ES2322126T3 - Polipeptido de la proteasa de segmentacion del factor von willebrand (vwf), acido nucleico que codifica dicho polipeptido y utilizacion del mismo. - Google Patents
Polipeptido de la proteasa de segmentacion del factor von willebrand (vwf), acido nucleico que codifica dicho polipeptido y utilizacion del mismo. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido que muestra la actividad del vWF-cp que comprende la secuencia de aminoácidos AAGGILH- LELLV, caracterizado porque la actividad del vWF-cp es definida por (1) la segmentación del vWF en el enlace peptídico 842Tyr-843Met, (2) tener la actividad proteolítica directa que convierte el vWF con una estructura singlete en el vWF con una estructura satélite, y (3) conservar la actividad en presencia, individualmente, del inhibidor de la serina proteasa, fluorofosfato de diisopropilo (DFP), y del inhibidor de la calpaína proteasa, carbobenziloxi (Z) peptidil diazometilcetona (Z-Leu-Leu-Tyr-CHN 2).
Description
Polipéptido de la proteasa de segmentación del
factor von Willebrand (vWF), ácido nucleico que codifica dicho
polipéptido y utilización del mismo.
La invención se refiere a un polipéptido de la
proteasa de segmentación del vWF (vWF-cp) o a una
secuencia parcial del mismo, a una molécula de ácido nucleico que
codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de
vWF-cp y a una composición que comprende dicho
polipéptido. La invención también se refiere a la utilización del
polipéptido vWF-cp para la producción de anticuerpos
anti-vWF-cp del polipéptido y para
la producción de una preparación para la profilaxis y la terapia de
la trombosis y de la enfermedad tromboembólica.
El vWF es una glicoproteína que circula en el
plasma en forma de una serie de multímeros cuyo tamaño oscila entre
aproximadamente 500 y 20.000 kD. Las formas multiméricas del vWF se
componen de subunidades polipeptídicas de 250 kD unidas por enlaces
disulfuro. El vWF media en la adhesión plaquetaria inicial en el
subendotelio de una pared de vaso deteriorada, aunque parece que
sólo los multímeros más grandes presentan actividad hemostática.
Estos multímeros del vWF de gran masa molecular se almacenan en los
cuerpos de Weibel-Palade de las células
endoteliales y se cree que las células endoteliales segregan estas
grandes formas poliméricas del vWF. Se cree que las formas del vWF
de bajo peso molecular (bajo peso molecular o LMV vWF) provienen de
la segmentación proteolítica de multímeros más grandes.
Una pequeña parte del vWF presente en el plasma
normal circula en forma de fragmentos de 189, 176 y 140 kD, que
resultan de la degradación proteolítica in vivo del vWF,
procediendo el fragmento de 140 kD de la región
N-terminal y el fragmento de 176 kD de la región
C-terminal de la subunidad. Cuando las formas de
bajo peso molecular (LMW) del vWF se aíslan de plasma humano normal
y se someten a SDS-PAGE (electroforesis en gel de
poliacrilamida) después de reducción de disulfuro, se encuentra una
parte inhabitualmente alta de fragmentos de vWF. Este
descubrimiento es compatible con la idea de que las formas de LMW
del vWF provienen parcial o predominantemente de grandes multímeros
debido a su degradación proteolítica.
La degradación proteolítica del vWF es un
proceso fisiológico en individuos sanos, sin embargo, en pacientes
que padecen la enfermedad de von Willebrand (vWD) del tipo 2A, se
puede acelerar y, consecuentemente, estos pacientes carecen de
multímeros de vWF de mayor masa molecular. Se observa también una
carencia de multímeros más grandes de vWF, así como un aumento del
nivel de fragmentos proteolíticos en la enfermedad de von Willebrand
(vWD) adquirida asociada al síndrome de mieloproliferación, que
indica un aumento de la proteolisis in vivo también bajo
esta condición.
Por otra parte, en pacientes con púrpura
trombocitopénica trombótica (TTP) se detectan multímeros
inhabitualmente grandes de vWF y se ha demostrado un incremento de
la unión del vWF a las plaquetas en estos pacientes (Moake y col.,
1982, N. Engl. J. Med. 307: 1432-1435). La TTP de
tipo familiar se asocia a una deficiencia congénita severa de la
proteasa del vWF, además de observarse la presencia de proteasas de
segmentación del vWF que inhiben los autoanticuerpos en pacientes
con TTP de tipo no familiar.
Los multímeros de vWF grandes asociados a la
TTP desaparecen normalmente después de una transfusión al paciente
de plasma fresco congelado normal. Actualmente, el intercambio del
plasma es el tratamiento más importante para la TTP, aunque se han
comunicado notables efectos secundarios con esta terapia. Se ha
establecido la existencia de una deficiencia congénita severa de la
proteasa de vWF en pacientes con TTP de tipo familiar y se ha
observado la presencia de una proteasa de segementación del vWF que
inhibe los autoanticuerpos en pacientes con TTP de tipo no
familiar.
Se ha demostrado que diversas proteasas pueden
segementar el vWF, perjudicando así su afinidad de unión a las
plaquetas. Sin embargo, la segmentación in vitro del vWF con
estas proteasas en cada caso resulta en productos de segmentación
distintos de los fragmentos obtenidos a partir de la segmentación
in vivo.
Así, por ejemplo, mientras la plasmina es capaz
de segmentar varios enlaces peptídicos del vWF, el vWF tratado con
plasmina conserva una región nuclear de alto peso molecular que
mantiene el 70% aproximadamente de su actividad de aglutinación
plaquetaria (determinada como cofactor ristocetina). En las etapas
tempranas del tratamiento con plasmina se separa un péptido de 34
kD de los N-terminales de las subunidades
individuales del vWF, y el mapeo de epítopos de estos fragmentos
inducidos por la plasmina muestra que estos fragmentos procedentes
de regiones de la subunidad de vWF son distintos de los fragmentos
del vWF presentes en el plasma circulante.
También se ha demostrado que la elastasa
pancreática porcina y diversas serina-proteasas
liberadas de los leucocitos humanos degradan el vWF
proteolíticamente, resultando una pérdida de grandes multímeros. El
mapeo de epítopos de los productos de degradación indica de nuevo
que estos fragmentos son también diferentes de aquellos presentes
en el plasma normal y en el vWD de tipo 2A. Además, se ha demostrado
que una proteasa similar a la calpaína liberada de las plaquetas
humanas degrada los multímeros grandes del vWF y genera fragmentos
de vWF similares a los que se observan in vivo.
Un objeto de la invención consiste en
proporcionar un polipéptido de la proteasa de segmentación del vWF
(vWF-cp) o una secuencia parcial del mismo.
Otro objeto de la invención proporciona una
composición que comprende un polipéptido vWF-cp.
Un objeto de la presente invención consiste en
proporcionar una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de
aminoácidos de un polipéptido vWF-cp.
También es objeto de la invención proporcionar
un polipéptido recombinante del vWF-cp.
Otro objeto de la invención proporciona un
método de producción de un polipéptido recombinante del
vWF-cp.
Es también objeto de la invención proporcionar
un método de purificación del vWF por medio de un polipéptido del
vWF-cp o una secuencia parcial del mismo.
Es también un objeto de la invención
proporcionar anticuerpos
anti-vWF-cp.
Fig. 1: muestra el diagrama esquemático de
purificación del vWF-cp procedente de plasma.
Fig. 2: muestra el SDS-PAGE de
los polipéptidos vWF-cp purificados bajo condiciones
no reductoras (A) y reductoras en presencia de DTT (B).
Fig. 3: muestra la secuencia parcial de
nucleótidos y aminoácidos del polipéptido de
vWF-cp.
Fig. 4: muestra esquemáticamente la localización
genómica del gen de la proteasa de segmentación del vWF.
Fig. 5: muestra la secuencia completa de
aminoácidos y nucleótidos de la proteasa de segmentación del vWF.
El principio y el final del péptido señal, los dominios
metaloproteasa, la región rica en cisteína (ACR), el motivo de la
trombospondina de tipo 1 (TSP 1), y el motivo análogo a la
desintegrina (RGD) se indican mediante flechas. El sitio de
segmentación de la furina, el sitio catalítico y el
Met-turn están subrayados. Los sitios putativos de
N-glicosilación se indican mediante asteriscos.
Fig. 6: muestra la representación esquemática de
la organización de los dominios de la proteasa de segmentación del
vWF y aquellos de los miembros humanos de la familia
ADAM-TS. Se muestran las estructuras de los dominios
de la proteasa de segmentación del vWF (ADAMTS 13) y de todas las
proteínas ADAMTS conocidas. No se puede encontrar ADAMTS 10 en las
bases de datos y la ADAMTS 11 es idéntica a la ADAMTS 5.
Fig. 7: muestra el análisis Western Blot de
células transfectadas con un vector que comprende secuencias
codificadoras del polipéptido de vWF-cp, con: la
banda 1: marcador estándar de peso molecular, banda 2: vector de
control cDNA3.1 (+) y banda 3: vector pCMV-vWFcp.
La banda específica del polipéptido del vWF-cp viene
indicada por la flecha.
Fig. 8: muestra el SDS-PAGE de
la actividad del vWF-cp en el vWF con la banda 1:
vWF plasmático purificado como control, banda 2: vWF incubado con
plasma humano normal, banda 3: vWF incubado con tampón como control,
banda 4: vWF incubado con lisado celular de células
SK-Hep transfectadas con el vector de control
cDNA3.1 (+) y banda 5: vWF incubado con lisado celular de células
SK-Hep transfectadas con vWF-cp que
expresan el vector pCMV-vWFcp.
De acuerdo con uno de los objetos de la
invención, se proporciona un polipéptido que muestra una actividad
de vWF-cp que comprende la secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO. 1, siendo la actividad del vWF-cp tal
como se define en la reivindicación 1. Preferentemente, el
polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 180 kD,
aproximadamente 170 kD, aproximadamente 160 kD o aproximadamente 120
kD, tal como se determina por SDS-PAGE bajo
condiciones reductoras.
El polipéptido según este aspecto de la
invención puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2
ó SEQ ID NO. 3. Se revelan también polipéptidos que comprenden la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, o una
secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 80%,
al menos un 90%, o al menos un 95% con cualquiera de las secuencias
de aminoácidos SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO.
4 ó SEQ ID NO. 5.
Tal como se revela, se trata de un polipéptido
que posee la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 5 y una
secuencia parcial de la misma de al menos 12 o al menos 15
aminoácidos. El polipéptido del vWF-cp de la
invención conserva la actividad de proteasa de segmentación del vWF
en presencia del inhibidor de la serina-proteasa
fluorofosfato de diisopropilo y en presencia del inhibidor de la
calpaína
Z-Leu-Leu-Tyr-CHN_{2}.
El término "polipéptido" significa una
cadena de residuos aminoácidos enlazados mediante enlaces peptídicos
entre el carbono \alpha-carboxilo de un residuo
aminoácido y el \alpha-nitrógeno del siguiente
aminoácido, y que comprende 10 o más residuos aminoácidos unidos
unos a otros. El polipéptido puede contener otros aminoácidos
distintos de los 20 aminoácidos codificados genéticamente.
"Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, tales como
péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas,
generalmente denominadas proteínas. "Polipéptido" incluye
secuencias de aminoácidos modificadas por medio de procesos
naturales, tales como modificaciones
post-traducción, o modificaciones químicas, que son
conocidas en la técnica. Las modificaciones pueden tener lugar en
cualquier sitio del polipéptido. La modificación puede llevar a una
variante del polipéptido que puede ser diferente en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido original en una o más sustituciones,
adiciones, deleciones, fusiones o cualquier combinación, o una
variante natural, tal como una variante alélica o una variante no
natural obtenida por mutagénesis o ingeniería genética. El
"polipéptido" puede encontrarse en forma de un precursor no
procesado o parcialmente procesado, el polipéptido "maduro", o
de un fragmento que tenga una secuencia de aminoácidos que es
exactamente la misma que una parte pero no que la totalidad de la
secuencia de aminoácidos de la cadena más larga de polipéptidos. El
fragmento puede ser una región continua única más corta de la
cadena más larga o estar incluido en un polipéptido más largo del
cual forma parte. Un fragmento de polipéptidos puede incluir, por
ejemplo, un polipéptido truncado que tenga una secuencia parcial de
aminoácidos del vWF-cp. Un "fragmento" puede
ser un fragmento biológico activo que medie la actividad de
proteasa de segmentación del vWF, incluidos aquellos con una
actividad análoga o una actividad mejorada o con una actividad
reducida.
"Identidad" significa la identidad de la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO.
1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 ó SEQ ID NO. 5. "Al
menos un 80% de identidad" significa que la secuencia de
aminoácidos es idéntica excepto que la secuencia de polipéptidos es
diferente en no menos de 20 aminoácidos por cada 100 aminoácidos.
"Al menos un 90%" o "al menos un 95% de identidad"
significa una diferencia no inferior a 10 o no inferior a 5
aminoácidos por cada 100 aminoácidos.
El término "proteasa de segmentación del
vWF" (vWR-cp) se refiere a una proteína o un
polipéptido que posee la actividad de segmentación del vWF y
segmenta los multímeros vWF de alto peso molecular del vWF en
moléculas de peso molecular más bajo que siguen teniendo la
actividad y propiedades del vWF.
El término "polipéptido de la proteasa de
segmentación del vWF" se refiere a un polipéptido que tiene como
mínimo 10 residuos aminoácidos. La secuencia completa de aminoácidos
del polipéptido no procesado comprende 1.427 aminoácidos. El
polipéptido "maduro", que forma parte del polipéptido no
procesado más grande, tendría que empezar normalmente por o cerca
del aminoácido 75, empezando por AAGGILH y continuando hacia el
terminal carboxilo. La proteasa de segmentación del vWF madura
tiene una masa calculada del polipéptido de aproximadamente 145 kD.
Se pueden incluir aminoácidos adicionales que contienen secuencias
secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que
ayudan a la purificación o identificación, tales como residuos His
múltiples, una secuencia etiqueta FLAG o adicional para la
estabilidad durante la producción recombinante.
El término "actividad de segmentación del
vWF" se refiere a una actividad fisiológica de segmentación del
vWF que se define por (1) segmentar el vWF en el enlace peptídico
842Tyr-843Met, (2) tener una actividad proteolítica
directa que convierte el vWF de estructura singlete en vWF con
estructura satélite, y (3) conservar la actividad en presencia de
un inhibidor de la serina-proteasa tal como
fluorofosfato de diisopropilo (DFP) y en presencia de un inhibidor
de la calpaína-proteasa tal como el inhibidor
carbobenziloxi (Z) peptidil diazometilcetona
(Z-Leu-Leu-Tyr-CHN_{2}).
Las entidades proteolíticas proporcionadas con la presente invención
pueden actuar también de forma indirecta a través de otra proteína
efectora, por ejemplo una proteasa. Este polipéptido puede formar
un complejo activo de segmentación del vWF junto con un ión metálico
seleccionado de entre el grupo consistente en Ca^{++}, Sr^{++},
Mg^{++} y Ba^{++}. El ión metálico preferente es Ca^{++}.
Este complejo activo es capaz de segmentar el vWF de forma
fisiológica, tal como se ha descrito anteriormente. La actividad de
segmentación del vWF del polipéptido de acuerdo con la presente
invención, tal como se define en la reivindicación 1, puede
determinarse por medio de cualquier método descrito en la técnica,
por ejemplo el método según Furlan y col., (1996, Blood 87:
4223-4234).
El polipéptido de la invención se puede
aislar.
El término "aislado" significa alterado de
su estado natural y/o retirado de su entorno original.
El polipéptido de la invención puede ser
sustancialmente puro.
El término "sustancialmente puro" significa
una pureza tan alta como las proporciones relativas de las cadenas
de polipéptidos con una actividad de vWF-cp presente
en una cantidad por encima del 50%, especialmente por encima del
80%, preferentemente por encima del 90% aproximadamente, de proteína
total en comparación con la actividad proteasa del vWF en plasma.
La pureza se determina por SDS-PAGE (teñido con
plata o teñido con azul de Commassie), así como por Western Blot, y
una proporción entre el polipéptido de la proteasa del vWF y la
cantidad total de proteína, dicha pureza es preferentemente superior
a aproximadamente el 98%. Si el polipéptido purificado del
vWF-cp se purifica a partir de plasma, la
preparación contiene entre el 0,001% y el 1%, preferentemente el
0,002% de la cantidad inicial de proteína plasmática, y al menos el
1%, preferentemente al menos el 2,3% de la actividad enzimática
inicial, que puede ser inactivada parcialmente durante el proceso de
purificación. La preparación que comprende un polipéptido de
vWF-cp de acuerdo con la presente invención está
esencialmente libre de vWF o de fragmentos de vWF; es decir, tiene
un contenido en vWF por debajo del 5%, preferentemente por debajo
del límite de detección de un ensayo empleado para detectar el vWF,
tal como el ensayo de colágeno descrito en la EP 0 816 852.
El polipéptido sustancialmente puro de
vWF-cp puede mostrar un peso molecular aparente de
aproximadamente 180 kD, 170 kD, 160 kD ó 120 kD en el análisis por
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras.
Se revela también que el polipéptido
sustancialmente puro de la proteasa del vWF puede mostrar un peso
molecular aparente de aproximadamente 150 kD, 140 kD, 130 kD ó 110
kD en el análisis por SDS-PAGE bajo condiciones no
reductoras.
El SDS-PAGE se realiza bajo
condiciones reductoras o no reductoras. Se conoce bien en la técnica
que la determinación del peso molecular por
SDS-PAGE resulta en la detección de masas
moleculares aparentes, que pueden ser diferentes de las masas
moleculares de la proteína nativa no desnaturalizada.
El análisis del material no desnaturalizado por
espectrometría de masas mostró picos muy anchos de alto peso
molecular. Este descubrimiento está de acuerdo con lo observado en
los experimentos por filtración en gel, lo que sugiere que las
proteínas de esta preparación tienden a polimerizarse bajo
condiciones fisiológicas (una propiedad de la clusterina).
El polipéptido de la invención se puede aislar
desde cualquier fuente que incluya un polipéptido de
vWF-cp.
El término "fuente" se refiere a plasma
humano, un sobrenadante de un cultivo celular que expresa un
polipéptido de vWF-cp de acuerdo con la presente
invención, leche u otros fluidos corporales de animales transgénicos
que expresan el polipéptido de la invención.
La purificación del polipéptido de
vWF-cp se puede llevar a cabo por medio de una
combinación de pasos cromatográficos que incluyen la cromatografía
de inmunoafinidad, de filtración en gel, y por cromatografía de
intercambio iónico. Por ejemplo, el primer paso de purificación
puede ser una cromatografía de inmunoafinidad, el segundo paso
puede ser la filtración en gel, seguida de uno o más pasos
adicionales de cromatografía de inmunoafinidad. Se puede realizar
otra purificación mediante una cromatografía de intercambio iónico,
preferentemente cromatografía de intercambio aniónico, y al menos
una cromatografía de afinidad. Se pueden llevar a cabo otros pasos
de purificación mediante cromatografía de intercambio iónico,
filtración en gel y otros pasos de cromatografía de afinidad.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se proporciona una composición que comprende un
polipéptido del vWF-cp según el primer aspecto de
la invención. Se proporciona también una composición que incluye un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
de entre el grupo de la SEQ ID NO. 4 y la SEQ ID NO. 5 y una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con
la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO. 1, SEQ
ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 ó SEQ ID NO. 5.
La composición de la invención que comprende el
polipéptido puede incluir además un ión metálico divalente
seleccionado de entre el grupo Ca^{2+}, Sr^{2+}, Ba^{2+} y
Mg^{2+}.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un complejo de polipéptido aislado de vWF-cp que
tiene actividad de vWF-cp, vWF y un ión metálico
seleccionado de entre el grupo consistente en Ca^{2+}, Sr^{2+},
Ba^{2+} y Mg^{2+}. La preparación puede comprender iones
metálicos divalentes en una concentración de aproximadamente 1 a
10^{6} iones por molécula polipeptídica con la actividad proteasa
de vWF y puede contener el polipéptido vWF-cp en
una forma esencialmente purificada.
La composición puede comprender clusterina o un
análogo o un derivado de la misma que tenga la actividad clusterina.
Con respecto a la actividad de la proteína, el término
"derivado" o "análogo" de la clusterina se refiere a un
polipéptido que muestra las mismas características que la proteína
clusterina nativa.
La clusterina es una glicoproteína
heterodimérica compuesta por dos subunidades no idénticas, con una
masa molecular de aproximadamente 80 kDa (Rosenberg y col., 1995,
Int. J. Biochem. Cell Biol. 27: 633-645; Tschopp y
col., 1994, Clin. Exp. Immunol. 97 (Suppl. 2):
11-14). Se produce en una amplia serie de tejidos y
se encuentra en la mayoría de los fluidos biológicos. Las funciones
fisiológicas descritas en la técnica anterior incluyen regulación
del complemento, transporte de lípidos, maduración del esperma,
iniciación de la apoptosis, secreción de endocrinos, protección de
la membrana y promoción de las interacciones celulares. Se ha
descubierto que la estabilidad inhabitualmente alta del polipéptido
vWF-cp de la presente invención en el plasma
circulante está asociada a la presencia de clusterina y que la vida
media de la actividad de la proteasa de segmentación del vWF in
vivo ocila entre 1 y 4 días, mientras que otras proteasas del
plasma tienen vidas medias que oscilan entre unos segundos y unas
horas. La proporción entre la clusterina y el polipéptido de la
proteasa de vWF en una composición de acuerdo con la presente
invención oscila preferentemente entre 10M:1M y 1M:10M, y en
especial, la proporción entre la clusterina y el vWF se encuentra en
el rango equimolar. En plasma humano, la concentración de la
proteasa de segementación del vWF es de 2 a 10 mg/litro, mientras
que la concentración de clusterina es de 50 a 400 mg/litro de
plasma (el coeficiente molar entre la proteasa de segmentación de
vWF y la clusterina en plasma humano es de aproximadamente 1:20 a
1:100).
De acuerdo con un tercer aspecto de la
invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el
polipéptido del primer aspecto de la invención. Se proporciona
también una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de las SEQ
ID NO. 4 y SEQ ID NO. 5 y una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de
cualquiera de las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID
NO. 4 ó SEQ ID NO. 5.
El término "molécula de ácido nucleico"
significa un polinucleótido y se refiere en general a cualquier ADN
o ARN, lo que también incluye variantes del ADN o ARN, ADN o ARN que
puede ser modificado o no modificado, de hebra única o doble o una
mezcla de los mismos, o un polinucleótido corto, generalmente
denominado oligonucleótido. Una variante típica de un
polinucleótido es diferente en la secuencia de nucleótidos del
polinucleótido original en su secuencia y puede o no modificar la
secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el
polinucleótido de referencia. Los cambios en el nucleótido pueden
resultar en sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones o
truncamientos de aminoácidos en la secuencia polipepetídica del
polipéptido. La secuencia de polinucleótidos puede modificarse para
mejorar la expresión recombinante. Esta modificación incluye la
utilización de codones altamente traducidos. La secuencia de ácidos
nucleicos que se hibridiza realmente con la secuencia de ADN, tal
como se muestra en la Fig. 5, o la secuencia parcial que codifica un
aminoácido de 12 aminoácidos como mínimo forman parte del alcance
de la presente invención. Las técnicas de hibridación son bien
conocidas del especialista en la técnica.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la
invención, se proporciona un vector de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico del tercer aspecto de la invención. Se
proporciona también un vector de expresión que incluye una molécula
de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos
que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre el grupo de las SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 5 y
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad
con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO. 1,
SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 5.
La molécula de ácido nucleico de la invención se
puede utilizar para construir sistemas de expresión que proporcionen
los elementos apropiados para la replicación del vector dentro de
una célula huésped y la expresión del ADN, que entonces se puede
utilizar para la expresión de un polipéptido que tiene la actividad
la proteasa de segmentación del vWF de acuerdo con la presente
invención. La secuencia de ácidos nucleicos puede modificarse para
mejorar la expresión, por ejemplo añadiendo una secuencia
Kozak.
El vector de expresión puede comprender, por
ejemplo en la dirección de la transcripción, una región de
regulación transcripcional y una región de iniciación de traducción
funcional en una célula huésped, una secuencia de ADN incluyendo un
polinucleótido que expresa un polipéptido de vWF-cp
de acuerdo con la presente invención y regiones de terminación de
traducción y transcripción funcionales en dicha célula huésped, en
las cuales la expresión de la secuencia nucleica es regulada por
las regiones de iniciación y terminación. El vector de expresión
puede contener también elementos para la replicación del nucleótido.
Ejemplos de vectores de expresión del ADN son pBPV, pSVL, pRc/CMV,
pRc/RSV, sistemas de vectores miogénicos, un vector basado en pcDNA3
(Invitrogen) o vectores procedentes de sistemas virales, por
ejemplo del virus vaccinia, adenovirus, adenovirus asociados, virus
del herpes, retrovirus o baculovirus. Los vectores de expresión
adecuados en mamíferos contienen normalmente una o más unidades de
transcripción en eucariotas que son capaces de expresarse en células
de mamífero. La unidad de transcripción se compone como mínimo de
un elemento promotor para mediar la transcripción de secuencias de
ADN extrañas. Los promotores adecuados para las células de mamíferos
son conocidos en la técnica e incluyen promotores virales tales
como los del virus del simio 40 (SV40), citomegalovirus (CMV),
virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV), virus del
papiloma bovino (BPV) y otros promotores seleccionados de entre el
grupo de promotores de metalotioneína y de
\beta-actina. Otros promotores conocidos en la
técnica son también aplicables para la expresión.
El vector de expresión que contiene la secuencia
de ácido nucleicos que codifica el polipéptido de
vWF-cp de acuerdo con la presente invención se
puede utilizar para transformar las células huésped, que producen
luego el polipéptido. Se pueden cultivar las células huésped
transformadas en un sistema de cultivo celular para producir el
polipéptido in vitro. Las células huésped pueden excretar el
polipéptido con la actividad proteasa de vWF dentro del medio de
cultivo celular a partir del cual se puede preparar o el polipéptido
se puede aislar del lisado celular.
De acuerdo con un quinto aspecto de la
invención, se proporciona una célula huésped que comprende un vector
de expresión del cuarto aspecto de la invención. Se proporciona
también una célula huésped que incluye un vector de expresión que
comprende una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de las SEQ
ID NO. 4 y SEQ ID NO. 5, así como una secuencia de aminoácidos que
tiene como mínimo un 80% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID
NO. 3, SEQ ID NO. 4 o SEQ ID NO. 5. El vector de expresión se puede
transformar o transfectar en una célula huésped para la expresión
del polipéptido recombinante. Células huésped adecuadas incluyen
cualquier célula capaz de producir el polipéptido de
vWF-cp después de haber sido transformada o
transfectada. Las células preferentes incluyen células bacterianas,
levaduras, células de insectos o células de animales. La célula
huésped puede ser una célula procedente del cuerpo de un mamífero,
por ejemplo fibroblastos, queratinocitos, células hematopoyéticas,
hepatocitos o mioblastos, que se transforman in vitro con un
sistema de vectores de expresión que llevan un ácido nucleico de
acuerdo con la presente invención y se reimplantan en el mamífero.
El polipéptido de acuerdo con la presente invención codificado por
dicho ácido nucleico será sintetizado por estas células in
vivo y mostrará la actividad biológica deseada en el
mamífero.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles
como huéspedes para la expresión son conocidas en la técnica e
incluyen numerosas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Células huésped
ejemplo de mamíferos incluyen en particular líneas celulares de
primates y líneas celulares de roedores, incluyendo las líneas
celulares transformadas. Preferentemente, para una integración
estable del ADN vector y para la amplificación posterior del ADN
vector integrado, ambos mediante métodos convencionales, se emplean
células de ovario de hámster chino (CHO) como células huésped
seleccionadas de mamíferos. Otras líneas celulares adecuadas
incluyen, pero no se limitan a, células HeLa, células renales de
hámster bebé (BHK), células renales de mono (COS-1),
células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2),
células 293 transformadas con adenovirus humano, células HEK 293,
células SKHep, células L-929 de ratón, líneas
celulares de hámster HaK, células 3T3 murinas derivadas de ratones
Swiss, Balb-c o NIH y diversas otras líneas
celulares. Otra línea celular de mamíferos adecuada es la línea
celular CV-1. Son también adecuadas las células
diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivos in
vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las
células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen
de selección o pueden contener un gen de selección de acción
dominante.
dominante.
Las células huésped pueden ser células
transformadas o células no transformadas. Las células huésped son
preferentemente aquellas que expresan la furina de forma natural o
después de haber sido genéticamente modificadas para expresar la
furina recombinante.
La selección de células huésped adecuadas de
mamíferos y los métodos para la transformación, el cultivo, la
amplificación, la selección y la producción y purificación de
productos son bien conocidos en la técnica.
Las células huésped transformadas con un vector
que lleva el polipéptido de vWF-cp que codifica el
ácido nucleico se pueden cultivar luego, si se desea, en
condiciones adecuadas, con la amplificación de los genes
introducidos. Las condiciones eficaces incluyen, pero no se limitan
a, las condiciones apropiadas de medios, biorreactor, temperatura,
pH y oxígeno, que permiten la producción de proteínas. Por tanto, el
método de la presente invención comprende el cultivo de una célula
o de una línea celular adecuada que ha sido transformada con una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de
aminoácidos del polipéptido de vWF-cp, encontrándose
la secuencia de codificación bajo el control de una secuencia de
regulación transcripcional. Entonces se recupera el polipéptido
expresado, se aísla y purifica a partir del medio de cultivo, si es
segregado por las células, o a partir de la célula, si se expresa
intracelularmente, mediante los medios apropiados conocidos por los
especialistas en la técnica.
La molécula de ácido nucleico de la invención o
un fragmento de la misma se puede expresar en un sistema de
microorganismos eucariotas o procariotas, tales como hongos,
incluyendo levaduras, o bacterias. Los fragmentos pueden incluir
formas truncadas de la proteasa de segmentación del vWF. Ejemplos de
truncamiento incluyen, pero no se limitan a, deleciones N- o
C-terminales.
La molécula de ácido nucleico de la invención se
puede utilizar también para generar animales transgénicos que
expresen dicho polipéptido in vivo. En una realización de
esta aplicación específica, los animales transgénicos pueden
expresar el polipéptido de vWF-cp en las glándulas
endógenas, por ejemplo en las glándulas mamarias, a partir de las
cuales se segregan dichas proteínas. En el caso de las glándulas
mamarias, dicho polipéptido de la proteasa del vWF se segrega en la
leche de los animales, a partir de la cual se pueden preparar tales
proteínas. Los animales pueden ser ratones, ganado, cerdos, cabras,
ovejas, conejos o cualquier otro animal económicamente útil.
El polipéptido del vWF-cp de la
invención se puede utilizar en un método de purificación de vWF
proporcionando, como ligando para el vWF, un polipéptido de
vWF-cp de la invención, poniendo en contacto una
solución que comprende el vWF con el ligando polipeptídico de
vWF-cp bajo condiciones donde el vWF se enlazado al
ligando y recuperar de dicho ligando el vWF purificado. El ligando
polipeptídico de vWF-cp puede estar unido a un
soporte sólido.
Otro aspecto de la invención consiste en un
método para la producción de anticuerpos
anti-vWF-cp del polipéptido
mediante la inmunización de un animal con un polipéptido de la
invención y el aislamiento de los anticuerpos
anti-vWF-cp del polipéptido. Se
revela que el polipéptido del vWF-cp de la invención
se puede emplear también para el desarrollo de otras moléculas de
unión del polipéptido del vWF-cp por medio de
técnicas conocidas en este campo.
El término "anticuerpos" tal como se
utiliza aquí, incluye anticuerpos monoclonales y policlonales,
anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única y humanizados,
así como fragmentos Fab, incluyendo productos de un Fab u otra
librería de expresión de inmunoglobulinas, péptidos o
peptidomiméticos. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir
de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Otras moléculas
de unión pueden ser derivados de un anticuerpo, tal como un
anticuerpo de cadena única, un fragmento Fab-, o F(ab')2, un
anticuerpo quimérico o un péptido o un peptidomimético, que se
pueden obtener por medio de métodos conocidos, por ejemplo por el
método de visualización de fagos.
Se revela también que una molécula de unión al
polipéptido de vWF-cp seleccionada de entre el grupo
de anticuerpos de cadena única, el fragmento Fab o F(ab')2 o
los polipéptidos con el sitio de unión de la proteasa de vWF se
puede producir por medio de un método donde se explora una librería
de visualización de fagos en busca de la molécula de unión al
polipéptido anti-vWF-cp, se
determina la secuencia de ácidos nucleicos de los clones positivos
y se clona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia
en un vector de expresión.
El desarrollo de los anticuerpos, derivados de
anticuerpos, peptidomiméticos o cualquier otra molécula que se una
al polipéptido de vWF-cp se puede realizar de
acuerdo con los métodos conocidos en la técnica anterior (Greer y
col., 1994, J. Med. Chem. 37: 1035-1054; Kemp 1990,
Trends Biotechnol. 8: 249-255).
Otro aspecto de la invención consiste en un
método para la purificación del polipéptido del
vWF-cp utilizando una molécula de unión al
polipéptido del vWF-cp como ligando para purificar
el vWF-cp, tal como se define en la reivindicación
17. Este método se puede llevar a cabo poniendo en contacto una
solución que comprende el polipéptido del vWF-cp
con la molécula de unión al polipéptido del vWF-cp
bajo condiciones por las cuales el polipéptido de
vWF-cp se une a la molécula de unión y recuperando
el polipéptido del vWF-cp mediante la elución
selectiva del polipéptido de vWF-cp de la molécula
de unión al vWF-cp. La molécula de unión al
vWF-cp se puede unir a un soporte sólido.
Otro aspecto de la invención consiste en un
método para la detección del polipéptido de vWF-cp
en una muestra por medio de una molécula de unión al polipéptido
vWF-cp tal como se define en la reivindicación 18.
Así, una solución que se cree contiene el polipéptido de
vWF-cp se pone en contacto con una molécula de unión
al polipéptido de vWF-cp tal como se ha descrito
anteriormente bajo condiciones que permitan la formación de un
complejo del polipéptido de vWF-cp/molécula de unión
al polipéptido de vWF-cp y la detección del
complejo.
El polipéptido de vWF-cp de la
invención se puede utilizar, por ejemplo, para procesar vWF
plasmático o producido de forma recombinante. El vWF recombinante
(r-vWF) se puede producir en células CHO, por
ejemplo según Fischer y col. (1995. FEBS Lett. 375:
259-262). Se dispone del r-vWF
recuperado de esta manera en forma de vWF maduro y posee una
estructura singlete, es decir que es diferente del vWF derivado de
plasma, que tiene siempre una estructura satélite característica
cuando se examina sobre geles de agarosa con SDS al 2%. La US
5.854.403 enseña que el r-vWF se compone de
multímeros con alta integridad estructural que se conservan aún
después de la purificación y tratamiento para la inactivación
viral. La estructura intacta del r-vWF viene
definida por el resultado de un análisis electroforético que se
compone de bandas de multímeros con ausencia de bandas satélites.
Para elaborar una preparación de r-vWF con una
estructura que se corresponda más estrechamente con la del vWF
derivado de plasma a partir de r-vWF con estructura
singlete, se trata el r-vWF con el polipéptido de
la proteasa de vWF o con una composición que comprende el
polipéptido de la proteasa de vWF de la presente invención, y
opcionalmente iones metálicos y/o clusterina.
De acuerdo con un aspecto de la invención, el
polipéptido del vWF-cp se puede utilizar para la
producción de una preparación para la profilaxis y la terapia de
enfermedades donde aparecen un contenido supranormal de vWF o un
aumento del nivel de vWF de alto peso molecular en pacientes, tal
como la enfermedad tromboembólica. Esto puede resultar en trombosis
y enfermedades tromboembólicas. Por ejemplo, la púrpura
trombocitopénica trombótica (TTP), la púrpura de
Henoch-Schönlein, preeclampsia, trombocitopenia
neonatal o síndrome hemolítico-urémico. Al
administrar una dosis eficaz de un polipéptido de la invención y al
tener una actividad proteasa del vWF, se puede llegar a la
reducción del contenido de multímeros del vWF de alto peso molecular
en los pacientes, lo que resulta en una terapia eficaz de estas
enfermedades. La enfermedad tromboembólica se puede seleccionar de
entre la púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), la púrpura de
Henoch-Schönlein, preeclampsia, trombocitopenia
neonatal o síndrome hemolítico-urémico.
En los siguientes ejemplos, se describe la
invención sin limitarla a los mismos.
El IgG-eTTP se aísla con ayuda
de 20 ml de proteína A-Sepharose® (diámetro 1,6 cm)
en TBS, pH 7,4. Se aplica a la columna, en un volumen de 50 ml,
plasma para féresis de un paciente que padece TTP adquirida
("erworbenes" TTP; eTTP), el cual ha sido ensayado previamente
en cuanto a su contenido inhibidor con respecto a la proteasa de
segmentación de vWF. Después de aclarado posterior con TBS, pH 7,4,
los IgG unidos se eluyen sucesivamente con citrato 0,1 M, pH 4,0 y
glicina 0,1 M, pH 2,7. Las fracciones se llevan inmediatamente a pH
fisiológico mediante la adición de Tris, 1,5 M, pH 8,8, y se
dializan contra TBS, pH 7,4. El Affi-Gel® Hz se
acopla según las instrucciones del productor con el
IgG-eTTP que ha sido extraído de la proteína
A-Sepharose® con un pH de 4,0. El material de la
columna así preparado se extrae primero tal como se ha descrito,
posteriormente se lava 3 veces alternativamente con 50 ml de tampón
B y 200 ml de tampón A (capítulo 1.7). Antes de su uso, se lleva a
cabo, en cada caso, un aclarado intensivo con el tampón A.
Como material de partida se utilizaron 100 ml de
un pool de plasma CPD que procedía como mínimo de tres donantes y
había sido almacenado a -20ºC, después de su centrifugación a 2.500
rpm (1.100 g) durante 5 minutos. El plasma se cargó a un caudal
relativamente bajo (FR: 30 ml/h) en una columna cromatográfica de
200 ml con IgG-eTTP Affi-Gel® Hz
(hidrazida, diámetro de 2,6 cm) que había sido equilibrado en el
tampón A. Después de su lavado con al menos 400 ml del tampón A
durante toda la noche al mismo caudal, se conectó a la misma una
columna para desalinización por filtración en gel de 200 ml
(Bio-Gel® P-6DG, diámetro de 2,6 cm)
y 10 ml de una proteína G-Sepharose® (diámetro de
1,6 cm), que también había sido aclarada previamente con el tampón
A. Después de aumentar el caudal a 100 ml/h, las proteínas unidas a
Affi-Gel Hz se eluyeron directamente con 50 ml de
tampón B sobre Bio-Gel® P-6DG para
eliminar de las proteínas el NaSCN que se encontraba en el tampón B.
Las proteínas que se habían eluído de la columna de desalinización
antes del NaSCN se guían a través de la proteína
G-Sepharose® sin interrupción, donde se liberan de
los IgGs. En ese momento, el caudal se baja a 50 ml/h para ampliar
el intervalo de permanencia de las proteínas en la columna de 10
ml. Para la regeneración, la proteína G-Sepharose®
se lava rápidamente con el tampón C, y la fracción eluída de IgG se
almacena para su análisis.
El primer paso se lleva a cabo 8 veces antes de
reunir y después procesar las fracciones recogidas que se habían
congelado a -20ºC.
Las fracciones reunidas a partir de las 8
cromatografías del primer paso se diluyen 1:1 con H_{2}O para
obtener una potencia iónica a la cual las proteínas deseadas se
unirían a la columna de intercambio aniónico (High Q Support®). La
muestra, cuyo volumen es de 1.500 a 1.800 ml, dependiendo de la
carga utilizada, se comprueba en cuanto a su pH y su potencia
iónica y se aplica durante la noche a un caudal de 90 ml/h a través
de una columna de 50 ml con Therasorb® (diámetro de 1,6 cm) sobre 50
ml de High Q Support® (diámetro de 1,6 cm). Tanto el Therasorb como
el High Q Support® han sido equilibrados previamente en el tampón D.
Después de su lavado con aproximadamente 150 ml de tampón D, se
desconecta el Therasorb y se conectan 25 ml de Lectina de Lenteja
Sepharose® (diámetro de 1,6 cm) que ha sido equilibrada en el tampón
E para continuar el High Q Support®. A un caudal de 60 ml/h, las
proteínas unidas al High Q Support se eluyen inmediatamente con el
tampón E directamente en la Lectina de Lenteja de Sepharose®. Las
proteínas que se unen a la Lectina de Lenteja de Sepharose® se
pueden eluir en dos pasos con los tampones G y H y se pueden
recoger. Las proteínas que se han quedado unidas al Therasorb y
High Q Support® se eliminan por lavado con el tampón C o el tampón
F, respectivamente, y se desechan después del análisis.
Para la regeneración, la Lectina de Lenteja de
Sepharose®, antes de su uso, se aclara en cada caso de acuerdo con
las instrucciones del fabricante 3 veces, alternando con 20 ml de
cada uno de los tampones I y J, el High Q Support se aclara
sucesivamente con 10 ml cada vez de NaOH 1 N y NaCl 1 M.
Las fracciones reunidas que ya han sido eluídas
de la Lectina de Lenteja de Sepharose® con el tampón H se someten a
diálisis tres veces durante un total de 4 horas, cada una contra 1 l
del tampón D, y se aplican de nuevo al High Q Support a un caudal
de 60 ml/h. Conectado enfrente se encuentra una
Heparina-Sepharose de 5 ml (diámetro de 1,4 cm),
que ha sido equilibrada del mismo modo en el tampón D. Después de la
aplicación de la muestra, se aclara con aproximadamente 50 ml del
tampón D, se desconecta la Heparina-Sepharose y se
conecta a la misma una Sephacryl® S-300 HR de 500 ml
(diámetro de 2,6 cm), que ha sido equilibrada en el tampón L. Las
proteínas unidas al High Q Support se eluyen directamente en la
columna de filtración en gel con 10 ml de tampón K. La
cromatografía de exclusión se realiza a un caudal de 42 ml/h y se
recogen las fracciones con 7 ml cada una. Las proteínas que están
más fuertemente unidas al High Q Support® se eluyen de nuevo con el
tampón F, aquellas que han quedado adheridas a la
Heparina-Sepharose, con el tampón K.
El pool de fracciones activas procedentes del
tercer paso se aplica sin tratamiento a un caudal de 10 ml/h a una
columna de
anti-\alpha_{2}-macroglobulina
de 1 ml (caudal de 0,7 cm) que se ha equilibrado en el tampón L. La
columna de
anti-\alpha_{2}-macroglobulina
se prepara mediante inmovilización, de acuerdo con las
instrucciones, de anticuerpos de
anti-\alpha_{2}-macroglobulina
de conejo a una concentración de 4,9 mg/ml en Sepharose activada
con CNBr. Las proteínas unidas a la misma se eluyen con NaSCN 3 M en
el tampón L, así como con el tampón C, y se almacenan para su
análisis.
\newpage
Alternativamente o además del cuarto paso, se
puede aplicar como paso adicional una cromatografía en columna con
anti-clusterina. Las muestras se preparan de forma
idéntica a la columna de
anti-\alpha_{2}-macroglobulina
utilizando anticuerpos anti-clusterina.
La preparación final del tercer paso de
aislamiento se somete a electroforesis en un gel de
SDS-poliacrilamida de 1,5 mm de espesor de acuerdo
con Laemmli (1970, Nature, 227: 680-685). Se utiliza
un gradiente del 4 al 12% de poliacrilamida para fraccionar las
proteínas. Después de la electroforesis en condiciones reductoras o
no reductoras (concentración final de 65 mmol/l de ditiotreita DTT),
las proteínas se hacen visibles mediante tinción con plata o con
azul de Commassie (Fig. 2). En condiciones no reductoras, las bandas
que tienen un peso molecular (MW) de aproximadamente 150 kD, 140
kD, 130 kD y 110 kD son detectables y en condiciones reductoras las
de aproximadamente 180 kD, 170 kD, 160 kD y 120 kD.
Las distintas fracciones aisladas mediante el
proceso de purificación descrito anteriormente se someten a prueba
en busca de la actividad de segmentación de vWF por medio del método
descrito por Furlan y col. (1996. Blood 87:
4223-4234).
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación proteica final desde el tercer
paso de aislamiento se somete a electroforesis en un gel de
SDS-poliacrilamida de 1,5 mm de espesor de acuerdo
con Laemmli (1970, Nature, 227: 680-685). Se utiliza
un gradiente del 4 al 12% de poliacrilamida para fraccionar las
proteínas de alto peso molecular y un gradiente del 8 al 12% de
poliacrilamida para las proteínas de bajo peso molecular. Después de
la electroforesis en condiciones reductoras o no reductoras
(concentración final de 65 mmol/l de ditiotreita), se someten a un
Blot sobre membranas PVDF y se tiñen durante 2 minutos con un 0,25%
de Azul de Commassie en un 45% de metanol, 9% de ácido acético y
46% de H_{2}O. Después de su aclarado con una mezcla de un 50% de
metanol, 10% de ácido acético y 40% de H_{2}O, las bandas de
proteínas visibles se cortan y analizan en un Secuenciador
Procise-cLC (Foster City, CA) en el Instituto
Químico de la Universidad de Berna.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de las bandas polipeptídicas separadas
por SDS-PAGE de la proteasa purificada de
segmentación del vWF se muestra en la Tabla 3.
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\newpage
El análisis de la composición de los aminoácidos
se realiza con la misma muestra que la que se utilizó para la
secuenciación de los aminoácidos. Las bandas de proteínas se
hidrolizan en fase gaseosa en HCl 6N durante 22 horas a 100ºC y se
determinan los aminoácidos por cromatografía líquida de alta
resolución. Se analizan cuatro bandas de polipéptidos no reducidos
procedentes del SDS-PAGE de vWF-cp
purificado con M_{r} 150, 140, 130 y 110 kDa. Se muestran los
resultados en la Tabla 4.
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Se determina la secuencia de codificación del
ácido nucleico de la secuencia de aminoácidos del péptido
AAGGILHLELLVAVG (SEQ ID NO. 2) de los 15 residuos
N-terminales de vWF-cp plasmático
humano purificado y corresponde a la secuencia de ácido nucleico
GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ ID
NO. 9). Una base de datos de búsqueda en el GenBank NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) mostró la localización de la
secuencia de ácido nucleico correspondiente GCT GCA GGC GGC ATC CTA
CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTG GGC (SEQ ID NO. 9) en el cromosoma
9 clon RP11-244N20 (AL158826, GI11544459). Así, la
secuencia de nucleótidos desde la base 150001 a 185911 se explora
en busca de exones potenciales. La superposición consecutiva de
segmentos del genoma con varias longitudes (1.500 bases - 5.000
bases) se analiza utilizando instrumentos de búsqueda que se
consultan a través de Internet-Explorer. Los
segmentos de la secuencia genómica, sus traducciones y los
resultados de la búsqueda se manejan por medio del programa
informático "Vectors NTI Suite1 v.5.2" (Informax Inc.,
USA). La secuencia de RP11-244N20 tiene un tamaño
de aproximadamente 185 kb y la secuencia de ácido nucleico
identificada empieza en la posición 156.653. La utilización de un
programa de búsqueda de exones (Grail,
http://compbio.ornl.gov/Grail-1.3) permitió la
identificación de aproximadamente 30 exones putativos "aguas
arriba" y "aguas abajo" de la posición 156.653. Los
primeros cuatro exones de la búsqueda se traducen en la secuencia de
aminoácidos correspondientes y se buscan las homologías de estas
secuencias. Esta búsqueda reveló que cada secuencia muestra una alta
homología con la secuencia de aminoácidos de la familia de la
desintegrina humana y metaloproteinasas con los motivos
trombospondina (ADAM-TS).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de conectar los exones putativos, el
poli-A-ARN procedente del hígado se
transcribe a la inversa y el cADN es amplificado entonces por PCR
con cebadores específicos de algunos de los exones putativos (Tabla
5). Los productos de PCR de los cebadores 6142 (SEQ ID NO.
16)-6277 (SEQ ID NO. 17), 6142 (SEQ ID NO.
16)-6546 (SEQ ID NO. 18), 6351 (SEQ ID NO.
19)-6546 (SEQ ID NO. 18), 6278 (SEQ ID NO.
21)-6407 (SEQ ID NO. 20), 6346 (SEQ ID NO.
23)-6395 (SEQ ID NO. 24) y 6406 (SEQ ID NO.
25)-6506 (SEQ ID NO. 26) (procedentes de los exones
putativos 1-6, 3-11,
6-11, 10-14, 13-16,
14-23, respectivamente) revelaron bandas del tamaño
esperado. Después de la secuenciación, se puede identificar un
marco de lectura abierto desde el exón 1 hasta el exón 23 localizado
cerca del extremo 3' del clon RP11-244N20. El
extremo 3' de la secuencia de cADN se examina por amplificación por
PCR del cADN utilizando el cebador directo (forward) 6548 (SEQ ID
NO. 27) del exón 22 y la secuencia MC18 específica del RT cebador
spdT. El fragmento resultante de un tamaño de aproximadamente 1,8 kb
se secuencia y, después de la búsqueda en la base de datos, la
parte 3' de la nueva secuencia de cADN se puede localizar en la
región q34 (AC002325) del cromosoma 9.
La secuencia desconocida del gen en el extremo
5' es identificada por 5'-RACE y la secuenciación
del producto resultante por PCR descubrió dos exones adicionales.
Ninguno de los siguientes cinco exones "aguas arriba" del exón
1-2 se pueden conectar por PCR a la secuencia de
cADN ya conocida. Se descubren todos los 29 exones juntos con un
tamaño de cADN de 4,6 kb. El gen de la proteasa de segmentación del
vWF mide aproximadamente 37 kb, se muestra un dibujo esquemático de
la localización de los exones en la Figura 4. La secuencia completa
de cADN se describe en la Figura. 5.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se buscan en el programa SMART
(http://smart.eml-heidelberg.de) las
arquitecturas del dominio proteasa así como los módulos de las
proteínas identificadas incluyendo un péptido señal con su región
transmembrana, un sitio de segmentación de la furina, un dominio
metaloproteasa, es decir una secuencia consenso en el sitio
catalítico de la Zn-proteasa, un Met turn, un
dominio desintegrina, una región rica en cisteína y motivos
trombospondina de tipo 1 (TSP-1) (Figura 6). Estos
módulos son compartidos también por miembros de la nueva familia de
las metaloproteinasas ADAMTS (para una desintegrina y metaloproteasa
con el motivo trombospondina de tipo 1) (Tang 1999, FEBS Lett. 445:
223-225; Tang 2001. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33:
33-44). La secuencia de aminoácidos de la proteasa
de segmentación del vWF se alinea con todas las secuencias proteicas
humanas ADAMTS, listadas por el Comité de Nomenclatura Genética de
la Organización del Genoma Humano (HUGO)
http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/adamts.html.
Se muestra en la Figura 6 una representación esquemática de los
dominios. Contrariamente a las proteínas ADAMTS, nuestro nuevo
miembro putativo de esta familia carece de prodominio. Sin embargo,
al examinar las secuencias de aminoácidos de los siguientes cinco
exones putativos "aguas arriba" del exón 1-2 no
se observó ninguna homología de secuencias con las proteínas
ADAMTS. Además, no se puede encontrar ninguna secuencia de péptidos
señal en estos exones. Por tanto, denominamos la proteasa de
segmentación del vWF ADAMTS13. La secuencia deducida de los
aminoácidos se compara también con la base de datos de proteínas
EMBL (http://ww2.ebi.ac.uk). Los exones 9 a 16 se
corresponden parcialmente con una proteína hipotética de 39,9 kDa ya
propuesta localizada en el cromosoma 9 y de marco de lectura
abierto calificado 8 (C9ORF8, XM 005647, GI12735207). Además, los
exones 26 a 29 se corresponden con la proteína hipotética
DKFZp434C2322 (NM032252, GI14149974) (Wiemann y col., 2001. Genome
Res. 11: 422-435).
El péptido con la secuencia AAGGILHLELLV (SEQ ID
NO. 1) se sintetiza en un soporte en fase sólida siguiendo el
método de Barany y col., (1980. Solid-phase Peptide
Synthesis. In: The Peptides. vol. 2, Gross, E. and
Meienhofer, J. (eds.) Academic, New York, SEITEN). Después de
segmentar y desproteger el péptido, se purifica el péptido mediante
cromatografía de intercambio iónico. El péptido se caracteriza por
HPLC en fase inversa en una columna de sílice C8 con elución en
gradiente de ácido trifluoroacético con acetonitrilo. El péptido no
mostró subproductos principales.
El péptido se solubiliza a una concentración de
5 mg/ml en 0,1 mol de un tampón fosfato de pH 7,5 y se incuba con
un gel preactivado adecuado para la cromatografía por afinidad
(Actigel, ALD-Superflow, Sterogene). Antes del
acoplamiento del péptido al gel, la matriz preactivada se lava con
un exceso del mismo tampón fosfato. Entonces se mezcla un volumen
de gel prelavado con un volumen de la solución peptídica para ser
inmovilizado y posteriormente partes de 0,1 en volumen de una
solución de 0,1 mol de cianoborohidruro (NaCNBH_{3}) en 0,1 mol
de un tampón de fosfato de pH 7,5. Se suspende el gel en esta
solución y se agita durante 15 horas a temperatura ambiente.
Posteriormente, se lava el gel en un embudo sinterizado con un
volumen 10 veces mayor del tampón fosfato conteniendo 150 mmol de
NaCl y con 5 volúmenes del tampón fosfato conteniendo 2 mol de
NaCl. Entonces se equilibra el gel con un exceso de 0,1 mol de
tampón fosfato pH 7,0.
Entonces se transfiere el gel a una columna
cromatográfica que tiene un diámetro cuya dimensión con respecto a
la altura del lecho de gel es 1:4. Se calcula la cantidad de péptido
acoplado a la matriz de afinidad determinando la concentración
peptídica de una solución del sobrenadante de incubación después de
su separación del gel y de las soluciones de lavado. El coeficiente
de acoplamiento es del 85%.
Posteriormente, se utiliza el gel para purificar
el vWF a partir del complejo Factor VIII (FVIII)/vWF. Se produce un
concentrado del complejo FVIII/vWF de acuerdo con la US 4.814.435,
conteniendo el vWF a una concentración de 260 U vWF:Ag/ml y con una
actividad específica de 13,5 U vWF:Ag/mg de proteína. Se diluye el
concentrado con 20 mM de tampón fosfato pH 7,0 hasta una
concentración final de vWF de 6 U vWF:Ag/ml. Se somete un volumen
de 20 ml de esta solución a una columna de afinidad con el péptido
inmovilizado descrito anteriormente. Después de lavar la columna
con 10 ml del tampón fosfato, el vWF unido específicamente al
ligando peptídico se eluye con un gradiente lineal de
0-2 mol/l de NaCl en el tampón fosfato a un caudal
de 1 ml/minuto. Se recogen fracciones de 1 ml y su densidad óptica
se determina a 280 nm. Se miden todas las fracciones en cuanto a su
contenido de antígeno de vWF determinado mediante un método ELISA
específico (Asserachrom vWF, Boehringer, Mannheim). La medición
mostró un pico específico de elución de vWF del péptido a una
concentración de NaCl de 100 mmol/l, mientras que la mayor parte de
la proteína medida por absorción UV se eluyó antes de la fracción
del vWF con el tampón de lavado. Las fracciones que contienen el
vWF se reúnen y se mide en ellas la actividad de vWF. El vWF de
este pool tenía una actividad específica de 95 U vWF/mg de proteína
y está esencialmente exento de otras proteínas.
Se sintetiza el péptido con la secuencia
AAGGILHLELLV (SEQ ID NO. 1) y se purifica tal como se describe en
el Ejemplo 4. Luego se utiliza el péptido para inmunizar ratones
BALB/c de 3 meses de edad con el siguiente protocolo: inyección
primaria subcutánea de 100 \mug de antígeno peptídico en emulsión
en 100 \mul de adyuvante completo de Freund, seguido de estímulos
intraperitoneales de 100 \mug de antígeno peptídico en una
solución tamponada con fosfato a intervalos mensuales.
La concentración de
anti-péptidos se somete a prueba por medio del
método de rutina ELISA utilizando un péptido purificado como
antígeno de detección. Después del último estímulo, se extraen los
bazos de los ratones por fusión celular. La fusión celular se lleva
a cabo de acuerdo con un protocolo estándar descrito originariamente
por Köhler y col. (1975, Nature 256: 495-497). Los
anticuerpos antipéptido que producen líneas celulares de hibridomas
son detectados por medio de técnicas estándar, con el péptido
purificado como antígeno de detección, basado esencialmente en una
metodología ELISA convencional. Después de la clonación, se puede
aislar una línea celular con un alto nivel de expresión de un
anticuerpo específico del péptido de detección con la secuencia
AAGGILHLELLV. Esta línea celular se cultiva en un medio de cultivo
libre de suero y se desarrolla hasta una alta densidad. El
sobrenadante del cultivo celular se recoge mediante centrifugación
para eliminar las células, el anticuerpo monoclonal que contiene el
sobrenadante se concentra mediante ultradiafiltración y se
acondiciona para su uso posterior.
El anticuerpo monoclonal obtenido tenía una alta
selectividad para la proteasa de segmentación del vWF, tal como se
describe en Furlan y col. (1996, Blood 87:
4223-4234). Este anticuerpo monoclonal se inmoviliza
en una placa ELISA de poliestireno en un tampón
carbonato/bicarbonato, 0,05 mol, pH 9,6, a una concentración de 5
\mug de inmunoglobulina/ml durante toda la noche (16 horas) a 4ºC,
cada una con 100 \mul de solución de recubrimiento por pocillo.
Se retira la solución de recubrimiento de los pocillos y se
sustituye por una solución de seroalbúmina bovina (BSA) a una
concentración de 100 \mug/ml, a un volumen de 100 \mul por
pocillo, durante 2 horas. Se retira la solución de BSA y se lavan
los pocillos con una solución salina tamponada con fosfato. Las
placas prerrecubiertas se incuban entonces con muestras de plasma
pobre en plaquetas procedente de donantes humanos sanos de plasma o
con plasma pobre en plaquetas procedente de pacientes con un
diagnóstico no claro de púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) o
de síndrome hemolítico-urémico (HUS). Después de la
incubación de las muestras de plasma con las placas ELISA
recubiertas de anticuerpo, como en un sistema ELISA de tipo
sandwich de rutina, a las 3 horas se retira el plasma de los
pocillos. Se lavan los pocillos con una solución salina tamponada
con fosfato y se incuban con el anticuerpo monoclonal dirigido
contra el péptido de secuencia AAGGILHLELLV, conjugado con
peroxidasa de rábano picante, siguiendo el método de Wilson y col.
(1978: In: Immunofluorescence and Related Staining
Techniques; Knapp, W. Holubar, K. and Wick, G (eds.),
Elsevier/North Holland, Amsterdam, 215) y detectado por el reactivo
OPT, tal como se describe en Cathy y col. (1989. ELISA and related
enzyme immunoassays, In: Antibodies II a practical approach.
Cathy D (ed.), IRL Press Eynsham Oxford England, 97).
En base al nivel de las muestras procedentes de
donantes humanos sanos de plasma se establece un rango normal. Los
plasmas de pacientes con HUS tenían una actividad de proteasa de vWF
equivalente a los humanos sanos, mientras que los pacientes con TTP
tenían una actividad de proteasa reducida, como lo confirmó el
ensayo basado en un principio de ensayo diferente tal como el
descrito en la WO 00/50904.
Se compra a Clontech poli-A+ARN
de glándulas salivares. Se obtiene la primera hebra de cADN por
medio de una transcriptasa reversa Expand (Hoffmann La Roche) y el
cebadorOligo d(T) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se realiza una PCR utilizando
5'-CGGCGGGATCCTACACCTGG-3' (SEQ ID
NO. 10) y 5'-AATGGT
GACTCCCAGGTCGA-3' (SEQ ID NO. 11) como cebadores con 10 ng de cADN de glándulas salivares como patrón y 10 U de polimerasa Hot Star Taq (Qiagen). Los parámetros del ciclo térmico son: incubación inicial a 94ºC durante 15 minutos seguida de 45 ciclos a 94ºC (50 segundos), 50ºC (50 segundos), 72ºC (2 minutos). Los productos de PCR se secuencian directamente en ambas direcciones utilizando el BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PerkinElmer Life Science).
GACTCCCAGGTCGA-3' (SEQ ID NO. 11) como cebadores con 10 ng de cADN de glándulas salivares como patrón y 10 U de polimerasa Hot Star Taq (Qiagen). Los parámetros del ciclo térmico son: incubación inicial a 94ºC durante 15 minutos seguida de 45 ciclos a 94ºC (50 segundos), 50ºC (50 segundos), 72ºC (2 minutos). Los productos de PCR se secuencian directamente en ambas direcciones utilizando el BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PerkinElmer Life Science).
La secuencia de ADN obtenida se utiliza para
escanear la base de datos genómica mediante los programas BLAST
(Herramienta Básica de Búsqueda de Alineamientos Locales) y se hace
coincidir con el cromosoma 9 del clon RP11-224N20.
La secuencia de ADN se traduce a la secuencia de aminoácidos
utilizando las herramientas de proteómica ExPASy. El ADN y la
secuencia de aminoácidos traducida correspondiente a 4 exones
putativos del cromosoma 9q34 se muestra en la Fig. 5.
Los fragmentos RT-PCR que
abarcan la preprosecuencia o los dominios maduros de la proteasa de
segmentación del vWF se clonan en el vector pDrive (Qiagen) por
clonación PCR. Para la amplificación del vWF-cp
maduro, se utilizan los cebadores #6601
(5'-AGCGGTCTCTATGGCTGCAGGCGGCATCCTACACC-3')
(SEQ ID NO. 30) y #6617
(5'-AGCCTCGAGCTGGCCAGACACGGAACAAAT-3')
(SEQ ID NO. 31).
El fragmento de ADN resultante se liga a las
superposiciones-T del vector pDrive. El constructo
que comprende el vWF-cp maduro se denomina pFP
H251/8. Para la amplificación de la preprosecuencia del
vWF-cp, se utilizan
los cebadores #66128 (5'-GGCGAATTCATGCACCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO. 32) y #6787
(5'-ACAGCATTAAACTAAGCCGCC-3') (SEQ ID NO. 33). El fragmento de ADN resultante se inserta en el vector pDrive. El constructo resultante se llama pFP H262-35/14.
los cebadores #66128 (5'-GGCGAATTCATGCACCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO. 32) y #6787
(5'-ACAGCATTAAACTAAGCCGCC-3') (SEQ ID NO. 33). El fragmento de ADN resultante se inserta en el vector pDrive. El constructo resultante se llama pFP H262-35/14.
Se utiliza el vector de expresión eucariota
pcADN3.1(+) (Invitrogen) para la expresión de la proteasa de
segmentación del vWF (vWF-cp) de longitud completa
bajo el control del promotor humano CMV.
Se extrae un fragmento EcoRI/XhoI de 4,12 kb del
plásmido pFP H251/8, fragmento que engloba la secuencia de cADN que
codifica el vWF-cp maduro procedente del nucleótido
nt 223 a 4.284 (sin la preprosecuencia de nt 1 a nt 222) y se
inserta en los sitios EcoRI/XhoI de pcADN3.1(+). Para completar el
extremo 5' del cADN con el fin de añadir la secuencia de
propéptidos y la líder, se realiza una PCR utilizando el plásmido
pFP H262-35/14 que contiene la secuencia de cADN
del vWF-cp desde n-10 (10 nt
"aguas arriba" del codón de partida ATG) hasta nt +824, con el
vector pDrive (Qiagen) como patrón, y el cebador directo 6839
(5'-GATCGAATTCGCCGGC
CACCATGCACCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO. 34), que alberga la secuencia consenso de Kozak (subrayada) para un contexto óptimo para el reconocimiento del codón de inicio, y el cebador reverso 3113 (5'-CGGATAACAATTTCACACAGG-3') (SEQ ID NO. 35), que se une a la región lacZ del vector pDrive. Se realiza la PCR en condiciones de reacción estándar utilizando una ADN polimerasa HotStar (Qiagen) y una Q-solución (Qiagen). El fragmento amplificado que comprende nt-10 a +824 se corta con EcoRI y AscI y se utiliza para sustituir el fragmento EcoRI/AscI del clon incompleto que contiene solamente la secuencia madura del vWF-cp. El último constructo que codifica la secuencia completa del vWF-cp, llamada pCMV-vWFcp, se utiliza luego para la transfección y los estudios de expresión en células de mamíferos.
CACCATGCACCAGCGTCACCCCCG-3') (SEQ ID NO. 34), que alberga la secuencia consenso de Kozak (subrayada) para un contexto óptimo para el reconocimiento del codón de inicio, y el cebador reverso 3113 (5'-CGGATAACAATTTCACACAGG-3') (SEQ ID NO. 35), que se une a la región lacZ del vector pDrive. Se realiza la PCR en condiciones de reacción estándar utilizando una ADN polimerasa HotStar (Qiagen) y una Q-solución (Qiagen). El fragmento amplificado que comprende nt-10 a +824 se corta con EcoRI y AscI y se utiliza para sustituir el fragmento EcoRI/AscI del clon incompleto que contiene solamente la secuencia madura del vWF-cp. El último constructo que codifica la secuencia completa del vWF-cp, llamada pCMV-vWFcp, se utiliza luego para la transfección y los estudios de expresión en células de mamíferos.
Para la expresión del vWF-cp, se
transfectan temporalmente células SKHep (ATCC) con el plásmido
pCMV-vWFcp y, en paralelo, como control, con el
vector parental cADN3.1(+), utilizando Lipofectamine 2000 (Life
Technologies, Inc.). Las células transfectadas se cultivan bajo
condiciones estándar en el medio DMEM/HAM F12 (1:1) (GIBCO) con un
10% de suero de ternera fetal, a una temperatura de 37ºC y con un 5%
de CO_{2}.
Se analiza la expresión del
vWF-cp por Western Blot, donde las muestras del
medio de cultivo acondicionado y de la cosecha de células se
someten a SDS-PAGE con un 4% de gel de
apilamiento/6% de gel de separación y se realiza el análisis
Western Blot utilizando plasma con
anti-vWF-cp de un paciente con TTP
que contiene anticuerpos
anti-vWF-cp policlonales y
cabra-anti-hu-IgG
(Fab-specific AB, SIGMA). Las bandas específicas
del vWF-cp se visualizan por detección BCIP/NBT.
Se puede detectar vWF-cp en la
muestra del lisado celular y parece que está principalmente asociado
a las células. Los resultados del análisis Western Blot se indican
en la Figura 7, mostrando una banda proteica específica de
vWF-cp a un peso molecular aproximado de 170 kD
reaccionando con los sueros del paciente.
El lisado celular de las células de expresión de
vWF-cp se somete entonces a una prueba en busca de
la actividad de vWF-cp de acuerdo con el método
descrito por Furlan y col. (1996. Blood 87:
4235-4244) y el análisis de los multímeros de vWF
se realiza en un 1% de gel de SDS-agarosa, tal como
se describe en Ruggeri y col. (1981. Blood 57:
1140-1143) (Fig. 8). Se puede demostrar claramente
la actividad biológica del vWF-cp expresado en
células de mamíferos, ya que el vWF de alto peso molecular se
degrada en moléculas de vWF de menor peso molecular (Fig. 8, banda
5).
<110> Baxter AG
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> polipéptido de la proteasa de
segmentación del factor von Willebrand (vWF), ácido nucleico que
codifica el polipéptido y uso del mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FA247
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/721,254
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-11-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/833,328
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-04-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 12
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 15
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 1353
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1427
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4585
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4284
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4284)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
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<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión del cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión del cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión del cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
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<212> ADN
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<221> unión del cebador
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<221> unión del cebador
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión del cebador
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<222> (1)..(39)
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<220>
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<221> unión del cebador
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<400> 29
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<210> 30
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión del cebador
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<222> (1)..(35)
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión del cebador
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<222> (1)..(30)
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<210> 32
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión del cebador
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<222> (1)..(29)
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<210> 33
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<221> unión del cebador
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<221> unión del cebador
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<222> (1)..(21)
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<400> 35
Claims (19)
1. Polipéptido que muestra la actividad del
vWF-cp que comprende la secuencia de aminoácidos
AAGGILHLELLV, caracterizado porque la actividad del
vWF-cp es definida por (1) la segmentación del vWF
en el enlace peptídico 842Tyr-843Met, (2) tener la
actividad proteolítica directa que convierte el vWF con una
estructura singlete en el vWF con una estructura satélite, y (3)
conservar la actividad en presencia, individualmente, del inhibidor
de la serina proteasa, fluorofosfato de diisopropilo (DFP), y del
inhibidor de la calpaína proteasa, carbobenziloxi (Z) peptidil
diazometilcetona
(Z-Leu-Leu-Tyr-CHN_{2}).
2. Polipéptido según la reivindicación 1
caracterizado porque tiene un peso molecular de
aproximadamente 180 kD, aproximadamente 170 kD, aproximadamente 160
kD o aproximadamente 120 kD tal como se determina en un
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras.
3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2
caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO. 2 ó SEQ ID NO. 3.
4. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho
polipéptido conserva la actividad de la proteasa de segmentación
del vWF en presencia del inhibidor de la serina proteasa y de un
inhibidor de la calpaína proteasa.
5. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipéptido
es expresado por una célula huésped transformada con un vector que
lleva un ácido nucleico que codifica el polipéptido del
vWF-cp.
6. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque es
sustancialmente puro.
7. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque está
aislado.
8. Composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Composición según la reivindicación 8 que
comprende además un ión metálico divalente seleccionado de entre el
grupo Ca^{2+}, Sr^{2+} y Ba^{2+}.
10. Composición según la reivindicación 8 ó 9
que comprende clusterina o un análogo o un derivado de la misma que
tiene actividad de clusterina.
11. Molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Vector de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11.
13. Célula huésped que comprende un vector de
expresión según la reivindicación 12.
14. Método para la producción de un polipéptido
de proteasa de vWF-cp que comprende los pasos
de:
- -
- cultivar una célula huésped según la reivindicación 13 en un medio nutriente bajo condiciones que permitan expresar dicho polipéptido;
- -
- cosechar dicho polipéptido expresado, y
- -
- aislar dicho polipéptido.
15. Método para la producción de anticuerpos del
polipéptido anti-vWF-cp
caracterizado porque se inmuniza a un animal con un
polipéptido de vWF-cp según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y los anticuerpos
anti-vWF-cp del polipéptido se
aíslan de dicho animal.
16. Método para la purificación del polipéptido
de vWF-cp que comprende el paso de poner en contacto
una solución que incluye el polipéptido de vWF-cp
con la molécula de unión al polipéptido de la proteasa de vWF
seleccionada de entre el grupo de anticuerpos, anticuerpos de
cadena única y fragmentos Fab- o F(ab')2, bajo condiciones
por las cuales el polipéptido de vWF-cp se une a
dicha molécula de unión del polipéptido de vWF-cp,
eluyendo selectivamente el polipéptido de vWF-cp de
dicha molécula de unión y recuperando el polipéptido purificado de
vWF-cp.
17. Método para la detección del polipéptido de
vWF-cp en una muestra, caracterizado porque
una solución que se supone contiene el vWF-cp se
pone en contacto con una molécula de unión al polipéptido de
vWF-cp seleccionada de entre el grupo de
anticuerpos, anticuerpos de cadena única y fragmentos Fab- o
F(ab')2, para permitir la formación de un complejo de
polipéptido de vWF-cp/molécula de unión y la
detección de dicho complejo.
18. Utilización del polipéptido de
vWF-cp según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7 para la producción de una preparación para la profilaxis y la
terapia de la trombosis y de la enfermedad tromboembólica.
19. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque la enfermedad tromboembólica es púrpura
trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura de
Henoch-Schönlein, preeclampsia, trombocitopenia
neonatal o síndrome hemolítico-urémico.
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