). Rešerš databázy v NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ukázala umiestnenie zodpovedajúcej sekvencie nukleovej kyseliny GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ. ID. NO. 9) na chromozóme 9 kloň RP11-244N20 (AL 158826, GI 11544459). Nukleotidová sekvencia od bázy 150001 do 185911 sa teda preverila na potenciálne exóny. Následné prekrývania genómových segmentov s rôznymi dĺžkami (1 500 báz - 5 000 báz) sa analyzovali s použitím vyhľadávacích nástrojov, kedy sa kladú dotazy cestou intemetového prieskumu. Segmenty genomickej sekvencie, jej translácie a výsledky vyhľadávania sa zvládli s použitím počítačového programu „Vectors NTI Suitel v. 5,2 (Informax Inc., USA). Sekvencia RP11-244N20 má veľkosť približne 185 kb a identifikovaná sekvencia nukleovej kyseliny začína v polohe 156.653. Využitie vyhľadávacieho programu exónov (Grail, http://c0mbio.oml.gov/Grail-L3) umožnilo identifikáciu okolo 30 údajných exónov v smere a proti smeru od polohy 156.653. Prvé štyri exóny z vyhľadávania sa translatujú do zodpovedajúcej sekvencie aminokyselín a vyhľadávajú sa homológie. Toto vyhľadávanie odhalilo, že každá sekvencia prejavuje vysokú homológiu so sekvenciou aminokyselín disintegrínu ľudského druhu a metaloproteinázami s motívmi trombospondínu (ADAM-TS).

Aby sa spojili údajné exóny, prepisuje sa reverzne polyA-RNA z pečene a cDNA sa potom pomocou PCR amplifikuje s primérmi špecifickými pre niektoré z údajných exónov (tabuľka 5). Produkty PCR primérov 6142 (SEQ ID NO 16) - 6277 (SEQ ID NO 17), 6142 (SEQ ID NO 16) - 6546 (SEQ ID NO 18), 6351 (SEQ ID NO 19) - 66546 (SEQ ID NO 18), 6278 (SEQ ID NO 21) - 6407 (SEQ ID NO 20), 6346 (SEQ ID NO 23) - 6395 (SEQ ID NO 24) a 6406 (SEQ ID NO 25) - 6506 (SEQ ID NO. 26) (pochádzajúcich od údajných exónov 1 - 6, 3 - 11, 6 - 11, 10 - 14, 13 - 16 respektíve 14 - 23) prejavili pásy očakávanej veľkosti. Po sekvencovaní otvoreného čítacieho rámca z exónu 1 až exónu 23 blízko konca 3', môže byť identifikovaný kloň RP11-244N20. Koniec 3' sekvencie cDNA sa vyšetril PCR amplifikáciou cDNA pri použití pôvodného priméru 6548 (SEQ. ID. NO. 27) exónu 22 a špecifickej MC 18 sekvencie RT priméru spdT. Vznikajúci fragment s veľkosťou približne do 1,8 kb sa sekvencoval a po vyhľadaní v databáze môže byť 3' časť novej cDNA sekvencie umiestená do oblasti q34 (AC002325) na chromozóme 9.

Neznáma sekvencia génu na konci 5' bola identifikovaná pomocou 5'- RAČE a sekvencovanie vznikajúceho PCR produktu odhalilo dva ďalšie exóny. Žiadny z najbližších piatich exónov proti smeru exónu 1 - 2 nemôže byť pomocou PCR spojený už so známou CDNA sekvenciou. Našlo sa všetkých dohromady 29 exónov s veľkosťou cDNA 4,6 kb. Gén vWF štiepiacej proteázy má rozpätie približne 37 kb, schematický nákres lokalizácie exónov je ukázaný na obrázku 4. Kompletná cDNA sekvencia je zobrazená na obrázku 5.

Tabuľka 5

Sekvencie primérov použitých na reverznú transkripciu, PCR a klonovanie
SpdT	5'-GAGCAAATTCCTGTACTGAC (T)3I) NN-3'	(SEQ. ID. NO. 12)	Produkcia cDNA
MCI 8	5-GAGCAAATTCCTGTACTGAC-3'	(SEQ. ID. NO. 13)	Špecifická časť spdT
6434	5'-GACCACGCGTATCGACGTCGAC-3'	(SEQ. ID.NO. 14)	Kotvový primér
6275	5'-CTCAGGGTTGATGGTCTGGCT-3'	(SEQ. ID. NO. 15)	Exón 5 reverzovaný

SK 288119 Β6

Sekvencie primérov použitých na reverznú transkripciu, PCR a klonovanie
6142	5'-CGGGCTGCAGGCGGGATCCTACACCTGGAG-3'	(SEQ. ID. NO. 16)	Exón 3 pôvodný
6277	5'-AATGGTGACTCCCAGGTCGAG-3'	(SEQ. ID.NO. 17)	Exón 6 reverzovaný
6546	5'-TGGAGGTCAGCACCAACACA-3'	(SEQ. ID.NO. 18)	Exón 11 reverzovaný
6351	5'-GAGTTGCCTGATGGTAACCG-3	(SEQ. ID. NO. 19)	Exón 6 pôvodný
6407	5'-GAGCCCTTCCGZGGGCTGCA-3'	(SEQ. ID. NO. 20)	Exón 14 reverzovaný
6278	5'-CGCTCCCTGGTGGAGCTGACC-3'	(SEQ. ID. NO. 21)	Exón 10 pôvodný
6561	5'-CTCACCATCGTCCTCCCCAT-3'	(SEQ. ID. NO. 22)	Exón 23 reverzovaný
6346	5'-ATCATGAAGCGTGGAGACAGC-3'	(SEQ. ID. NO. 23)	Exón 13 pôvodný
6395	5'-CCTGGAGGGGTCCCCAGATG-3'	(SEQ. ID. NO. 24)	Exón 16 reverzovaný
6406	5'-TGCAGCCCACGGAAGGGCTC-3'	(SEQ. ID. NO. 25)	Exón 14 pôvodný
6506	5-CAGGGCTCCAGGCTGCAGGC-3'	(SEQ. ID. NO. 26)	Exón 23 reverzovaný
6548	5'-AGGAAGAGCTGTGTGGCCTG-3'	(SEQ. ID. NO. 27)	Exón 22 pôvodný
6725	5'-GACGCGGCCCAGCCGGCCGCTGCAGGCGGCATCCTACAC-3'	(SEQ. ID. NO. 28)	Exón 3 pôvodný - Sfil
6276	5'-GGCCCTCGAGCGGTTCCTTCCTTTCCCTTCAGG-3'	(SEQ. ID. NO. 29)	Exón 29 reverzovaný-ATioI

Stanovenie podobnosti s inými proteínmi

SMART programom (http://smart.eml-heidelberg.de) sa vyhľadávala architektúra domén proteázy a identifikovali sa proteínové moduly vrátane signálneho peptidu s jeho transmembránovou oblasťou, miesto štiepenia furínu, metaloproteázová doména, t. j. sekvencia konsenzuálna katalytickému miestu Zn-proteázy (HEXXH), Met otáčky, domény disintegrínu, cysteínom bohaté oblasti a motívu trombospondínového typu 1 (TSP-1) (obrázok 6). Tieto moduly sú rovnako spoločné aj pre členov nového ADAMTS druhu metaloproteinázy (pre disintegrín a metaloproteáz s motívom typu 1 trombospondínu) [Táng, FEBS Lett. 445,223-225 (1999); Táng, Int. J. Biochem. Celí Biol. 33, 33-34 (2001)]. Sekvencia aminokyselín proteázy štiepiacej vWF sa radí ku všetkým ľudským ADAMTS proteínovým sekvenciám, ktoré sú uvádzané komitétom génovej nomenklatúry organizácie pre ľudský genóm (HUGO), http//www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefämily/adamts.html. Schematické zobrazenie domén je uvedené na obrázku 6. Na rozdiel od ADAMTS proteínov údajnému novému členovi tohto druhu chýba prodoména. Ale skúmanie sekvencie aminokyselín najbližších údajných exónov proti smeru exónu 1 - 2 neukázalo sekvenčné homológie k ADAMTS proteínom. Navyše sa na týchto exónoch nezistili sekvencie signálnych peptidov. A tak sa proteáza štiepiaca vWF pomenovala ADAMTS 13. Odvodená sekvencia aminokyselín sa rovnako porovnala s databázou EMBL proteínu (http://ww2.ebi.ac.uk). Exóny 6 až 16 čiastočne zodpovedajú už navrhnutému hypotetickému proteínu 39,9 kD umiestenému na chromozóme 9 a zakončenému otvoreným čítacím rámcom 8 (C9ORF8, XM 005647, GI12735207). Okrem toho exón 26 až 29 zodpovedá hypotetickému proteínu DKFZp434C2322 (NM032252, GI14149974) [Wiemann a spol., Genome Res. 11,422-435 (2001)].

Príklad 4

Afinitné čistenie von Willebrandového faktora (vWF)

Peptid so sekvenciou AAGGILHLELLV (SEQ ID NO 1) sa syntetizoval na nosiči z tuhej fázy podľa metódy Baranyho a spol. [Solid-phase Peptide Synthesis v The Peptides, sv. 2, vydavatelia Gross E. a Meienhofer J., Academic, New York 1980, SEITEN], Po štiepení a deprotekcii peptidu sa peptid vyčistil iónovo výmennou chromatografiou. Peptid bol charakterizovaný pomocou HPLC na obrátených fázach na kolóne s C8 kremelinou s gradientovou elúciou v kyseline trifluóroctovej s acetonitrilom. Peptid nemal väčšie vedľajšie produkty.

Peptid bol v koncentrácii 5 mg/ml solubilizovaný v 0,1 molámom fosfátovom pufri pH 7,5 a inkubovaný s vopred aktivovaným gélom, vhodnom na afinitnú chromatografiu (Actigel, ALD-Superflow, Sterogene). Pred zmiešaním peptidu s gélom sa vopred aktivovaná matrica nadmerne premyla tým istým fosfátovým pufrom. Ten istý objem vopred premytého gélu sa potom zmiešal s tým istým objemom roztoku peptidu kvôli imobilizácii a potom s 0,1 objemových podielov roztoku 0,1 molámeho kyanoborohydridu (NaCNBH₃) v 0,1 molámom fosfátovom pufri pH 7,5. Gél sa suspendoval v tomto roztoku a trepal 15 hodín pri teplote miestnosti. Následne sa gél v lieviku s filtrom zo spekaného skla premýval desaťnásobným objemom fosfátového pufra obsahujúceho 150 mmol NaCl a piatimi objemami fosfátového pufra obsahujúceho 2 mol NaCl. Potom sa gél ekvilibroval s prídavkom 0,1 molárneho fosfátového pufra pH 7,0.

Gél sa potom preniesol do chromatografickej kolóny majúcej rozmer priemeru k výške gélového lôžka 1 : : 4. Množstvo peptidu spojeného s afinitnou matricou sa vypočíta stanovením koncentrácie peptidu roztoku inkubačného supematantu po separácii od gélu a premývacích roztokov. Miera spojenia je 85 %.

Gél sa potom použil na čistenie vWF od komplexu Faktora VIII (FVIII). Komplexný koncentrát FVIII/vWF bol produkovaný podľa US 4 814 435 obsahujúcej vWF v koncentrácii 260 U vWF : Ag/ml a so špecifickou aktivitou 13,5 U vWF : Ag/ml proteínu. Koncentrát bol zriedený 20 mM fosfátového pufra pH 7,0 na finálnu vWF koncentráciu 6 U vWF : Ag/ml. Objem 20 ml tohto roztoku sa vniesol do opísanej afinitnej kolóny s imobilizovaným peptidom. Po premytí kolóny 10 ml fosfátového pufra sa vWF, špecificky viazaný na peptidový ligand, eluuoval lineárnym gradientom od 0 - 2 mol/1 NaCl vo fosfátovom pufri prietokovou rýchlosťou 1 ml/min. Zbierali sa frakcie 1 ml a pri 280 nm sa stanovila ich optická hustota. Všetky frakcie sa merali na ich obsah vWF antigénu stanovovaného špeciálnou ELISA metódou (Asserachrom vWF, Boehringer, Mannheim). Meranie malo špecifický peak vWF eluujúceho z peptidu pri koncentrácii NaCl 100 mmol/1, zatiaľ čo väčšina proteínu meraného UV absorpciou eluovala s premývacím pufrom pred frakciou vWF. vWF obsahujúce frakcie sa zhromaždili a zmerala sa ich vWF aktivita. vWF v tomto zbere mal špecifickú aktivitu 95 U vWF/mg proteínu a je v podstate voľný od iných proteínov.

Príklad 5

Protilátky anti-vWF-cp polypeptidu

Syntetizoval sa peptid so sekvenciou AAGG1LHLELLV (SEQ ID NO 1) a vyčistil sa, ako sa opisuje v príklade 4. Peptid sa potom využil na imunizáciu 3 mesiace starých BALB/c myší podľa nasledujúceho protokolu: primárne subkutánne injekcie 100 pg peptidového antigénu emulzifikovaného v 100 μΐ Freundovho kompletného adjuvantu, nasledovaná intraperitoneálnym zvyšovaním dávok 100 pg peptidového antigénu vo fosfátom pufrovanej soľanke v mesačných intervaloch.

Antipeptidový titer sa testoval rutinnou metódou ELISA s použitím vyčisteného peptidu ako skríningového antigénu. Po pridaní konečnej dávky sa z myší odobrala slezina pre bunkovú fúziu. Bunková fúzia sa uskutočnila podľa štandardného protokolu pôvodne opísaného Kôhlerom a spol. [Náture 256, 495 - 497 (1975)]. Antipeptidové protilátky produkujúce bunkové rady hybridómov sa s vyčisteným peptidom ako skríningovým antigénom podrobili skríningu štandardnými technikami, v podstate založenými na konvenčnej ELISA metodológii. Po klonovaní môže byť izolovaný bunkový rad s vysokou úrovňou expresie protilátky špecifickej pre skríningový peptid so sekvenciou AAGGILHLELLV. Tento bunkový rad sa kultivoval v séra zbavenom kultivačnom médiu a vypestoval do vysokej hustoty. Supematant bunkovej kultúry sa podrobil centrifugovaniu, aby sa odstránili bunky a monoklonálna protilátka obsahujúca supematant sa koncentrovala ultradiafiltráciou a upravila na ďalšie použitie.

Získaná monoklonálna protilátka má vysokú selektivitu pre vWF štiepiacu proteázu, ako opísal Furlan a spol. [Blood 87, 4223-4234 (1996)]. Táto monoklonálna protilátka sa cez noc (16 hodín) pri 4 °C imobilizovala na polystyrénovej ELISA doštičke v karbonát/bikarbonátovom pufri, 0,05 mol, pH 9,6, pri koncentrácii 5 pg imunoglobulínu/ml, sa 100 μ 1 krycieho roztoku na jamku. Krycí roztok sa z jamiek odstránil a na 2 hodiny zamenil roztokom albumínu hovädzieho séra (BSA) koncentrácie 100 pg/ml, pri objeme 100 pg na jamku. BSA roztok sa odstránil a jamky sa premyli fosfátom pufrovanou soľankou. Vopred pokryté doštičky sa potom inkubovali buď so vzorkami na krvné doštičky chudobnej plazmy od zdravých darcov ľudskej plazmy, alebo na krvné doštičky chudobnej plazmy od pacientov s nejasnou diagnózou buď trombotickej trombocytopennej purpury (TTP), alebo hemolytického uremického syndrómu (HUS). Po inkubácii vzoriek plazmy s protilátkou pokrytými ELISA doštičkami ako pri rutinnom sendvičovom ELISA systéme sa z jamiek po 3 hodinách odstránila plazma. Jamky sa premyli fosfátom pufrovanou soľankou a inkubovali s monoklonálnou protilátkou zameranou proti peptidu so sekvenciou AAGGILHLELLV, spojenou s peroxidázou chrenu podľa metódy Wilsona a spol. (v : Immunofluorescence and Related Staining Techniques, editori Knapp W., Holubar K. a Wick G., str. 215, Elsevier/North Holland, Amsterdam 1978) a detegovali sa pomocou OPT reagenta, ako opísal Cathy a spol. ( ELISA and related enzýme immunoassays, v Antibodies II a practical approach, editor Cathy D., str. 97, IRL Press Eynsham Oxford England).

Na základe úrovne vzoriek od zdravých darcov ľudskej plazmy sa stanovil normálny rozsah. Plazmy od pacientov s HUS mali aktivitu vWF proteázy ekvivalentnú zdravým ľuďom, zatiaľ čo pacienti s TTP mali zníženú aktivitu proteázy, ako bolo potvrdené analýzou založenou na odlišnom princípe eseje, ako sa opisuje vo WO 00/50904.

Príklad 6

Klonovanie génu proteázy štiepiacej vWF

Poly A+ RNA ľudskej slinnej žľazy bola zakúpená u Clontoch. Prvý reťazec cDNA bol získaný s použitím Expand reverznej transkriptázy (Hoffmann La Roche) a oligo d (T) priméru podľa inštrukcií výrobcu. PCR sa uskutočnila s použitím 5'-CGGCGGGATCCTACACCTGG-3' (SEQ ID NO 10) a 5'-AATGGTGACTCCCAGGTCGA-3' (SEQ ID NO 11) ako primérov s 10 ng cDNA slinnej žľazy ako templátu a 10 U Hot Star Taq polymerázy (Qiagen). Parametre termického cyklovania boli počiatočná inkubácia pri 94 °C, po 15 minútach nasledovaná 45 cyklami 94 °C (50 s), 50 °C (50 s), 72 °C (2 min.). PCR produkty sa priamo sekvencovali v oboch smeroch s použitím BigDye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction

SK 288119 Β6

Kit (PerkinElmer Life Science).

Získaná DNA sekvencia sa použila na skenovanie genomickej databázy pri aplikácii programu BLAST (basic local aligment search tool, základné vyhľadávacie pomôcky lokálneho zoradenia) a porovnával sa chromozóm 9 kloň RP11-224N20. DNA sekvencia sa translatovala do sekvencie aminokyselín pomocou ExPASy proteomických pomôcok. DNA a translatovaná sekvencia aminokyselín zodpovedajúca 4 údajným exónom chromozómu 9q34 je uvedená na obr. 5.

RT-PCR fragmenty zahrnujúce buď pre-prosekvenciu, alebo vyvinuté domény proteázy štiepiacej vWF, sa klonovali vo vektore pDrive (Qiagen) pomocou PCR klonovania. Na amplifíkáciu vyvinuté vWF-cp sa použili priméry # 6601 (5'-AGCGGTCTCTATGGCTGCAGGCGGCATCCTACACC-3') (SEQ ID NO 30) a # 6617 (5'-AGCCTCGAGCTGGCCAGACACGGAACAAAT-3') (SEQ ID NO 31). Vznikajúci fragment DNA je pripojený k T-prekryvom vektora pDrive. Konštrukt obsahujúci vyvinutú vWF-cp sa nazýva pFP H251/8. Na amplifíkáciu pre-prosekvencie sa používajú priméry.

# 66128 (5'-GGCGAATTCATGCYCCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO 32) a # 6787 (5'-ACAGCATTAAACTAAGCCGCC-3') (SEQ ID NO 33). Vznikajúci fragment DNA sa vloží do vektora pDrive. Vznikajúci konštrukt sa nazýva pFP H262-35/14.

Príklad 7

Expresia vWF štiepiacej proteázy

Pre expresiu úplnej dĺžky vWF štiepiacej proteázy (vWF-cp) sa použije eukaryotický expresný vektor pcDNA3.1(+) (Invitrogén) za kontroly ľudským CMV promótorom.

Z plazmidu pFP H251/8 sa vyreže fragment EcoRI/Xhol 4,12 kB, fragment zahrnujúci cDNA sekvenciu kódujúcu vyvinutú vWF-cp z nukleotidu nt 223 až 4284 (bez pre-prosekvencie od nt 1 do nt 222) a vloží do EcoRI/Xhol miest v pcDNA3.1(+). Na skomp leto vanie 5'-konca, aby sa pridala vedúca a propeptidová sekvencia, sa uskutoční PCR s použitím plazmidu pFP H262-35/14, ktorý obsahuje cDNA sekvenciu vWF-cp od nt -10 (10 nt proti smeru od počiatočného kodónu AFG) do nt +824 vo vektore pDrive (Qiagen) ako templát a priamy primér 6839 (5'-GATCGAATTCGCCGGCCACCATGCACCAGCGTCACCC CCG-3 ) (SEQ ID NO 34), obsahujúci v sebe zhodu s Kozákovou sekvenciou (podčiarknuté) pre optimálnu súvislosť na rozoznávanie počiatočného kodónu a reverzného priméru 3113(5'-CGGATAACAATTTCACACAGG-3') (SEQ ID NO 35), ktorý sa viaže v lacZ oblasti vektora pDrive. PCR sa uskutočňuje za štandardných reakčných podmienok s použitím HotStar DNA polymerázy (Qiagen) a Q-roztoku (Qiagen). Amplifikovaný fragment obsahujúci nt -10 až +824 bol krátený s EcoRI a AscI a použitý na náhradu EcoRI/AscI fragmentu neúplného klonu obsahujúceho len vyvinutú sekvenciu vWF-cp. Tento konštrukt kódujúci kompletnú sekvenciu vWFcp, nazývaný pCMV-vWFcp, sa ďalej použije na transfekčné a expresívne štúdie v cicavčích bunkách.

Na expresiu vWF-cp sa SKHep bunky (ATCC) bunky prechodne transfektovali plazmidom pCMV-vWFcp a ako kontrola paralelne materským vektorom cDNA3.1(+) s použitím Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Inc.). Transfektované bunky sa za štandardných podmienok kultivovali v médiu DMEM/HAM F12 (1:1) (GIBCO) s 10 % plodovým teľacím sérom pri teplote 37 °C a 5 % CO₂.

Expresia vWF sa analyzovala westemovým prenosom, pomocou ktorého vzorky kondiciovaného média a zozbieraných buniek boli podrobené SDS-PAGE na géli 4 % ukladanie/6 % separácia a analýza westemového prenosu sa uskutočňovala s použitím anti-vWF-cp z plazmy pacienta s TTP, obsahujúcej polyklonálne anti-vWF-cp protilátky a kozie-anti-hu-IgG (Fab- špecifické AB, SIGMA). vWF špecifické pásy boli vizualizované pomocou BCIP/NBT detekcie.

vWF-cp by mohla byť detegovaná vo vzorke bunkového lyzátu a zdá sa, že je prevažne asociovaná k bunke. Výsledky analýzy westemového prenosu sú uvedené na obrázku 7, ukazujúcom proteínové pásy vWF-cp okolo molekulovej hmotnosti zhruba 170 kD, reagujúce s pacientovým sérom.

Bunkové lyzáty buniek exprimujúcich vWF-cp sa ďalej testovali na vWF-cp aktivitu podľa metódy, ktorú opísal Furlan a spol. [Blood 87, 4235-4244 (1996)] a analýza vWF multimérov sa uskutočnila na 1 % SDS agarosovom géli, ako opísal Ruggeri a spol. [Blood 57, 1140 - 1143 (1981)] (obr. 8). Biologická aktivita vWF-cp exprimovanej v cicavčích bunkách môže byť jasne dokázaná, keď sa vysokomolekulárna vWF degraduje na vWF molekuly majúce nižšiu molekulovú hmotnosť (obr. 8, pruh 5).

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid majúci aktivitu vWF-cp, zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín AAGGILHLELLV, kde aktivita vWF-cp je definovaná (1) štiepením vWF v mieste peptidovej väzby 845Tyr-843Met, (2) tým, že má priamu proteolytickú aktivitu, ktorá konvertuje vWF so singletovou štruktúrou na vWF so satelitnou štruktúrou, a (3) zachovaním aktivity v prítomnosti, individuálne, inhibítora serínovej proteázy diizopropylfluórfosfátu (DFP) a inhibítora calpaínovej proteázy karbobenzyloxy(Z) peptidyl diazometylketónu (Z-Leu-Leu-Tyr15

   SK 288119 Β6

   -CHN₂).
2. 2. Polypeptid podľa nároku 1 s molekulovou hmotnosťou približne 180 kD, približne 170 kD, približne 160 kD alebo približne 120 kD zistenou pomocou SDS PAGE za redukujúcich podmienok.
3. 3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 3.
4. 4. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde tento polypeptid si zachováva aktivitu proteázy štiepiacej vWF v prítomnosti inhibítora serínovej proteázy a inhibítora calpaínovej proteázy.
5. 5. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý je exprimovaný hostiteľskou bunkou transformovanou vektorom nesúcim nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid vWF-cp.
6. 6. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je v podstate čistý.
7. 7. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je izolovaný.
8. 8. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
9. 9. Kompozícia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahŕňa ión dvojmocného kovu vybraného zo skupiny Ca²⁺, Sr²⁴, Ba²⁺ a Mg²⁺.
10. 10. Kompozícia podľa nároku 8 alebo 9, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa clusterín alebo jeho analóg, či derivát majúci aktivitu clusterínu.
11. 11. Molekula nukleovej kyseliny, zahŕňajúca sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu vWF-cp polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
12. 12. Expresný vektor, zahŕňajúci molekulu nukleovej kyseliny podľa nároku 11.
13. 13. Hostiteľská bunka, zahŕňajúca expresný vektor podľa nároku 12.
14. 14. Spôsob produkcie polypeptidu vWF-cp proteázy, vyznačujúci sa tým, že

    - sa pestujú hostiteľské bunky podľa nároku 13 v živnom médiu za podmienok na expresiu uvedeného polypeptidu,

    - exprimovaný polypeptid sa zbiera,

    - uvedený polypeptid sa izoluje.
15. 15. Spôsob produkcie protilátok proti vWF-cp polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že sa zviera imunizuje vWF-cp polypeptidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 a zo zvieraťa sa izolujú protilátky proti vWF-cp polypeptidu.
16. 16. Spôsob čistenia vWF-cp polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky uvedenia roztoku obsahujúceho vWF-cp polypeptid do styku s molekulou viažucou polypeptid vWF proteázy vybranou zo skupiny protilátok, jednoreťazcových protilátok a Fab- alebo Fab'2-fragmentov za podmienok, pri ktorých je vWF-cp polypeptid viazaný k tejto molekule viažucej vWF-cp polypeptid, selektívne eluovanie vWF-cp polypeptidu z tejto viažucej molekuly a získanie vyčisteného vWF-cp polypeptidu.
17. 17. Spôsob detekcie vWF-cp polypeptidu vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že roztok s predpokladaným obsahom vWF-cp je uvedený do styku s molekulou viažucou vWF-cp polypeptid vybranou zo skupiny protilátok, jednoreťazcových protilátok a Fab- alebo Fab'2-fragmentov, na umožnenie tvorby komplexu vWF-cp polypeptid/viažuca molekula, a deteguje sa tento komplex.
18. 18. Použitie vWF-cp polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 na produkciu prípravku na profylaxiu a liečenie trombózy a tromboembolického ochorenia.
19. 19. Použitie podľa nároku 18, kde tromboembolickým ochorením je trombotická trombocytová purpura (TTP), Henochova-Schônleinova purpura, preemklapsia, neonatálna trombocytopénia alebo hemolyticko-uremický syndróm.
20. 20. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že molekula viažuca polypeptid vWF proteázy je monoklonálna protilátka.