ES2283424T3 - Proteina desintegrina humana. - Google Patents
Proteina desintegrina humana. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2283424T3 ES2283424T3 ES01959270T ES01959270T ES2283424T3 ES 2283424 T3 ES2283424 T3 ES 2283424T3 ES 01959270 T ES01959270 T ES 01959270T ES 01959270 T ES01959270 T ES 01959270T ES 2283424 T3 ES2283424 T3 ES 2283424T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- adam
- seq
- amino acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
- G16B15/30—Drug targeting using structural data; Docking or binding prediction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10; (b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ ID NO :6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis; (c) fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio desintegrina, correspondiendo dicha secuencia a la secuencia desde el residuo de aminoácido 73+-5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360+ -5 a 362+ - 5 de SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285+ -5 a 287+ -5 de SEQ ID NO:8, y desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 735 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314+ -5 a 329+ -5, respectivamente; (d) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360+ - 5 a 362+ -5; (e) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285+ -5 a 287+ -5; (f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314+ -5 a 329+ -5; (g) polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a través de la longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, en el que la identidad de aminoácidos en porcentaje se selecciona del grupo que consiste en al menos el 97, 5%, al menos el 99% y al menos el 99, 5%; y (h) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
Description
Proteína desintegrina humana.
Esta solicitud se acoge al párrafo 119 de 35
U.S.C. (código de los EE.UU.) de la solicitud provisional
estadounidense con número de serie 60/221.838, presentada el 28 de
julio de 2000, y la solicitud provisional estadounidense con número
de serie 60/282.550, presentada el 9 de abril de 2001.
Esta invención se refiere a polipéptidos que
tienen homología con una familia de polipéptidos humanos
desintegrina-metaloproteinasa, a polinucleótidos
que codifican para tales polipéptidos, y a métodos para la
preparación y uso de los mismos.
Los polipéptidos
desintegrina-metaloproteinasa, también denominados
en el presente documento como polipéptidos ADAM o "ADAM"
("un dominio desintegrina y uno metaloproteinasa" ("A
Disintegrin And Metalloproteinase domain")) son un grupo
relacionado de polipéptidos de membrana de tipo I, de dominios
múltiples. Ciertos miembros de la familia ADAM de polipéptidos
están sumamente expresados en algunos tipos de células incluyendo,
por ejemplo, las células musculares o del tejido reproductor.
Además, miembros de la familia ADAM de polipéptidos se expresan
generalmente de manera constitutiva a lo largo del desarrollo.
Se han identificado varios genes de ADAM,
incluyendo de fertilina \alpha y \beta (implicadas en la unión
y la fusión mediadas por integrina del óvulo y el espermatozoide;
anteriormente conocida como PH-30 \alpha y
\beta), proteína apical del epididimo I, ciritesteína, MDC (un
candidato a supresor tumoral en el cáncer de mama humano),
meltrina-\alpha (que media la fusión de mioblastos
en el proceso de formación de miotubo), MS2 (un antígeno de
superficie de macrófagos), y metargidina. Además, se ha demostrado
que un nuevo gen de la familia ADAM, denominado
ADAMTS-1, que contiene un dominio desintegrina y uno
metaloproteinasa con motivos de trombospondina (TSP), está
íntimamente asociado con diversos procesos inflamatorios, así como
con el desarrollo de caquexia por cáncer (Kuno, K. et al., J.
Biol. Chem. 272:556-562 (1997)). Se encontró que un
nuevo miembro de ADAM en Drosophila, denominado gen kuzbanian
("KUZ"), estaba implicado en la neurogénesis de
Drosophila (Rooke, J. et al., Science
273:1227-1231 (agosto de 1996)).
Polipéptidos típicos de la familia ADAM son
polipéptidos de superficie celular que consisten en dominios
citoplasmáticos y transmembrana, de repetición, de tipo factor de
crecimiento epidérmico, ricos en cisteína, de tipo desintegrina,
metaloproteasa y prodominios. Se cree que en algunos ADAM, el domino
metaloproteinasa está implicado en las funciones de procesamiento
de proteínas tales como liberación de factores de crecimiento,
proteínas de adhesión, y factores inflamatorios. El dominio
desintegrina puede tener un papel en las interacciones de adhesión
celular mediadas por integrina (célula a célula y célula a matriz),
tales como en la agregación plaquetaria, migración de células
tumorales o neutrófilos y angiogénesis. Lo más probable es que estas
actividades de la familia ADAM de polipéptidos estén mediadas por
interacciones con los sustratos de la metaloproteinasa y con
integrinas, uniéndose los sustratos de la metaloproteinasa al
dominio catalítico de la metaloproteinasa y uniéndose las
integrinas al dominio desintegrina de la familia ADAM de
polipéptidos. Debido a sus supuestos papeles en la mediación de las
funciones de procesamiento de las proteínas, tales como la
liberación de factores de crecimiento, proteínas de adhesión, y
factores inflamatorios y adhesión celular, se cree que la familia
ADAM de polipéptidos está asociada con estados de inflamación,
cáncer, alergia, del tejido reproductor y vasculares. Las
características y actividades de la familia de polipéptidos ADAM se
describen adicionalmente en Black, R.A. y White, J.M., 1998, Curr.
Opin. in Cell Biol.10: 654-659; y en Schlondorff, J.
y Blobel, C.P, 1999, J. Cell Sci. 112: 3603-3617.
Nath et al., J. Cell Sci. 113:2319-2328
(2000) notifican que la meltrina y (ADAM-9) pueden
desempeñar un papel en la regulación de la movilidad de células
uniéndose a la integrina \alpha_{6}\beta_{1}.
La entrada referente a la secuencia ID HS388301
(20 de marzo de 1996; Bouillaud, F.) de la base de datos EMBL
(número de registro N73388) describe una secuencia de 688
nucleótidos de un clon de EST humano derivado del tejido adiposo
que se indica que es similar a la proteína de membrana con dominio
desintegrina y metaloproteinasa de la familia MDC o ADAM.
Por primera vez se proporcionan en el presente
documento un polinucleótido y secuencias de polipéptidos que tienen
homología con la familia de polipéptidos ADAM, denominada en el
presente documento "ADAM-H9", para ("una
desintegrina y metaloproteinasa con homología con ADAM9") así
como métodos para prepararlos y métodos para usar los mismos.
La invención proporciona un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID
NO:10; (b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ ID NO:6,
SEQID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tienen al menos una actividad
seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a
integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e
inhibición de angiogénesis; (c) fragmentos del polipéptido de SEQ
ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprende una secuencia de
aminoácidos con domino desintegrina, correspondiendo dicha
secuencia a la secuencia del residuo de aminoácidos 73\pm5 a uno
cualquiera de los residuos de aminoácidos 360\pm5 a 362\pm5 de
SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1
a 165 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 285\pm5
a 287\pm5 de SEQ ID NO:8, y desde uno cualquiera de los residuos
de aminoácidos 1 a 735 hasta uno cualquiera de los residuos de
aminoácidos 314\pm5 a 329\pm5, respectivamente; (d) SEQ ID NO:6
desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácidos 360\pm5 a 362\pm5; (e) SEQ ID NO:8 desde
uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1 a 16\pm5 hasta
uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 285\pm5 a
287\pm5; (f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de
aminoácidos 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de
aminoácidos 314\pm5 a 329\pm5; (g) polipéptidos que tienen
secuencias de aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a
lo largo de la longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID
NO:8 o SEQ ID NO:10, en los que el porcentaje de identidad de
aminoácido se selecciona del grupo que consiste en al menos el
97,5%, al menos el 99%, y al menos el 99,5%; y (h) un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
La invención proporciona adicionalmente un
polipéptido, tal como se describió anteriormente, unido a un segundo
polipéptido, en la que el segundo polipéptido es un polipéptido de
cremallera de leucina, un polipéptido de Fc, o un ligador
peptídico.
La invención también proporciona un
polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido, tal como se
describió anteriormente.
La invención también proporciona un
polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en (a) un
polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID
NO:9; (b) SEQ ID NO:5 desde el nucleótido 248 hasta el nucleótido
1111 de SEQ ID NO:5; (c) un polinucleótido que comprende una
secuencia de SEQ ID NO:7 desde un nucleótido entre 82 y 127 hasta
el nucleótido 936; d) un polinucleótido que comprende una secuencia
de SEQ ID NO:9 desde un nucleótido entre 32 y 248 hasta un
nucleótido entre 973 y 1018; (e) una secuencia de nucleótidos
complementaria a una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; y (f)
cualquiera de las secuencias de nucleótidos de a (a) a (e) en las
que T también puede ser U. La invención proporciona adicionalmente
un polinucleótido aislado que comprende una secuencia descrita
anteriormente operativamente unida a un polinucleótido que codifica
para un polipéptido de interés.
La invención proporciona un polinucleótido
aislado que codifica para cualquiera de los polipéptidos anteriores.
En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia
expuesta en las SEQ ID NO:5, 7, o 9, complementos de los mismos.
Además se describen en el presente documento polinucleótidos que se
hibridan con un polinucleótido que tiene una secuencia de las SEQ
ID NO:2, 5, 7, o 9. El polinucleótido puede ser ADN o ARN.
La invención también proporciona un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia tal como se
expone en la SEQ ID NO:5, 7, o 9 operativamente unido a un
polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés (por
ejemplo, una secuencia que codifica para una cremallera de leucina,
polipéptido de Fc, o secuencia de ligador peptídico).
Preferiblemente, el polinucleótido de SEQ ID NO:5, 7, o 9 codifica
para un fragmento que tiene actividad desintegrina y codifica para
un polipéptido tal como se expone en las SEQ ID NO:6 desde
aproximadamente el aminoácido número 73 hasta aproximadamente el
360, SEQ ID NO:8 desde el aminoácido 1 o 16 hasta el 285 y/o SEQ ID
NO:10 desde el aminoácido 1 o 73 hasta 314 o 329.
La invención proporciona un vector de expresión
que tiene un polinucleótido de la invención así como células
huésped que comprenden un vector de expresión de este tipo o un
polinucleótido recombinante de la invención.
La invención proporciona adicionalmente un
método para producir un polipéptido, que comprende cultivar una
célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido de la
invención en condiciones que estimulan la expresión del polipéptido
codificado por el polinucleótido y la purificación del
polipéptido.
La invención proporciona un anticuerpo
sustancialmente purificado que se une específicamente a un
polipéptido de la invención. El anticuerpo puede ser monoclonal o
policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humano o
humanizado.
También se describe en el presente documento un
método para diseñar un inhibidor o agente de unión de un polipéptido
de la invención. El método incluye determinar la estructura
tridimensional de un polipéptido ADAM-H9 de la
invención, analizar la estructura tridimensional del polipéptido
para unirse a sitios de ligandos, diseñar una molécula que se prevé
que interaccione con el polipéptido, y determinar la actividad
inhibidora o de unión de la molécula.
La invención también proporciona un método para
identificar un agente que modula la expresión o actividad de
ADAM-H9. El método incluye poner en contacto el
agente con un polinucleótido o polipéptido ADAM-H9
en condiciones de manera que el agente y el polipéptido o el
polinucleótido interaccionen y determinar la expresión o actividad
de ADAM-H9 en presencia de un agente comparado con
un control en el que un cambio en la actividad o expresión es
indicativo de un agente que modula expresión o actividad de ADAM
-H9.
Además se describe en el presente documento un
método para modular la angiogénesis en un tejido, que comprende
poner en contacto el tejido con un polipéptido
ADAM-H9 de la invención. La puesta en contacto puede
ser in vitro o in vivo. También se proporcionan
métodos para modular la migración de células endoteliales, poniendo
en contacto una célula endotelial con un polipéptido
ADAM-H9 o un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido ADAM-H9. La puesta en contacto puede
ser in vitro o in vivo.
La invención también proporciona un método para
inhibir la unión de una integrina con un ligando que comprende
poner en contacto una célula que expresa la integrina con una
cantidad eficaz de un dominio desintegrina de
ADAM-H9. En algunas realizaciones, el dominio
desintegrina de ADAM-H9 comprende una secuencia tal
como se expone en la SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el
aminoácido número 73 hasta aproximadamente el 360, la SEQ ID NO:8
desde el aminoácido 1 o 16 (o residuos entre medias) hasta el 285, o
la SEQ ID NO:10 desde el aminoácido 1 o 73 (o residuos entre
medias) hasta el 314 o 329 (o residuos entre medias).
También se describe un método para modular la
unión de una integrina a un ligando en un mamífero que comprende
administrar una cantidad eficaz de un polipéptido soluble que
comprende un dominio desintegrina de ADAM-H9. En
algunas realizaciones, el mamífero está aquejado de un estado
seleccionado del grupo que consiste en trastornos oculares; estados
metastásicos o cancerosos; enfermedades inflamatorias; osteoporosis
y otros estados mediados por resorción ósea acelerada; reestenosis;
agregación, reclutamiento o activación plaquetaria inapropiada;
trombosis; o un estado que requiere reparación tisular o
cicatrización de heridas.
También se describe en el presente documento un
método para inhibir la angiogénesis en un mamífero, que comprende
administrar al mamífero una cantidad eficaz en inhibición de un
polipéptido soluble que comprende un dominio desintegrina de
ADAM-H9. En una realización, el dominio desintegrina
de ADAM-H9 comprende una secuencia tal como se
expone en SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73
hasta el 360, SEQ ID NO:8 desde aproximadamente el aminoácido 1 o
16 hasta el 285, o SEQ ID NO:10 desde aproximadamente el aminoácido
1 o 73 hasta el 314 o 329. El dominio desintegrina de
ADAM-H9 soluble puede estar en la forma de un
multímero (por ejemplo, un dímero, trímero, o polipéptido de
fusión). En una realización, el multímero comprende un polipéptido
de Fc o una cremallera de leucina. En otra realización, el
polipéptido comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID
NO:25.
También se describe un medio legible en
ordenador que contiene en el mismo datos legibles en ordenador de
una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, o una combinación de las mismas.
La invención también proporciona el uso de un
polipéptido ADAM-H9 soluble con dominio desintegrina
que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID
NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada
del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición
de la migración de células endoteliales, e inhibición de
angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica
para inhibir la angiogénesis en un mamífero con necesidad de un
tratamiento de este tipo.
La invención proporciona adicionalmente el uso
de un polipéptido ADAM-H9 soluble con dominio
desintegrina que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad
seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a
integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e
inhibición de angiogénesis, para la preparación de una composición
farmacéutica para tratar un estado seleccionado del grupo que
consiste en trastornos oculares, estados metastásicos y cancerosos;
enfermedades inflamatorias; osteoporosis, trastornos de resorción
ósea acelerada; reestenosis; agregación, reclutamiento o activación
plaquetaria inapropiada; trombosis; y un estado que requiere
reparación tisular o cicatrización de heridas.
La figura 1 muestra una alineación de secuencias
de ADAM9 (SEQ ID NO:23) con ADAM-H9 expuestas en SEQ
ID Nos: 6, 8, y 10. En la figura se identifican dominios previstos
por homología con la familia ADAM de polipéptidos.
La figura 2 muestra una tabla que representa las
secuencias de aminoácidos de polipéptidos según la invención.
La figura 3 muestra una tabla que representa las
secuencias de nucleótidos de polinucleótidos según la invención.
Los elementos estructurales típicos comunes a
varios miembros la familia ADAM de polipéptidos incluyen, en orden
de N a C, una secuencia señal, un prodominio, un dominio
metaloproteinasa, un dominio desintegrina, un dominio rico en
cisteínas, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.
Existen ciertos residuos clave en los motivos/dominios
metaloproteinasa (por ejemplo, el motivo de HexGHxxGxxHD (SEQ ID
NO:24)) de manera que es probable que las sustituciones de esos
residuos extremadamente conservados estén asociadas con una función
alterada o falta de función para el polipéptido. Los ADAM con la
secuencia del sitio activo de metaloproteasa conservado de SEQ ID
NO:24 incluyen los ADAM 1, 8-10,
12-13, 15-17, 19-21,
24-26, 28, y 30. Los dominios metaloproteinasa
catalíticos también contienen cuatro cisteínas conservadas que
pueden requerirse para la formación de una estructura polipeptídica
funcional mediante enlaces disulfuro. Existen 31 cisteínas
sumamente conservadas en la región rica en cisteínas y desintegrina;
casi todos los miembros de la familia ADAM de polipéptidos tienen
estas 31 cisteínas. El experto en la técnica reconocerá que los
límites de estas regiones dentro de los polipéptidos son
aproximados y que los límites precisos de tales dominios (que pueden
predecirse usando programas de ordenador disponibles con ese fin)
pueden diferir de un miembro a otro dentro de la familia ADAM de
polipéptidos.
La familia ADAM de polipéptidos está
razonablemente bien conservada, con los miembros humanos de la
familia similares entre sí y a miembros de la familia ADAM de otras
especies, tales como ratón, rata e incluso Drosophila
melanogaster y Caenorhabditis elegans (véase, por
ejemplo, Yamamoto et al., Immunol. Today, 20(6):278,
1999; y los siguientes sitios web de internet para más información
(www): gene.ucl.ac.uk/users/hester/metalo.html;
uta.fi/\simloiika/ADAMs/HADAMs.html; y
people.Virginia.EDU/\simjag6n/Table_of_the_ADAMs.html). Sin
embargo,
pueden definirse subfamilias de la familia ADAM de polipéptidos basándose en la similitud de secuencia y actividades biológicas relacionadas. Una subfamilia de este tipo comprende los polipéptidos ADAM10 y ADAM17/TACE, que muestran mayor similitud de secuencia entre sí, en comparación con otros miembros identificados hasta el momento en la familia ADAM de polipéptidos. Los ADAM 10 y 17 tienen 21 cisteínas en la región rica en cisteínas y desintegrina, en contraposición a las 31 cisteínas conservadas en esta región entre los otros ADAM. Por consiguiente, los ADAM pueden tener desde 20 hasta 31 cisteínas conservadas (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o 31 cisteínas conservadas). ADAM17/TACE y ADAM-10 también son "convertasas", ("sheddases") lo que significa que se cree que escinden y liberan los dominios extracelulares de otras proteínas de membrana. La principal función de otra subfamilia puede ser unir integrinas u otras proteínas. Se procesa, por ejemplo, ADAM-2 para eliminar tanto el prodominio como el dominio catalítico de metaloproteinasa para exponer el dominio desintegrina y permitir que se una a su secuencia análoga. Otra subfamilia que puede definirse son los ADAM que parece que son específicos de testículos; estos polipéptidos son los ADAM 2-3, 16, 18, 20-21, 24-26, y 29-30; siendo los ADAM 5 y 6 principalmente específicos de testículos.
pueden definirse subfamilias de la familia ADAM de polipéptidos basándose en la similitud de secuencia y actividades biológicas relacionadas. Una subfamilia de este tipo comprende los polipéptidos ADAM10 y ADAM17/TACE, que muestran mayor similitud de secuencia entre sí, en comparación con otros miembros identificados hasta el momento en la familia ADAM de polipéptidos. Los ADAM 10 y 17 tienen 21 cisteínas en la región rica en cisteínas y desintegrina, en contraposición a las 31 cisteínas conservadas en esta región entre los otros ADAM. Por consiguiente, los ADAM pueden tener desde 20 hasta 31 cisteínas conservadas (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o 31 cisteínas conservadas). ADAM17/TACE y ADAM-10 también son "convertasas", ("sheddases") lo que significa que se cree que escinden y liberan los dominios extracelulares de otras proteínas de membrana. La principal función de otra subfamilia puede ser unir integrinas u otras proteínas. Se procesa, por ejemplo, ADAM-2 para eliminar tanto el prodominio como el dominio catalítico de metaloproteinasa para exponer el dominio desintegrina y permitir que se una a su secuencia análoga. Otra subfamilia que puede definirse son los ADAM que parece que son específicos de testículos; estos polipéptidos son los ADAM 2-3, 16, 18, 20-21, 24-26, y 29-30; siendo los ADAM 5 y 6 principalmente específicos de testículos.
Los polipéptidos de la familia ADAM se expresan
en muchos tipos de células incluyendo, por ejemplo, tejidos
genitourinarios (por ejemplo, tejido del riñón y tejido
reproductor), tejido neurológico y células musculares. Algunas
parejas de unión para los polipéptidos ADAM se expresan, por
ejemplo, en células endoteliales y células T, tal como se presenta
por los dominios ricos cisteínas y desintegrina de varios
polipéptidos de la familia ADAM que se unen a células endoteliales,
al menos en parte mediante la interacción con integrinas, y a
células T. Es probable que las interacciones entre los miembros de
la familia ADAM de polipéptidos y sus parejas de unión participen
en las interacciones de mediación entre tipos de células incluyendo
tejido reproductor, tejido neurológico, y células musculares, y
células endoteliales y células T que expresan parejas de unión.
El dominio desintegrina de algunos polipéptidos
de la familia ADAM puede interaccionar con parejas de unión tales
como integrinas de la superficie celular (véase, por ejemplo, la
solicitud de patente internacional en tramitación junto con la
presente con número de serie PCT/US01/05701, cuya descripción se
incorpora al presente documento como referencia en su totalidad).
Mediante su unión a una o más parejas de unión, el polipéptido con
dominio desintegrina puede inhibir actividades biológicas (por
ejemplo, angiogénesis) mediadas a través de la unión de los
polipéptidos ADAM a su pareja de unión. Dado que algunos
polipéptidos de la familia ADAM muestran actividades de unión a
integrina a través del dominio desintegrina, la modulación de la
actividad desintegrina modulará la adhesión de, por ejemplo, el
papel de los ADAM 1 y 2 en la unión del espermatozoide al óvulo y
el papel de ADAM9 en interacciones de células epiteliales tubulares
y glomerulares con la lámina basal en tejido renal. Puede
determinarse el grado en el que los miembros individuales de la
familia ADAM de polipéptidos y fragmentos y otros derivados de
estos polipéptidos muestran estas actividades mediante métodos de
ensayo habituales, tales como inhibición de la migración de células
endoteliales mediante constructos de
desintegrina-Fc, y similares. Ensayos
particularmente adecuados para detectar o medir la unión entre los
polipéptidos ADAM y sus parejas de unión son los análisis FACS.
Ensayos adicionales para evaluar las actividades biológicas y las
propiedades de unión a las parejas de los polipéptidos de la familia
ADAM se describen más adelante (véanse, por ejemplo, los ejemplos
5-7). Aunque ADAM-H9 carece de
dominio metaloproteinasa, puede actuar como un dominante negativo
con respecto a la actividad metaloproteinasa de otros polipéptidos
de la familia ADAM.
Los polipéptidos de la familia ADAM están
implicados en enfermedades y trastornos neurales, del tejido
reproductor, alergia, cáncer, inflamación, angiogénesis y estados o
enfermedades vasculares que comparten como una característica común
interacciones asociadas con integrina. Ejemplos de enfermedades y
trastornos neutrales, del tejido reproductor, alergia, cáncer,
inflamación, angiogénesis y estados vasculares que se sabe que son o
es probable que impliquen actividades biológicas de los
polipéptidos ADAM son artritis reumatoide, choque séptico,
enfermedades glomerulares, insuficiencia renal aguda, enfermedad de
Alzheimer y resorción ósea inapropiada. El bloqueo o inhibición de
las interacciones entre miembros de la familia ADAM de polipéptidos
y sus sustratos, ligandos, receptores, parejas de unión u otros
polipéptidos que interaccionan es un aspecto de la invención y
proporciona métodos para tratar, modular o mejorar estas
enfermedades y estados mediante el uso de inhibidores o moduladores
de la actividad del polipéptido ADAM. En una realización, se lleva
a cabo la interacción entre miembros de la familia ADAM de
polipéptidos y sus secuencias análogas poniendo en contacto una
muestra que contiene un polipéptido de la familia ADAM o su
secuencia análoga con un anticuerpo o polipéptido
ADAM-H9. En otra realización, el polipéptido de la
familia ADAM es ADAM-H9.
Para ciertos estados que implican muy poca
actividad desintegrina, los métodos para tratar o mejorar estos
estados comprenden aumentar la cantidad o actividad de, por ejemplo,
los polipéptidos ADAM-H9, proporcionando
polipéptidos o fragmentos activos o polipéptidos de fusión de los
mismos, o proporcionando agentes que activan polipéptidos ADAM
endógenos o exógenos. Usos adicionales para miembros de la familia
de polipéptidos ADAM incluyen reactivos de diagnóstico para
trastornos neurales, del tejido reproductor, alergia, cáncer,
inflamación, y enfermedades vasculares; reactivos de investigación
para la investigación de procesos de fertilización y polipéptidos
de integrina, purificación y procesamiento de integrinas y/o células
endoteliales o células T; o como un polipéptido de selección como
diana/vehículo para administrar agentes terapéuticos a células.
Tal como se usa en el presente documento, tanto
"proteína" como "polipéptido" significa cualquier cadena
de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación
posterior a la traducción (por ejemplo, glucosilación o
fosforilación), e incluye proteínas naturales, polipéptidos o
péptidos sintéticos y recombinantes, así como una molécula
recombinante que consiste en un híbrido con una parte que tiene, por
ejemplo, toda o parte de una secuencia de aminoácidos de
ADAM-H9 y una segunda parte que está codificada por
toda o parte de una secuencia de nucleótidos. Normalmente, la
proteína o polipéptido es sustancialmente puro de otros componentes
a partir de los cuales está normalmente presente en la naturaleza.
El término "sustancialmente puro" o "purificado" cuando
se refiere a un polipéptido, significa un polipéptido que está al
menos en un 30% libre de proteínas y moléculas orgánicas que se
producen de manera natural con las que está asociadas de manera
natural. Preferiblemente, el polipéptido sustancialmente puro de la
invención está purificado en al menos el 35-50%;
preferiblemente el 60-70%; más preferiblemente al
menos el 75% al 90%; y lo más preferiblemente al menos el 99% en
peso a partir de otras moléculas que se producen de manera natural.
Puede obtenerse un polipéptido sustancialmente puro de la
invención, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente
natural, mediante la expresión de un polinucleótido recombinante
que codifica para el polipéptido, o mediante síntesis química del
polipéptido. La pureza puede medirse mediante cualquier método
apropiado, por ejemplo, análisis por HPLC, PAGE o
cromatografía.
Tal como se usa en el presente documento, un
"polipéptido ADAM-H9" significa un polipéptido
que contiene o comprende una secuencia de aminoácidos tal como se
expone en la figura 2; polipéptidos que tienen homología sustancial
o identidad sustancial con las secuencias expuestas en las SEQ ID,
NO:1, 3, 4, 6, 8, o 10; fragmentos de las secuencias anteriores; y
variantes conservativas de las anteriores. En el presente documento
se describen y/o reivindican polipéptidos que tienen una secuencia
tal como se expone las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, y 10. Se ha
demostrado que los polipéptidos tienen un elevado grado de homología
con el polipéptido ADAM9 y, por tanto, tienen una función/actividad
prevista de un polipéptido ADAM. Por consiguiente, en el presente
documento se describe y/o reivindica un polipéptido
ADAM-H9 que comprende una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, y 10. En una
realización, un polipéptido ADAM-H9 tiene una
actividad desintegrina o actividad inhibidora de metaloproteinasa o
una combinación de las mismas. Pueden conseguirse métodos para
determinar si un polipéptido de la invención tiene o no una
actividad desintegrina o actividad inhibidora de metaloproteinasa
deseada sometiendo a ensayo el polipéptido mediante cualquiera de
los métodos descritos más adelante en el presente documento. Por
ejemplo, puede medirse la actividad desintegrina de
ADAM-H9 usando, los métodos de los ejemplos
5-7, a continuación.
Un polipéptido de la invención también engloba
una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad o
similitud suficiente o sustancial con una secuencia expuesta en la
figura 2. Los expertos en la técnica pueden identificar secuencias
sustancialmente idénticas que tienen dominios estructurales y/o que
tienen actividad biológica en común con un polipéptido
ADAM-H9. Los métodos para determinar la similitud o
identidad pueden emplear algoritmos computacionales tales como, por
ejemplo, BLAST, FASTA, y similares.
La expresión "sustancialmente idénticos",
en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a
secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%,
preferiblemente el 80% o el 85%, lo más preferiblemente el
90-95% de identidad con el residuo de aminoácido o
nucleótido cuando se alinea para una correspondencia máxima a
través de una ventana de comparación tal como se mide mediante, por
ejemplo, un algoritmo de comparación de secuencia o mediante una
alineación manual e inspección visual. Esta definición también se
refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tienen
complementariedad sustancial de secuencia o subsecuencia cuando la
secuencia de prueba tiene identidad sustancial con respecto a la
secuencia de referencia. Una "ventana de comparación", tal
como se usa en el presente documento, incluye referencia a un
segmento de una cualquiera de la variedad de posiciones contiguas
seleccionadas del grupo que consiste en desde 20 hasta 1800,
normalmente de aproximadamente 50 a 200, más normalmente de
aproximadamente 70 a 150, en la que puede compararse una secuencia
con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones
contiguas, una vez que las dos secuencias están óptimamente
alineadas.
Para la comparación de secuencias, normalmente
una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se
comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de
comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y
referencia en un ordenador, se diseñan coordenadas de subsecuencia,
si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de
algoritmo de secuencia. Pueden usarse parámetros del programa por
defecto, o pueden diseñarse parámetros alternativos. El algoritmo de
comparación de secuencia calcula entonces las identidades de
secuencia en porcentaje para las secuencias de prueba con respecto a
la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del
programa.
Puede realizarse una alineación óptima de
secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo
de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482
(1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de
Needleman & Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la
búsqueda por el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc.
Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988), mediante
implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, del
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o
mediante alineación manual e inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un
grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por parejas,
progresivas para mostrar la relación e identidad de secuencia en
porcentaje. PILEUP usa una simplificación del método de alineación
progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987), y
es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151
(1989). El procedimiento de alineación múltiple comienza con la
alineación por parejas de las dos secuencias más similares,
produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta
agrupación se alinea entonces con la siguiente secuencia o
agrupación de secuencias alineadas más relacionada. Se alinean dos
agrupaciones de secuencias mediante una extensión sencilla de la
alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación
final se logra mediante una serie de alineaciones por parejas,
progresivas. Por ejemplo, puede compararse una secuencia de
referencia con otras secuencias de prueba para determinar la
relación de identidad de secuencia en porcentaje usando los
siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de
longitud de hueco por defecto (0,10), y huecos de extremo
pesados.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar la identidad de secuencia en porcentaje y similitud de
secuencia es el algoritmo BLAST, tal como se describe en Altschul
et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para
realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del
National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para
Información de Biotecnología) (www- ncbi.nlm.nih.gov/). Este
algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencia de
alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W
en la secuencia de búsqueda, que o bien corresponde o bien satisface
una puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una
palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se
denomina como el umbral de puntuación de palabras vecinas. Estas
identidades exactas de palabras vecinas iniciales actúan como
inicio para comenzar búsquedas para encontrar HSP más largos que los
contengan. Las identidades exactas de palabras se extienden en
ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda
aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Se detiene la
extensión de identidades exactas de palabras en cada dirección
cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en la
cantidad X de su valor alcanzado máximo; la puntuación acumulativa
se hace cero o menos, debido a la acumulación de una o más
alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el
extremo de cualquier secuencia. El programa BLAST usa por defecto
una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62
(véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915
(1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y
una comparación de ambas cadenas. Una medición de la similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de
suma (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad por la que podría producirse una correspondencia entre
dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por
ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una
secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una
comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de
referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente
inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente inferior
a aproximadamente 0,001.
Alternativamente, la identidad en porcentaje de
dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico puede determinarse
comparando la información de la secuencia usando el programa de
ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al.
(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible del Genetics Computer
Group de la Universidad de Wisconsin. Los parámetros por defecto
preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de
comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y
de 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de
comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res.
14:6745, 1986, tal como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds.,
Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical
Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una
penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de
0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización
para huecos en los extremos.
Un experto en la técnica reconocerá que las
adiciones, deleciones o sustituciones individuales a una secuencia
de ácido nucleico, péptido o secuencia polipeptídica, que altera,
añade o deleciona un único aminoácido o un pequeño porcentaje de
aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada
de manera conservativa" donde la alteración da como resultado
una molécula que tiene sustancialmente la misma actividad biológica
(por ejemplo, actividad desintegrina). Por ejemplo, una alteración
que da como resultado la sustitución de un aminoácido por un
aminoácido químicamente similar es una variante modificada de manera
conservativa. En la técnica se conocen tablas de sustitución
conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares.
Cada uno de los siguientes seis grupos contienen aminoácidos que son
sustituciones conservativas entre sí 1) Alanina (A), Serina (S),
Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3)
Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),Valina (V); y 6)
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) (véase, por ejemplo,
Creighton, Proteins (1984)).
Una indicación de que dos polinucleótidos o
polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido
codificado por un primer polinucleótido reacciona inmunológicamente
de manera cruzada con los anticuerpos surgidos frente al
polipéptido codificado por un segundo polinucleótido. Otra
indicación de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos
es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en
condiciones rigurosas.
La invención también engloba a los polipéptidos
derivados de los polipéptidos ADAM-H9 de la
invención mediante cualquier tipo de alteración (por ejemplo,
inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en
el estado de glucosilación del polipéptido; replegamiento o
isomerización para cambiar su estructura tridimensional o estado de
autoasociación; y cambios en su asociación con otros polipéptidos o
moléculas). Por tanto, los polipéptidos proporcionados por la
invención incluyen polipéptidos caracterizados por secuencias de
aminoácidos similares a las expuestas en la figura 2, pero en las
que las modificaciones se proporcionan de manera natural o
modificadas por ingeniería genética de manera deliberada. La
invención engloba a un polipéptido que comparte actividades
biológicas en común con un polipéptido que comprende una secuencia
tal como se expone en las SEQ ID NO 6, 8, o 10 que tienen actividad
desintegrina y/o actividad inhibidora de matoloproteinasa.
La presente invención engloba diversas formas de
dominios de desintegrina de ADAM-H9 que conservan al
menos una actividad ("actividad desintegrina") seleccionada
del grupo que consiste en actividad de unión a integrina,
inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de
la angiogénesis. Se pretende que la expresión "polipéptido
ADAM-H9 con dominio desintegrina"
(ADAM-H9dis) englobe polipéptidos que contienen todo
o parte de un dominio desintegrina de ADAM-H9, con
o sin otros dominios ADAM (tal como la región rica en cisteínas),
así como formas relacionadas incluyendo, pero sin limitarse a: (a)
fragmentos, (b) variantes, (c) derivados, (d) polipéptidos de
fusión, y (e) formas multiméricas (multímeros). La capacidad de
estas formas relacionadas para inhibir la unión a integrina, la
migración de células endoteliales y/o la inhibición de la
angiogénesis puede determinarse in vitro o in vivo
usando métodos tales como los ejemplificados más adelante o usando
otros ensayos conocidos en la técnica.
Un experto en la técnica puede realizar ensayos
fácilmente para determinar la actividad usando los métodos
descritos en el presente documento. Tales métodos miden, por
ejemplo, las actividades biológicas mostradas por los miembros de
la familia ADAM de polipéptidos incluyendo, sin limitación, adhesión
celular. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos
anti-ADAM-H9, que neutralizan la
actividad de ADAM-H9, para realizar un ensayo para
determinar polipéptidos similares poniendo en contacto un anticuerpo
anti-ADAM-H9 con un polipéptido de
interés y determinando si se neutraliza la actividad asociada con
el polipéptido de interés. Además, la reactividad cruzada de un
anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido
ADAM-H9 de la invención es indicativo de un
polipéptido que comparte características estructurales (por ejemplo,
características de proteína primaria, secundaria o terciaria) con
un polipéptido ADAM-H9 de la invención.
La invención proporciona tanto formas de
longitud completa como madura de polipéptidos
ADAM-H9. Los polipéptidos de longitud completa son
los que tienen la secuencia primaria de aminoácidos completa del
polipéptido tal como se tradujeron inicialmente. Las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos longitud completa pueden obtenerse,
por ejemplo, traduciendo el marco de lectura abierto ("ORF") de
una molécula de ADNc. Pueden codificarse varios polipéptidos de
longitud completa por un locus genético sencillo si se producen
múltiples formas de ARNm a partir de este locus mediante corte y
empalme alternativo o mediante el uso de múltiples sitios de
iniciación de la traducción. La "forma madura" de un
polipéptido se refiere a un polipéptido que ha experimentado etapas
de procesamiento posteriores a la traducción, si las hay, tales
como, por ejemplo, escisión de la secuencia señal o escisión
proteolítica para eliminar un prodominio. Pueden producirse
múltiples formas maduras de un polipéptido de longitud completa
particular, por ejemplo, mediante escisión imprecisa de la secuencia
señal, o mediante regulación diferencial de proteasas que escinden
el polipéptido. La(s) forma(s) madura(s) de tal
polipéptido puede(n) obtenerse mediante expresión, en una
célula de mamífero adecuada u otra célula huésped, de un
polinucleótido que codifica para el polipéptido de longitud
completa. La secuencia de la forma madura del polipéptido también
puede determinarse a partir de la secuencia de aminoácidos de la
forma de longitud completa, mediante la identificación de las
secuencias señal o sitios de escisión de proteasas (por ejemplo,
S68 o P71 de las SEQ ID NO:6 y 10 son posibles sitios de
procesamiento). Los polipéptidos ADAM-H9 de la
invención también incluyen polipéptidos que son el resultado de
acontecimientos de procesamiento posteriores a la transcripción o
posteriores a la traducción tales como procesamiento de ARNm
alternativo que puede dar un polipéptido truncado pero
biológicamente activo, por ejemplo, una forma soluble que se produce
de manera natural del polipéptido. También se engloban en la
invención variaciones atribuibles a proteolisis, tales como
diferencias en los extremos N o C-terminal con la
expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la
eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales del
polipéptido (generalmente desde los aminoácidos 1-5
terminales).
Un polipéptido de la invención puede prepararse
cultivando células huésped transformadas o recombinantes en
condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido de la
invención. El polipéptido expresado resultante puede purificarse
entonces a partir de un cultivo de este tipo usando procedimientos
de purificación conocidos, tales como la filtración en gel y
cromatografía de intercambio iónico. La purificación del polipéptido
también puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes
que se unirán al polipéptido; una o más etapas de columna sobre
resinas de afinidad de este tipo como concanavalina
A-agarosa, heparina-toyopearl® o
Cibacrom blue3GA Sepharose®; una o más etapas que implican
cromatografía de interacción hidrófoba usando resinas de este tipo
como fenil éter, butil éter, o propil éter; o cromatografía de
inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido de la invención
también puede expresarse en una forma que facilitará la
purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de
fusión, tales como los polipéptidos de unión a maltosa (MBP),
glutatión-S-transferasa (GST) o
tiorredoxina (TRX). Existen kits para la expresión y purificación de
tales polipéptidos de fusión disponibles comercialmente de New
England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ), e
InVitrogen, respectivamente. El polipéptido también puede marcarse
con un epítopo y posteriormente purificarse usando un anticuerpo
específico dirigido a tal epítopo. Un epítopo de este tipo
("Flag") está disponible comercialmente de Kodak (New Haven,
Conn.). Finalmente, puede emplearse una o varias etapas de
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC) empleando medios de
RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que
tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para
purificar adicionalmente el polipéptido. También puede emplearse
alguna o todas las etapas de purificación posteriores, en varias
combinaciones, para proporcionar un polipéptido recombinante
sustancialmente homogéneo. El polipéptido así purificado está
sustancialmente libre de otros polipéptidos de mamífero y se define
según la invención como un "polipéptido sustancialmente
purificado"; tales polipéptidos purificados incluyen anticuerpos
que se unen específicamente a un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, variante, y similares. Un
polipéptido de la invención también puede expresarse como un
producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente
de la leche de ovejas, cerdas, cabras o vacas transgénicas que se
caracterizan por células germinales o somáticas que contienen un
polinucleótido que codifica para un polipéptido de la
invención.
También es posible utilizar una columna de
afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado frente a los
polipéptidos de la invención, para purificar por afinidad los
polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden eliminarse de
una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo,
en un tampón de elución rico en sal y después dializarse en un
tampón pobre en sal para su uso o cambiando el pH u otros
componentes dependiendo de la matriza de afinidad utilizada, o
eliminarse de manera competitiva usando el sustrato que se produce
de manera natural del resto de afinidad, tal como un polipéptido
derivado de la invención. En este aspecto de la invención,
proteínas que se unen a un polipéptido de la invención (por ejemplo,
un anticuerpo anti-ADAM-H9 de la
invención) puede unirse a un soporte en fase sólida o un sustrato
similar adecuado para la identificación, separación o purificación
de células que expresan polipéptidos de la invención sobre su
superficie. Puede lograrse adherencia de, por ejemplo, un anticuerpo
anti-ADAM-H9 de la invención a una
superficie en fase sólida por cualquier medio, por ejemplo, pueden
recubrirse microesferas magnéticas con estas proteínas de unión a
polipéptido y conservarse en el recipiente de incubación mediante un
campo magnético. Se ponen en contacto suspensiones de mezclas de
células con la fase sólida que tiene proteínas de unión a
polipéptido sobre ellas. Los anticuerpos
anti-ADAM-H9 se unen a las células
que tienen los polipéptidos de la invención sobre su superficie
(por ejemplo, un dominio extracelular de ADAM-H9).
Se eliminaron por lavado las células no unidas (por ejemplo, las
células que carecen del polipéptido ADAM-H9) de las
células unidas. Este método de unión por afinidad es útil para la
purificación, selección o separación de tales células que expresan
el polipéptido de la solución. En la técnica se conocen métodos
para liberar células seleccionadas positivamente de la fase sólida
y engloban, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son
preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y
preferiblemente se dirigen para escindir la pareja de unión a
superficie de las células. Alternativamente, se incuban en primer
lugar mezclas de células que se sospecha que contienen células que
expresan polipéptido de la invención con un polipéptido de unión
biotinilado de la invención. Normalmente los periodos de incubación
son de al menos una hora de duración para garantizar la unión
suficiente a los polipéptidos de la invención. La mezcla resultante
se pasa entonces a través de una columna empaquetada con perlas
recubiertas de avidina, mediante la cual la elevada afinidad de la
biotina por la avidina proporciona la unión de las células a las
perlas. El uso de perlas recubiertas con avidina se conoce en la
técnica (véase, Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239,
1986). Se realiza el lavado de material no unido y la liberación de
las células unidas usando métodos convencionales.
Un polipéptido de la invención también puede
producirse mediante síntesis química convencional conocida. Los
expertos en la técnica conocen métodos para construir los
polipéptidos de la invención mediante métodos sintéticos. Las
secuencias de polipéptidos construidas sintéticamente, en virtud de
la compartición de las características de la estructura primaria,
secundaria, o terciaria y/o las características conformacionales con
polipéptidos nativos pueden presentar propiedades biológicas en
común con las mismas, incluyendo la actividad biológica. Por tanto,
los polipéptidos sintetizados pueden emplearse como sustitutos
biológicamente activos o inmunológicos de polipéptidos naturales,
purificados, en la selección de compuestos terapéuticos y en
procesos inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.
El grado de pureza deseado depende del uso
pretendido del polipéptido. Se desea un grado de pureza deseado
relativamente alto cuando el polipéptido va a administrarse por
ejemplo in vivo. En un caso de este tipo, los polipéptidos
se purifican de manera que no puedan detectarse bandas de
polipéptidos correspondientes a otros polipéptidos tras el análisis
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS
(SDS-PAGE). Un experto en el campo pertinente
reconocerá que las bandas múltiples correspondientes al polipéptido
pueden visualizarse mediante SDS-PAGE, debido a
glucosilación diferencial, procesamiento posterior a la traducción
diferencial y similares. Lo más preferiblemente, el polipéptido de
la invención se purifica hasta la homogeneidad sustancial, tal como
se indica mediante una banda de polipéptido única tras el análisis
mediante SDS-PAGE. La banda de polipéptido puede
visualizarse mediante tinción con plata, tinción con azul de
Coomassie, o (si el polipéptido está radiomarcado) mediante
autorradiografía.
La invención también proporciona homólogos de
especie de polipéptidos ADAM-H9 y polinucleótidos
que codifican para los polipéptidos. Tal como se usa en el presente
documento, un "homólogo de especie" es un polipéptido o
polinucleótido con una especie de origen diferente de la de un
polipéptido o polinucleótido dado, pero con similitud de secuencia
significativa al polipéptido o polinucleótido dado. Los homólogos de
especie pueden aislarse e identificarse preparando cebadores o
sondas adecuadas a partir de polinucleótidos que codifican para los
polipéptidos proporcionados en el presente documento y seleccionando
una fuente de ácidos nucleicos adecuada de las especies deseadas.
Alternativamente, los homólogos pueden identificarse examinando una
base de datos de genoma que contiene secuencias de una o más
especies utilizando una secuencia (por ejemplo, secuencia de ácido
nucleico o aminoácidos) de un ADAM-H9 de la
invención. Tales bases de datos de genoma están fácilmente
disponibles para varias especies (por ejemplo, en la "world wide
web" (www) en tigr.org/tdb;genetics.wisc.edu;
stanford.edu/-ball; hiv-web.1an1.gov;
ncbi.nlm.nig.gov; ebi.ac.uk; y pasteur.fr/other/biology). La
invención también engloba variantes alélicas de polipéptidos
ADAM-H9 y ácidos nucleicos que los codifican que son
formas alternativas que se producen de forma natural de tales
polipéptidos y polinucleótidos en las que las diferencias en las
secuencias de aminoácidos o nucleótidos se atribuyen al polimorfismo
genético.
Puede usarse la búsqueda de secuencias
intermedia (ISS) para identificar homólogos íntimamente relacionados
así como distantes contentando dos proteínas a través de una o más
secuencias intermedias. ISS usa repetidamente los resultados de la
búsqueda anterior como inicio para nueva búsqueda. BLAST saturado es
un paquete que realiza ISS. Empezando con una secuencia de
proteínas, BLAST saturado opera en un búsqueda BLAST e identifica
secuencias representativas para la siguiente generación de
búsquedas. Se ejecuta el procedimiento hasta la convergencia o
hasta que se alcanzan algunos criterios predefinidos. BLAST saturado
está disponible en la "world wide web" (www) en:
bioinformatics.burnham-inst.org/xblast (véase
también, Li et al. Bioinformatics 16(12):1105,
2000).
La invención también engloba fragmentos de los
polipéptidos ADAM-H9 de la invención y pueden estar
en forma lineal o cíclica usando métodos conocidos (véase, por
ejemplo, H.U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773
(1992); y R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc.
114:9245 (1992), incorporados ambos como mediante referencia en el
presente documento). Los fragmentos peptídicos de los polipéptidos
ADAM-H9 de la invención, y los polinucleótidos que
codifican para tales fragmentos incluyen longitudes de secuencia de
aminoácidos o nucleótidos que son al menos el 25% (más
preferiblemente al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo más
preferiblemente al menos el 80%) de la longitud de un
polinucleótido o polipéptido ADAM-H9.
Preferiblemente, tales secuencias tendrán al menos el 60% de
identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70%-75%, el
80%-85%, el 90%-95%, al menos el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más
preferiblemente al menos el 99,5%) con un polinucleótido o
polipéptido ADAM-H9 cuando se alinea para maximizar
el solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de
secuencia. También se incluyen en la invención polipéptidos,
fragmentos peptídicos, y polinucleótidos que los codifican, que
contienen o codifican para un segmento que comprende preferiblemente
al menos de 8 a 10, o más preferiblemente al menos 20, o todavía
más preferiblemente al menos 30, o lo más preferiblemente al menos
40 aminoácidos contiguos. Tales polipéptidos y fragmentos también
pueden contener un segmento que comparte al menos el 70% (al menos
el 75%, el 80%-85%, el 90%-95%, al menos el 97,5%, o al menos el
99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con cualquier
segmento de este tipo de cualquiera de los polipéptidos de la
familia ADAM, cuando se alinea para maximizar el solapamiento y la
identidad mientras se minimizan los huecos de secuencia. La
inspección visual, el cálculo matemático o los algoritmos
informáticos pueden determinar la identidad en porcentaje.
La invención también proporciona formas solubles
de polipéptidos ADAM-H9 que comprenden ciertos
fragmentos o dominios de estos polipéptidos. Son de particular
interés los fragmentos solubles que tienen actividad desintegrina.
Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que comienza con una
secuencia CGN sumamente conservada en el residuo 73 y que continúa
hasta aproximadamente el residuo 361 que carece de una región
transmembrana de SEQ ID NO:6 tiene actividad desintegrina. Otras
formas solubles incluyen polipéptidos que comprenden SEQ ID NO:8 que
comienza en un aminoácido entre e incluyendo los residuos 1 y 16
hasta el residuo 285, o SEQ ID NO: 10 que comienza en un aminoácido
entre e incluyendo los residuos 1 y 73 hasta un residuo entre 314 y
329. En tales formas, parte o la totalidad de los dominios
intracelular y transmembrana del polipéptido se eliminan de manera
que el polipéptido se segrega totalmente de la célula en la que se
expresa. Pueden identificarse los dominios intracelular y
transmembrana de polipéptidos de la invención según técnicas
conocidas para la determinación de tales dominios a partir de la
información de la secuencia. Por ejemplo, la alineación de las
secuencias polipeptídicas de la invención con otros miembros de la
familia ADAM de polipéptidos que tienen dominios conocidos
proporcionará información en relación con los dominios de los
polipéptidos de la invención. Por ejemplo, se han identificado las
SEQ ID NO:1 3, 6, 8 y 10 basándose en su homología con ADAM9 y
tienen dominios que se prevé que pertenecen a un dominio
desintegrina, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.
Un polipéptido que tiene, por ejemplo, una secuencia expuesta en
las SEQ ID NO:6, 8, y 10 que comienza con una secuencia CGN
sumamente conservada en, por ejemplo, el residuo 73 de SEQ ID NO:6 y
que continúa hasta aproximadamente el residuo 360, tiene varios
residuos de cisteína conservados cuando se compara con ADAM9 e
incluye un dominio desintegrina previsto de un polipéptido de la
familia ADAM. Un experto en la técnica reconocerá que pueden
realizarse ligeras modificaciones en el intervalo de secuencias de
un dominio particular sin afectar a la actividad biológica de la
molécula. Por consiguiente, la presente invención engloba los
cambios en las secuencias identificadas de 1, 2, 3, 4, o 5
aminoácidos en cualquier dirección del dominio particular (por
ejemplo, el dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 puede incluir los
residuos 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, o 78 hasta
aproximadamente los residuos 355, 356, 357, 358, 359, 361, 362, 363,
364, o 365).
En otro aspecto de la invención, un polipéptido
puede comprender varias combinaciones de dominios de polipéptidos
ADAM, tales como un dominio metaloproteinasa, un dominio
desintegrina, o un dominio citoplasmático. Por consiguiente, los
polipéptidos y polinucleótidos de la invención incluyen los que
comprenden o codifican para dos o más copias de un dominio tal como
el dominio metaloproteinasa, dos o más copias de un dominio tal como
el dominio desintegrina, o al menos una copia de cada dominio, y
pueden presentarse estos dominios en cualquier orden dentro de
tales polipéptidos. También se incluyen polipéptidos recombinantes y
los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos, en los que
los polipéptidos recombinantes son "polipéptidos quiméricos" o
"polipéptidos de fusión" y comprenden una secuencia de
ADAM-H9 tal como se expone en SEQ ID NO:1, 3, 6, 8 o
10 operativamente unida a un segundo polipéptido. El segundo
polipéptido puede ser cualquier polipéptido de interés que tiene
una actividad o función independiente de, o relacionada con, la
función de un polipéptido ADAM-H9. Por ejemplo, el
segundo polipéptido puede ser un dominio de un miembro relacionado
pero distinto de la familia ADAM de polipéptidos tal como, por
ejemplo, un dominio extracelular, citoplasmático, metaloproteasa, o
transmembrana de un polipéptido ADAM relacionado. Se pretende que
la expresión "operativamente unido" indique que la secuencia
de ADAM-H9 y la secuencia del segundo polipéptido
están fusionadas entre sí en marco. El segundo polipéptido puede
estar fusionado al extremo N-terminal o
C-terminal de una secuencia de
ADAM-H9 tal como se expone en la figura 2. Por
ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión es un
polipéptido de fusión GST-ADAM-H9
en el que las secuencias de ADAM-H9 están fusionadas
al extremo C-terminal de las secuencias de GST.
Tales polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de
secuencias de ADAM-H9 recombinantes. En otra
realización, el polipéptido de fusión es una secuencia de
ADAM-H9 que comprende una secuencia señal heteróloga
en su extremo N-terminal. En ciertas células
huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), puede aumentarse
la expresión y/o secreción de un polipéptido
ADAM-H9 mediante el uso de una secuencia señal. Como
otro ejemplo, un polipéptido ADAM-H9 o fragmento
del mismo puede fusionarse con una cola de
hexa-histidina para facilitar la purificación de la
proteína expresada en bacterias, o con una cola de hemaglutinina
para facilitar la purificación de la proteína expresada en células
eucariotas. Además, los polipéptidos de fusión pueden comprender,
por ejemplo, poli-His o los péptidos de
identificación antigénica descritos en la patente estadounidense
número 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/ Technology 6:1204,
1988. Un péptido de este tipo es el péptido FLAG®, que es sumamente
antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante
un anticuerpo monoclonal, permitiendo un ensayo rápido y la fácil
purificación del polipéptido recombinante expresado. Un hibridoma
murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une
al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos
divalentes, tal como se describió en la patente estadounidense
5.011.912, incorporada al presente documento como referencia. La
línea celular de hibridoma 4E11 se ha depositado en la ATCC con el
número de registro HB9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen
al péptido FLAG® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific
Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.
La invención engloba oligómeros o polipéptidos
de fusión que contienen un polipéptido ADAM-H9. Los
oligómeros que pueden usarse como parejas de fusión pueden estar en
forma de multímeros unidos covalentemente o no covalentemente,
incluyendo dímeros, trímeros, u oligómeros superiores. En un aspecto
de la invención, los oligómeros mantienen la capacidad de unión de
los componentes polipeptídicos y proporcionan para los mismos sitios
de uniones bivalentes, trivalentes y similares. En una realización
alternativa, la invención se refiere a oligómeros que comprenden
múltiples polipéptidos unidos a través de interacciones covalentes o
no covalentes entre los restos peptídicos fusionados con los
polipéptidos. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos
(espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la
oligomerización. Cremalleras de leucinas y ciertos polipéptidos
derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden
estimular la oligomerización de los polipéptidos unidos a los
mismos, tal como se describe con más detalle más adelante. Los
oligómeros particularmente preferidos comprenden un dominio
desintegrina de ADAM-H9. Tales oligómeros preferidos
se ejemplifican mediante un ADAM-H9dis
operativamente unido a un dominio de Fc o dominio de cremallera de
leucina.
Normalmente, un ligador será un resto de ligador
peptídico. La longitud del resto de ligador se elige para optimizar
la actividad biológica del polipéptido que tiene una secuencia de
ADAM-H9 y puede determinarse empíricamente sin
demasiada experimentación. El resto de ligador debe ser
suficientemente largo y suficientemente flexible para permitir que
un resto de ADAM-H9 interaccione libremente con un
sustrato o ligando. El resto de ligador preferido es un péptido
entre aproximadamente uno y 30 residuos de aminoácidos de longitud,
preferiblemente entre aproximadamente dos y 15 residuos de
aminoácidos. Restos de ligador preferidos son - -
Gly-Gly-, GGGGS(SEQ ID NO:11),
(GGGGS)n (SEQ ID NO:12), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:13),
GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:14), GSTSGSGKS
SEGSGSTKG (SEQ ID NO:15), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 16), o EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:17). Se describen restos de unión, por ejemplo, en Huston; J. S., et al., PNAS 85:5879 (1988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989 (1993), y Newton, D. L., et al., Biochemistry 35:545 (1996). Otros ligadores peptídicos adecuados son los descritos en las patentes estadounidenses 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan al presente documento como referencia. Una secuencia de ADN que codifica para un ligador peptídico deseado puede insertarse entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, puede ligarse entre las secuencias un oligonucleótido químicamente sintetizado que codifica para el lidagor. En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos ADAM solubles, separados por ligadores peptídicos.
SEGSGSTKG (SEQ ID NO:15), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 16), o EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:17). Se describen restos de unión, por ejemplo, en Huston; J. S., et al., PNAS 85:5879 (1988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989 (1993), y Newton, D. L., et al., Biochemistry 35:545 (1996). Otros ligadores peptídicos adecuados son los descritos en las patentes estadounidenses 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan al presente documento como referencia. Una secuencia de ADN que codifica para un ligador peptídico deseado puede insertarse entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, puede ligarse entre las secuencias un oligonucleótido químicamente sintetizado que codifica para el lidagor. En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos ADAM solubles, separados por ligadores peptídicos.
En las realizaciones en las que se construyen
variantes de un polipéptido ADAM-H9 para incluir un
dominio transmembrana, formarán un polipéptido de membrana tipo I.
En tales realizaciones, es preferible unir la pareja de fusión al
extremo C-terminal del polipéptido
ADAM-H9. Alternativamente, los polipéptidos
transmembrana pueden fusionarse con los polipéptidos de dominio de
receptor extracelular conocidos, para los cuales también se conoce
el ligando. Tales polipéptidos de fusión pueden manipularse entonces
para controlar las rutas de señalización intracelular
desencadenadas por el polipéptido ADAM-H9 unido.
Polipéptidos que abarcan la membrana celular también pueden
fusionarse con agonistas o antagonistas de receptores de la
superficie celular, o moléculas de adhesión celular para modular
adicionalmente efectos intracelulares de ADAM-H9. En
otro aspecto de la invención, pueden situarse interleucinas entre
el fragmento de polipéptido ADAM-H9 preferido y
otros dominios de polipéptido de fusión.
Los polipéptidos ADAM-H9 de la
invención también pueden incluir una secuencia de localización para
dirigir el polipéptido a sitios celulares particulares mediante la
fusión a secuencias señal que seleccionan como diana los orgánulos
apropiadas o proteínas huésped localizadas. Un polinucleótido que
codifica para una secuencia de localización, o secuencia señal,
puede ligarse o fusionarse al extremo 5’ de un polinucleótido que
codifica para un polipéptido ADAM-H9 de manera que
el péptido señal está localizado en el extremo amino terminal del
polinucleótido/polipéptido de fusión resultante. En eucariotas, el
péptido señal funciona para transportar un polipéptido a través del
retículo endoplasmático. La proteína secretora se transporta
entonces a través del aparato de Golgi, hacia vesículas secretoras
y hacia el espacio extracelular o el entorno externo. Los péptidos
señal incluyen pre-pro-péptidos que
contienen un sitio de reconocimiento enzimático proteolítico.
La secuencia de localización puede ser una
secuencia de localización nuclear, de retículo endoplasmático, de
peroxisoma, o mitocondrial, o una proteína localizada. Las
secuencias de localización pueden ser secuencias que seleccionan
como diana que se describen, por ejemplo, en "Protein
Targeting", capítulo 35 de Stryer, L., Biochemistry (4ª ed.). W.
H. Freeman, 1995. Algunas secuencias de señalización importantes
incluyen las que seleccionan como diana el núcleo (por ejemplo,
KKKRK (SEQ ID NO:18)), la mitocondria (MLRTSSLFTRRVQPSLFRNILRLQST
(SEQ ID NO:19)), el retículo endoplasmático (KDEL (SEQ ID NO:20)),
el peroxisoma (SKF), la membrana plasmática (CAAX (SEQ ID NO:21),
CC, CXC, o CCXX (SEQ ID NO:22)), el lado citoplasmático de la
membrana plasmática (fusión a SNAP-25), o el
aparato de Golgi (fusión a furina).
En otra realización, un polipéptido de la
invención o fragmentos del mismo pueden fusionarse a moléculas
transportadoras tales como inmunoglobulinas para una variedad de
fines incluyendo aumentar la valencia de los sitios de unión al
polipéptido. Como ejemplo, los fragmentos del polipéptido pueden
fusionarse a través de secuencias ligadoras a la parte Fc de una
inmunoglobulina. Para una forma bivalente del polipéptido, tal
fusión podría ser a la parte Fc de una molécula de IgG. También
pueden usarse otros isotipos de inmunoglobulinas para generar tales
fusiones. Por ejemplo, una fusión polipéptido-IgM
debe generar una forma decavalente del polipéptido de la invención.
En una realización, la invención proporciona un polipéptido de
fusión que tiene un dominio polipeptídico de Fc y una secuencia de
polipéptido ADAM-H9, tal como se expone en SEQ ID
NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73 hasta
aproximadamente el 360, SEQ ID NO:8 desde el aminoácido 1 o 16 hasta
el 285, o SEQ ID NO: 10 desde el aminoácido 1 o 73 hasta el 314 o
329.
La expresión "polipéptido de Fc", tal como
se usa en el presente documento, incluye formas nativas y de muteína
de polipéptidos constituidos de la región Fc de un anticuerpo que
comprende cualquiera o todos los dominios CH dominios de la región
Fc. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que
contienen la región bisagra que promueve la dimerización.
Polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido de Fc derivado de
un anticuerpo IgG1 humano. Como alternativa, se prepara un oligómero
usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito
la preparación de polipéptidos de fusión que comprenden ciertos
polipéptidos heterólogos fusionados a varias partes de polipéptidos
derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por
Ashkenazi et al. (PNASUSA 88:10535, 1991); Byrn et
al. (Nature 344:677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo
("Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides", en
Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1 -
10.19.11, 1992). En la técnica se conocen métodos para la
preparación y uso de oligómeros basados en inmunoglobulina. Una
realización de la invención se refiere a un dímero que comprende dos
polipéptidos de fusión creados fusionando un polipéptido de la
invención con un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo. Un gen
de fusión que codifica para el polipéptido/polipéptido de fusión Fc
se inserta en un vector de expresión apropiado. Se expresan el
polipéptido/ polipéptidos de fusión Fc en células huésped
trasformadas o transfectadas con el vector de expresión
recombinante o polinucleótido recombinante que codifica para el
polipéptido de fusión, y se dejan que se reúnan de manera muy
parecida a moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces
disulfuro intercatenarios entre los restos de Fc para dar moléculas
divalentes. Un polipéptido de Fc adecuado, escrito en solicitud PCT
WO 93/10151 (incorporada al presente documento como referencia), es
un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región
bisagra N-terminal hasta el extremo
C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo
IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína Fc descrita
en la patente estadounidense 5.457.035 y en Baum et al.,
(EMBO J. 13:3992, 1994) incorporada al presente documento como
referencia. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica
a la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151,
excepto en que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el
aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha
cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra afinidad reducida para los
receptores de Fc. Los polipéptidos de fusión anteriormente
descritos que comprenden restos de Fc (y los oligómeros formados a
partir de los mismos) ofrecen la ventaja de la purificación fácil
mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de polipéptido A
o polipéptido G. En otras realizaciones, los polipéptidos de la
invención pueden sustituirse por la parte variable de la cadena
pesada o ligera de un anticuerpo. Si se preparan polipéptidos de
fusión con cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es
posible formar un oligómero con hasta cuatro regiones
extracelulares de ADAM-H9 y/o ADAM.
Otro método para preparar los oligómeros de la
invención implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios
de cremallera de leucina son péptidos que estimulan la
oligomerización (dímeros y trímeros) de los polipéptidos en los que
se encuentran. Originalmente se identificaron cremalleras de
leucinas en varios polipéptidos de unión a ADN (Landschulz et
al., Science 240:1759,1988), y desde entonces se han encontrado
en una variedad de polipéptidos diferentes. El dominio de
cremallera comprende una repetición de siete aminoácidos
repetitivos, a menudo con cuatro o cinco residuos de leucina
intercalados con otros aminoácidos.
Un polipéptido quimérico o de fusión de la
invención puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante.
En una realización, fragmentos de polinucleótido que codifican para
las diferentes secuencias de polipéptidos están ligados juntos en
marco según técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos
romos o escalonados para el ligamiento, digestión por enzimas de
restricción para proporcionar los extremos apropiados, llenado de
extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa
alcalina para evitar la unión no deseable y el ligamiento
enzimática. Ejemplos de polinucleótidos que codifican para todos o
partes de polipéptidos ADAM-H9 se exponen en la
figura 3. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse
mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores
automáticos de ADN. Alternativamente, puede llevarse a cabo
amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de
anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos
fragmentos génicos consecutivos que pueden aparearse posteriormente
y volverse a amplificar para generar una secuencia génica quimérica
(véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds.
Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Es más, muchos
vectores de expresión están disponibles comercialmente que ya
codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido
GST).
La invención incluye adicionalmente polipéptidos
con o sin glucosilación de patrón nativo asociado. Polipéptidos
expresados en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (por
ejemplo, células COS-1 o CHO) pueden ser similares
a o significativamente diferentes de un polipéptido nativo en el
peso molecular y el patrón de glucosilación, dependiendo de la
elección del sistema de expresión. La expresión de los polipéptidos
de la invención en sistemas de expresión bacterianos, tales como
E. coli, proporciona moléculas no glucosiladas. Además, una
preparación dada puede incluir especies glucosiladas de manera
diferente del polipéptido. Los grupos glucosilo pueden eliminarse
mediante métodos convencionales, en particular los que usan
glucopeptidasa.
En otra realización, pueden hacerse
modificaciones en el polipéptido o polinucleótido usando técnicas
conocidas. Las modificaciones de interés en las secuencias de
polipéptido pueden incluir la alteración, sustitución, reemplazo,
inserción, deleción de un residuo de aminoácido seleccionado en la
secuencia codificante. Por ejemplo, uno o más de los residuos de
cisteína puede delecionarse o sustituirse con otro aminoácido para
alterar la conformación de la molécula, una alteración que puede
suponer evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares
incorrectos tras el plegamiento o renaturalización. Las técnicas
para tal alteración, sustitución, reemplazo, inserción o deleción
son conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,
la patente estadounidense número 4.518.584). Como otro ejemplo,
pueden modificarse los sitios de N-glucosilación en
un domino extracelular de un polipéptido para excluir la
glucosilación, permitiendo la expresión de un análogo de hidrato de
carbono reducido en sistemas de expresión de mamífero y de
levadura. Los sitios de N-glucosilación en
polipéptidos eucariotas se caracterizan por un triplete de
aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es
cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Sustituciones,
adiciones o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos
que codifica para estos tripletes darán como resultado la
prevención de la unión de residuos de hidrato de carbono en la
cadena lateral de Asn. La alteración de un nucleótido sencillo,
elegido de manera que Asn se sustituya por un aminoácido diferente,
por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de
N-glucosilación. Alternativamente, la Ser o el Thr
pueden sustituirse por otro aminoácido, tal como Ala. Procedimientos
conocidos para inactivar sitios de N-glucosilación
en polipéptidos incluyen los descritos en la patente estadounidense
5.071.972 y el documento EP 276.846, incorporados al presente
documento como referencia. Posibles sitios de
N-glicosilación incluyen N23 de SEQ ID NO:1; N37 de
SEQ ID NO:3; N53 de SEQ ID NO:4; N144 y N277 de SEQ ID NO:6; N10,
N69, y N202 de SEQ ID NO:8; y N144,N277 de SEQ ID NO:10.
Variantes adicionales dentro del alcance de la
invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear
derivados de los mismos mediante formación de conjugados covalentes
o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos
glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Pueden
prepararse derivados covalentes uniendo los restos químicos a
grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos o en el
extremo N-terminal o C-terminal de
un polipéptido. En el presente documento se contemplan conjugados
que comprenden agentes terapéuticos o de diagnóstico (detectables)
unidos a los mismos. Preferiblemente, tal alteración, sustitución,
reemplazo, inserción o deleción conserva la actividad deseada del
polipéptido.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican para polipéptidos ADAM-H9. El término
"polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de
nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Los nucleótidos pueden
ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o formas modificadas
de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de
cadena sencilla y doble de ADN o ARN. El ADN incluye, por ejemplo,
ADNc, ADN genómico, ADN químicamente sintetizado, ADN amplificado
mediante PCR, y combinaciones de los mismos. Los polinucleótidos de
la invención incluyen genes de longitud completa y moléculas de
ADNc, así como una combinación de fragmentos de los mismos. Los
polinucleótidos de la invención se derivan preferentemente de
fuentes humanas, pero la invención incluye los derivados de
especies no humanas, también.
Por "polinucleótido aislado" se quiere
decir un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo con ambas
secuencias codificantes con el que es inmediatamente contiguo (una
en el extremo 5’ y una en el extremo 3’) en el genoma que se
produce de manera natural del organismo del que se deriva. El
término por tanto incluye, por ejemplo, una molécula de
polinucleótido recombinante, que está incorporada en un vector, por
ejemplo, un vector de expresión; en un virus o plásmido que se
replica de manera autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o
eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un
ADNc) independiente de otras secuencias.
Un polinucleótido ADAM-H9 (1)
descrito y/o reivindicado en el presente documento codifica para un
polipéptido que comprende una secuencia tal como se expone en las
SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, o 10; (2) tiene una secuencia tal como se
expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9 (véase, por ejemplo, la figura
3); (3) tiene secuencias complementarias a una secuencia tal como
se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9; (4) fragmentos de las SEQ
ID NO:2, 5, 7, o 9 o sus complementos que se hibridan
específicamente con el polinucleótido de (2) o (3) en condiciones de
moderadas a rigurosas; (5) polinucleótidos de (1), (2), (3), o (4)
en los que T también puede ser U (por ejemplo, secuencias de ARN).
También se describen homólogos de un polinucleótido
ADAM-H9 de la invención. Estos polinucleótidos
pueden identificarse de varias maneras, incluyendo aislamiento de
moléculas genómicas o de ADNc a partir de una fuente adecuada, o
búsquedas computacionales de bases de datos de secuencias
disponibles. Pueden usarse oligonucleótidos o polinucleótidos
correspondientes a las secuencias de aminoácidos descritas en el
presente documento como sondas o cebadores para el aislamiento de
homólogos de polinucleótido o como secuencias de búsqueda para
búsquedas de bases de datos. Pueden obtenerse secuencias de
oligonucleótidos degeneradas mediante "traducción inversa" a
partir de las secuencias de aminoácidos de la invención. Puede
emplearse el procedimiento de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que
codifica para un polipéptido ADAM o una combinación deseada de
fragmentos de polipéptido ADAM. Se emplean oligonucleótidos que
definen el extremo deseado de una molécula de ADN diana como
cebadores 5’ y 3’. Por consiguiente, los fragmentos de los
polinucleótidos de la invención son útiles como sondas y cebadores
para identificar o amplificar la secuencia relacionada o para
obtener secuencias de longitud completa de un
ADAM-H9 de la invención. Los oligonucleótidos
pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para
endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción de la
combinación amplificada de fragmentos de ADN en un vector de
expresión. Las técnicas de PCR se conocen en la técnica (véase, por
ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis
et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)).
La invención también incluye polinucleótidos y
oligonucleótidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad
reducidas, más preferiblemente condiciones moderadamente rigurosas,
y lo más preferiblemente condiciones sumamente rigurosas, a los
polinucleótidos ADAM-H9 descritos en el presente
documento. Los parámetros básicos que afectan a la elección de las
condiciones de hibridación y a la guía para deducir condiciones
adecuadas se exponen por Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y
Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et
al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y
6.3-6.4, incorporados al presente documento como
referencia), y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la
técnica basándose, por ejemplo, en la longitud y/o la composición
de las bases del polinucleótido. Una manera de lograr condiciones
moderadamente rigurosas supone el uso de una solución de prelavado
que contiene 5 x SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de
hibridación de formamida aproximadamente al 50%, 6 x SSC, y una
temperatura de hibridación de aproximadamente 55°C (u otras
soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene
formamida a aproximadamente el 50%, con una temperatura de
hibridación de aproximadamente 42°C), y condiciones de lavado de
aproximadamente 60°C, en 0,5 x SSC, SDS al 0,1%. Generalmente, se
definen condiciones sumamente rigurosas como las condiciones de
hibridación anteriores, pero con lavado a aproximadamente 68°C, 0,2
x SSC, SDS al 0,1%. SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M, NaH_{2}PO_{4}
10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por SSC (1xSSC es
NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación
y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos una vez que se
completa la hibridación. Debe entenderse que la temperatura de
lavado y la concentración de sal de lavado pueden ajustarse según
sea necesario para lograr un grado deseado de rigurosidad aplicando
los principios básicos que rigen las reacciones de hibridación y
estabilidad de dúplex, tal como conocen los expertos en la técnica
y descritos adicionalmente más adelante (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., 1989). Cuando se hibrida un ácido nucleico
con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que
la longitud del híbrido es la del ácido nucleico con que se está
hibridando. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia
conocida, la longitud del híbrido puede determinarse mediante la
alineación de las secuencias de los ácidos nucleicos e
identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia
óptima. Se prevé que la temperatura de hibridación para híbridos
inferiores a 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10°C
inferior a la temperatura de fusión (T_{f}) del híbrido, donde
T_{f} se determina según una de las siguientes ecuaciones. Para
híbridos inferiores a 18 pares de bases de longitud, T_{f} (°C) =
2 (número de bases A + T) + 4
(número de bases G + C). Para híbridos superiores a 18 pares de bases de longitud, T_{f} (°C) = 81,5 + 16,6(log_{10} [Na^{+}]) +
0,41(% G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na^{+}] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na^{+}] para 1xSSC = 0,165M). Preferiblemente, cada ácido nucleico que se hibrida de este tipo tiene una longitud que es al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo más preferiblemente al menos el 80%) de la longitud de un polinucleótido de la invención con el cual se hibrida y tiene al menos el 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con un polinucleótido de la invención con el que se hibrida.
(número de bases G + C). Para híbridos superiores a 18 pares de bases de longitud, T_{f} (°C) = 81,5 + 16,6(log_{10} [Na^{+}]) +
0,41(% G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na^{+}] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na^{+}] para 1xSSC = 0,165M). Preferiblemente, cada ácido nucleico que se hibrida de este tipo tiene una longitud que es al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo más preferiblemente al menos el 80%) de la longitud de un polinucleótido de la invención con el cual se hibrida y tiene al menos el 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con un polinucleótido de la invención con el que se hibrida.
"Variantes modificadas de manera
conservativa" se aplica tanto al polipéptido como al
polinucleótido. Con respecto a polinucleótido particular, las
variantes modificadas de manera conservativa se refieren a codones
en el polinucleótido que codifican para aminoácidos idénticos o
esencialmente idénticos. Debido a la degeneración del código
genético, un gran número de polinucleótidos funcionalmente idénticos
codifican para cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones
GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican para el aminoácido alanina. Por
tanto, en cada posición en la que una alanina se especifica por un
codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones
correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado.
Tales variaciones son "variaciones silenciosas", que son una
especie de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada
secuencia de polinucleótidos en el presente documento que codifica
para un polipéptido también describe todas las posibles variaciones
silenciosas del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá
que cada codón en un polinucleótido (excepto AUG, que normalmente
es el único codón para metionina) puede modificarse para dar una
molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación
silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido
está implícita en cada secuencia descrita.
La invención también proporciona metodología
para el análisis de polinucleótidos de la invención sobre "chips
de ADN" tal como se describe en Hacia et al., Nature
Genetics, 14:441-447 (1996). Por ejemplo, se aplican
matrices de alta densidad de oligonucleótidos que comprenden una
secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, 9, o una
variante o forma mutante de la misma y se inmovilizan sobre el chip
y pueden usarse para detectar variaciones de secuencia en una
población. En una muestra de prueba, se hibridan los polinucleótidos
a los oligonucleótidos inmovilizados. El perfil de hibridación del
polinucleótido diana a la sonda inmovilizada se cuantifica y
compara con un perfil de referencia. La información genética
resultante puede usarse en el diagnóstico molecular. Puede
modificarse la densidad de los oligonucleótidos sobre los chips de
ADN según sea necesario.
La invención también proporciona genes
correspondientes a los polinucleótidos descritos en el presente
documento. "Genes correspondientes" son las regiones del
genoma que se transcriben para producir los ARNm de los cuales se
derivan las moléculas de ADNc y pueden incluir regiones contiguas
del genoma necesarias para la expresión regulada de tales genes.
Por tanto, los genes correspondientes pueden incluir, pero sin
limitarse a, secuencias codificantes, regiones no traducidas en 5’
y 3’, exones alternativamente cortados y empalmados, intrones,
promotores, potenciadores, y silencidadores o elementos supresores.
Los genes correspondientes pueden aislarse según métodos conocidos
usando la información de secuencia descrita en el presente
documento. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o
cebadores a partir de la información de secuencia descrita para la
identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas
apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos.
Puede realizarse la expresión, aislamiento, y
purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención
mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse
a, los siguientes métodos.
Los polinucleótidos aislados de la invención
pueden estar operativamente unidos a una secuencia control de la
expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en
Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485 (1991); y Pouwels
et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva
York, (1985, y Suplementos), con el fin de producir
recombinantemente un polipéptido de la invención. En la técnica se
conocen muchas secuencias control de la expresión. También se
conocen métodos generales para expresar polipéptidos recombinantes y
se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185:537
(1990). Tal como se define en el presente documento
"operativamente unido" significa que un polinucleótido aislado
de la invención y una secuencia control de la expresión están
situados en un vector o célula de tal manera que el polipéptido
codificado por el polinucleótido se expresa por una célula huésped
que se ha transformado (transfectado) con el vector o polinucleótido
operativamente unido a la secuencia control.
Además, una secuencia que codifica para un
péptido señal apropiado (nativo o heterólogo) puede incorporarse en
vectores de expresión. La elección de una secuencia líder o péptido
señal puede depender de factores tales como el tipo de células
huésped en las que va a producirse el polipéptido recombinante.
Ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en
células huésped de mamíferos incluyen la secuencia señal para
interleucina (IL)-7 (véase, patente estadounidense
4.965.195); la secuencia señal para el receptor de
IL-2 (véase, Cosman et al., Nature 312:768,
1984); el péptido señal del receptor de IL-4 (véase,
el documento EP 367.566); el péptido señal del receptor de
IL-1 de tipo I (véase, patente estadounidense
4.968.607); y el péptido señal del receptor de IL-1
de tipo II (véase, el documento EP 460.846). Un péptido señal que es
funcional en las células huésped deseadas estimula la secreción
extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del
polipéptido tras la secreción de un polipéptido de la célula. Una
preparación de polipéptido puede incluir una mezcla de moléculas
polipeptídicas que tienen diferentes aminoácidos
N-terminal, que resultan de la escisión del péptido
señal en más de un sitio.
Se han descrito métodos establecidos para
introducir ADN en células de mamíferos (Kaufman, R.J., Large Scale
Mammalian Cell Culture, 1990, págs. 15-69). Pueden
usarse protocolos adicionales usando reactivos comercialmente
disponibles, tales como Lipofectamina o
Lipofectamina-más reactivo lipídico (Gibco/BRL),
para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad
Sci. USA 84:7413, 1987). Además, puede usarse la electroporación
para transfectar células de mamíferos usando procedimientos
convencionales, tales como los que aparecen en Sambrook et
al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Puede realizarse la selección de transformantes estables usando
métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo,
resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al., Meth. in
Enzymology 185:487, 1990, describe varios esquemas de selección,
tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una
variedad adecuada para la selección de DHFR puede ser la variedad
DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980). Puede
introducirse un plásmido que expresa el ADNc de DHFR en la variedad
DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido
pueden crecer en los medios selectivos apropiados. Otros ejemplos
de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de
expresión incluyen ADNc que confieren resistencia frente a
antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Se seleccionan
células que albergan al vector basándose en la resistencia frente a
estos compuestos.
Alternativamente, pueden obtenerse productos
génicos a través de recombinación homóloga, o técnicas de
"selección como diana de genes". Tales técnicas emplean la
introducción de elementos control de transcripción exógena (tales
como el promotor de CMV o similares) en un sitio predeterminado
particular en el genoma, para inducir la expresión de un
ADAM-H9 endógeno de la invención. La ubicación de la
integración en un cromosoma huésped o genoma puede determinarse
fácilmente por un experto en la técnica, dada la ubicación conocida
y la secuencia del gen. En una realización preferida, la invención
también contempla la introducción de elementos control
transcripcionales exógenos junto con un gen amplificable, para
producir cantidades aumentadas del producto génico. La práctica de
recombinación homóloga o de selección como diana de genes se explica
por Chappel en la patente estadounidense número 5.272.071 (véase
también Schimke, et al. "Amplification of Genes in Somatic
Mammalian cells", Methods in Enzymology 151:85 (1987), y por
Capecchi, et al., "The New Mouse Genetics: Altering the
Genome by Gene Targeting", TIG 5:70 (1989)).
Células huésped adecuadas para la expresión del
polipéptido incluyen células eucariotas y procariotas. Células
huésped de mamíferos incluyen, por ejemplo, la línea
COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651)
(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células
C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster
chino (CHO), células HeLa, líneas de células BHK (ATCC CRL 10),
línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de
mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase, McMahan et al.
EMBO J. 10: 2821, 1991), células 293 de riñón humanas, células
A431de la epidermis humana, células Colo205 humanas, otras líneas
celulares de primates transformadas, células diploide normales,
variedades celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido
primario, explantes primarios, HL-60, U937, HaK o
células Jurkat. Alternativamente, puede ser posible producir el
polipéptido en eucariotas inferiores tales como levadura o en
procariotas tales como bacterias. Cepas de levadura potencialmente
adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa
de levadura que puede expresar polipéptidos heterólogos. Cepas
bacterianas potencialmente adecuadas incluyen, por ejemplo,
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium,
o cualquier cepa bacteriana que puede expresar polipéptidos
heterólogos. Si el polipéptido se prepara en levaduras o bacterias,
puede ser necesario modificar el polipéptido producido en las
mismas, por ejemplo mediante fosforilación o glucosilación de los
sitios apropiados, con el fin de obtener el polipéptido funcional.
Tales uniones covalentes pueden conseguirse usando métodos químicos
o enzimáticos conocidos. El polipéptido también puede producirse
uniendo operativamente un polinucleótido de la invención a
secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de
insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Materiales
y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/insecto están
comercialmente disponibles en forma de kit de, por ejemplo,
Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU. (el kit MaxBac®), así como métodos
descritos en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station
Bulletin No. 1555 (1987), y Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47
(1988), incorporados al presente documento como referencia. También
podrían emplearse sistemas de traducción libres de células para
producir polipéptidos que usan ARN derivados de constructos de acido
nucleico descritos en el presente documento. Una célula huésped que
comprende un polinucleótido aislado de la invención, unido
preferiblemente de manera operativa a al menos una secuencia control
de expresión, es una "célula huésped recombinante".
En algunos casos puede ser deseable reducir la
cantidad de actividad de un polipéptido ADAM-H9 en
el que la sobreexpresión o actividad aberrante de
ADAM-H9 está asociada con un trastorno o enfermedad.
Puede usarse cualquier método que neutraliza los polipéptidos
ADAM-H9 o inhibe la expresión (o bien la
transcripción o bien la traducción) de un polinucleótido
ADAM-H9 para reducir las actividades biológicas de
los polipéptidos ADAM-H9.
Pueden diseñarse antagonistas para reducir el
nivel de expresión de ADAM-H9 endógeno, por ejemplo,
usando enfoques de ribozima o antisentido conocidos para inhibir o
evitar la traducción de transcriptos de ARNm de
ADAM-H9; enfoques de triple hélice para inhibir la
transcripción de genes ADAM-H9; o recombinación
homóloga dirigida para inactivar o "desactivar" los genes de
ADAM-H9 o sus elementos potenciadores o promotores
endógenos. Tales antagonistas antisentido, de ribozima y de triple
hélice pueden diseñarse para reducir o inhibir la actividad de
ADAM-H9 o bien dañada o bien, si es apropiado,
mutante.
Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan
para bloquear directamente la traducción de ARNm hibridándose con
un ARNm dirigido y evitando la traducción de polipéptidos. Los
enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (o bien
ADN o bien ARN) que son complementarios a un ARNm que tiene una
secuencia de polinucleótido ADAM-H9. No se
requiere, aunque se prefiere, la complementariedad absoluta. Los
oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5’ del mensaje,
por ejemplo, la secuencia no traducida en 5’ hasta, e incluyendo, el
codón de iniciación AUG, deben funcionar lo más eficazmente en la
inhibición de la traducción. Los ácidos nucleicos antisentido son
preferiblemente oligonucleótidos que varían desde 6 hasta
aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos
pueden ser ADN, ARN, mezclas quiméricas, derivados o versiones
modificadas de los mismos, de cadena sencilla o de cadena doble. El
oligonucleótido puede modificarse en el resto básico, resto de
azúcar, o esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la
estabilidad de la molécula, hibridación y similares. El
oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como
péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana receptores de
células huésped in vivo), o agentes que facilitan el
transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo,
Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553,
1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648, 1987;
publicación PCT número WO88/09810), o agentes de intercalación o
agentes de escisión desencadenados por la hibridación (véase, por
ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539, 1988). Se administran las
moléculas antisentido a células, que expresan un transcrito que
tiene una secuencia de polinucleótido ADAM-H9 in
vivo mediante, por ejemplo, inyección directa en el sitio de
derivación celular o tisular, o moléculas antisentido modificadas,
diseñadas para seleccionar como diana las células deseadas (por
ejemplo, moléculas antisentido unidas a péptidos o anticuerpos que
se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la
superficie celular diana) pueden administrarse sistémicamente. Un
enfoque preferido utiliza un constructo de ADN recombinante en el
que el oligonucleótido antisentido está situado bajo el control de
un fuerte promotor de pol III o pol II.
Las moléculas de ribozima diseñadas para
escindir catalíticamente transcriptos de ARNm que tienen una
secuencia de polinucleótido ADAM-H9 evitan la
traducción de ARNm de ADAM-H9 (véanse, por ejemplo,
publicación internacional PCT WO90/11364, patente estadounidense
número 5.824.519). Los ribozimas son moléculas de ARN que tienen la
capacidad de escindir específicamente otro ARN de cadena sencilla.
Dado que las ribozimas son específicas de secuencia, sólo se
inactivan ARNm con secuencias particulares. Existen dos tipos
básicos de ribozimas concretamente, tipo Tetrahymena
(Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988) y de tipo "cabeza de
martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen
secuencias, que son de cuatro bases de longitud, mientras que las
ribozimas de tipo "cabeza de martillo "reconocen secuencias de
bases de 11-18 bases de longitud. Cuanto más larga
es la secuencia de reconocimiento, mayor es la probabilidad de que
la secuencia se produzca exclusivamente en las especies de ARNm
diana. En consecuencia, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son
preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena. Como en el
enfoque antisentido, las ribozimas pueden estar compuestas por
oligonucleótidos modificados y administrarse usando un constructo
de ADN "que codifica para" la ribozima bajo el control de un
fuerte promotor pol III o pol II constitutivo.
Alternativamente, puede reducirse la expresión
de ADAM-H9 endógeno seleccionando como diana
secuencias de ADN complementarias a una región reguladora del gen
diana (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores del gen diana)
para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción
del gen diana (véase de manera general, Helene, Anticancer Drug
Des., 6(6), 569, 1991; Helene, et al., Ann. N.Y. Acad.
Sci., 660:27, 1992; y Maher, Bioassays 14(12), 807,
1992).
Pueden prepararse moléculas antisentido, de
ribozima y de triple hélice mediante cualquier método conocido en
la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN e incluir
técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos y
oligorribonucleótidos tales como, por ejemplo, síntesis química de
fosforamidita en fase sólida usando un sintetizador automático de
ADN disponible de Biosearch, Applied Biosystems. Pueden sintetizarse
oligonucleótidos de fosforotioato mediante el método de Stein et
al., Nucl. Acids Res. 16:3209, 1988. Pueden prepararse
oligonucleótidos de metilfosfonato mediante el uso de soportes
poliméricos de vidrio de poro controlado (Sarin et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448, 1988). Alternativamente, pueden
generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro e
in vivo de secuencias de ADN que codifican para la molécula
de ARN antisentido.
La expresión génica endógena también puede
reducirse inactivando o "desactivando" el gen diana o su
promotor usando recombinación homóloga dirigida (véanse, por
ejemplo, Smithies, et al., Nature 317:230, 1985; Thomas y
Capecchi, Cell 51, 503, 1987; Thompson, et al., Cell 5, 313,
1989; cada uno de los cuales se incorpora como referencia al
presente documento en su totalidad). Por ejemplo, puede usarse un
gen diana no funcional mutante (o una secuencia de ADN no
relacionada completamente) flanqueado por ADN homólogo al gen diana
endógeno, con o sin un marcador seleccionable y/o marcador
seleccionable negativo. La inserción del constructo de ADN, a
través de recombinación homóloga dirigida, da como resultado la
inactivación del gen diana. Tales enfoques son particularmente
adecuados cuando pueden usarse modificaciones a células madre
embrionarias para generar crías de animales no humanos con un gen
diana inactivo (por ejemplo, véase Thomas y Capecchi, 1987 y
Thompson, 1989, citados anteriormente; véase también la técnica de
"interferencia por ARN" ("ARNi") de Grishok et al.,
Science 287 (5462): 2494, 2000), y Dernburg et al., Genes
Dev. 14 (13): 1578, 2000).
Tal como se usa en el presente documento, un
"animal transgénico" es un animal que incluye un transgén que
se inserta en una célula embrionaria y se convierte en una parte del
genoma del animal que se desarrolla a partir de esa célula, o una
cría de tal animal. Cualquier animal no humano que puede producirse
mediante tecnología transgénica está incluido en la invención,
aunque se prefieren mamíferos. Los mamíferos preferidos incluyen
primates no humanos, ovejas, cabras, caballos, ganado, cerdos,
conejos y roedores, tales como cobayas, hámster, ratas, jerbos y
ratones.
Un "transgén" es un polinucleótido que
comprende una o más secuencias seleccionadas (por ejemplo, ribozimas
codificantes que escinden ARNm de ADAM-H9, que
codifican para una molécula antisentido a ARNm de
ADAM-H9, que codifican para una secuencia de
ADAM-H9 mutante, y similares) para expresarse en un
animal transgénico. El polinucleótido es parcial o completamente
heterólogo, es decir, foráneo, al animal transgénico, u homólogo a
un gen endógeno del animal transgénico, pero que se ha diseñado para
insertarse en el genoma del animal en una ubicación que difiere de
la del gen natural. Un transgén puede incluir uno o más promotores y
cualquier otra secuencia de ADN, tales como intrones, necesarias
para la expresión del ADN seleccionado, todas operativamente unidas
al ADN seleccionado, y puede incluir una secuencia potenciadora.
Puede usarse el animal transgénico con el fin de
identificar el impacto de niveles de ADAM-H9
aumentados o disminuidos sobre una ruta o fenotipo particular. En
la técnica se conocen protocolos útiles en la producción de tales
animales transgénicos (véase, por ejemplo, Brinster, et al.,
Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:4438, 1985; Jaenisch, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 73:1260, 1976; Hogan, et al., 1986,
Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y.; Jahner, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:6927, 1985; Van der Putten, et al., Proc Natl.
Acad. Sci. USA 82:6148; Steward, et al., EMBO J., 6:383,
1987; Jahner, et al., Nature, 298:623, 1982).
En otra realización, se proporcionan en el
presente documento anticuerpos que son inmunorreactivos con los
polipéptidos de la invención. Los polipéptidos
ADAM-H9, fragmentos, variantes, polipéptidos de
fusión, y similares, tal como se expuso anteriormente, pueden
emplearse como "inmunógenos" para producir anticuerpos
inmunorreactivos con los mismos. Tales anticuerpos se unen
específicamente a los polipéptidos a través de los sitios de unión
a antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos que se unen
específicamente son los que reconocerán específicamente y se unirán
con polipéptidos de la familia ADAM-H9, homólogos, y
variantes, pero no con otras moléculas. En una realización
preferida, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que
tienen una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 de
la invención y no reacciona de manera cruzada con otros
polipéptidos.
Más específicamente, los polipéptidos,
fragmento, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen
determinantes antigénicos o epítopos que provocan la formación de
anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser
o bien lineales o bien conformacionales (discontinuos). Los epítopos
lineales están compuestos por una sección única de aminoácidos del
polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o
discontinuos están compuestos por secciones de aminoácidos de
diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se acercan mucho
tras el plegamiento del polipéptido. Pueden identificarse epítopos
mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.
Adicionalmente, pueden usarse epítopos de los polipéptidos de la
invención como reactivos de investigación, en ensayos, y para
purificar anticuerpos de unión específica de sustancias tales como
sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales
epítopos o variantes de los mismos pueden producirse usando
técnicas conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida,
escisión química o enzimática de un polipéptido, o usando
tecnología de ADN recombinante.
Pueden prepararse anticuerpos tanto policlonales
como monoclonales frente a los polipéptidos de la invención
mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal
Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,
Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988); Kohler y
Milstein, (patente estadounidense número 4.376.110); la técnica del
hibridoma de células B humano (Kosbor et al., Immunology
Today 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80:2026, 1983); y la técnica del hibridoma de VEB (Cole et
al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R.
Liss, Inc., págs. 77-96). También se contemplan en
el presente documento líneas celulares de hibridoma que producen
anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la
invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse
mediante técnicas convencionales. Para la producción de
anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales huésped mediante
inyección con un polipéptido ADAM-H9, fragmento,
variante o mutantes del mismo. Tales animales huésped pueden
incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por
nombrar algunos. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la
respuesta inmunológica. Dependiendo de las especies huésped, tales
adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund
(completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de
aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina,
polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite,
hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos
potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Pueden recuperarse los anticuerpos monoclonales mediante técnicas
convencionales. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser cualquier
clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y
cualquier subclase de las mismas.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Takeda et
al., Nature, 314:452, 1985) mediante corte y empalme de los
genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de
antígenos apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo
humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es
una molécula en la que diferentes partes se derivan de diferentes
especies animales, tales como los que tienen una región variable
derivada de AcM porcino y una región constante de imunoglobulina
humana. Los anticuerpos monoclonales de la invención también
incluyen versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos.
Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas
conocidas y presentan la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando
se administran los anticuerpos a seres humanos. Por ejemplo, pueden
emplearse ratones transgénicos en los que se ha introducido material
genético que codifica para una o más cadenas de inmunoglobulina
humana. Tales ratones pueden alterarse genéticamente en una variedad
de formas. La manipulación genética puede dar como resultado
cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina humana que sustituyen
cadenas de inmunoglobulina endógenas en al menos algunos
(preferiblemente casi todos) anticuerpos producidos por el animal
tras la inmunización. Los procedimientos para la producción de
anticuerpos monoclonales modificados adicionalmente por ingeniería
y quiméricos incluyen los descritos en Riechmann et al.
(Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987),
Larrick et al. (Bio/ Technology 7:934, 1989), y Winter y
Harris (TIPS 14:139, Can, 1993). Pueden encontrarse procedimientos
para generar anticuerpos transgénicamente en el documento GB
2.272.440, patentes estadounidenses números 5.569.825 y 5.545.806 y
patentes relacionadas que reivindican prioridad de las mismas,
todos los cuales se incorporan como referencia al presente
documento. Preferiblemente, para su uso en seres humanos, los
anticuerpos son humanos o humanizados; también se conocen técnicas
para crear tales anticuerpos humanos. Los animales transgénicos
para preparar anticuerpos humanos están disponibles de, por
ejemplo, Medarex Inc. (Princeton, NJ) y Abgennix Inc. (Fremont,
CA).
Puede usarse la expresión de secuencias de
inmunoglobulina humanizada en huéspedes bacterianos para seleccionar
secuencias de inmunoglobulina humanizada de mayor afinidad
sometiendo a mutagénesis las regiones CDR y produciendo bibliotecas
de exposición en bacteriófago que pueden examinarse para detectar
variantes de CDR de inmunoglobulina inmunizada que tienen unión de
alta afinidad y/o alta especificidad a un polipéptido
ADAM-H9 o fragmento del mismo. Una ventaja
potencial de tal mejora de la afinidad es la generación de variantes
de CDR de inmunoglobulina humanizada que presentan afinidad de
unión mejorada y/o reactividad cruzada reducida con moléculas
diferentes al polipéptido ADAM-H9 o fragmento del
mismo. En la técnica se proporcionan métodos para producir
bibliotecas de exposición en fago que tienen secuencias de región
variable de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Cesareni, FEBS
Lett 307:66, 1992; Swimmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:3756, 1992; Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:3576,1992; Clackson et al., Nature 352:624, 1991; Scott
& Smith, Science 249:386, 1990; Garrard et al.,
Bio/Techniques 9:1373, 1991. Las secuencias de inmunoglobulina
humanizada de variantes de CDR de afinidad mejorada resultantes se
expresan posteriormente en un huésped adecuado.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo, que
reconocen epítopos específicos, mediante técnicas conocidas. Por
ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los
fragmentos F(ab’)_{2} que pueden producirse mediante
digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos
Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los
fragmentos (ab’)_{2}. Alternativamente, pueden construirse
bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., Science,
246:1275, 1989) para permitir una identificación rápida y sencilla
de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.
También pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción
de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense número
4.946.778; Bird, Science 242:423, 1988; Huston et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; y Ward et al., Nature
334:544, 1989) para producir anticuerpos de cadena sencilla frente
a polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos de
ADAM-H9. Además, pueden utilizarse, a su vez,
anticuerpos frente al polipéptido ADAM-H9 para
generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan"
a un polipéptido ADAM-H9 y que pueden unirse al
polipéptido ADAM-H9 usando técnicas conocidas por
los expertos en la técnica. (véanse, por ejemplo, Greenspan &
Bona, FASEB J 7(5):437, 1993; y Nissinoff, J. Immunol.
147(8):2429, 1991).
Se conocen procedimientos de selección para
identificar tales anticuerpos, y pueden implicar por ejemplo,
cromatografía de inmunoafinidad. Pueden seleccionarse anticuerpos
por sus propiedades agonistas (es decir, que imitan a ligando).
Tales anticuerpos, tras unirse a un polipéptido
ADAM-H9 en la superficie celular, pueden inducir
efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas)
similares a los efectos biológicos inducidos cuando la pareja de
unión a ADAM-H9 que se produce de manera natural se
une al polipéptido en la superficie celular. Pueden usarse
anticuerpos agonistas para inducir comunicación intracelular o rutas coestimuladoras mediadas por ADAM-H9.
anticuerpos agonistas para inducir comunicación intracelular o rutas coestimuladoras mediadas por ADAM-H9.
Además, pueden usarse anticuerpos que bloquean
la unión de un polipéptido que tiene una secuencia de
ADAM-H9 de la invención a su pareja de unión para
inhibir la comunicación intracelular mediada por
ADAM-H9 o la coestimulación que resulta de tal
unión y/o para identificar análogos de integrina de
ADAM-H9. Tales anticuerpos de bloqueo pueden
identificarse usando cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal
como someter a prueba anticuerpos para determinar la capacidad para
inhibir la unión de un polipéptido ADAM-H9 a ciertas
células que expresan una pareja de unión (por ejemplo, una
integrina) para el polipéptido. Alternativamente, pueden
identificarse anticuerpos de bloqueo en ensayos para determinar la
capacidad para inhibir un efecto biológico que resulta de la unión
de un polipéptido ADAM-H9 a células diana. En una
realización, se usa un ensayo de inhibición de la unión basado en
AcM de integrina de citometría de flujo para mostrar la unión de
polipéptidos ADAM-H9dis-Fc con
integrinas expresadas en la superficie de células endoteliales.
Pueden usarse células endoteliales humanas en tal ensayo. Las
células endoteliales humanas expresan integrinas
\alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5},
\beta_{1}, \beta_{4}, \alpha_{1}, \alpha_{2},
\alpha_{3}, \alpha_{4}, \alpha_{5}, y \alpha_{6}.
Se pone en contacto un polipéptido
ADAM-H9dis-Fc con las células
endoteliales. Los anticuerpos monoclonales específicos para
integrinas humanas \alpha_{v}\beta_{3} (LM609,
anti-CD51/61, Chemicon, Temecula, CA; Brooks et
al., Science 264:569, 1994), \alpha_{2}\beta_{1}
(BHA2.1, anti-CD49b, Chemicon; Wang et al.,
Mol. Biol. of the Cell 9:865, 1998), \alpha_{5}\beta_{1}
(SAM-1, anti-CD49e, Biodesign; A.
te Velde et al., J. Immunol. 140:1548, 1988),
(\alpha_{3}\beta_{1}, (ASC-6,
anti-CD49c, Chemicon; Pattaramalai et al.,
Exp. Cell. Res. 222: 281,1996), \alpha_{4}\beta_{1}, (HP2/1,
anti-CD49d, Immunotech, Marsella, Francia; Workshop
of the 4th International Conference on Human Leukocyte
Differentiation Antigens, Viena Austria, 1989, número de taller
p091), \alpha_{6}\beta_{1} (GoH3,
anti-CD49f, Immunotech; Workshop 4th International
Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, número de
taller p055), \alpha_{6}\beta_{4} (439-9B,
anti-CD104, Pharmingen, San Diego, CA; Schlossman
et al., 1995 Leukocyte Typing V: White Cell Differentiation
Antigens. Oxford University Press, Nueva York), y
\alpha_{v}\beta_{5} (MAB 1961, Chemicon; Weinaker, et
al., J.Biol. Chem. 269:6940, 1994) pueden unirse específicamente
a HMVEC-d. Se sabe que cada uno de estos
anticuerpos bloquea específicamente la unión de la integrina
indicada a sus ligandos (por ejemplo, fibronectina, vitronectina,
fibrinógeno). La capacidad de los AcM de integrina para inhibir la
unión de polipéptidos de
ADAM-H9dis-Pc revela qué integrinas
se unen a los dominios desintegrina e, indirectamente, qué
actividades de unión a integrina pueden antagonizar los dominios
desintegrina. Adicionalmente se someten a prueba polipéptidos
ADAM-H9dis-Fc que se unen para
seleccionar integrinas para determinar la capacidad para perturbar
las interacciones integrina-ligando y para modular
la función de las células endoteliales, angiogénesis y otras
actividades biológicas in vitro e in vivo.
Por tanto pueden tratarse trastornos causados o
agravados (directa o indirectamente) por la interacción de
ADAM-H9 con una pareja de unión a la superficie
celular. Un método terapéutico implica la administración in
vivo de un anticuerpo de bloqueo a un sujeto en una cantidad
eficaz para inhibir la actividad biológica mediada por la unión a
ADAM-H9. Tal como se usa en el presente documento,
un "sujeto" puede ser cualquier animal, preferiblemente un
mamífero (por ejemplo, canino, felino, bovino, porcino, equino,
primates, y similares), y lo más preferiblemente un ser humano.
Generalmente se prefieren anticuerpos monoclonales para su uso en
tales métodos terapéuticos. En una realización, se emplea un
fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. En el presente
documento, se proporcionan composiciones que comprenden un
anticuerpo frente a un polipéptido ADAM-H9, y un
diluyente, excipiente o vehículo fisiológicamente aceptable.
También se proporcionan en el presente documento
conjugados que comprenden un agente terapéutico o detectable (por
ejemplo, de diagnóstico) unido al anticuerpo. Los conjugados
encuentran su uso en procedimientos in vitro o in
vivo. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en
ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos
de la invención, o bien in vitro o bien in vivo. Los
anticuerpos también pueden emplearse para purificar polipéptidos o
fragmentos de la invención mediante cromatografía de
inmunoafinidad.
Se usa el diseño racional de fármacos para
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés o de moléculas pequeñas con las que
interaccionan, por ejemplo, sustratos, agentes de unión,
inhibidores, agonistas, antagonistas, y similares. Los métodos
proporcionados en el presente documento pueden usarse para crear o
identificar agentes que son formas más activas o estables del
polipéptido o que potencian o interfieren en la función de un
polipéptido in vivo (Hodgson J, Biotechnology 9:19, 1991). La
estructura tridimensional de un polipéptido de la invención, un
ligando o pareja de unión, o de un complejo de pareja de unión a
polipéptido, se determina mediante cristalografía de rayos X,
mediante resonancia magnética nuclear o mediante modelización de la
homología por ordenador o, lo más normalmente, mediante una
combinación de estos enfoques. Se usa la información estructural
relevante para diseñar moléculas análogas, para identificar
inhibidores eficaces o para identificar moléculas pequeñas que
pueden unirse a un polipéptido de la invención. El uso de
información estructural de polipéptido ADAM, preferiblemente
información estructural de ADAM-H9, en sistemas de
software de modelización molecular prevé el diseño de inhibidores o
agentes de unión útiles en la modulación de la actividad de
ADAM-H9. Un método particular comprende analizar la
estructura tridimensional de polipéptidos ADAM-H9
para detectar sitios de unión probable de sustratos o ligandos,
sintetizar una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo
predictivo y someter a ensayo la nueva molécula tal como se describe
adicionalmente en el presente documento. Se describen ejemplos de
algoritmos, software y métodos para modelar sustratos o agentes de
unión basados en la estructura tridimensional de una proteína en la
publicación PCT WO107579A2.
También es posible aislar un anticuerpo
específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal
como se describe adicionalmente en el presente documento, y después
resolver su estructura cristalina dando así un núcleo farmacéutico
en el que se basa el posterior diseño de fármacos. Es posible evitar
la cristalografía del polipéptido todo junto generando anticuerpos
antiidiotípicos (anti-id) frente a un anticuerpo
funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen especular de
una imagen especular, debe esperarse que el sitio de unión de los
anti-id sea análogo al del receptor original. Podría
entonces usarse el anti-id para identificar y
aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o
biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el
núcleo farmacéutico.
La invención proporciona métodos para
identificar agentes que modulan la expresión o actividad de
ADAM-H9. Tales métodos incluyen poner en contacto
una muestra que contiene un polinucleótido o polipéptido
ADAM-H9 con un agente de prueba en condiciones que
permiten que interaccionen el agente de prueba y el polipéptido o
polinucleótido y medir la actividad o expresión de un polipéptido
ADAM-H9 en presencia o ausencia del agente de
prueba.
En una realización, una célula que contiene un
polinucleótido ADAM-H9 se pone en contacto con un
agente de prueba en condiciones tales que permiten que
interaccionen la célula y el agente de prueba. Tales condiciones
incluyen normalmente condiciones normales de cultivo celular que
concuerdan con el tipo de célula particular que está utilizándose y
que se conocen en la técnica. Puede ser deseable dejar que el agente
de prueba y la célula interaccionen en condiciones asociadas con el
aumento de temperatura o en presencia de reactivos que facilitan la
captación del agente de prueba por la célula. Se trata un control de
manera similar pero en ausencia del agente de prueba.
Alternativamente, puede medirse la expresión o actividad de
ADAM-H9 antes de ponerse en contacto con el agente
de prueba (por ejemplo, la medición habitual o de control) y luego
de nuevo tras el contacto con el agente de prueba. La célula
tratada se compara entonces con el control y una diferencia en la
expresión o actividad de ADAM-H9 comparado con el
control es indicativa de un agente que modula la expresión o
actividad de ADAM-H9.
Cuando se esta midiendo la expresión de
ADAM-H9, puede cuantificarse la detección de la
cantidad de ARNm que codifica para un polipéptido
ADAM-H9 en la célula mediante, por ejemplo, PCR o
transferencia de tipo Northern. Cuando se está midiendo un cambio
en la cantidad de polipéptido ADAM-H9 en la muestra,
puede usarse la detección de ADAM-H9 mediante el
uso de anticuerpos anti-ADAM-H9 para
cuantificar la cantidad de polipéptido ADAM-H9 en
la célula usando técnicas conocidas.
Un agente de prueba puede ser cualquier molécula
usada normalmente en la modulación de la expresión o actividad de
una proteína e incluye, por ejemplo, moléculas pequeñas, productos
químicos, peptidomiméticos, anticuerpos, péptidos, polinucleótidos
(por ejemplo, moléculas de ribozima o antisentido), y similares. Por
consiguiente, pueden someterse a prueba agentes desarrollados
mediante diseño de fármacos basado en ordenador en el laboratorio
usando el ensayo y los métodos descritos en el presente documento
para determinar la actividad del agente en la modulación de la
expresión o actividad de ADAM-H9. La modulación de
ADAM-H9 incluye un aumento o disminución de la
actividad o expresión.
Un polipéptido ADAM-H9 de la
invención (incluyendo fragmentos, variantes, oligómeros y otras
formas) es útil en una variedad de ensayos. Por ejemplo, un
ADAM-H9 de la invención puede usarse para
identificar parejas de unión de miembros de la familia ADAM de
polipéptidos, que también puede usarse para modular la comunicación
intracelular, coestimulación o actividad celular inmunitaria.
Alternativamente, pueden usarse para identificar moléculas de
parejas no de unión o sustancias que modulan la comunicación
intracelular, rutas coestimuladoras o la actividad celular
inmunitaria.
Pueden usarse polipéptidos
ADAM-H9 y fragmentos de los mismos para identificar
parejas de unión. Por ejemplo, pueden someterse a prueba para
determinar la capacidad para unirse a una pareja de unión candidata
en cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo de unión
convencional. Para ilustrar, un polipéptido ADAM-H9
o fragmento del mismo puede marcarse con una molécula detectable
(por ejemplo, un radionúclido, un cromóforo y una enzima que
cataliza una reacción colorimétrica o fluoriométrica y similares).
El polipéptido marcado se pone en contacto con células que expresan
la pareja de unión candidata. Se lavan entonces las células para
eliminar polipéptido marcado no unido, y se determina la presencia
de marcador unido a célula mediante una técnica adecuada, elegida
según la naturaleza del marcador.
En una realización, se identifica una integrina
de pareja de unión mediante el uso de anticuerpos
anti-integrina. La capacidad de los AcM frente a
integrina para inhibir la unión de polipéptidos
ADAM-H9dis-Fc revela qué integrina
se une al dominio desintegrina e indirectamente qué actividades de
unión a integrina puede antagonizar el dominio desintegrina. Los
polipéptidos ADAM-H9dis-Fc que se
unen para seleccionar integrinas se someten a prueba adicionalmente
para determinar la capacidad para perturbar las interacciones
integrina-ligando y para modular la función de las
células endoteliales, angiogénesis y otras actividades biológicas
in vitro e in vivo.
En otro ejemplo de un ensayo de unión, se
transfecta un vector de expresión recombinante que contiene el ADNc
de la pareja de unión candidata en células
CVI-EBNA-1. Se incuban las células
durante 1 hora a 37°C con diversas concentraciones de, por ejemplo,
un polipéptido ADAM-H9 soluble/polipéptido de fusión
de Fc. Se lavan las células y se incuban con una concentración
saturante constante de ^{125}I-IgG de ratón
anti-humana. Tras el lavado, se liberan las células
mediante tripsinización. La IgG de ratón anti-humana
empleada anteriormente se dirige contra la región Fc de la IgG
humana y puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories,
Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se unirá a la parte Fc de
cualquier polipéptido de Fc que se haya unido a las células. Se
cuantifica el ^{125}I-anticuerpo unido a células
en un contador Packard Autogamma.
Cuando un polipéptido ADAM-H9 se
une o potencialmente se une a otro polipéptido (por ejemplo, en una
interacción receptor-ligando), el polinucleótido
ADAM-H9 también puede usarse en ensayos de trampa de
interacción (véase, por ejemplo, Gyuris et al., Cell 75:791,
1993) para identificar polinucleótidos que codifican para el otro
polipéptido con el que se produce la unión o para identificar
inhibidores de la interacción de unión. También pueden usarse
polipéptidos implicados en estas interacciones de unión para
seleccionar inhibidores de molécula pequeña o péptido o agonistas
de la interacción de unión.
Otro tipo de ensayo de unión adecuado es un
ensayo de unión competitiva. Para ilustrar, puede determinarse la
actividad biológica de una variante sometiendo a ensayo la capacidad
de la variante para competir con el polipéptido nativo por unirse a
la pareja de unión candidata. Pueden realizarse ensayos de unión
competitiva mediante la metodología convencional. Los reactivos que
pueden emplearse en ensayos de unión competitiva incluyen una
variante o fragmento de ADAM-H9 radiomarcado y
células intactas que expresan ADAM-H9 (endógeno o
recombinante) en la superficie celular. En lugar de células
intactas, podría sustituirse una pareja de unión soluble
/polipéptido de fusión de Fc unido a una fase sólida a través de la
interacción de polipéptido A o polipéptido G (sobre la fase sólida)
con el resto de Fc. Las columnas de cromatografía que contienen
polipéptido A y G incluyen las disponibles de Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ.
Puede someterse a ensayo la influencia de los
polipéptidos ADAM-H9, fragmentos de
ADAM-H9 y anticuerpos sobre la comunicación
intracelular, coestimulación, unión a integrinas, migración de
células endoteliales, angiogénesis o actividad celular inmunitaria,
poniendo en contacto una célula o grupo de células con un
polinucleótido, polipéptido, agonista o antagonista, para inducir,
potenciar, suprimir o detener la comunicación celular,
coestimulación, unión a integrinas, migración de células
endoteliales, angiogénesis o actividad en las células diana. Puede
realizarse la identificación de polipéptidos
ADAM-H9, agonistas o antagonistas mediante una
variedad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Están
incluidos en tales ensayos los que evalúan la capacidad de un
polipéptido ADAM-H9 para influir en la comunicación
intracelular, coestimulación, unión a integrinas, migración de
células endoteliales o angiogénesis. Un ensayo de este tipo
implicaría, por ejemplo, el análisis de las interacciones
célula-célula (por ejemplo, a través de unión
relacionada con integrinas) en presencia de un polipéptido
ADAM-H9 o fragmento de desintegrina soluble del
mismo. En un ensayo de este tipo, se determinaría una tasa de
interacción célula-célula, interacción
célula-matriz, o unión asociada a integrinas en
presencia de un polipéptido que tiene una secuencia de
ADAM-H9 y después determinar si tal unión o
interacción se altera en presencia de, por ejemplo, una secuencia
de ADAM-H9 con desintegrina soluble
(ADAM-H9dis). Ensayos a modo de ejemplo de este
aspecto de la invención incluyen ensayos de migración endotelial. En
la técnica se conocen otros ensayos.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para detectar la capacidad de un agente de prueba para
afectar la interacción célula-célula, interacción
célula-matriz, actividad de unión asociada a
integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o
actividad angiogénica del agente de prueba en una célula o cultivo.
En este aspecto, el método comprende: (1) poner en contacto un
primer grupo de células diana con un agente de prueba que incluye
un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9
(por ejemplo, las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, o 10; o un resto de
desintegrina de ADAM-H9 soluble), un ligando o
receptor para un polipéptido ADAM-H9, o un
fragmento del mismo, en condiciones apropiadas para el ensayo
particular que se está usando; (2) medir la tasa neta de
interacción célula-célula, interacción
célula-matriz, actividad de unión asociada a
integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad
angiogénica entre las células diana; y (3) observar la tasa neta de
interacción célula-célula, interacción
célula-matriz, actividad de unión asociada a
integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad
angiogénica entre células control que contienen un ligando de
polipéptido ADAM-H9 o fragmentos del mismo, en
ausencia de un agente de prueba, en condiciones de otra manera
idénticas a las del primer grupo de células. En esta realización, la
tasa neta de comunicación intracelular o coestimulación en las
células control se compara con la de las células tratadas tanto con
una molécula de ADAM-H9 como con un agente de
prueba. La comparación proporcionará una diferencia en la tasa neta
de interacción célula-célula, interacción
célula-matriz, actividad de unión asociada a
integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o
actividad angiogénica indicativa de un agente que modula la
actividad de ADAM-H9. El agente de prueba puede
funcionar como un efector mediante o bien activación o bien
regulación por incremento, o bien inhibición o bien regulación por
disminución de la interacción célula-célula,
interacción célula-matriz, unión asociada a
integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad
angiogénica.
Un polipéptido de la invención puede mostrar
actividad de inhibición o producción de citocinas, proliferación
celular (o bien inductora o bien inhibidora), o actividad de
diferenciación celular (o bien inductora o bien inhibidora). Muchos
factores polipeptídicos descubiertos hasta la fecha, incluyendo
todas las citocinas conocidas, han mostrado actividad en uno o más
ensayos de proliferación celular, y por tanto los ensayos sirven
como una confirmación conveniente de la actividad de citocinas. La
actividad de un polipéptido de la invención se pone en evidencia
mediante uno cualquiera de una variedad de ensayos de proliferación
celular dependientes de factor rutinarios para líneas celulares que
incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3,
MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2,
TF-1, Mo7e y CMK. La actividad de un polipéptido
ADAM-H9 de la invención puede medirse mediante los
siguientes métodos:
Los ensayos para determinar la proliferación de
células T o timocitos incluyen, sin limitación, los descritos en:
Current Protocols in Immunology, Ed. por Coligan et al., Pub.
Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience
(Capítulo 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986;
Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706, 1990; Bertagnolli
et al., Cell. Im-
munol. 133:327,1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756, 1994.
munol. 133:327,1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756, 1994.
Los ensayos para determinar la producción de
citocinas y/o proliferación de células de bazo, células de ganglio
linfático o timocitos incluyen, sin limitación, los descritos en:
Policlonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. y Shevach, Vol. 1
págs. 3.12.1-3.12.14, y Measurement of mouse and
human Interferon \gamma, Schreiber, R. D. Vol. 1 págs.
6.8.1-6.8.8. en Current Protocols in Immunology. E.
M. Coligan eds. John Wiley and Sons, Toronto. 1994; Coligan eds.,
John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Los ensayos para determinar la proliferación y
diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas
incluyen, sin limitación, los descritos en: Measurement of Human and
Murine Interleukin 2 y Interleukin 4, Bottomly et al., en
Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs.
6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991;
de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205, 1991; Moreau et
al., Nature 336:690, 1988; Greenberger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931, 1983; Measurement of mouse and
human interleukin 6, Nordan, R. en Current Protocols in Immunology.
Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.6.1-6.6.5, John Wiley
and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A.83:1857, 1986; Measurement of human Interleukin 11,
Bennett et al., en Current Protocols in Immunology. Coligan
eds. Vol. 1 págs. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991;
Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta et
al., en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1
págs. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991.
Los ensayos para determinar respuestas de clones
de células T frente a antígenos (que identificarán, entre otros,
polipéptidos que afectan las interacciones
APC-célula T así como efectos de células T directos
midiendo la proliferación y producción de citocinas) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology,
Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (Capítulo 3, In vitro
assays for Mouse Lymphocyte Function; Capítulo 6, Cytokines and
their cellular receptors; Capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:6091, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:405,
1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986; Takai et
al., J. Immunol. 140:508, 1988.
Los ensayos para determinar la citotoxicidad de
timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación, Current
Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience (In vitro
assays for Mouse Lymphocyte Function págs. 3.1-3.19;
Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488,1981; Herrmann et al., J.
Immunol. 128:1968, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564,
1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986; Takai et
al., J. Immunol. 140:508, 1988; Bowman et al., J. Virol.
61:1992; Bertagnolli et al., Cell. Imm. 133:327, 1991; Brown
et al., J. Immun. 153:3079, 1994.
Los ensayos para determinar respuestas de IgG
dependientes de células T y cambio de isotipo (que identificarán,
entre otros, polipéptidos que modulan las respuestas de anticuerpos
dependientes de células T y que afectan a los perfiles de Th1/Th2)
incluyen, sin limitación, los descritos en: Maliszewski, J. Immunol.
144:3028, 1990; y Assays for B cell function: In vitro
antibodies production, Mond, J. J. y Brunswick, M. en Current
Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs.
3.8.1-3.8.16, Wiley and Sons, Toronto. 1994.
Los ensayos de reacción mixta de linfocitos
(MLR) (que identificará, entre otros, polipéptidos que
predominantemente generan respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology,
Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (In vitro assays for Mouse
Lymphocyte Function págs. 3.1-3.19; Capítulo 7,
Immunologic studies in Humans); Takai et al., 1986, citado
anteriormente; Takai et al., 1988, citado anteriormente;
Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778, 1992.
Los ensayos dependientes de células dendríticas
(que identificarán, entre otros, polipéptidos expresados por
células dendríticas que activan células T vírgenes) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Guery et al., J. Immunol.
134:536, 1995; Inaba et al., J. of Exp. Med. 173:549, 1991;
Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071, 1995; Porgador et
al., J. of Exp. Med.182:255, 1995; Nair et al., J. Virol.
67:4062, 1993; Huang et al., Science 264:961, 1994;
Macatonia et al., J. of Exp. Med. 169:1255, 1989; Bhardwaj
et al., J. Clin. Invest. 94:797, 1994; e Inaba et
al., J. of Exp. Med. 172:631, 1990.
Los ensayos para determinar la
apoptosis/supervivencia de linfocitos (que identificarán, entre
otros, polipéptidos que evitan la apóptosis tras la inducción de
superantígeno y polipéptidos que regulan la homeostasis de
linfocitos) incluyen, sin limitación, los descritos en:
Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795, 1992; Gorczyca et
al., Leukemia 7:659, 1993; Gorczyca et al., Cancer
Research 53:1945, 1993; Itoh et al., Cell 66:233, 1991;
Zacharchuk, J. Immunol. 145:4037, 1990; Zamai et al.,
Cytometry 14:891, 1993; Gorczyca et al., Int. J. of Oncology
1:639, 1992.
Los ensayos para determinar polipéptidos que
influyen las etapas tempranas de compromiso y desarrollo de células
T incluyen, sin limitación, los descritos en: Antica et al.,
Blood 84:111, 1994; Fine et al., Cell. Immunol. 155:111,
1994; Galy et al., Blood 85:2770, 1995; Toki et al.,
Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:7548, 1991.
Los ensayos para determinar la diferenciación de
células madre embrionarias (que identificarán, entre otros,
polipéptidos que influyen en la hematopoyesis de la diferenciación
embrionaria) incluyen, sin limitación, los descritos en: Johansson
et al Cell. Biol. 15:141, 1995; Keller et al., Mol.
and Cell. Biol. 13:473, 1993; McClanahan et al., Blood
81:2903, 1993.
Los ensayos para determinar la diferenciación y
supervivencia de células madre (que identificarán, entre otros,
polipéptidos que regulan la linfohematopoyesis) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Methylcellulose colony forming
assays, Freshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I.
Freshney, et al. eds. Vol. págs. 265-268,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Hirayama
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony
forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. y
Briddell, R. A. en Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney,
et al. eds. Vol. págs. 23-39,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Neben
et al., Exp. Hematol. 22:353, 1994;
Cobble-stone area forming cell assay, Ploemacher,
en Culture of Hematopoietic Cells. Freshney, et al. eds. Vol.
págs. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva
York, N.Y. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of
stromal cells, Spooncer et al. en Culture of Hematopoietic
Cells. Freshney, et al. eds. Vol. págs.
163-179, Wiley-Liss, Inc., Nueva
York, N.Y. 1994; Long term culture initiating cell assay,
Sutherland, en Culture of Hematopoietic Cells. Freshney, et
al. eds. Vol. págs.139-162,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994.
Los ensayos para determinar de actividad de
generación tisular incluyen, sin limitación, los descritos en:
publicación de patente número WO95/16035 (hueso, cartílago, tendón);
publicación de patente número WO95/05846 (nervio, neuronal);
publicación de patente número WO91/07491 (piel, endotelio). Los
ensayos para determinar la actividad de cicatrización de heridas
incluyen, sin limitación, los descritos en: Winter, Epidermal Wound
Healing, págs. 71-112 (Maibach, y Rovee, eds.), Year
Book Medical Publishers, Inc., Chicago, modificado por Eaglstein y
Mertz, J. Invest. Dermatol 71:382-84 (1978).
Los ensayos para determinar la actividad de
activina/inhibina incluyen, sin limitación, los descritos en: Vale
et al., Endocrinol. 91:562, 1972; Ling et al., Nature
321:779, 1986; Vale et al., Nature 321:776, 1986; Mason
et al., Nature 318:659, 1985; Forage et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:3091, 1986.
Los ensayos para determinar la adhesión y
movimiento celular incluyen, sin limitación, los descritos en:
Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience
(Capítulo 6.12, Measurement of \alpha and \beta Chemokines
6.12.1-6.12.38; Taub et al. J. Clin. Invest.
95:1370-1376, 1995; Lind et al. APMIS
103:140, 1995; Muller et al. Eur. J. Immunol. 25: 1744;
Gruber et al. J. Immunol. 152:5860, 1994; Johnston et
al. J. Immunol. 153: 1762, 1994.
Los ensayos para determinar la actividad
hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, los descritos
en: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131, 1986; Burdick
et al., Thrombosis Res. 45:413,1987; Humphrey et al.,
Fibrinolysis 5:71, 1991; Schaub, Prostaglandins 35:467, 1988.
Los ensayos para determinar la actividad de
receptor-ligando incluyen, sin limitación, los
descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub.
Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience
(Capítulo 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static
conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864, 1987; Bierer et al., J.
Exp. Med. 168:1145, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med.
169:149, 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods
175:59, 1994; Stitt et al., Cell 80:661, 1995.
Los ensayos para determinar la actividad
supresora invasiva y adhesiva de cadherina incluyen, sin limitación,
los descritos en: Hortsch et al. J Biol. Chem.
270(32):18809, 1995; Miyaki et al. Oncogene 11: 2547,
1995; Ozawa et al. Cell 63:1033, 1990. Puede usarse un
polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una
secuencia de ADAM-H9 proporcionada por la invención
para numerosos fines de diagnóstico u otros fines útiles. Un
polinucleótido de la invención (por ejemplo, las SEQ ID NO:2, 5, 7,
o 9) puede usarse como marcadores para tejidos en los que el
polipéptido correspondiente se expresa preferentemente, como
marcadores de peso molecular en geles tipo Southern, como
marcadores cromosómicos o como etiquetas para identificar cromosomas
o para mapear posiciones génicas relacionadas, para comparar con
secuencias de ADN endógenas en sujetos para identificar trastornos
genéticos potenciales, como sondas para hibridar y descubrir así
polinucleótidos relacionados novedosos, como una fuente de
información para derivar cebadores de PCR para la identificación
mediante la huella dactilar genética, como una sonda para
"restar" polinucleótidos conocidos en el proceso de
descubrimiento de otros ácidos nucleicos novedosos, como un
antígeno para producir anticuerpos anti-ADN o
provocar otra respuesta inmunitaria, y para terapia génica.
Sondas y cebadores. Entre los usos de los
polipéptidos ADAM-H9 descritos, y combinaciones de
fragmentos de los mismos, está el uso de fragmentos como sondas o
cebadores. Tales fragmentos comprenden generalmente al menos
aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En
otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o
al menos 60 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Los
parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de
hibridación y la orientación para concebir condiciones adecuadas se
exponen por Sambrook et al., 1989 y se describieron en
detalle anteriormente. Usando el conocimiento del código genético
junto con las secuencias de aminoácidos expuestas anteriormente,
pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Tales
oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en las que se aíslan
fragmentos de ADN y se amplifican. En ciertas realizaciones, pueden
usarse cebadores degenerados como sondas para bibliotecas genéticas
no humanas. Tales bibliotecas incluirán, pero no se limitan a
bibliotecas de ADNc, bibliotecas genómicas e incluso bibliotecas de
ADN o EST (etiqueta de secuencia expresada) electrónicas. Se usarán
entonces las secuencias homólogas identificadas mediante este
método como sondas para identificar homólogos no humanos de la
secuencia de ADAM-H9 identificada en el presente
documento.
Mapeo cromosómico. Los polinucleótidos que
codifican para polipéptidos ADAM-H9, y los
fragmentos y combinaciones descritos de estos polinucleótidos,
pueden usarse por los expertos en la técnica usando técnicas
conocidas para identificar el cromosoma humano en el que se mapean
estas secuencias. Técnicas útiles incluyen, pero no se limitan a,
usar la secuencia o partes, incluyendo oligonucleótidos, como una
sonda en varias técnicas conocidas tales como mapeo de híbridos de
radiación (alta resolución), hibridación in situ con
extensiones cromosómicas (resolución moderada), e hibridación de
tipo Southern para hibridar líneas celulares que contienen
cromosomas humanos individuales (baja resolución). El siguiente
sitio web proporciona información adicional sobre el mapeo de
híbridos de radiación:
www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/humanSTSreleases/july97/07-97.INTRO.html.
Un polinucleótido que codifica para un
polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 de la
invención, y los fragmentos y combinaciones descritos de estos
polinucleótidos puede usarse para analizar anomalías asociadas con
los genes correspondientes a polipéptidos ADAM-H9.
Esto permite distinguir condiciones en las que este marcador se
reordena o deleciona. Además, pueden usarse polinucleótidos de la
invención o un fragmento de los mismos como un marcador posicional
para mapear otros genes de ubicación desconocida. El polinucleótido
puede usarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno
mediado (directa o indirectamente) por cantidades deficientes o
insuficientes de genes (por ejemplo, un trastorno asociado a
ADAM-H9) correspondientes a los polinucleótidos de
la invención. Los polinucleótidos y secuencias asociadas descritos
en el presente documento permiten la detección de genes
defectuosos, y la sustitución de los mismos por genes normales.
Pueden detectarse genes defectuosos en ensayos de diagnóstico in
vitro, y comparando las secuencias de polinucleótido descritas
en el presente documento con las de un gen derivado de un sujeto del
que se sospecha que alberga un defecto en su gen o que tiene un
trastorno asociado a ADAM-
H9.
H9.
Los usos de polipéptidos ADAM-H9
y fragmentos peptídicos de los mismos incluyen, pero no se limitan
a, los siguientes: agentes de administración; reactivos de
investigación y terapéuticos; marcadores de peso molecular e
isoelectroenfoque; controles para la fragmentación peptídica;
identificación de polipéptidos desconocidos; y preparación de
anticuerpos.
Los polipéptidos ADAM-H9
descritos y/o reivindicados en el presente documento (por ejemplo,
las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10) de la invención pueden usarse
como reactivos de purificación de polipéptidos. Por ejemplo, los
polipéptidos ADAM-H9 pueden unirse a un material de
soporte sólido y usarse para purificar sus parejas de unión (por
ejemplo, una molécula de integrina) mediante cromatografía de
afinidad. En realizaciones particulares, se une un polipéptido a un
soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como ejemplo,
están disponibles columnas de cromatografía que contienen grupos
funcionales que reaccionarán con cadenas laterales de aminoácidos
de los polipéptidos (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). En
una alternativa, se une un polipéptido
ADAM-H9-Fc a columnas de
cromatografía que contienen polipéptido A o polipéptido G mediante
interacción con el resto Fc. El polipéptido también encuentra uso
para purificar o identificar células que expresan una pareja de
unión en la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase
sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un
sustrato adecuado similar. Por ejemplo, pueden recubrirse
microesferas magnéticas con los polipéptidos y mantenerlos en un
recipiente de incubación a través de un campo magnético. Se ponen en
contacto suspensiones de mezclas celulares que contienen células
que expresan la pareja de unión con la fase sólida que tiene los
polipéptidos en ella. Las células que expresan la pareja de unión en
la superficie celular se unen a los polipéptidos sobre la fase
sólida, y después se eliminan por lavado las células no unidas.
Alternativamente, los polipéptidos pueden conjugarse con un resto
detectable, después incubarse con células que van a someterse a
prueba para determinar la expresión de la pareja de unión. Tras la
incubación, se elimina la materia marcada no unida y se determina
la presencia o ausencia del resto detectable en las células.
Vehículos y agentes de administración. Los
polipéptidos también encuentran uso como vehículos para administrar
agentes unidos a los mismos a células que portan parejas de unión
identificadas (por ejemplo, una integrina). Por tanto, los
polipéptidos pueden usarse para administrar agentes terapéuticos o
de diagnóstico a tales células en procedimientos in vitro o
in vivo. Agentes terapéuticos y detectables (de diagnóstico)
que pueden unirse a un polipéptido incluyen, pero no se limitan a,
toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos, radionúclidos,
cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o
fluorométrica, y similares, eligiéndose el agente particular según
la aplicación pretendida. Entre las toxinas están ricina, abrina,
toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa,
polipéptidos inactivantes ribosómicos, micotoxinas tales como
tricotecenos, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas
sencillas) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para uso
diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I,
^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Los ejemplos de radionúclidos
adecuados para uso terapéutico son ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br,
^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd,
^{64}Cu y ^{67}Cu. Tales agentes pueden unirse al polipéptido
mediante cualquier procedimiento adecuado. El polipéptido comprende
grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos que
pueden reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para
formar por ejemplo, enlaces covalentes. Alternativamente, el
polipéptido o agente puede derivatizarse para generar o unir un
grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar
la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales
disponibles para unir diversas moléculas a polipéptidos (Pierce
Chemical Company, Rockford, Illinois). Son de particular interés
las desintegrinas de ADAM-H9 solubles que pueden
usarse para dirigir células que expresan una pareja de unión para
el resto de desintegrina de ADAM-H9 (por ejemplo,
una integrina). Tales desintegrinas de ADAM-H9
solubles pueden usarse para dirigir reactivos a células que
expresan, por ejemplo, la integrina análoga de la desintegrina. De
manera similar, y tal como se describe con más detalle a
continuación, pueden marcarse anticuerpos específicos para un
polipéptido ADAM-H9 con un agente terapéutico o de
diagnóstico y usarse para dirigir el agente terapéutico o de
diagnóstico a células que expresan un polipéptido
ADAM-H9.
Pueden emplearse polipéptidos
ADAM-H9 y fragmentos de ADAM-H9 (por
ejemplo, fragmentos que tienen actividad desintegrina) para modular
una actividad biológica de un polipéptido ADAM, particularmente un
polipéptido ADAM-H9, en procedimientos in
vitro o in vivo. Están englobados dentro de la invención
los dominios de polipéptido ADAM-H9 que actúan como
moduladores de la función del polipéptido ADAM nativo, incluyendo la
actividad de ADAM-H9 nativo, cuando se expresan
como fragmentos o como componentes de polipéptidos de fusión. Por
ejemplo, puede usarse un dominio polipeptídico sustancialmente
purificado de la invención para inhibir la unión de un polipéptido
ADAM-H9 a parejas de unión endógenas. Tal uso
bloquearía eficazmente las interacciones de ADAM-H9
e inhibiría las actividades de ADAM-H9. En todavía
otro aspecto de la invención, se usa una forma soluble de una
pareja de unión de ADAM-H9 (por ejemplo, un dominio
integrina soluble) para unirse a, e inhibir competitivamente la
activación del polipéptido ADAM-H9 endógeno.
En otra realización, la invención se refiere a
métodos para inhibir la unión de una integrina a su ligando, e
inhibir así la actividad biológica de la integrina, que comprende
poner en contacto la integrina con una cantidad eficaz de un
polipéptido ADAM-H9dis. La invención se refiere
además a métodos para inhibir la migración de células endoteliales
y métodos para inhibir la angiogénesis que comprenden administrar
una cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9dis.
En algunas realizaciones el polipéptido ADAM-H9dis
está en la forma de un multímero, preferiblemente un multímero de
cremallera de leucina o polipéptido de Fc. Alternativamente, pueden
administrarse polipéptidos ADAM-H9 sustancialmente
purificados o modificados de la invención para modular las
interacciones entre polipéptidos ADAM-H9 y parejas
de unión a ADAM-H9 que no están unidos a la
membrana.
Los anticuerpos que se unen a polipéptidos
ADAM-H9 pueden inhibir la actividad del polipéptido
ADAM-H9 y pueden actuar como antagonistas. Por
ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen específicamente a uno
o más epítopos de un polipéptido ADAM-H9, o epítopo
de variantes conservadas de polipéptidos ADAM-H9 o
fragmentos, para inhibir la actividad de ADAM-H9.
Por "unirse específicamente" se quiere decir que un anticuerpo
frente a un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del
mismo no reaccionará de manera cruzada con polipéptidos no
relacionados. Preferiblemente un anticuerpo de este tipo no
reaccionará de manera cruzada con otros miembros de la familia
ADAM.
En un aspecto alternativo, la invención engloba
además el uso de agonistas de la actividad de
ADAM-H9 para tratar o mejorar los síntomas de una
enfermedad para la cual es beneficioso el aumento de la actividad
desintegrina. En un aspecto preferido, la invención supone
administrar composiciones que comprenden un polinucleótido
ADAM-H9 (por ejemplo, que comprende las SEQ ID NO
5,7 o 9) o fragmento del mismo o un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 (por ejemplo,
las SEQ ID NO 6, 8 o 10) o un fragmento del mismo. La administración
puede ser a células in vitro, a células ex vivo, a
células in vivo, y/o a organismos multicelulares. Las formas
terapéuticas preferidas incluyen formas solubles de un
ADAM-H9 que tiene actividad desintegrina. Una
desintegrina de ADAM-H9 soluble de este tipo se
unirá a su pareja de unión (por ejemplo, una integrina) y estimulará
una actividad biológica asociada con la pareja de unión.
Todavía en otro aspecto de la invención, las
composiciones comprenden administrar un polinucleótido que codifica
para un polipéptido ADAM-H9 para la expresión en un
organismo huésped para el tratamiento de enfermedades.
Particularmente preferida, a este respecto, es la expresión en un
sujeto humano para el tratamiento de una disfunción asociada con la
actividad endógena aberrante (por ejemplo, disminuida) de un
polipéptido ADAM-H9. Además, la invención engloba
la administración de compuestos que se encuentra que aumentan la
actividad endógena de polipéptidos que tienen una secuencia de
aminoácidos de ADAM-H9 a células y/u organismos. Un
ejemplo de compuestos que aumentan la actividad del polipéptido
ADAM-H9 son anticuerpos que se unen a polipéptidos
ADAM-H9, preferiblemente anticuerpos monoclonales,
y aumentan o estimulan la actividad del polipéptido
ADAM-H9 produciendo señalización intracelular
constitutiva (o "imitación de ligandos"), o evitando la unión
de un inhibidor nativo de la actividad del polipéptido
ADAM-H9.
Debido a la multiplicidad e interconexión de las
rutas e interacciones biológicas, un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, variante, antagonista,
agonista, anticuerpo y pareja de unión de la invención puede ser
útil para tratar estados médicos y enfermedades asociados con
interacciones célula-célula y
célula-matriz (por ejemplo, trastornos mediados por
integrinas), migración endotelial, angiogénesis, inflamación,
cáncer, alergia, estados reproductores, neurológicos y vasculares
tal como se describen adicionalmente en el presente documento. La
molécula o moléculas terapéuticas que van a usarse dependerán de la
etiología del estado que va a tratarse y las rutas biológicas
implicadas, y se considerará que diferentes variantes, antagonistas,
y parejas de unión de los polipéptidos ADAM-H9
pueden tener efectos similares o diferentes. Por ejemplo, un
polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo puede
actuar como un antagonista de una función de procesamiento proteico
de metaloproteinasas (por ejemplo, de otros miembros de la familia
ADAM de polipéptidos) interaccionando con un pareja de unión de
ADAM y evitando la actividad de la metaloproteinasa sobre su
sustrato. En consecuencia, un ADAM-H9 puede modular
el procesamiento proteico, tal como la liberación de factores de
crecimiento, proteínas de adhesión y factores inflamatorios.
Los polipéptidos ADAM-H9
descritos, fragmentos de los mismos, anticuerpos, composiciones y
terapias de combinación descritos en el presente documento son
útiles en medicamentos para tratar infecciones bacterianas, víricas
o protozoarias, y las complicaciones que resultan de las mismas. Se
pueden tratar trastornos cardiovasculares con los polipéptidos
ADAM-H9 descritos, fragmentos de los mismos,
anticuerpos, composiciones farmacéuticas o terapias de combinación,
incluyendo aneurismas aórticos; arteritis; oclusión vascular;
complicaciones de cirugía de derivación coronaria; lesión por
isquemia/reperfusión; enfermedad cardíaca; insuficiencia cardíaca e
infarto de miocardio. Además, pueden usarse los polipéptidos
ADAM-H9, fragmentos de los mismos, anticuerpos,
composiciones y terapias de combinación de la invención para tratar
estados de dolor crónico, para tratar diversos trastornos del
sistema endocrino, estados del sistema gastrointestinal, trastornos
del sistema genitourinario, y anemias y trastornos
hematológicos.
Debido al papel de las integrinas (por ejemplo,
integrinas a_{v}b_{3}, a_{v}b_{5}, b_{1}, b_{4},
a_{1}, a_{2}, a_{3}, a_{4}, a_{5} y a_{6}) en trastornos
proliferativos celulares, incluyendo cáncer y metástasis de células
cancerígenas, también se proporcionan en el presente documento
métodos para usar los polipéptidos ADAM-H9,
fragmentos de los mismos (particularmente los que comprenden un
dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), anticuerpos,
composiciones o terapias de combinación para tratar diversos
trastornos hematológicos y oncológicos. Por ejemplo, pueden usarse
dominios desintegrina de ADAM-H9 soluble para
tratar diversas formas de cáncer, incluyendo leucemia mielógena
aguda, carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de
Epstein-Barr, glioma, cáncer de colon, estómago,
próstata, de células renales, cervicouterino y de ovario, cáncer de
pulmón (CPCP y CPCNP), incluyendo caquexia asociada al cáncer,
fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e
hipercalcemia, modulando las interacciones asociadas a
integrinas.
Enfermedades adicionales que pueden tratarse con
los polipéptidos, fragmentos, anticuerpos, composiciones o terapias
de combinación de la invención son tumores sólidos, incluyendo
sarcoma, osteosarcoma, y carcinoma, tales como adenocarcinoma (por
ejemplo, cáncer de mama) y carcinoma de células escamosas. La
administración de un dominio desintegrina de
ADAM-H9 soluble puede modular interacciones
célula-célula y célula-matriz de
tales células tumorales y/o modular la angiogénesis y el riego
sanguíneo a tales tumores.
Además, los polipéptidos
ADAM-H9, fragmentos de los mismos, composiciones o
terapias de combinación son útiles para tratar la leucemia,
incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda o
crónica y leucemia de células pilosas. Otros tumores malignos con
potencial metastásico invasivo que pueden tratarse con los
polipéptidos ADAM-H9, fragmentos, anticuerpos,
composiciones y terapias de combinación, incluyen mieloma múltiple,
diversos trastornos linfoproliferativos tales como síndrome
linfoproliferativo autoinmune (SLPA), leucemia linfoblástica
crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfática crónica,
linfoma de células T periférico, linfoma linfocítico pequeño,
linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt,
linfoma de células T positivo para el virus de
Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de
Hodgkin, linfoma difuso agresivo, leucemias linfáticas agudas,
enfermedad linfoproliferativa T-gamma, linfoma
cutáneo de células B, linfoma cutáneo de células T (es decir,
micosis fungoides), y síndrome de Sézary.
Puede administrarse una combinación de al menos
un polipéptido ADAM-H9, fragmento del mismo, o un
anticuerpo, y uno o más factores antiangiogénesis adicionales u
otro(s) agente(s) terapéutico(s) al sujeto.
El/los agente(s) terapéutico(s) adicional(es)
pueden administrarse antes de, o de manera concurrente con, o tras
la administración del polipéptido ADAM-H9,
fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio
ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo. Es
particularmente ventajoso el uso de más de un agente terapéutico
cuando el sujeto que se está tratando tiene un tumor sólido. En
algunas realizaciones de la invención, el tratamiento comprende
además tratar al mamífero con radiación. La radiación, incluyendo
braquiterapia y teleterapia, puede administrarse antes de, de
manera concurrente con, o tras la administración del polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 y/o agente(s) terapéutico(s)
adicional(es).
El método incluye la administración de, además
de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo
(particularmente los que comprenden un dominio
ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno
o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en
agentes de alquilación, antimetabolitos, alcaloides de la vinca y
otros quimioterápicos de origen vegetal, antibióticos antitumorales,
enzimas antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, análogos de
platino, supresores adrenocorticales, hormonas y antihormonas,
anticuerpos, agentes inmunoterápicos, agentes radioterápicos y
modificadores de la respuesta biológica.
El método incluye además la administración de,
además de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del
mismo (particularmente los que comprenden un dominio
ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno
o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en
cisplatino, ciclofosfamida, mecloretamina, melfalán, bleomicina,
carboplatino, fluorouracilo, 5-fluorodesoxiuridina,
metotrexato, taxol, asparaginasa, vincristina, y vinblastina,
linfocinas y citocinas tales como interleucinas, interferones
(\alpha, \beta o \delta) y TNF, clorambucilo, busulfano,
carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, dacarbazina,
citarabina, mercaptopurina, tioguanina, vindesina, etopósido,
tenipósido, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina,
plicamicina, mitomicina, L-asparaginasa,
hidroxiurea, metilhidrazina, mitotano, tamoxifeno, fluoximesterona,
inhibidores de IL-8, angiostatina, endostatina,
kringle 5, angiopoyetina 2 u otros antagonistas de angiopoyetina 1,
antagonistas del factor activador de las plaquetas, antagonistas del
factor de crecimiento de fibroblastos básico e inhibidores de
COX-2.
El método también incluye la administración de,
además de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del
mismo (particularmente los que comprenden un dominio
ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno
o más polipéptidos terapéuticos, incluyendo formas solubles de los
mismos, seleccionado del grupo que consiste en ligando Flt3 (véase
la patente estadounidense número 5.554.512), ligando CD40 (véase la
patente estadounidense número 5.716.805), IL-2,
IL-12, ligando 4-1BB (véase la
patente estadounidense número 5.674.704), anticuerpos
anti-4-1BB, TRAIL (véase la patente
estadounidense número 5.763.223), antagonistas de TNF y antagonistas
del receptor de TNF (TNFR) incluyendo TNFR/Fc, antagonistas de Tek
(véase la publicación PCT número WO 00/75323, 14 de diciembre de
2000), antagonistas de TWEAK y antagonistas de
TWEAK-R (véanse las patentes estadounidenses con
números de serie 60/172.878 y 60/203.347 y Feng et al., Am.
J. Pathol. 156(4):1253) incluyendo
TWEAK-R/Fc, antagonistas de VEGF incluyendo
anticuerpos anti-VEGF, antagonistas del receptor de
VEGF (incluyendo VEGFR1 y VEGF-R2, también
conocidos como Flt1 y Flkl o KDR), proteínas de unión a CD148
(también denominadas como DEP-1, ECRTP, y PTPRJ,
véase Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol.
10:2135-45, 1999; y publicación PCT número WO
00/15258, 23 de marzo de 2000), y antagonistas de nectina 3 (véase,
Satoh-Horikawa et al., J. Biol. Chem.
275(14):10291, 2000; los números de registro Genbank de las
secuencias de polipéptido y ácido nucleico de nectina 3 humana son
AF282874 y AAF97597, respectivamente).
En algunas realizaciones preferidas, se usa un
polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo
(particularmente los que comprenden un dominio
ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de
ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo de
la invención como componente de, o en combinación con, "terapia
metronómica", tal como la descrita por Browder et al. y
Klement et al. (Cancer Research 60:1478, 2000; J. Clin.
Invest. 105(8):R15, 2000; véase también Barinaga, Science
288:245, 2000).
Se describen y/o reivindican en el presente
documento compuestos, composiciones y métodos para tratar un sujeto,
preferiblemente un sujeto mamífero, y lo más preferiblemente un
sujeto humano, que padece un trastorno médico, y en particular un
trastorno asociado a ADAM-H9. Tales trastornos
asociados a ADAM-H9 incluyen estados provocados
(directa o indirectamente) o agravados por la unión entre un
polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 (por
ejemplo, las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10) y su pareja de unión (por
ejemplo, una integrina). Para los fines de esta descripción, los
términos "dolencia", "enfermedad", "trastorno",
"estado médico", "estado anómalo" y similares se usan de
manera intercambiable con el término "trastorno médico". Los
términos "tratar", "que trata", y "tratamiento"
usados en el presente documento incluyen tratamiento curativo,
preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo o de mejora.
Para tales usos terapéuticos, pueden administrarse polipéptidos
ADAM-H9 y fragmentos, polinucleótidos de
ADAM-H9 que codifican para un polipéptido
ADAM-H9, y/o agonistas o antagonistas del
polipéptido ADAM-H9 tales como anticuerpos, al
sujeto que lo necesita a través de medios conocidos. Las
composiciones de la invención pueden contener un polipéptido en
cualquier forma descrita en el presente documento, tales como
polipéptidos nativos, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos
biológicamente activos. En realizaciones particulares, la
composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que
comprende polipéptidos ADAM-H9 solubles (por
ejemplo, un dominio desintegrina de ADAM-H9
soluble).
En la puesta en práctica del método de
tratamiento o uso de la invención, se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de la invención a
un sujeto que tiene un estado que va a tratarse, preferiblemente
para tratar o mejorar enfermedades asociadas con la actividad de un
polipéptido ADAM-H9. "Agente terapéutico"
incluye sin limitación cualquier polipéptido
ADAM-H9, fragmento, y variante; polinucleótido que
codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento, y
variante; agonistas o antagonistas del un polipéptido
ADAM-H9 tales como anticuerpos; una pareja de unión
al polipéptido ADAM-H9; complejos formados a partir
de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante y
pareja de unión, y similares. Tal como se usa en el presente
documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz"
significa la cantidad total de cada agente terapéutico u otro
componente activo de la composición farmacéutica o método que es
suficiente para mostrar un beneficio significativo para el sujeto,
por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o mejoría del estado
médico relevante, o un aumento en la velocidad de tratamiento,
curación, prevención o mejoría de tales estados. Cuando se aplica a
un agente terapéutico o principio activo individual, administrado
solo, el término se refiere a ese componente solo. Cuando se aplica
a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de
los componentes que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se
administren en combinación, en serie o simultáneamente. Tal como se
usa en el presente documento, la frase "administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa que
el sujeto se trata con dicho agente terapéutico en una cantidad y
durante un tiempo suficiente para inducir una mejora, y
preferiblemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que
refleja la gravedad del trastorno. Una mejora se considera
"sostenida" si el sujeto muestra la mejora en al menos dos
ocasiones separadas por una o más semanas. Se determina el grado de
mejora basándose en signos o síntomas, y las determinaciones
también pueden emplear cuestionarios que se distribuyen al sujeto,
tales como cuestionarios sobre la calidad de vida. Pueden evaluarse
diversos indicadores que reflejan el grado de la dolencia del sujeto
para determinar si la cantidad y momento del tratamiento son
suficientes. Se establece el valor inicial para el indicador o
indicadores elegidos mediante el examen del sujeto antes de la
administración de la primera dosis del agente terapéutico.
Preferiblemente, el examen inicial se realiza en un plazo de
aproximadamente 60 días anteriores a la administración de la
primera dosis. Si se está administrando el agente terapéutico para
tratar síntomas agudos, la primera dosis se administra lo antes
posible en la práctica tras producirse la lesión. Se induce la
mejora administrando agentes terapéuticos tales como un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 hasta que el sujeto manifiesta una mejora
con respecto al nivel inicial para el indicador o indicadores
elegidos. En el tratamiento de estados crónicos, se obtiene este
grado de mejora mediante la administración repetida de este
medicamento durante un periodo de al menos un mes o más, por
ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más tiempo, o
indefinidamente. Con frecuencia es suficiente un periodo de una a
seis semanas, o incluso una única dosis, para tratar estados
agudos. Aunque puede parecer que el grado de la dolencia de un
sujeto ha mejorado tras el tratamiento según uno o más indicadores,
el tratamiento puede continuarse indefinidamente al mismo nivel o a
una dosis o frecuencia reducida. Una vez que se ha reducido o
interrumpido el tratamiento, puede reanudarse más tarde al nivel
original si los síntomas vuelven a aparecer.
Un experto en la técnica reconocerá que las
dosificaciones adecuadas variarán, dependiendo de factores tales
como la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse, el
peso corporal, edad, estado general y dolencias y/o tratamientos
previos del sujeto, y la vía de administración. Pueden determinarse
las dosis preliminares según pruebas con animales, y la ampliación
a escala de dosificaciones para administración a seres humanos se
realiza según prácticas aceptadas en la técnica tales como ensayos
de dosificación convencionales. Por ejemplo, puede estimarse
inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de
cultivo celular. La dosificación dependerá de la actividad
específica del compuesto y puede determinarse fácilmente mediante
experimentación de rutina. Puede formularse una dosis en modelos
animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma
circulante que incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del
compuesto de prueba que consigue una inhibición que es la mitad de
la máxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular,
mientras se minimizan las tonicidades. Puede usarse tal información
para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos. En
última instancia, el médico que atiende decidirá la cantidad de
polipéptido de la invención con la que tratar a cada sujeto
individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará dosis
bajas del polipéptido de la invención y observará la respuesta del
sujeto. Pueden administrarse dosis mayores del polipéptido de la
invención hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el
sujeto, y en ese punto la dosis no se aumenta más. Se contempla que
las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en
práctica el método de la invención deben contener de
aproximadamente 0,01 ng a aproximadamente 100 mg (preferiblemente
de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 10 mg, más
preferiblemente de aproximadamente 0,1 microgramos a
aproximadamente 1 mg) de un polipéptido de la invención por kg de
peso corporal. En una realización de la invención, se administra un
polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja
de unión a ADAM-H9 una vez a la semana para tratar
los diversos trastornos médicos descritos en el presente documento.
En otra realización, se administra un polipéptido, fragmento,
anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9, al menos
dos veces a la semana y en otra realización al menos tres veces a
la semana. Si se inyecta, la cantidad eficaz de un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 por dosis de adulto oscila desde
1-20 mg/m^{2}, y es preferiblemente de
aproximadamente 5-12 mg/m^{2}. Alternativamente,
puede administrarse una dosis uniforme cuya cantidad puede oscilar
desde 5-100 mg/dosis. Los intervalos de dosis a modo
de ejemplo para una dosis uniforme que va a administrarse mediante
inyección subcutánea son de 5-25 mg/dosis,
25-50 mg/dosis y 50-100 mg/dosis.
En una realización de la invención, se tratan las diversas
indicaciones descritas en el presente documento administrando una
preparación aceptable para inyección que contiene un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 a 25 mg/dosis, o alternativamente, que
contiene 50 mg por dosis. Las dosis de 25 mg o 50 mg pueden
administrarse de manera repetida, particularmente para estados
crónicos. Si se usa una vía de administración distinta a la
inyección, se ajusta apropiadamente la dosis según las prácticas
médicas habituales. En muchos casos, se obtendrá una mejora en el
estado de un sujeto inyectando una dosis de aproximadamente 25 mg
de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o
pareja de unión a ADAM-H9 una a tres veces a la
semana durante un periodo de al menos tres semanas, o una dosis de
50 mg de un polipéptido ADAM-H9, fragmento,
anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 una o dos
veces a la semana durante al menos tres semanas (puede ser
necesario un tratamiento durante periodos más prolongados para
inducir el grado de mejora deseado). Para estados crónicos
incurables, puede continuarse el régimen indefinidamente,
realizándose ajustes en la dosis y frecuencia si se consideran
necesarios por el médico del sujeto. Las dosis anteriores son
ejemplos para un sujeto adulto que es una persona que tiene 18 años
de edad o más. Para sujetos pediátricos (edad de
4-17 años), un régimen adecuado supone la inyección
subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de un
polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja
de unión a ADAM-H9, administrados mediante inyección
subcutánea una o más veces a la semana. Si se usa un anticuerpo
frente a un polipéptido ADAM-H9 como un antagonista
del polipéptido ADAM-H9, un intervalo de dosis
preferido es de 0,1 a 20 mg/kg, y más preferiblemente es de
1-10 mg/kg. Otro intervalo de dosis preferido para
un anticuerpo anti-polipéptido
ADAM-H9 es de 0,75 a 7,5 mg/kg de peso corporal. Se
prefieren anticuerpos humanizados. Tales anticuerpos pueden
inyectarse o administrarse por vía intravenosa.
En el presente documento, se proporcionan
composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido
ADAM-H9 de la invención (derivado de cualquier
fuente, incluyendo sin limitación a partir de fuentes recombinantes
y no recombinantes), en combinación con otros componentes tales como
un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. El
término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no
tóxico que no interfiere en la eficacia de la actividad biológica
del/de los principio(s) activo(s). Las formulaciones
adecuadas para la administración incluyen soluciones para inyección
estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes,
tampones, bacterióstatos y solutos que hacen la formulación
isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles,
acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o
agentes espesantes. Pueden formularse los polipéptidos según
métodos conocidos usados para preparar composiciones útiles
farmacéuticamente. Pueden combinarse en mezcla, o bien como el
único material activo o con otros materiales activos conocidos
adecuados para una indicación dada, con diluyentes (por ejemplo,
solución salina, Tris-HCl, soluciones tamponadas con
acetato y fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol
bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes
y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones
adecuadas para las composiciones farmacéuticas incluyen las
descritas en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack
Publishing Company, Easton, PA. En algunas realizaciones, el
polipéptido puede someterse a pegilación para ayudar en la
adsorción o captación. Por ejemplo, pueden complejarse tales
composiciones con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o
incorporarse en compuestos poliméricos tales como poli(ácido
acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, dextrano, y similares,
o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas
unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasma o
esferoblastos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal
incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos,
lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares.
La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del
nivel de las habilidades de la técnica, tal como se describe, por
ejemplo, en la patente estadounidense número 4.235.871; la patente
estadounidense número 4.501.728; la patente estadounidense número
4.837.028; y la patente estadounidense número 4.737.323, que se
incorporan todas al presente documento como referencia. Tales
composiciones influirán en el estado físico, solubilidad,
estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de
aclaramiento in vivo, y por tanto, se eligen según la
aplicación pretendida, de modo que las características del vehículo
dependerán de la vía de administración seleccionada. En una
realización preferida de la invención, se usan formas de liberación
sostenida de un polipéptido ADAM-H9. Las formas de
liberación sostenida adecuadas para su uso en los métodos descritos
incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido
ADAM-H9 que está encapsulado en un polímero
biocompatible que se disuelve lentamente (tal como las
micropartículas de alginato descritas en la patente estadounidense
número 6.036.978), mezclado con un polímero de este tipo (incluyendo
hidrogeles aplicados tópicamente), y/o encerrado en un implante
semipermeable biocompatible.
Un polipéptido ADAM-H9 de la
invención puede ser activo en multímeros (por ejemplo, heterodímeros
u homodímeros) o complejos con el mismo u otros polipéptidos. Como
resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden
comprender un polipéptido de la invención en tal forma multimérica o
complejada. La composición farmacéutica de la invención puede estar
en la forma de un complejo del/de los polipéptido(s) de la
invención La invención incluye además la administración de un
polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja
de unión a ADAM-H9 de manera concurrente con uno o
más fármacos que se administran al mismo sujeto en combinación,
administrándose cada fármaco según un régimen adecuado para ese
medicamento. La "administración concurrente" engloba el
tratamiento simultáneo o secuencial con los componentes de la
combinación, así como regímenes en los que se alternan los
fármacos, o en los que se administra un componente a largo plazo y
el/los otro(s) se administran intermitentemente. Pueden
administrarse los componentes en la misma composición o en
composiciones separadas, y por la misma vía de administración o
vías diferentes. Ejemplos de componentes que pueden incluirse en la
composición farmacéutica de la invención son citocinas, linfocinas
u otros factores hematopoyéticos tales como: MCSF,
GM-CSF, TNF, IL-1,
IL-2, IL-3, IL4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL,-11, IL-12, IL-13,
IL-14, IL-15, IL-17,
IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2,
G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina,
factor de células madre y eritropoyetina. La composición
farmacéutica puede contener además otros agentes que o bien
potencian la actividad del polipéptido o complementan su actividad
o uso en tratamiento. Tales factores y/o agentes adicionales pueden
incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto
sinérgico con un polipéptido de la invención, o para minimizar los
efectos secundarios. Por el contrario, puede incluirse un
polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja
de unión a ADAM-H9 de la invención en formulaciones
con una citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor
trombolítico o antitrombótico, o agente antiinflamatorio particular,
para minimizar los efectos secundarios de la citocina, linfocina,
otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o
agente antiinflamatorio. Ejemplos adicionales de fármacos que van a
administrarse de manera concurrente incluyen, pero no se limitan a
antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticoesteroides,
antagonistas de citocinas inflamatorias, antiinflamatorios no
esteroideos, pentoxifilina, talidomida, y fármacos antirreumáticos
modificadores de la enfermedad (FARME) tales como azatioprina,
ciclofosfamida, ciclosporina, sulfato de hidroxicloroquina,
metotrexato, leflunomida, minociclina, penicilamina, sulfasalazina
y compuestos de oro tales como oro oral, aurotiomalato sódico y
aurotioglucosa. Adicionalmente, puede combinarse un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 con un segundo polipéptido
ADAM-H9, anticuerpo frente a un polipéptido
ADAM-H9, o un péptido derivado del polipéptido
ADAM-H9 que actúa como un inhibidor competitivo de
un polipéptido ADAM-H9 nativo.
Puede usarse una vía de administración eficaz
para administrar terapéuticamente un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9 del mismo, incluyendo aquellas composiciones
que comprenden polinucleótidos de ADAM-H9. La
administración parenteral incluye inyección, por ejemplo, a través
de las vías intraarticular, intravenosa, intramuscular,
intralesional, intraperitoneal o subcutánea mediante inyección en
bolo o mediante infusión continua. Otras vías incluyen la
administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o
lesión. Otros medios de administración adecuados incluyen la
liberación sostenida desde implantes; inhalación y/o insuflación de
aerosoles; colirios; supositorios vaginales o rectales;
preparaciones bucales; preparaciones orales, incluyendo píldoras,
jarabes, pastillas para chupar o chicle; y preparaciones tópicas
tales como lociones, geles, pulverizaciones, pomadas u otras
técnicas adecuadas. Alternativamente, puede suministrarse el
polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o
pareja de unión a ADAM-H9 mediante la implantación
de células que expresan el polipéptido, por ejemplo, mediante la
implantación de células que expresan un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a
ADAM-H9. También pueden cultivarse las células ex
vivo en presencia de polipéptidos de la invención con el fin de
que proliferen o para producir un efecto deseado sobre o en la
actividad de tales células. Entonces pueden introducirse in
vivo células tratadas para fines terapéuticos. En otra
realización, se inducen las propias células del sujeto para que
produzcan un polipéptido ADAM-H9, fragmento,
anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 mediante
transfección in vivo o ex vivo con un polinucleótido
que codifica para un polipéptido ADAM-H9,
fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9.
El polinucleótido puede introducirse en las células del sujeto, por
ejemplo, inyectando ADN desnudo o ADN encapsulado en liposomas que
codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento,
anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9, o mediante
otros medios de transfección. También pueden administrarse los
polinucleótidos de la invención a sujetos mediante otros métodos
conocidos para la introducción de ácidos nucleicos en una célula u
organismo (incluyendo, sin limitación, en la forma de vectores
víricos).
Cuando se administra por vía oral una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido ADAM-H9,
fragmento del mismo, anticuerpo, o pareja de unión de la invención,
el polipéptido normalmente estará en la forma de un comprimido,
cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de
comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede
contener adicionalmente un vehículo sólido tal como una gelatina o
un adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen desde
aproximadamente el 5 hasta el 95% de un polipéptido de la invención,
y preferiblemente desde aproximadamente el 25 hasta el 90% de un
polipéptido de la invención. Cuando se administra en forma líquida,
puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites
de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite
mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La
forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además
solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos,
o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o
polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la
composición farmacéutica contiene desde aproximadamente el 0,5 hasta
el 90% en peso de un polipéptido de la invención, y preferiblemente
desde aproximadamente el 1 hasta el 50% de un polipéptido de la
invención.
Cuando se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido ADAM-H9,
fragmento, anticuerpo, o agente de unión de la invención mediante
inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el polipéptido estará
en la forma de una solución acuosa libre de pirógenos, aceptable por
vía parenteral. La preparación de tales soluciones de polipéptido
aceptables por vía parenteral, teniendo en debida consideración el
pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de las
habilidades del experto en la técnica. Una composición farmacéutica
preferida para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe
contener, además de un polipéptido de la invención, un vehículo
isotónico tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de
Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de
sodio, inyección de Ringer con lactato, u otro vehículo tal como se
conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la invención
también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones,
antioxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos en la
técnica. La duración de la terapia intravenosa usando la
composición farmacéutica de la invención variará, dependiendo de la
gravedad de la enfermedad que se esté tratando y el estado y
posible respuesta idiosincrásica de cada sujeto individual. Se
contempla que la duración de cada aplicación de un polipéptido de la
invención estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración
intravenosa continua. En última instancia, el médico que atiende
decidirá sobre la duración apropiada de la terapia intravenosa.
Para las composiciones de la invención que son
útiles para la reparación o regeneración de tejido, el método
terapéutico incluye administrar una forma libre de pirógenos,
fisiológicamente aceptable de la composición tópicamente, por vía
sistémica o localmente o en asociación con un implante o
dispositivo. Además, la composición puede encapsularse o inyectarse
de manera deseable en una forma viscosa para la administración al
sitio con daño tisular. También pueden incluirse opcionalmente
agentes útiles adicionales en la composición, tal como se describió
anteriormente, o pueden administrarse simultánea o secuencialmente
con la composición en los métodos de la invención. Las
composiciones pueden incluir una matriz que puede administrar la
composición que contiene el polipéptido en el sitio con daño
tisular, proporcionando una estructura para el desarrollo de tejido
y que puede reabsorberse de manera óptima en el cuerpo. La elección
del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad,
biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y
propiedades de la interfase. Las posibles matrices para las
composiciones incluyen sulfato de calcio, fosfato de tricalcio,
hidroxiapatita, poli(ácido láctico), poli (ácido glicólico) y
polianhídridos. Otras posibles matrices no son biodegradables y
están definidas químicamente, tales como hidroxiapatita sinterizada,
biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden
componerse de combinaciones de cualquiera de los tipos de material
mencionados anteriormente, tales como poli(ácido láctico) e
hidroxiapatita o colágeno y fosfato de tricalcio. Puede
monitorizarse el progreso mediante la evaluación periódica del
crecimiento y/o reparación de tejido/hueso, por ejemplo, rayos X,
determinaciones histomorfométricas y marcado con tetraciclina.
Además de sujetos humanos, las composiciones que
comprenden un polipéptido ADAM-H9, fragmento,
anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 son útiles
en el tratamiento de estados patológicos en animales no humanos,
tales como mascotas (perros, gatos, aves, primates y similares),
animales de granja domésticos (caballos, ganado, ovejas, cerdos,
aves y similares). En tales casos, puede determinarse una dosis
apropiada según el peso corporal del animal. Por ejemplo, puede
usarse una dosis de 0,2-1 mg/kg. Alternativamente,
se determina la dosis según el área superficial del animal,
oscilando una dosis a modo de ejemplo desde 0,1-20
mg/m^{2}, o más preferiblemente, desde 5-12
mg/m^{2}. Para animales pequeños, tales como perros o gatos, una
dosis adecuada es de 0,4 mg/kg. En una realización, se administra
un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o
pareja de unión a ADAM-H9 (preferiblemente
construido a partir de genes derivados de la misma especie que el
sujeto), mediante inyección u otra vía adecuada una o más veces a
la semana hasta que mejora el estado del animal, o puede
administrarse indefinidamente.
La invención también se refiere al uso de un
polipéptido ADAM-H9, fragmento y variante;
polinucleótido que codifica para un polipéptido
ADAM-H9, fragmento, y variante; agonistas o
antagonistas de un polipéptido ADAM-H9 tales como
anticuerpos; una pareja de unión al polipéptido
ADAM-H9; complejos formados a partir de un
polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante, y pareja
de unión, y similares, en la fabricación de un medicamento para la
prevención o tratamiento terapéutico de una enfermedad o
trastorno.
También están englobados por la invención
sistemas y métodos para analizar polipéptidos
ADAM-H9 que comprenden identificar y/o caracterizar
uno o más polipéptidos ADAM-H9, ácidos nucleicos que
los codifican, y genes correspondientes, comprendiendo
preferiblemente estos sistemas y métodos un conjunto de datos que
representan un conjunto de una o más moléculas de
ADAM-H9, o el uso de las mismos. En consecuencia, se
describe en el presente documento un medio legible por ordenador
que tiene almacenado en él un elemento seleccionado del grupo que
consiste en un polinucleótido que comprende una secuencia tal como
se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7 o 9; un polipéptido que
comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:1, 3, 4,
6, 8 o 10; un conjunto de secuencias de polinucleótido en las que
al menos una de dichas secuencias comprende una secuencia tal como
se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9; y un conjunto de
secuencias de polipéptido en las que al menos una de dichas
secuencias comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID
NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10.
Además se describe en el presente documento un
entorno de cálculo y una pluralidad de algoritmos ejecutados
selectivamente para analizar un polipéptido o polinucleótido de la
invención. Los ejemplos de análisis de un polipéptido ADAM
incluyen, sin limitación, visualizar la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido en el conjunto, comparar la secuencia de aminoácidos
de un polipéptido en el conjunto con la secuencia de aminoácidos de
otro polipéptido en el conjunto, predecir la estructura de un
polipéptido en el conjunto, determinar las secuencias de
nucleótidos de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido en
el conjunto, e identificar un gen correspondiente a un polipéptido
en el conjunto.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende un experto en la técnica a
la que pertenece esta invención. Todos los títulos y subtítulos
proporcionados en el presente documento son solamente para la
facilidad de lectura y no debe considerarse que limitan la
invención. Los términos "un", "una" y "el/la" tal
como se usan en el presente documento pretenden englobar el plural
a menos que el contexto dicte claramente la forma singular. Aunque
pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los
descritos en el presente documento, en la práctica o las pruebas de
la invención, a continuación se describen métodos y materiales
adecuados. En caso de conflicto, dominará la presente memoria
descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales,
métodos, y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser
limitantes. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar
realizaciones particulares y no limitan el alcance de la
invención.
Se recibió un conjunto de datos de Celera
Genomics (Rockville, Maryland) que contenía secuencias de
aminoácidos que se prevé que están codificadas por el genoma
humano. Se buscó este conjunto de datos usando un algoritmo BLAST
para identificar los polipéptidos de la familia ADAM. Se identificó
que una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:1
comprendía secuencias de aminoácidos parciales de un nuevo
polipéptido de la familia ADAM humano. Se usó esta secuencia de
aminoácidos para identificar un primer exón de aproximadamente 194
pb. Se usó este primer exón para identificar un clon que contenía un
polinucleótido contiguo que contenía la secuencia del primer exón.
Se identificó un segundo exón analizando la secuencia contigua en el
sentido de 5' del primer exón hasta que se encontró homología
sustancial con la secuencia codificante para ADAM9 (SEQ ID NO:23).
Se identificó esta región de homología sustancial como un posible
segundo exón y posteriormente se amplificó por PCR a partir de una
biblioteca de ADNc de células de ganglio linfático. El producto de
PCR (SEQ ID NO:2) codificaba para una secuencia parcial de un
polipéptido ADAM-H9 que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 (desde el residuo
17 hasta el 67). Los primeros 14 aminoácidos de SEQ ID NO:3
representan la traducción de un segundo exón de aproximadamente 42
pb (aproximadamente 1,3 kb en el sentido de 5' del primer exón
identificado) y se confirmaron ambos exones mediante amplificación
por PCR y análisis de ADNc de una variedad de tejidos humanos
incluyendo placenta, hígado, riñón, páncreas, bazo, testículos,
estómago, médula ósea, ganglio linfático, corazón, músculo
esquelético, cerebro, pulmón, colon, próstata, timo, ovario,
intestino delgado, piel y esófago. También se analizó ADNc de
algunos tejidos relacionados de origen fetal. Las secuencias de
aminoácidos presentadas en la figura 2 se presentan en el código de
aminoácidos de 1 letra habitual, en el que "A" representa
alanina, "C" representa cisteína y similares.
Se identificaron polinucleótidos adicionales que
codificaban para un polipéptido ADAM-H9 mediante
análisis de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE,
"rapid amplification of cDNA ends"). Se clonaron todos los
productos de RACE en vectores y se secuenciaron. Los análisis de
secuencia de los productos de RACE identificaron varios clones que
tenían secuencias sustancialmente idénticas. Los kits de análisis
RACE están disponibles a partir de varias compañías incluyendo
Roche Molecular Systems. Se diseñaron cebadores basándose en
secuencias consenso encontradas mediante comparación de productos
de RACE.
Se usó un par de cebadores que comprendían los
nucleótidos 25-49 y 1434-1464 de SEQ
ID NO:5 para amplificar por PCR una biblioteca de ADNc de células
de ganglio linfático y células de la médula ósea. Se clonaron los
productos de PCR resultantes y se secuenciaron usando protocolos
habituales. Los polinucleótidos contenidos en estos clones se
presentan en las SEQ ID NO:5, 7 y 9 y codifican para los
polipéptidos que tienen una secuencia tal como se expone en las SEQ
ID NO:6, 8 y 10, respectivamente. Dos de las tres secuencias
clonadas incluyen dominios citoplasmáticos y anclajes transmembrana
previstos.
Un análisis de la secuencia de
ADAM-H9 demuestra que todas las SEQ ID NO: 1, 3, 4,
6, 8 y 10 contienen una región de aminoácidos que tiene homología
con el dominio desintegrina de la familia ADAM de polipéptidos. Un
dominio desintegrina de la invención puede incluir una secuencia que
comienza con una secuencia CGN altamente conservada que comienza en
el residuo 73 y que continua hasta aproximadamente el residuo 360 a
362 de SEQ ID NO:6; puede incluir una secuencia desde
aproximadamente el residuo 1 o 16 hasta aproximadamente el residuo
285 a 287 de SEQ ID NO:8; o puede incluir una secuencia desde el
residuo 1 o 73 (o cualquier residuo intermedio) hasta
aproximadamente 314 o 329 (o cualquier residuo intermedio) de SEQ ID
NO:10. El análisis también identificó una secuencia transmembrana
presente en SEQ ID NO:6 y 8 que comienza en aproximadamente el
residuo 361 y que continúa hasta el residuo 382 de SEQ ID NO:6 o
desde aproximadamente el residuo 286 hasta el residuo 307 de SEQ ID
NO:8. En consecuencia, un polipéptido que carece de un dominio
transmembrana, (por ejemplo, fragmentos de las SEQ ID NO:6 y 8 que
tienen el dominio transmembrana ausente o delecionado) se prevé que
son polipéptidos solubles que tienen actividad desintegrina.
También se identifica por la invención una variante que se produce
de manera natural de un polipéptido ADAM-H9 que
carece de un dominio transmembrana (véase, por ejemplo, SEQ ID
NO:10). Además, una comparación de la secuencias del polipéptido
ADAM-H9 de SEQ ID NO:6, 8 y 10 con las de la
secuencia de ADAM9 humana demuestra varios residuos de cisteína
conservados en los dominios ricos en cisteína y desintegrina que
concuerdan con los polipéptidos de la familia ADAM. En la figura 1,
se presenta una alineación de la secuencia de ADAM9 con SEQ ID
NO:6, 8 y 10. En la figura 1, las barras grises representan una
aproximación del dominio rico en cisteína y desintegrina y la línea
de puntos el dominio transmembrana aproximado. Los residuos de
cisteína conservados están marcados y en mayúsculas.
En la figura 3, se proporcionan las secuencias
de polinucleótido que codifican para una parte o para todas las
secuencias de polipéptido de ADAM-H9 (SEQ ID NO: 1,
3, 4, 6, 8 o 10). La ATG en negrita en las SEQ ID NO:5, 7 y 9
anteriores representa el codón de inicio o metionina en la posición
1 de SEQ ID NO:6, 8 y 10. Un análisis de la secuencia codificante
de SEQ ID NO:6, 8 y 10, tal como se representa en las SEQ ID NO: 5,
7 y 9, respectivamente, demuestra que el dominio que tiene actividad
desintegrina corresponde a de aproximadamente el nucleótido 248 a
aproximadamente el nucleótido 1111 de SEQ ID NO:5; de
aproximadamente el nucleótido 82 o 127 (o cualquier nucleótido
intermedio) a aproximadamente el nucleótido 936 de SEQ ID NO:7; o de
aproximadamente el nucleótido 32 o 248 (o cualquier nucleótido
intermedio) a aproximadamente el nucleótido 973 o 1018 (o cualquier
nucleótido intermedio) de SEQ ID NO:9. En consecuencia, un
polinucleótido que comprende fragmentos de las secuencias de ácidos
nucleicos anteriores representa una secuencia codificante para un
polipéptido soluble que tiene la actividad desintegrina. Además, la
secuencia codificante para el dominio transmembrana de SEQ ID NO:6
y 8 corresponde a de aproximadamente los nucleótidos 1112 a
aproximadamente el 1177 o de aproximadamente los nucleótidos 937 a
aproximadamente el 1002 de las SEQ ID NO:5 y 7, respectivamente. Tal
como se trata en el presente documento, los dominios
citoplasmáticos de SEQ ID NO:6, 8 y 10 difieren y potencialmente
representan variantes de corte y empalme.
Las variantes de las secuencias del polipéptido
ADAM-H9 pueden identificarse basándose en las
secuencias proporcionadas en el presente documento. En el presente
documento, se proporcionan varias variantes (tal como se describe
de manera más completa a continuación) y se incluyen dentro del
alcance de la invención. Por ejemplo, SEQ ID NO:1 está presente en
las SEQ ID NO:3, 4, 6, 8 y 10, sin embargo, SEQ ID NO:8 carece de un
tramo de 39 aminoácidos en el dominio citoplasmático previsto del
polipéptido comparado con SEQ ID NO:6. Se prevé que es más probable
que las sustituciones de aminoácidos y otras alteraciones
(deleciones, inserciones y similares) en las secuencias de
aminoácidos de ADAM-H9 alteren o perturben las
actividades del polipéptido ADAM-H9 si dan como
resultado cambios en los residuos conservados de la secuencias de
aminoácidos tal como se muestra en la figura 1, y particularmente
si esos cambios no sustituyen un aminoácido de estructura similar
(tales como la sustitución de uno cualquiera de los residuos
alifáticos - Ala, Gly; Leu, Ile o Val - por otro residuo
alifático). A la inversa, si se realiza un cambio en una secuencia
de aminoácidos de ADAM-H9 que da como resultado la
sustitución del residuo en esa posición en la alineación de una de
las otras secuencias de polipéptido ADAM-H9, es
menos probable que una alteración de este tipo afecte a la función
del polipéptido ADAM-H9 alterado.
Puede usarse un polipéptido
ADAM-H9 sustancialmente purificado para generar
anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con éste, usando técnicas
convencionales tales como las descritas en la patente estadounidense
4.411.993. Se inmunizan ratones con un inmunógeno de polipéptido
ADAM-H9 emulsionado en adyuvante completo de Freund,
y se les inyecta por vía subcutánea o por vía intraperitoneal
cantidades que oscilan desde 10-100 \mug. De diez
a doce días más tarde, a los animales inmunizados se administra una
dosis de refuerzo con polipéptido ADAM-H9 adicional
emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Se les administra una
dosis de refuerzo periódicamente a los ratones después con un
programa de inmunización de semanal a bisemanal. Se toman
periódicamente muestras de suero mediante extracción de sangre
retroorbital o escisión del extremo de la cola para someter a prueba
un anticuerpo frente al polipéptido ADAM-H9
mediante ensayo de inmunotransferencia puntual, ELISA (ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas) o inhibición de la unión de un
polipéptido ADAM-H9 a una pareja de unión al
polipéptido ADAM-H9.
Tras la detección de un título de anticuerpos
apropiado, se les proporciona a los animales positivos una última
inyección de un polipéptido ADAM-H9 en solución
salina. De tres a cuatro días más tarde, se sacrifican los
animales, se recogen las células del bazo, y se fusionan las células
del bazo con una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1
o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan
células de hibridoma, que se siembran en múltiples placas de
microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina
y timidina) para inhibir la proliferación de las células no
fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.
Se seleccionan las células de hibridoma mediante
ELISA para determinar la reactividad frente a un polipéptido
ADAM-H9 sustancialmente puro mediante adaptaciones
de las técnicas descritas en Engvall et al., (Immunochem.
8:871, 1971) y en la patente estadounidense 4.703.004. Una técnica
de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos
descrita en Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212,1990). Las
células de hibridoma positivas pueden inyectarse por vía
intraperitoneal a los ratones BALB/c singénicos para producir
ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpo monoclonal
anti-ADAM-H9. Alternativamente,
pueden hacerse crecer las células de hibridoma in vitro en
matraces o frascos rotatorios mediante varias técnicas. Los
anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis de ratón pueden
purificarse mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido
por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también
puede usarse la cromatografía de afinidad basada en la unión del
anticuerpos a polipéptido A o polipéptido G, como puede ser la
cromatografía basada en la unión al polipéptido
ADAM-H9.
Se mapea el gen correspondiente a un polipéptido
ADAM-H9 usando estrategias de mapeo basadas en PCR.
Las asignaciones cromosómicas humanas iniciales se realizan usando
cebadores de PCR específico para ADAM-H9 tales como
los descritos anteriormente en el ejemplo 1 y un kit BIOS Somatic
Cell Hybrid PCRable DNA (ADN que puede someterse a PCR de híbridos
de células somáticas) de BIOS Laboratories (New Haven, CT),
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realiza un mapeo más
detallado usando un panel de híbridos de radiación de Genebridge 4
(Research Genetics, Huntsville, AL (véase, por ejemplo, Walter, MA
et al., Nature Genetics 7:22-28, 1994).
Entonces, los datos de este análisis se someten electrónicamente al
mapeador de híbridos de radiación MIT
(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/condg/rhmapper.pl)
siguiendo las instrucciones contenidas en el mismo. Este análisis
produce nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se
someten electrónicamente a NCBI:
(www-ncbi.nlm.nih.gov/genemap/map.cgi?CHR=8),
producen el intervalo cromosómico específico. La ubicación
cromosómica prevista es en el cromosoma 8 en aproximadamente
8p11.1.
Para construir un polinucleótido que codifica
para el dominio extracelular de ADAM-H9 fusionado
con un Fc, se unió un ácido nucleico que codifica para los residuos
de aminoácidos 73 a 362 de SEQ ID NO:6, a un ácido nucleico que
codifica para una parte Fc de IgG1 humana. El polipéptido codificado
por este constructo se muestra en SEQ ID NO:25. Este constructo usa
la secuencia líder igKappa, que se escinde por la peptidasa de señal
tras el aminoácido G (glicina) C- terminal en la posición 20 de SEQ
ID NO:25. Entonces se prevé que la forma soluble de la molécula se
inicia en el aminoácido 21 de SEQ ID NO:25. La secuencia TS
(treonina-serina) (aminoácidos 21 y 22 de SEQ ID
NO:25) es una consecuencia del sitio de restricción usado para unir
un dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 (aminoácidos 73 a 362 de SEQ
ID NO:6) al dominio Fc. Un dominio desintegrina de SEQ ID NO:6
comienza en el aminoácido 23 y continúa hasta el aminoácido 312 de
SEQ ID NO:25. La secuencia RS (arginina-serina) en
los aminoácidos 313-314 es una consecuencia del
sitio de restricción usado para unir un dominio desintegrina de SEQ
ID NO:6 (aminoácidos 73 a 362 de SEQ ID NO:6) al dominio Fc. La
secuencia de Fc comienza en el aminoácido 315 y continúa hasta el
codón de terminación en marco tras el residuo 542.
Se usa un ensayo de cavidad corneal en ratón
para cuantificar la inhibición de la angiogénesis por los
polipéptidos ADAM-H9dis-Fc in
vivo. En este ensayo, se inmovilizan los agentes que van a
someterse a prueba para determinar la actividad angiogénica o
antiángiogénica en una forma de liberación lenta en un gránulo de
Hydron, que se implanta en las microcavidades creadas en el
epitelio corneal de los ratones anestesiados. Se mide la
vascularización como la aparición, densidad y extensión de vasos en
crecimiento del limbo corneal vascularizado en la cornea
normalmente avascular.
Los gránulos de Hydron, tal como se describe en
Kenyon et al., Invest Opthamol. & Visual Science 37:1625,
1996, incorporan sucralfato con FGFb (90 ng/gránulo), FGFb e IgG
(11 \mug/gránulo, control), o FGFb y un intervalo de
concentraciones del agente que va a someterse a prueba (por ejemplo,
polipéptido ADAM-H9dis-Fc). Los
gránulos se implantan quirúrgicamente en las microcavidades
estromales corneales creadas mediante la microdisección a 1 mm en
la parte media con respecto al limbo corneal lateral de ratones
C57BL machos de 6-8 semanas de edad. Tras cinco
días, en el pico de la respuesta neovascular a FGFb, se fotografían
las corneas usando una lámpara de hendidura Zeiss en un ángulo
incipiente de 35-50° del eje polar en el meridiano
que contiene el gránulo. Se digitalizan y procesan las imágenes
mediante filtros de color sustractivos (Adobe Photoshop 4.0) para
delinear microvasos establecidos por el contenido en hemoglobina.
Se usa un software de análisis de imágenes (Bioquant, Nashville,
TN) para calcular la fracción de la imagen corneal que está
vascularizada, la densidad de vasos dentro del área vascularizada,
y la densidad de vasos dentro de la cornea total. Se determina la
inhibición de la angiogénesis corneal inducida por FGFb, como una
función de la dosis de polipéptido ADAM-H9 con
desintegrina-Fc.
La supervivencia de tejidos cardíacos
trasplantados heterotópicamente de un ratón donante a la piel de la
oreja de otro ratón genéticamente similar, requiere la
neovascularización adecuada por el corazón trasplantado y el tejido
que lo rodea, para promover la supervivencia y la energía para la
función del músculo cardíaco. La vasculatura inadecuada en el sitio
de trasplante produce una isquemia excesiva al corazón, daño tisular
y fallo del tejido que va a injertarse. Los agentes que antagonizan
los factores implicados en la migración de las células endoteliales
y la formación de vasos pueden disminuir la angiogénesis en el sitio
de transplante, limitando así la función del tejido de injerto y
por último su propio prendimiento del injerto. Se usa un modelo de
isoinjerto cardíaco heterotópico murino para demostrar los efectos
antagonistas de polipéptidos
ADAM-H9dis-Fc sobre la
neovascularización.
Se administran injertos de corazón neonatal a
receptores hembras BALB/c (\approx 12 semanas de edad) de ratones
donantes de la misma raza. Se injerta el tejido de corazón del
donante en el pabellón auditivo de la oreja izquierda del receptor
en el día 0 y se dividen los ratones en dos grupos. El grupo control
recibe IgG humana (IgG Hu) mientras que el otro grupo recibe
ADAM-H9dis-Fc, ambos por vía
intraperitoneal. Se continúan los tratamientos durante cinco días
consecutivos. Se determina la funcionalidad de los injertos
monitorizando la actividad pulsátil visible en los días 7 y 14 tras
el prendimiento del injerto. La inhibición del prendimiento del
injerto funcional, se determina como una función de las dosis de
ADAM-H9dis-Fc. Se examina la
histología de los corazones trasplantados con el fin de visualizar
los efectos de ADAM-H9dis-Fc sobre
el edema en el sitio de trasplantes y la vasculatura del tejido de
donante y huésped (usando, por ejemplo, la tinción con factor
VIII).
Se somete a prueba
ADAM-H9dis-Fc en modelos animales de
tumores sólidos. Se determina el efecto de
ADAMdis-Fc midiendo la frecuencia tumoral y el
crecimiento tumoral. También se demuestra la actividad biológica de
ADAM-H9dis-Fc en otros ensayos
in vitro, ex vivo e in vivo conocidos en la
técnica, tales como ensayos de movilización de calcio y ensayos
para medir la activación, reclutamiento o agregación de
plaquetas.
<110> Immunex Corporation
\hskip1cm Poindexter, Kurt
\hskip1cm Black, Roy A.
\hskip1cm Mosley, Bruce
\hskip1cm Dubose, Robert F
\hskip1cm Wiley, Steve R
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNA DESINTEGRINA HUMANA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> IMNX 3199-WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PENDIENTE DE CESIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
27-07-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/221.838
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-07-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/282.550
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-04-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(154)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1432)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (82)..(1140)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X es una o más repeticiones de
GGGGS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu
Gly Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu
Gly Ser Gly Ser Thr}
\sac{Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
Gly Glu Gly Ser Thr}
\sac{Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Resto de ligador artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
Lus Glu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de localización
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Arg Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de localización
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Arg Thr Ser Ser Leu Phe Thr Arg Arg
Val Gln Pro Ser Leu}
\sac{Phe Arg Asn Ile Leu Arg Leu Gln Ser
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de localización
artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de localización
artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en el residuo 4 es cualquier
aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Ala Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de localización
artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en el residuo 3 y 4 puede ser
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia consenso artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> x en los residuos 3, 6, 7, 9 y 10
puede ser cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa His
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 542
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo de
desintegrina-Fc
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (40)
1. Polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10;
(b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ
ID NO :6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una
actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión
a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e
inhibición de la angiogénesis;
(c) fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO:6,
SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprenden una secuencia de
aminoácidos de un dominio desintegrina, correspondiendo dicha
secuencia a la secuencia desde el residuo de aminoácido 73\pm5
hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a
362\pm5 de SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de
aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de
aminoácido 285\pm5 a 287\pm5 de SEQ ID NO:8, y desde uno
cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 735 hasta uno
cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5,
respectivamente;
(d) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido
73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido
360\pm5 a 362\pm5;
(e) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 285\pm5 a 287\pm5;
(f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5;
(g) polipéptidos que tienen secuencias de
aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a través de la
longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID
NO:10, en el que la identidad de aminoácidos en porcentaje se
selecciona del grupo que consiste en al menos el 97,5%, al menos el
99% y al menos el 99,5%; y
(h) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, unido
a un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido es un
polipéptido de cremallera de leucina, un polipéptido de Fc o un
ligador peptídico.
3. Polinucleótido aislado que codifica para un
polipéptido según la reivindicación 1 o 2.
4. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo
que consiste en
(a) un polinucleótido que comprende una
secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9;
(b) SEQ ID NO:5 desde el nucleótido 248 hasta el
nucleótido 1111 de SEQ ID NO:5;
(c) un polinucleótido que comprende una
secuencia de SEQ ID NO:7 desde un nucleótido entre 82 y 127 hasta el
nucleótido 936;
(d) un polinucleótido que comprende una
secuencia de SEQ ID NO:9 desde un nucleótido entre 32 y 248 hasta un
nucleótido entre 973 y 1018;
(e) una secuencia de nucleótidos complementaria
a una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; y
(f) cualquiera de las secuencias de nucleótidos
de a) a e) en las que T también puede ser U.
5. Polinucleótido aislado que comprende una
secuencia según la reivindicación 4, operativamente unida a un
polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés.
6. Vector de expresión que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 3, 4 o 5.
7. Célula huésped recombinante que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 3, 4 o 5.
8. Método para producir un polipéptido según la
reivindicación 1 o 2, que comprende cultivar la célula huésped
según la reivindicación 7 en condiciones que fomentan la expresión
del polipéptido según las reivindicaciones 1 o 2.
9. Método según la reivindicación 8, que
comprende además purificar el polipéptido.
10. Polipéptido de desintegrina producido
mediante el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 7
en condiciones que fomentan la expresión del polipéptido.
11. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido según la reivindicación 1.
12. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
13. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
14. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el
que el anticuerpo inhibe la actividad biológica del polipéptido
según la reivindicación 1.
15. Método para identificar un agente que modula
una actividad de un polipéptido según la reivindicación 1, que
comprende:
(a) poner en contacto el agente con un
polipéptido según la reivindicación 1 en condiciones tales que
interaccionan el agente y el polipéptido; y
(b) determinar la actividad del polipéptido en
presencia del agente comparado con un control, en el que un cambio
en la actividad es indicativo de un agente que modula la actividad
del polipéptido.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
el agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o
un péptido.
17. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble que comprende un fragmento del
polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene
al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en
actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de
células endoteliales e inhibición de la angiogénesis, para su uso
en terapia.
18. Uso de un polipéptido
ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que
comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del
grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de
la migración de células endoteliales e inhibición de la
angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica
para inhibir la angiogénesis en un mamífero que necesita tal
tratamiento.
19. Método in vitro para modular la
angiogénesis en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido
con un polipéptido según la reivindicación 1.
20. Polipéptido según la reivindicación 1, para
su uso en terapia.
21. Uso de un polipéptido según la
reivindicación 1, para la preparación de una composición
farmacéutica para modular la angiogénesis en un tejido.
22. Método in vitro para modular la
migración de células endoteliales, que comprende poner en contacto
una células endotelial con un polipéptido según la reivindicación
1.
23. Uso de un polipéptido según la
reivindicación 1, para la preparación de una composición
farmacéutica para modular la migración de células endoteliales.
24. Método in vitro para inhibir la unión
de una integrina a un ligando, que comprende poner en contacto una
célula que expresa la integrina con una cantidad eficaz de un
polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina
soluble que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6,
SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad
seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a
integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e
inhibición de la angiogénesis.
25. Uso de un polipéptido
ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que
comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del
grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de
la migración de células endoteliales e inhibición de la
angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica
para tratar un estado seleccionado del grupo que consiste en
trastornos oculares; estados cancerígenos y metastásicos;
enfermedades inflamatorias; osteoporosis, trastornos con resorción
ósea acelerada; reestenosis; activación, reclutamiento o agregación
de plaquetas inapropiados; trombosis; y un estado que requiere la
reparación de tejidos o la cicatrización de heridas.
26. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble según la reivindicación 17, para el uso
especificado en ella, en el que el polipéptido
ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble comprende
una secuencia seleccionado del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido
73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido
360\pm5 a 362\pm5;
\newpage
(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y
(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.
27. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble según la reivindicación 26, en el que
el dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en
la forma de un multímero.
28. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble según la reivindicación 27, en el que
el multímero es un dímero o trímero.
29. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble según las reivindicaciones 27 o 28, en
el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una cremallera
de leucina, o un ligador peptídico.
30. Polipéptido ADAM-H9 con
dominio desintegrina soluble según la reivindicación 29, en el que
el multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID
NO:25.
31. Uso según las reivindicaciones 18 o 25, en
el que el polipéptido ADAM-H9 con dominio
desintegrina soluble comprende una secuencia seleccionada del grupo
que consiste en:
(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido
73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido
360\pm5 a 362\pm5;
(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y
(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.
32. Uso según la reivindicación 31, en el que el
dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en la
forma de un multímero.
33. Uso según la reivindicación 32, en el que el
multímero es un dímero o trímero.
34. Uso según las reivindicaciones 32 o 33, en
el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una cremallera
de leucina o un ligador peptídico.
35. Uso según la reivindicación 34, en el que el
multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID
NO:25.
36. Método según la reivindicación 24, en el que
el polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina
soluble comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste
en:
(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido
73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido
360\pm5 a 362\pm5;
(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y
(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los
residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.
37. Método según la reivindicación 36, en el que
el dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en
la forma de un multímero.
38. Método según la reivindicación 37, en el que
el multímero es un dímero o trímero.
39. Método según las reivindicaciones 37 o 38,
en el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una
cremallera de leucina o un ligador peptídico.
40. Método según la reivindicación 39, en el que
el multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID
NO:25.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22183800P | 2000-07-28 | 2000-07-28 | |
US221838P | 2000-07-28 | ||
US28255001P | 2001-04-09 | 2001-04-09 | |
US282550P | 2010-02-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2283424T3 true ES2283424T3 (es) | 2007-11-01 |
Family
ID=26916195
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES01959270T Expired - Lifetime ES2283424T3 (es) | 2000-07-28 | 2001-07-27 | Proteina desintegrina humana. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1305434B1 (es) |
JP (1) | JP2004504845A (es) |
AT (1) | ATE356877T1 (es) |
AU (2) | AU8084301A (es) |
CA (1) | CA2415433A1 (es) |
DE (1) | DE60127264T2 (es) |
ES (1) | ES2283424T3 (es) |
MX (1) | MXPA03000843A (es) |
WO (1) | WO2002010405A2 (es) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021512596A (ja) * | 2018-01-31 | 2021-05-20 | ヴェラ セラピューティクス エルエルシー | Adam9生物活性を阻害するための方法および組成物 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6359000A (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-13 | Telemetry Technologies, Inc. | System and method for a virtual network operations center |
US6728770B1 (en) * | 1999-12-03 | 2004-04-27 | Storage Technology Corporation | Method and apparatus for workload balancing along multiple communication paths to a plurality of devices |
AU2001241611A1 (en) * | 2000-03-03 | 2001-09-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Adam polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
AU6531101A (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-17 | Genentech Inc | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
-
2001
- 2001-07-27 WO PCT/US2001/023709 patent/WO2002010405A2/en active IP Right Grant
- 2001-07-27 JP JP2002516321A patent/JP2004504845A/ja active Pending
- 2001-07-27 EP EP01959270A patent/EP1305434B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-27 AU AU8084301A patent/AU8084301A/xx active Pending
- 2001-07-27 CA CA002415433A patent/CA2415433A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-27 AT AT01959270T patent/ATE356877T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-27 ES ES01959270T patent/ES2283424T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-27 MX MXPA03000843A patent/MXPA03000843A/es not_active Application Discontinuation
- 2001-07-27 DE DE60127264T patent/DE60127264T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-27 AU AU2001280843A patent/AU2001280843B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002010405A3 (en) | 2003-01-23 |
ATE356877T1 (de) | 2007-04-15 |
EP1305434B1 (en) | 2007-03-14 |
DE60127264T2 (de) | 2007-12-20 |
AU8084301A (en) | 2002-02-13 |
MXPA03000843A (es) | 2004-04-05 |
CA2415433A1 (en) | 2002-02-07 |
AU2001280843B2 (en) | 2006-12-07 |
WO2002010405A2 (en) | 2002-02-07 |
JP2004504845A (ja) | 2004-02-19 |
DE60127264D1 (de) | 2007-04-26 |
EP1305434A2 (en) | 2003-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2383328T3 (es) | Métodos relacionados con LDCAM y CRTAM | |
US20080254506A1 (en) | Claudin polypeptides | |
US7175849B2 (en) | Nectin polypeptides | |
US8048994B2 (en) | C-type lectin polypeptide, polynucleotide and methods of making and use thereof | |
US20060292144A1 (en) | Human disintegrin protein | |
US20070081973A1 (en) | Cytokine polypeptides | |
JP2005507632A (ja) | ヘマトポエチン受容体、hpr1およびhpr2 | |
AU2001284977A1 (en) | Claudin polypeptides | |
US20040091473A1 (en) | Metalloproteinase-disintegrin polypeptides and methods of making and use thereof | |
US7186802B2 (en) | Claudin polypeptides | |
ES2283424T3 (es) | Proteina desintegrina humana. | |
US7189521B2 (en) | Claudin polypeptides, polynucleotides, and methods of making and use thereof | |
ES2267311T3 (es) | Adns y polipeptidos de il-1 zeta, variantes de empalme il-1 zeta y xrec2 descripcion. | |
JP2004507234A (ja) | メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドとその製造及び使用の方法 | |
AU2001280843A1 (en) | A human disintegrin protein | |
US20030087411A1 (en) | Death associated kinase containing ankyr in repeats (DAKAR) and methods of use | |
AU2006200669A1 (en) | Claudin polypeptides |