ES2267311T3

ES2267311T3 - Adns y polipeptidos de il-1 zeta, variantes de empalme il-1 zeta y xrec2 descripcion.

Info

Publication number: ES2267311T3
Application number: ES99966182T
Authority: ES
Inventors: John E. Sims; Dirk E. Smith; Teresa L. Born
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: DE69932259D1; WO2000036108A2; PT1141298E; CA2642146A1; CA2353483C; IL143361A; AU775128B2; JP4562287B2; CA2642146C; ATE332374T1; JP5081277B2; DE69932259T2; WO2000036108A3; DK1141298T3; CY1105405T1; DE69940750D1; EP1141298A2; AU2178800A; JP2002532094A; JP2010183921A

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de (a) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 3; (b) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 8; (c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 9; (d) un polipéptido que es al menos 95% idéntico a un polipéptido de a) o c), en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL- 1R; y (e) un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 3 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-51 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 188-192 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 24-192, 28- 192 o 34-192 de la SEQ ID NO: 3; (f) un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 41-61 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 214-218 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 43-218, 54- 218 o 60-218 de la SEQ ID NO: 8; y (g) un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-41 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 193-197 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 33-197 o 39- 197 de la SEQ ID NO: 9.

Description

ADNs y polipéptidos de IL-1 zeta, variantes de empalme IL-1 zeta y Xrec2.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se orienta a las variantes de empalme IL-1 zeta, IL-1 zeta, novedosas, purificadas y aisladas y los fragmentos de las mismas, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, los procedimientos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos, péptidos fragmentados derivados de estos polipéptidos, y los usos de estos.

Descripción de la técnica relacionada

La interleucina-1 (IL-1) es un miembro de un gran grupo de citoquinas cuya función primaria es mediar respuestas inmunes e inflamatorias. Hay cinco miembros de la familia IL-1 conocidos que incluyen IL-1 alfa (IL-1\alpha), IL-1 beta (IL- 1\beta), antagonista receptor IL-1 (IL-1ra), IL-1 delta (IL-1 \delta- como se revela en WO99/35268), e IL-18 (conocidos previamente como IGIF y algunas veces como IL-1 gamma). La IL-1 que se secreta por macrófagos es verdaderamente una mezcla en la mayoría de IL-1\beta y algo de IL-1\alpha (Abbas et al., 1994). La IL-1 \alpha y IL-1 \beta, que se producen primero como precursores 33 kD que carecen de una secuencia, son adicionalmente procesadas por división proteolítica para producir formas activas secretadas, cada una aproximadamente de 17 kD. Adicionalmente, el precursor 33 kD de IL-1\alpha también es activo. Ambas formas de la IL-1 son los productos de dos diferentes genes localizados sobre el cromosoma 2. Aunque las dos formas son homólogas entre sí menos del 30 por ciento, ambas se unen a los mismos receptores y tienen actividades similares.

La familia IL-1 de ligandos se une a un receptor común compuesto de una cadena de enlace del ligando, la receptor IL-1 tipo I (IL-1RI), y un componente de señalización requerido, la proteína accesorio de IL-1R (AcP) (Sims et al. 1988; Greenfeder et al. 1995; Cullinan et al. 1998). Una receptor IL-1 tipo II (IL-1RII) se une y secuestra la IL-1 agonista (especialmente IL- 1\beta) sin inducir cualquier respuesta de señalización de sí misma (McMahan et al. 1991; Sims et al. 1993; Colotta et al. 1993; Colotta et al. 1994). Los ligandos IL-1 también pueden unirse a un fragmento proteolítico soluble de IL-1RII (sIL-1RII) (Colotta et al., 1993).

La IL-1ra, una forma inactiva biológicamente de IL-1, es homóloga estructuralmente a IL-1. La IL-1ra se produce con una secuencia señal que permite la secreción eficiente en la región extracelular (Abbas et al., 1994). Adicionalmente, La IL-1ra se une al receptor IL-1 tipo I pero deja de provocar la interacción siguiente con AcP. De esa manera, el IL-1RI bloquea IL-Ira y previene la acción de la IL-1 agonista (Hannum et al. 1990; Eisenberg et al. 1990).

La principal fuente de IL-1 es el macrófago activado o fagocito mononuclear. Otras células que producen IL-1 incluyen células epiteliales y endoteliales (Abbas et al., 1994). La secreción de la IL-1 a partir de macrófagos ocurre después del encuentro con el macrófago y la ingesta de bacterias gram-negativas. Tal bacteria contiene moléculas lipopolisacárido (LPS), también conocidas como endotoxinas, en la pared celular bacterial. Las moléculas LPS son los componentes activos que estimulan a los macrófagos a producir el factor de necrosis tumoral (TNF) y la IL-1. En este caso, la IL-1 se produce en respuesta a la producción de LPS y TNF. A bajas concentraciones, las LPS estimulan los macrófagos y activan las células-B y las otras respuestas del huésped necesitadas para eliminar la infección bacteriana; sin embargo, a altas concentraciones, las LPS pueden causar grave daño tisular, choque, e incluso la
muerte.

Las funciones biológicas de la IL-1 incluyen la activación de células endoteliales vasculares y linfocitos, destrucción tisular local, y fiebre (Janeway et al., 1996). A niveles bajos, la IL-1 estimula los macrófagos y las células endoteliales vasculares para producir la IL-6, las moléculas que favorecen la expresión sobre la superficie de células endoteliales vasculares para incrementar la adhesión de leucocitos, e indirectamente activa los leucocitos inflamatorios por la estimulación de fagocitos mononucleares y otras células para producir ciertas quimiocinas que activan los leucocitos inflamatorios. Adicionalmente, la IL-1 se involucra en otras respuestas inflamatorias tales como inducción de prostaglandinas, óxido nítrico sintetasa, y metaloproteinasas. Estas funciones de la IL-1 son cruciales durante infecciones microbianas de nivel bajo. Sin embargo, si la infección microbiana se intensifica, la IL-1 actúa sistemáticamente por la inducción de fiebre, la estimulación fagocitos mononucleares para producir la IL-1 y IL-6, incrementando la producción de proteínas séricas a partir de hepatocitos, y la activación del sistema de coagulación. Adicionalmente, la IL-1 no causa necrosis hemorrágica de tumores, reprime la división de células madre de la médula ósea, y la IL-1 es letal para humanos a altas concentraciones.

Dada la importante función de la IL-1, existe la necesidad de identificar los miembros adicionales de la familia ligando IL-1 y la familia receptor IL-1. Además, en vista del interés continuado en investigar la proteína y el sistema inmunológico, el descubrimiento, la identificación, y papeles de nuevas proteínas y sus inhibidores, están a la vanguardia de la biología molecular y bioquímica moderna. El desafío del organismo cada vez mayor de conocimiento, sigue siendo una necesidad en el oficio, de descubrir la identidad y la función de las proteínas involucradas en las respuestas celular e inmune.

En otro aspecto, la identificación de la estructura primaria, o la secuencia, de una proteína desconocida es la culminación de un arduo proceso de experimentación. Con el fin de identificar una proteína desconocida, el investigador puede depender de una comparación de la proteína desconocida con conocidos péptidos utilizando una variedad de técnicas conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. Por ejemplo, las proteínas se analizan rutinariamente empleando técnicas tales como electroforesis, sedimentación, cromatografía, secuenciación y espectrometría de masas.

En particular, la naturaleza única de la composición de una proteína con respecto a sus componentes de aminoácidos específicos resulta en el emplazamiento único de sitios de división dentro de la proteína. La fragmentación específica de una proteína por división química o enzimática resulta en un único "huella digital peptídica" (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980). Por consiguiente, la división en un sitio específico resulta en una fragmentación reproducible de una proteína en particular en los péptidos de pesos moleculares precisos. Además, estos péptidos poseen las características de carga única que determina el pH isoeléctrico del péptido. Estas características únicas pueden ser explotadas utilizando una variedad de técnicas electroforéticas y otras técnicas (Brock et al., Biology of Microorganisms, pp. 76-77, Prentice Hall, 6th ed. 1991).

La fragmentación de las proteínas es además empleada para el análisis de la composición de aminoácidos y la secuenciación de proteína (P. Matsudiara, J Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskorn et al., Electrophoresis 9:830-838, 1988), particularmente la producción de fragmentos a partir de proteínas con un N-terminal "bloqueado". Además, las proteínas fragmentadas pueden ser utilizadas para la inmunización, por selección por afinidad (R. A. Brown, Patente U.S. No. 5, 151,412), para la determinación de los sitios de modificación (por ejemplo fosforilación), para la generación de los compuestos biológicamente activos (Brock et al., Biology of Microorganisms. pp. 300-301, Prentice Hall, 6th ed. 1991), y por la diferenciación de proteínas homólogas (M. Brown et al., J Gen. Virol. 50:309-316, 1980).

Además, cuando se obtiene una huella digital peptídica de una proteína desconocida, puede ser comparada con un banco de datos de proteínas conocidas, para ayudar en la identificación de la proteína desconocida empleando espectrometría de masas (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5011-5015, 1993; D. Fenyo et al., Electrophoresis 19:998-1005, 1998). Una variedad de programas de software de ordenador para facilitar estas comparaciones son posibles a través del Internet, tales como Protein Prospector (Sitio en internet: prospector.uscf.edu), MultiIdent (Sitio en internet: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Sitio en internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FRPeptideSearch Form.html), y ProFound (Sitio en internet: www.chaitsgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Estos programas permiten que el usuario especifique el agente de división y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia designada. Los programas comparan estos pesos moleculares con la información del peso molecular de la proteína almacenada en el banco de datos para ayudar en la determinación de la identidad de la proteína desconocida. La información exacta con respecto al número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de aquellos péptidos se requiere para la identificación exacta. Por lo tanto, el incremento de la exactitud en la determinación del número de péptidos fragmentados y sus pesos moleculares podrían resultar en la probabilidad mejorada del éxito en la identificación de proteínas desconocidas.

Además, el péptido metabolizado de las proteínas desconocidas puede ser secuenciado utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y la secuencia resultante investigada contra el banco de datos (J.K. Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5:976-989, 1994; M. Mann et al., Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994; J.A. Taylor et al., Rapid Comm. Mass Spec. 11:1067-1075, 1997). Los programas de búsqueda que pueden ser utilizadas en este proceso existen en el Internet, tales como Lutefisk 97 (Sitio en internet: www.Isbc.com: 70/Lutefisk97.html), y los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound descritos arriba. Por lo tanto, la adición a la secuencia de un gen y su secuencia de proteína predicha y los fragmentos del péptido para un banco de datos de secuencias puede ayudar en la identificación de las proteínas desconocidas utilizando espectrometría de masas en tándem.

Por lo tanto, también existe una necesidad en el oficio para utilizar polipéptidos apropiados en estudios de fragmentación de péptidos, para el uso en mediciones de peso molecular, y para utilizar en la secuenciación de proteínas utilizando espectrometría de masas en tándem.

Resumen de la invención

La presente invención provee ácidos nucleicos aislados y polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos para una familia ligando IL-1 llamada "IL-1 zeta" y dos variantes de empalme de IL-1 zeta, llamadas TDZ.1 y TDZ.2. Por lo tanto, en un aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de

(a): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 3;

(b): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 8;

(c): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 9;

(d): un polipéptido que es al menos 95% idéntico a un polipéptido de a) o c), en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL-1R; y

(e): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 3 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-51 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 188-192 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 24-192, 28-192 o 34-192 de la SEQ ID NO: 3;

(f): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de aminoácidos 41-61 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de aminoácidos 214-218 y que se une a un miembro de la familia IL-1 R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 43-218, 54-218 o 60-218 de la SEQ ID NO: 8; y

(g): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-41 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 193-197 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 33-197 o 39-197 de la SEQ ID NO: 9.

La molécula de ácido nucleico puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, la invención se dirige a un polipéptido aislado que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de

(a): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 3;

(b): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 8;

(c): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 9;

(d): un polipéptido que es al menos 95% idéntico a un polipéptido de a)-c), en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL-1R;

(f): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 41-61 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 214-218 y que se une a un miembro de la familia IL-1R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 43-218, 54-218 o 60-218 de la SEQ ID NO: 8; y

(g): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-41 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 193-197 y que se une a un miembro de la familia IL-1 R, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 33-197 o 39-197 de la SEQ ID NO: 9.

En el polinucleótido y el polipéptido de la invención, en donde el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 puede ser el aminoácido 52 y el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 puede ser el aminoácido 31.

La invención también provee un polipéptido oligomérico que comprende un polipéptido de la invención.

El ARN monocatenario y bicatenario y las moléculas de ácido nucleico ADN son comprendidos por la invención. La invención también abarca un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención y una célula huésped transformada o transferida con tal vector.

Los ácidos nucleicos antes mencionados pueden se usados para identificar los ácidos nucleicos que codifican las proteínas que tienen actividades asociadas con los ligandos y receptores de la familia IL-1s. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de IL-1 zeta pueden ser utilizadas para identificar el receptor IL-1 zeta.

Además, estos ácido nucleicos pueden ser utilizados para identificar los cromosomas humanos con los que los ácidos nucleicos son asociados. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 pueden ser utilizados para identificar el cromosoma 2 humano. Por lo tanto, estos ácidos nucleicos también pueden ser usados para hacer mapas de genes sobre el cromosoma 2 humano; identificar los genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras condiciones humanas asociadas con el cromosoma 2 humano, y estudiar la transducción de la célula señal y el sistema inmunológico.

Los oligonucleótidos sentido o antisentido a partir de los ácidos nucleicos de la SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7 pueden ser utilizados para inhibir la expresión del respectivo polinucleótido codificado por los ácidos nucleicos.

La invención además abarca un método para la preparación un polipéptido, que comprende el cultivo de una célula huésped bajo las condiciones promoviendo la expresión del polipéptido. El polipéptido luego se puede recuperar a partir del medio de cultivo. Especialmente, se abarca por la invención, la expresión de estos polipéptidos en células de bacterias, levaduras, plantas, insectos, y animal.

En general, los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados para estudiar los procedimientos celulares tales como regulación inmune, proliferación celular, muerte celular, migración celular, interacción célula-a-célula, y respuestas inflamatorias. Además, estos polipéptidos pueden ser utilizados para identificar las proteínas asociadas con IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2.

Además, estos polipéptidos pueden ser utilizados en ensayos de selección de inhibidores del potencial de la actividad asociada con la contra-estructura molecular del polipéptido, y como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por la contra-estructura molecular del polipéptido. Adicionalmente, estos polipéptidos pueden ser utilizados en el diseño de inhibidores de los mismos (por ejemplo, receptores artificiales que actúan como inhibidores).

Las secuencias de ácido nucleico de IL-1 zeta, las secuencias del aminoácido predichas del polipéptido o los fragmentos de estos, o una combinación de las secuencias del aminoácido predichas del polipéptido y fragmentos de estos, pueden ser utilizados en la búsqueda de un banco de datos electrónico para ayudar en la identificación de ácido nucleicos y/o proteínas de la muestra. Los polipéptidos revelados en esta pueden ser utilizados como controles para establecer la extensión de fragmentación de la proteína.

Anticuerpos policlonales o monoclonales aislados que se unen a estos polipéptidos también se abarcan por la invención. Estos anticuerpos pueden ser utilizados para ayudar en la purificación de los polipéptidos de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 da un diagrama de la estructura genómica del locus IL-1 zeta.

Figura 2 representa un modelo molecular que muestra la estructura secundaria de la IL-1 zeta, en la que cadenas-\beta se muestran en amarillo, con su dirección indicada por la punta de la flecha; giros-\beta se muestran en azul; y los espirales se muestran en verde. La estructura IL-1 zeta se presenta en dos diferentes criterios.

Descripción detallada de la invención

Las moléculas de ácido nucleico comprendidos en la invención incluye las siguientes secuencias de nucleótido:

Nombre: IL-1-zeta

1

\newpage

Nombre: Xrec2 (no comprendido en la invención)

2

3

Nombre: TDZ.1

4

Nombre: TDZ.2

5

\vskip1.000000\baselineskip

Nombre: TDZ.3 (no comprendido en la invención)

6

Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos codificados por la secuencia de nucleótido de la invención incluyen:

Nombre: IL-1 zeta (polipéptido)

7

\newpage

Nombre: Xrec2 (polipéptido) (no comprendido en la invención)

8

TDZ.1 (polipéptido)

9

Nombre: TDZ.2 (polipéptido)

10

Nombre: TDZ.3 (polipéptido) (no comprendido en la invención)

11

El descubrimiento de la IL-I zeta, las variantes de empalme de IL-1 zeta (TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3) y los ácidos nucleicos Xrec2 permite la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos respectivos y las células huésped transferidas o transformadas con los vectores de expresión. También se permite el aislamiento y purificación de IL-1 zeta biológicamente activo, las variantes de empalme IL-1 zeta, y los polipéptidos Xrec2 y fragmentos de estos. Los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de estos pueden ser utilizados como pruebas para identificar el ácido nucleico que codifica las proteínas que tienen actividades asociadas. Por lo tanto, IL-1 zeta y las variantes de empalme de IL-1 zeta pueden ser utilizados para identificar las actividades asociadas con la familia ligando IL-1s y Xrec2 pueden ser utilizados para identificar las actividades asociadas con la familia receptor IL-1es. Además, los ácidos nucleicos o los oligonucleótidos de estos de IL-1 zeta TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 pueden ser utilizados para identificar cromosomas humanos 2, mientras aquellos de Xrec2 pueden ser utilizados para identificar cromosoma X humano. Del mismo modo, estos ácidos nucleicos o los oligonucleótidos de estos pueden ser utilizados para hacer mapas de genes sobre cromosomas humanos 2 y X. respectivamente, y para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras condiciones humanas asociadas con cromosomas humanos 2 y X. Por lo tanto, los ácidos nucleicos o los oligonucleótidos de estos de IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 pueden ser utilizados para identificar glaucoma, displacia ectodérmica, diabetes mellitus insulin-dependiente, síndrome de la piel arrugada, leucemia/linfoma célula-T, y distrofia muscular de la tibia, mientras los ácidos nucleicos de Xrec2 o los oligonucleótidos de estos pueden ser utilizados para identificar retinosquisis, lisencefalia, heterotopía en bandas generalizada, retraso mental, síndrome de Cowchock, síndrome de Bazex, hipertricosis, síndrome linfoproliferativo, inmunodeficiencia, Displasia mesomélica de Langer, y leucemia. Finalmente, los oligonucleótidos sentido o antisentido monocatenarios a partir de estos ácidos nucleicos pueden ser utilizados para inhibir la expresión de polinucleótidos codificados por los genes IL-1 zeta y Xrec2, respectivamente.

Adicionalmente, los polipéptidos de IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2 y los fragmentos solubles de estos pueden ser utilizados para activar y/o inhibir la activación de células endoteliales vasculares y linfocitos, inducen y/o inhiben la inducción de la destrucción tisular local y fiebre (Janeway et al., 1996), inhiben y/o estimulan los macrófagos y las células endoteliales vascular para producir IL-6, inducen y/o inhiben la inducción de prostaglandinas, óxido nítrico sintetasa, y metaloproteinasas, y expresan y/o inhiben la expresión de las moléculas sobre la superficie de células endoteliales vasculares. Además estos polipéptidos y péptidos fragmentados también pueden ser usados para inducir y/o inhibir la inducción de mediadores inflamatorios tales como factores de transcripción NF-_{k}B y AP-1, MAPquinasas JNK y p38, COX-2, iNOS, y todas las actividades estimuladas por estas moléculas.

Además, estos polipéptidos y péptidos fragmentados pueden ser utilizados como controles para la fragmentación de péptidos. Finalmente, estos polipéptidos y fragmentos de estos pueden ser utilizados para generar anticuerpos, y la invención incluye el empleo de tales anticuerpos para purificar los polipéptidos IL-1 zeta y Xrec2.

Molécula de ácido nucleicos

En una modalidad particular, la invención se relaciona con ciertas secuencias de nucleótidos aisladas que están libres del material endógeno contaminante. Una "secuencia de nucleótido" se refiere a una molécula de polinucleótido en la forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande. La molécula de ácido nucleico ha sido derivada a partir de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración facilitando la identificación, manipulación, y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes por métodos bioquímicos estándar (tales como aquellos delineados en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Tales secuencias son preferiblemente proporcionadas y/o construidas en la forma de un marco de lectura abierta ininterrumpido por secuencias no-traducidas internas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no-traducidas pueden estar presentes en 5’ o 3’ a partir de un marco de lectura abierta, donde el mismo no interfiere con la manipulación o la expresión de la región codificada.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN en ambas formas monocatenaria y bicatenaria, así como el complemento de ARN de estas. El ADN incluye, por ejemplo, cADN, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, el ADN amplificado por PCR, y las combinaciones de estos. El ADN genómico puede ser aislado por técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando el cADN de las SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 7 o un fragmento de estos apropiado, como una sonda.

Las moléculas de ADN de la invención incluyen genes íntegros así como polinucleótidos y fragmentos de estos. El gen íntegro puede incluir el péptido señal N-terminal. Otras modalidades incluyen ADN que codifica una forma soluble, por ejemplo, que codifica el dominio extracelular de la proteína, ya sea con o sin el péptido señal.

Los ácidos nucleicos de la invención son preferencialmente derivados de fuentes humanas, pero la invención, también incluye aquellos derivados de especies no-humanas.

Secuencias Preferidas

Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferidas de la invención son aquellas mostradas en las SEQ ID NOs: 1 y 6 para IL-1 zeta y TDZ.2, respectivamente. Los clones de cADN que tienen la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOs: 1 y 2 se aislaron como se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias de los aminoácidos de IL-1 zeta y Xrec2 codificados por los ADNs de las SEQ ID NOs: 1 y 2 se muestran en las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente. Los clones de cADN que tienen la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOs: 5, 6, y 7 se aislaron como se describe en el Ejemplo 8. Las secuencias de los aminoácidos de TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 codificados por los ADNs de las SEQ ID NOs: 5, 6, y 7 se muestran en las SEQ ID NOs: 8, 9, y 10, respectivamente.

Las SEQ ID NOs: 1-4 identifican la IL-1 zeta de la SEQ ID NO: 3 como un miembro de la familia IL-1 y el Xrec2 de la SEQ ID NO: 4 como un miembro de la familia receptor IL-1. Las homologías en las cuales se basa, están publicadas en la Tabla I.

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TABLA I

Proteína	Fuente	Porcentaje de identidad para IL-1 zeta
IL-1 alfa	Humano	21%
IL-1 beta	Humano	24%
IL-1 delta	Humano	34%
IL-18	Humano	21%
IL-1ra	Humano	29%
Proteína	Fuente	Porcentaje de identidad para Xree2
TIGIRR (miembro de la familia IL-1 R)	Humano	63%
TIGIRR (miembro de la familia IL-1R)	Murina	61%
SIGIRR	Humano	22%
IL-1R-AcP	Humano	35%
IL-1R-AcPL	Humano	26%
IL-1R	Humano	29%
RP 1	Humano	31%
RP2	Humano	28%
ST2	Humano	26%

Las variantes de empalme IL-1 zeta se descubrieron en un tramo de la secuencia genómica de ADN (X22304.gbn). Esta secuencia genómica también contiene los diferentes exones de IL-1 zeta y otra variante de empalme conocida como Tango-77 (WO 99/06426). Que comparan las secuencias del cADN de la IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Tango-77 clonadas con la secuencia genómica proporciona comprensión en la generación de los eventos de corte y empalme. La figura 1 muestra la estructura genómica del locus de la IL-1 zeta y el cADNs generado por el corte y empalme alternativo. Las cajas numeradas indican 1-6 exones individuales y el tamaño aproximado de los intrones interviniendo se indica arriba. El asterisco (*) indica la presencia de un codón de terminación, al final de la secuencia codificada (exón 6) o como un codón de terminación dentro del marco (exón 3). "M" indica un potencial de iniciación con metionina originado ya sea a partir de exón 1 o exón 3. Tango-77 es la estructura de cADN revelada en WO 99/06426. Una característica significante de la IL-1 zeta y sus variantes de empalme es la presencia o la ausencia del exón 4. El exón 4 se presenta en la IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 pero no en Tango-77 o TDZ.3. La secuencia de aminoácido codificada por exón 4 se alinea bien con las secuencias de aminoácido de otros miembros de la familia IL-1 en las primeras hebras beta de los péptidos maduros. Por contraste, las secuencias de aminoácido codificadas por exones 1 y 2 del Tango-77 y exón 1 de TDZ.3 cADNs, que reemplaza en vez del suplemento exón 4 de IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2, no se alinean bien con otros miembros de la familia IL-1 en esta misma región. La IL-1 zeta, Tango-77, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 todas alinean bien con las secuencias de aminoácido de otros miembros de la familia IL-1 en el C-terminal 2/3 del péptido maduro (la región codificada por los exones 5 y 6 los cuales son comunes a todas aquellas isoformas de empalme). Por lo tanto, los "péptidos maduros" codificados por IL 1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 ADNs son probablemente representados como las moléculas IL-1 funcionales. Esto contrasta con los polipéptidos codificados por Tango-77 o TDZ.3 ADNs que probablemente son menos representados como una molécula IL-1 funcional.

Es probable que todas las isoformas de empalme, excepto TDZ.3, codifiquen proformas de una IL-1 como citoquina, dado que en la dirección del N-terminal los cADNs se extienden mucho más allá del N-terminal de IL-1s maduros. Esta observación predice que la IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2 codifica el mismo péptido maduro. En relación con esta observación esta es el pro-dominio (así como 5’ UTRs) que difieren entre la IL-1 zeta, TDZ.1 y TDZ.2.

La Tabla III, la cual detalla la distribución tisular de la IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Tango-77, muestra que la expresión de Tango-77 está más extendida que aquella de la IL-1 zeta. La Tabla III también muestra que la expresión TDZ.1 es comparable, y casi completamente traslapada, con aquellos de Tango-77. Los datos de distribución tisular combinados con la información de alineación de la Figura 1 muestra que TDZ.1 es el único miembro de las variantes de empalme que se aliena bien con otros miembros de la familia IL-1, y se extiende en su expresión. Estas observaciones sugieren que TDZ.1 puede ser la más significante de las variantes de empalme en términos de relevancia a las respuestas biológicas.

Secuencias Adicionales

Debido a la conocida degeneración del código genético, en donde más que un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar a partir de aquella mostrada en las SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, y 7 y aún así codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: 3, 4, 8, 9, y 10, respectivamente. Tales secuencias de ADN variante pueden resultar de mutaciones inadvertidas (por ejemplo, que ocurren durante la amplificación PCR), o puede ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

La invención proporciona secuencias aisladas de ADN que codifican los polipéptidos de la invención, seleccionada de: (a) ADN que comprende las secuencias de nucleótido de la SEQ ID NOs: 1, 5, y 6 y (b) ADN que codifican los polipéptidos de la SEQ ID NOs: 3, 8, y 9. Por supuesto, los polipéptidos codificados por tales secuencias de ADN están comprendidos por la invención.

Como se usa en esta, las condiciones de severidad moderada pueden ser fácilmente determinadas por aquellos que tienen ordinaria habilidad en el oficio basado en, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas son publicadas por Sambrook et al., Molecular Cloning: Un Manual de Laboratorio. 2nd ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e incluye el empleo de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS 0.5%, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), las condiciones de hibridización de aproximadamente 50% de formamida, 6X SSC a aproximadamente 42ºC (u otras soluciones de hibridización similares, tales como solución de Stark, en aproximadamente 50% de formamida a aproximadamente 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, 0.5X SSC, SDS 0.1%. Las condiciones de alta severidad también pueden ser fácilmente determinadas por el artesano experimentado basado en, por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridización como arriba, y con el lavado a aproximadamente 68°C, 0.2X SSC, SDS 0.1%. El artesano experimentado reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado pueden ser ajustadas según sea necesario de acuerdo con los factores tales como la longitud de la
sonda.

También se incluye según una modalidad de la invención el ADN que codifica ciertos fragmentos del polipéptido y polipéptidos que comprenden el sitio(s) de N-glicosilación inactivado(s), sitio(s) de elaboración de proteasa inactiva-
do(s), o sustitución(s) de aminoácido conservadora, según se describe abajo.

Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender secuencias de nucleótidos que son al menos 80% idénticas, al menos 90% idénticas, al menos 95% idénticas, al menos 98% idénticas, al menos 99% idénticas, o al menos 99.9% idénticas para una secuencia nativa.

El porcentaje de identidad se puede determinar por inspección visual y cálculo matemático, Como alternativa, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico puede ser determinado por la comparación de la información de la secuencia utilizando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984, y disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no-identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación de pesada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, según se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence y Structure, pp. 353-358, National Biomedical Research Foundation, 1979; (2) una penalización de 3.0 por cada hueco y una pena adicional de 0.10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) no penalización para huecos terminales. Otros programas utilizados por alguien de habilidad en el oficio de comparación de secuencia también pueden ser empleados.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados útiles en la producción de polipéptidos. Tales polipéptidos se pueden preparar mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención, o un fragmento deseado de esta se puede subclonar en un vector de expresión para la producción del polipéptido o de un fragmento. La secuencia de ADN ventajosamente se mezcla con una secuencia que codifica un apropiado líder o un péptido señal. De manera alterna, el fragmento deseado se puede sintetizar químicamente utilizando técnicas conocidas. Los fragmentos de ADN también se pueden producir por digestión con endonucleasa de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislada por electroforesis sobre geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen el terminal 5’ o 3’ en un punto deseado se pueden ligar a un fragmento de ADN generado por la digestión con la enzima de restricción. Tales oligonucleótidos adicionalmente pueden contener una endonucleasa de restricción en el sitio de división de la secuencia corriente arriba de la secuencia codificada deseada, y la posición de un codón de iniciación (ATG) en el N-terminal de la secuencia codificada.

El procedimiento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) conocido se puede emplear para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Los oligonucleótidos que definen el terminal deseado del fragmento de ADN son empleados como cebadores 5’ y 3’. Los oligonucleótidos adicionalmente pueden contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en un vector de expresión. Las técnicas PCR se describen en Saiki et al., Science, 239:487, 1988; Wu et al., eds., Recombinant ADN Methodology, pp. 189-196, Academic Press, Inc., San Diego, 1989; y Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications, Academic Press, Inc., 1990.

Polipéptidos y fragmentos de éstos

La invención abarca polipéptidos y fragmentos de estos en varias formas, que incluyen aquellos que ocurren naturalmente o producidos a través de varias técnicas tales como procedimientos que involucran tecnología de ADN recombinante. Tales formas incluyen, pero no limitan a, derivados, variantes, y oligómeros, así como proteínas de fusión o fragmentos de estas.

Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de longitud completa codificadas por las secuencias de ácido nucleico de la invención publicadas arriba. Los polipéptidos de IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2 comprenden la secuencia de aminoácido de las SEQ ID NOs: 3, 4, 8, 9, y 10 respectivamente. Para IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ-3, el N-terminal no codifica al péptido señal clásico pero la longitud extra relativa a la forma madura de otros miembros de la familia IL-1 sugiere que el N-terminal puede actuar como un prodominio. Un sitio de división predicho es el punto donde la porción estructural conservada de la proteína da inicio. Los datos de moldeado estructural soportan esta suposición. Para IL-1 zeta, TDZ.1, y TDZ.2 el sitio está en algún lugar cercano al final N-terminal de la secuencia de aminoácido codificada por exón 4. Por lo tanto, el polipéptido de IL-1 zeta, como se publica en la SEQ ID NO: 3, incluye un prodominio putativo que se extiende a partir de los aminoácidos 1 a x, donde x es un número entero desde 20 a 50. Del mismo modo, TDZ.1 de la SEQ ID NO: 8 incluye un prodominio putativo que se extiende a partir de los aminoácidos 1 a x’ donde x’ es un número entero desde 40-60 y más preferiblemente x’ es aproximadamente 52. TDZ.2 de la SEQ ID NO: 9 incluye un prodominio putativo que se extiende de los aminoácidos 1 a x'', donde x'' es un número entero desde 20-40 y más preferible x'' es 31.

IL-1 zeta diferente y sus variantes de empalme, el polipéptido de Xrec2, como se publica en la SEQ ID N0: 4, incluyen una región hidrofóbica N-terminal que funciona como un péptido señal, seguido por un dominio extracelular que comprende 19 a 359 aminoácidos, una región transmembrana que comprende de 360 a través de 378 aminoácidos, y un dominio citoplasmático C-terminal que comprende 379 a 696 aminoácidos. Un análisis por ordenador predice que el péptido señal corresponde a los residuos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 4 (aunque los sitios de división del péptido señal pronosticados por ordenador próximos más verosímiles, en orden descendente, ocurre después de 20 y 16 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4). La división del péptido señal de esta manera produciría una proteína madura que comprende los aminoácidos 19 a través de 696 de la SEQ ID NO: 4.

El artesano experimentado reconocerá que los alineamientos descritos arriba de tales regiones del polipéptido son aproximados. Ilustrar, los alineamientos de la región transmembrana (que pueden se pronosticadas mediante el uso de programas de ordenador disponibles para este propósito) pueden diferir de aquellos descritos arriba.

Los polipéptidos de la invención pueden ser unidos por la membrana o pueden ser secretados y, de esta manera, solubles. Los polipéptidos solubles son capaces de ser secretados de las células en las cuales ellas son expresadas En general, los polipéptidos solubles pueden ser identificados (y se distinguen de los equivalentes enlace-membrana no-solubles) por la separación de células intactas que expresan el polipéptido deseado del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, y el análisis del medio (sobrenadante) para la presencia del polipéptido deseado. La presencia del polipéptido en el medio indica que el polipéptido fue secretado a partir de las células y de esta manera es una forma soluble de la proteína.

En una modalidad, los polipéptidos solubles y fragmentos de estos comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero carecen de la región transmembrana que podría causar la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Un polipéptido soluble puede incluir el dominio citoplasmático, o una porción de estos, mientras el polipéptido sea secretado a partir de la célula en la cual esta se produce.

En general, el uso de formas solubles es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de los polipéptidos a partir de células huésped recombinantes se facilita, dado que los polipéptidos solubles son secretados a partir de las células. Adicionalmente, los polipéptidos solubles son generalmente más apropiados por administración intravenosa.

La invención también proporciona ciertos polipéptidos y los fragmentos del dominio extracelular que retienen una actividad biológica deseada. Modalidades particulares se dirigen a los fragmentos del polipéptido de las SEQ ID NOs: 3, 8, y 9 que retienen la habilidad para unir los análogos nativos, sustratos, o contra-estructura ("enlace asociado"). Tal fragmento puede ser un polipéptido soluble, según se describe arriba. En otra modalidad, los polipéptidos y fragmentos ventajosamente incluyen regiones que son conservadas en la familia ligando IL-1 y receptor IL-1 según se describe arriba.

Los fragmentos del polipéptido pueden comprender al menos 20, o al menos 30, aminoácidos contiguos de las secuencias de las SEQ ID NOs: 3, 4, 8, 9, y 10. Los fragmentos derivados a partir del dominio citoplasmático de Xrec2 de la SEQ ID NO: 4 encuentran el uso en los estudios de transducción de señal, y en procedimientos de regulación celular asociados con transducción de señales biológicas. Los fragmentos del polipéptido también pueden ser empleados como inmunógenos, en la generación de anticuerpos.

Variantes

Las variantes que ocurren naturalmente así como las variantes derivadas de los polipéptidos y los fragmentos son proporcionadas en esta.

Las variantes pueden exhibir secuencias de aminoácido que son al menos 80% idénticas, al menos 90% idénticas, al menos 95% idénticas, al menos 98% idénticas, al menos 99% idénticas, o al menos 99.9% idénticas al polipéptido preferido o al fragmento de estos. La presente invención proporciona un polipéptido aislado que es al menos 95% idéntico a un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 3, 8 o 9 en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL-1R, y un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica tal polipéptido. El porcentaje de identidad puede ser determinado por inspección visual y cálculo matemático. De manera alterna, el porcentaje de identidad de dos secuencias de proteína puede ser determinada por la comparación de la información de la secuencia utilizando el programa de ordenador GAP, basado en el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Bio. 48:443, 1970) y disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluye: (1) una matriz de recuento, blosum62, como se describe por Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915, 1992; (2) un peso del hueco de 12; (3) un peso de la longitud del hueco de 4; y (4) no penaliza para huecos finales. Otros programas utilizados por alguien de habilidad en el oficio de comparación secuencias también pueden ser utilizados.

Las variantes de la invención incluyen, por ejemplo, aquellas que resultan de los eventos de corte y empalme de mARN alterno o de la división proteolítica. El corte y empalme alterno de ARNm puede, por ejemplo, producir una proteína truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de la proteína que ocurre naturalmente. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en el N- o C-terminal sobre la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales a partir de la proteína (generalmente desde 1-5 aminoácidos terminales). También se contemplan en esta, las proteínas en las que las diferencias en la secuencia de aminoácido son atribuibles al poliformismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína).

Variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden ser modificados para crear derivados de estos mediante la formación de conjugados covalente o agregativo con otra fracciones químicas, tales como grupos glicosil, lípidos, fosfato, grupos acetil y similares. Derivados covalentes pueden prepararse mediante el acoplamiento de las fracciones químicas a grupos funcionales sobre las cadenas laterales del aminoácido o en el N-terminal o C-terminal de un polipéptido. Los conjugados que comprenden agentes de diagnóstico (detectable) o agentes terapéuticos adheridos a estos se contemplan es esta, como se discute con más detalle abajo.

Otros derivados incluyen conjugados covalente o agregativo de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos, tales como síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminal o C-terminal. Ejemplos de proteínas de fusión se discuten abajo en conexión con oligómeros. Adicionalmente, las proteínas de fusión pueden comprender péptidos adicionados para facilitar la purificación y identificación. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o la identificación de péptidos antigénicos descritos en la Patente U.S. No. 5, 011,912 y en Hopp et al., Bio/Technology, 6:1204, 1988. Tal péptido es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 11), que es altamente antigénico y proporciona un epítope reversiblemente unido mediante un anticuerpo monoclonal específico, facilitando un ensayo rápido y la purificación superficial de una proteína recombinante expresada. Un hibridoma murina designado como 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG® en la presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente U.S. 5, 011,912. La línea celular del hibridoma 4E11 se ha depositado con la American Type Culture Collection bajo el acceso No. HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG® son disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Entre los polipéptidos de la variante proporcionados en esta, están las variantes de los polipéptidos nativos que retienen la actividad biológica nativa o el equivalente sustancial de estos. Un ejemplo es una variante que se une con esencialmente la misma afinidad de enlace como la de la forma nativa. La afinidad del enlace puede ser medida por procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. No. 5, 512,457 y como se publica abajo.

Las variantes incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos a la forma nativa, pero que tienen una secuencia de aminoácido diferente de aquella de la forma nativa a causa de una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Modalidades particulares incluyen, pero no limitan a, polipéptidos que comprenden desde una a diez deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia nativa.

Un aminoácido dado puede ser reemplazado, por ejemplo, por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de tales sustituciones conservadoras incluyen sustitución de un residuo alifático por otro, tales como Ile, Val, Leu, o Ala por uno al otro; sustituciones de un residuo polar por otro, como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn; o sustituciones de una residuo aromático por otro, tal como Phe, Trp, o Tyr por uno al otro. Otras sustituciones conservadoras, por ejemplo, que involucran sustituciones de regiones enteras que tienen características hidrofóbicas similares, son conocidas.

Del mismo modo, los ADNs de la invención incluyen variantes que difieren de una secuencia nativa de ADN a causa de una o más deleciones, inserciones o sustituciones, pero que codifican un polipéptido activo biológicamente.

La invención además incluye los polipéptidos de la invención con o sin glicosilación nativa-patrón asociada. Los polipéptidos expresados en levaduras o sistemas de expresión de mamífero (por ejemplo, células COS-1 o COS-7) pueden ser similares a o -significantemente diferentes de un polipéptido nativo en peso molecular y glicosilación patrón, dependiendo del cambio del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de la invención en sistemas de expresión de bacterias, tales como E. coli, proporciona moléculas no-glicosiladas. Adicionalmente, una preparación dada puede incluir especies múltiples glicosiladas diferencialmente. Los grupos glicosil pueden ser eliminados a través de métodos convencionales, en particular aquellos que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipéptidos glicosilados de la invención se pueden incubar con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer Mannheim).

Respectivamente, las construcciones de ADN similares que codifican varias adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos o secuencias, o deleciones de residuos terminales o internos o secuencias son comprendidas por la invención. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el polipéptido dominio extracelular pueden ser modificados para prevenir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en mamífero y sistemas de expresión en levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un aminoácido triplete Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. Apropiadas sustituciones, adiciones, o deleciones en las secuencias de nucleótido que codifican estos tripletes resultarán en prevención de adherencias de residuos de carbohidratos en la cadena lateral Asn. La alteración de un nucleótido sencillo, escogida con el propósito de que Asn se reemplace por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente inactivar un sitio de N-glicosilación. De manera alterna, el Ser o Thr pueden ser reemplazados con otro aminoácido, como Ala. Procedimientos conocidos para inactivación de sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la Patente U.S.
5, 071,972 y EP 276,846.

En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden ser alteradas para originar los residuos Cys para ser suprimidos o remplazados con otros aminoácidos, impidiendo la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos bajo plegamiento o renaturalización.

Otras variantes se preparan por la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes, para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en las cuales la actividad de la proteasa KEX2 esta presente. EP 212,914 revela el uso de mutagénesis sitio-específico para inactivar la proteasa KEX2 que procesa los sitios en una proteína. La proteasa KEX2 que procesa los sitios se inactiva por deleción, adición, o sustitución de residuos para cambiar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar el evento de estos residuos básicos adyacentes. Los apareamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la división de KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa una estrategia conservadora y preferida para desactivar los sitios KEX2.

Oligómeros

Abarcados por la invención están los oligómeros o las proteínas de fusión que contienen polipéptidos de IL-1 zeta, TDZ.1 o TDZ.2. Cuando el polipéptido de la invención es una proteína membrana tipo I, la pareja de fusión está ligada al C-terminal de la proteína de membrana tipo I. Tales oligómeros pueden estar en la forma de multímeros ligados-covalentemente o no-ligados-covalentemente, incluyendo dimeros, trimeros, u oligómeros más grandes. Como se señalo anteriormente, los polipéptidos preferidos son solubles y de esta manera estos oligómeros pueden comprender polipéptidos solubles. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la habilidad de unir los componentes del polipéptido y suministran los sitios de unión bivalente, trivalente, etc, para estos.

Una modalidad de la invención se orienta a los oligómeros que comprenden multiples polipéptidos conectados vía interacciones covalentes o no-covalentes entre fracciones de péptidos fusionados a los polipéptidos. Tales péptidos pueden ser péptidos ligadores (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de la promoción de oligomerización. Los Cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están en medio de los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos adheridos a estos, como se describe con más detalle abajo.

Oligómeros basados en Inmunoglobulina

Como una alternativa, un oligómero se preparó utilizando los polipéptidos derivados de las inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprende ciertos polipéptidos heterólogos fundidos a varias porciones de polipéptidos derivados del anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al., PNAS USA 88:10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; y Hollenbaugh y Aruffo, "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins," en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11, 1992.

Una modalidad de la presente invención se orienta a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas por la fusión de un polipéptido de la invención con un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo. Un gen de fusión que codifica el polipéptido/proteína de fusión Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Polipéptido/proteínas de fusión Fc son expresadas en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo un ensamble muy similar a las moléculas anticuerpo, con lo cual se forman los enlaces disulfuro intercadena entre las fracciones Fc para producir las moléculas divalentes.

El término "polipéptido Fc " como se utiliza en esta incluye formas nativas y muteínas de los polipéptidos construidos de la región Fc de un anticuerpo que comprende cualquiera o todos los dominios CH de la región Fc. Las formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización también se incluyen. Los polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo IgGI humano.

Un apropiado polipéptido Fc, descrito en la aplicación PCT WO 93/10151, es un polipéptido de cadena sencilla que extiende de la región bisagra N-terminal al C-terminal nativo de la región Fc of un anticuerpo IgGI humano. Otro polipéptido Fc útil, es la muteína Fc descrito en la Patente U.S. 5,457,035 y en Baum et al., EMBD J. 13:3992-4001, 1994.

La secuencia de aminoácido de esta muteína es idéntica a esa de la secuencia nativa Fc presentada en WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para los receptores Fc.

Las proteínas de fusión descritas arriba que comprenden las fracciones Fc (y los oligómeros formados de estos) ofrecen la ventaja de fácil purificación por cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

En otras modalidades, los polipéptidos de la invención pueden ser sustituidos por la porción variable de un anticuerpo de cadena pesada o ligera. Si las proteínas de fusión se hacen con ambas cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero con tantas como cuatro regiones extracelulares del polipéptido.

Oligómeros Basados-Ligadores-Péptidos

De manera alterna, el oligómero es una proteína de fusión que comprende polipéptidos multiples, con o sin ligadores de péptidos (péptidos espaciadores). Entre los ligadores de péptidos apropiados están aquellos descritos en las Patentes U.S. 4, 751,180 y 4, 935,233.

Una secuencia de ADN que codifica un deseado ligador de péptido puede ser insertada entre, y en el mismo marco de lectura como, las secuencias de ADN de la invención, utilizando cualquier técnica convencional apropiada. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica el ligador puede ser ligado entre las secuencias. En modalidades particulares, una proteína de fusión comprende de dos a cuatro polipéptidos solubles de la invención, separados por ligadores de péptidos. Leucina-Cremalleras.

Otro método para la preparación de los oligómeros de la invención involucra el uso de un cremallera de leucina. Los dominios cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales ellas se encuentran. Los cremalleras de leucina se identifican originalmente en muchas proteínas enlace-ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988), y dado que se ha encontrado en una variedad de diferentes proteínas. En medio de los conocidos cremalleras de leucina están los péptidos que ocurren naturalmente y los derivados de estos que dimerizan o trimerizan.

El dominio cremallera (también referido en esta como una oligomerización, o que forma un oligómero, dominio) comprende una repetición siete veces repetitiva, generalmente con cuatro o cinco residuos de leucina entremezclados con otros aminoácidos. Ejemplos de dominios cremallera son aquellos encontrados en el factor de transcripción de levaduras GCN4 y una proteína termoestable enlace-ADN encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al., Science, 243:1681, 1989). Dos proteínas transformantes nucleares, fos y jun, también exhiben dominios cremallera, como hace el producto de gen del protooncogén en murina, c-myc (Landschulz et al., Science, 240:1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios cremallera que preferencialmente forman heterodímeros (O’Shea et al., Science, 245:646, 1989; Turner et al., Science, 243:1689, 1989). El dominio cremallera es necesario para la actividad biológica (enlace-ADN) en estas proteínas.

Las proteínas fusogénicas de virus diferentes diversos, incluyendo paramixovirus, virus corona, virus de sarampión y muchos retrovirus, también poseen dominios cremallera (Buckland et al., Nature, 338:547,1989; Britton, Nature, 353:394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research y Human Retroviruses, 6:703, 1990). Los dominios cremallera en estas proteínas virales fusogénicas están cerca de la región transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios cremallera podrían contribuir con la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de proteínas virales fusogénicas se involucra en la formación de poros de fusión (Spruce et al, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 88:3523, 1991). Los dominios Cremallera también se han reportado recientemente por jugar un papel en la oligomerización de factores transcripción de choque térmico (Rabindran et al., Science, 259: 230, 1993).

Los dominios Cremallera se doblan en corto, superhélices en paralelo. (O’Shea et al., Science, 254:539, 1991) La arquitectura general de la superhélice en paralelo ha sido caracterizada, con un empaquetamiento "botón-ojal" según lo propuesto por Crick en 1953 (Crick, Acta Crystallogr. 6:689, 1953). El dímero formado por un dominio cremallera se estabiliza mediante las siete repeticiones, señaladas (abcdefg)_{n} de acuerdo con la notación de McLachlan y Stewart, J. Mol. Biol., 98:293, 1975, en la cual los residuos a y d son generalmente residuos hidrofóbicos, con d siendo una leucina, que alinean sobre la misma cara de una hélice. Los residuos cargados-opuestamente normalmente ocurren en las posiciones g y e. Por lo tanto, en una superhélice en paralelo formado a partir de dos dominios cremallera helicoidales, los "botones" formadas por las cadenas laterales hidrofóbicas de la primera hélice se empacan en los "ojales" formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los residuos en la posición d (frecuentemente leucina) contribuye a las energías de estabilización hidrofóbica grandes, y son importantes para la formación de oligómeros (Krystek et al., Int. J. Peptide Res., 38:229, 1991). Lovejoy et al., Science, 259:1288, 1993, recientemente se reporto la síntesis de un fascículo \alpha-helicoidal tricatenario en la cual las hélices corren arriba-arriba-abajo. Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrofóbica proporciona la fuerza de conducción principal para la formación de superhélices de los monómeros helicoidales. Estos estudios también indican que las interacciones electrostáticas contribuyen a la estequiometría y geometría de superhélices. Adicionalmente la discusión de la estructura de los Cremalleras de leucina encontrados en Harbury et al., Science, 262:1401, 1993.

Ejemplos de dominios cremallera de leucina apropiados para la producción de proteínas oligoméricas solubles se describen en la aplicación PCT WO-94/10308, y el cremallera de leucina derivado de la proteína D del surfactante en el pulmón (SPD) descrito en Hoppe et al., FEBS Letters, 344:191, 1994. El uso de un cremallera de leucina modificado que permita la trimerización estable de una proteína heteróloga fundida a esta se describe en Fanslow et al., Semin. Immunol., 6:267-278, 1994. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido soluble fundido a un péptido cremallera de leucina se expresan en unas células huésped apropiadas, y el oligómero soluble que forma se recupera a partir del sobrenadante de cultivo.

Ciertas fracciones cremallera de leucina preferencialmente forman trímeros. Un ejemplo es un cremallera de leucina derivado de la proteína D del surfactante en el pulmón (SPD), como se describe en Hoppe et al., FEBS Letters, 344:191, 1994, y en la Patente U.S. 5, 716,805.

Este péptido cremallera de leucina SPD-derivado de pulmón comprende la secuencia de aminoácido Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gin Val Gln His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr (SEQ ID NO:12).

Otro ejemplo de un cremallera de leucina que promueve la trimerización es un péptido que comprende la secuencia de aminoácido Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg (SEQ ID NO: 13), como se describe en la Patente U.S. 5,716,805. En una modalidad alterna, un residuo Asp N-terminal se adiciona; en otra, el péptido carece del residuo Arg N-terminal.

Los fragmentos de los péptidos cremallera antes mencionados que retienen la propiedad de promover la oligomerización también pueden ser empleados. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no limitan a, péptidos que carecen de uno o dos de los residuos N-terminal o C-terminal presentes en las secuencias de aminoácidos antes mencionadas. Los Cremalleras de leucina pueden ser derivados de los péptidos cremallera de leucina que ocurren naturalmente, por ejemplo, sustitución(s) vía conservadora en la secuencia de aminoácidos nativa, en donde la capacidad del péptido para promover la oligomerización se retiene.

Otros péptidos derivados de proteínas triméricas que ocurren naturalmente pueden ser empleados en la preparación de oligómeros triméricos. De manera alterna, los péptidos sintéticos que promueven la oligomerización pueden ser empleados. En modalidades particulares, los residuos de leucina en una fracción de cremallera de leucina se reemplazan por residuos de isoleucina. Tales péptidos que abarcan isoleucina pueden ser referidos como cremalleras de isoleucina, pero están comprendidos por el término "Cremalleras de leucina" según se emplea en esta.

Producción de polipéptidos y fragmentos de éstos

La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y los fragmentos de la invención se pueden llevar a cabo por cualquier técnica apropiada, incluyendo pero no limitando a los siguientes:

Sistemas de expresión

La presente invención también proporciona los vectores de clonación y expresión recombinantes y que contienen ADN, así como la célula huésped que contiene los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que contienen ADN pueden ser utilizados para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un método para la producción de polipéptidos comprende cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifican el polipéptido, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido, luego la recuperación de los polipéptidos expresados a partir del cultivo. El artesano experto reconocerá que el procedimiento de purificación de los polipéptidos expresados variará de acuerdo con tales factores como el tipo de células huésped empleadas, y si el polipéptido es membrana-unido o una forma soluble que se secreta a partir de la célula huésped.

Cualquier sistema de expresión apropiado puede ser empleado. Los vectores incluyen un ADN que codifica un polipéptido o fragmento de la invención, de manera que se puede operar ligado a las secuencias de nucleótidos reguladoras transcripcionales o transnacionales apropiadas, tales como aquellas derivadas de un gen de mamífero, microbiano, viral, o insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o potenciadores, un sitio de enlace ribosómico ARNm, y las secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción, iniciación y terminación. Las secuencias de nucleótidos se pueden operar ligadas cuando la secuencia reguladora funcionalmente se asocia a la secuencia de ADN. Por lo tanto, un promotor de secuencias de nucleótidos se puede operar ligado a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleótido promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN. Un origen de replicación que confiere a la habilidad para replicar en las deseadas células huésped, y un gen de selección por el cual se transforma e identifica, son generalmente incorporados en el vector de expresión.

Además, una secuencia que codifica un apropiado péptido señal (nativo o heterólogo) se puede incorporar en los vectores de expresión. Una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretor) puede ser fundido en el marco de la secuencia de ácido nucleico de la invención así que el ADN inicialmente se transcribe, y el ARNm se traduce, en una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped previstas para promover la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se divide a partir del polipéptido sobre la secreción del polipéptido de la célula.

El artesano experto también reconocerá que la(s) posición(s) en la que el péptido señal se divide puede diferir de aquella predicha por el programa de ordenador, y puede variar de acuerdo con tales factores como el tipo de células huésped empleado en la expresión de un polipéptido recombinante. Una preparación de proteína puede incluir una mezcla de moléculas de proteína que tienen diferentes aminoácidos N-terminales, resultando de la división del péptido señal en más de un sitio. Ejemplos singulares de proteínas maduras incluyen, pero no limitan a, proteínas que tienen el residuo en una posición 6,23,25,26,39,41, o 48 de la SEQ ID NO:3 y en la posición 1 o 19 de la SEQ ID NO:4 como el aminoácido N-terminal.

Células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas elevadas. Las células de mamífero o insectos generalmente se prefieren para utilizar como células huésped. Los vectores apropiados de clonación y expresión para utilizar con células huésped de bacterias, hongos, levaduras, y mamífero se describen, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985. Los sistemas de traducción célula-libre también se podrían emplear para producir polipéptidos utilizando ARNs derivados del ADN construido revelado en esta.

Sistemas Procarióticos

Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram-positivos. Las células huésped procariotas apropiadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula huésped procariota, tal como E. coli, un polipéptido puede incluir un residuo metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariota. La Met N-terminal puede ser dividida del polipéptido recombinante expresado.

Los vectores de expresión para utilizar en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores genéticos fenotípicos. Un gen marcador genético fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento autótrofo. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas incluyen aquellos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y de esta manera provee métodos simples para la identificación de células transformadas. Un apropiado promotor y una secuencia de ADN se insertan en el vector pBR322. Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Secuencias promotoras utilizadas comúnmente para vectores de expresión de célula huésped procariota recombinante incluye \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature, 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature, 281: 544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. 412, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Un sistema de expresión célula huésped procariota particularmente útil emplea un promotor del fago \lambdaPL y una secuencia del represor termolábil cI857ts. Los vectores plásmidos disponibles de la American Type Culture Collection que incorpora derivados del promotor \lambdaPL incluye plásmido pHUB2 (residente en la cepa E. coli JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en la E. coli RR1, ATCC 53082).

Sistemas de Levaduras

De manera alterna, los polipéptidos se pueden expresar en células huésped de levaduras, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Otros géneros de levaduras, tales como Pichia o Kluyveromyces, también pueden-ser-empleados. Los vectores de levadura con frecuencia contendrán un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2 \mu, una secuencia de replicación autónomamente (ARS), una región promotor, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción, y un gen marcador genético. Las secuencias promotoras apropiadas para vectores de levaduras incluye, en medio de otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J Adv. Enzyme Reg., 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato de decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvatoquinasa, triosefosfato isomerasa, fosfo-glucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores apropiados para utilizar en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73,657. Otra alternativa es el promotor glucosa-reprimible ADH2 descrito por Russell et al., J. Biol. Chem., 258: 2674, 1982; y Beier et al., Nature, 300:724, 1982. Los vectores transportadores replicables en ambas levaduras y E. coli pueden ser construidos por la inserción de secuencias de ADN a partir del pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de la replicación) en los vectores de levaduras descritos arriba.

Las levaduras de la secuencia líder del factor-\alpha pueden ser empleadas para dirigir la secreción del polipéptido. La secuencia líder del factor-\alpha se inserta frecuentemente entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. (Kurjan et al., Cell, 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81:5330, 1984.) Otras secuencias líder apropiadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes a partir de levaduras huésped se conocen por aquellos de habilidad en el oficio. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su final 3’ para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los protocolos de transformación son conocidos por aquellos de habilidad en el oficio. Un protocolo se describe por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. Seleccionado para transformantes Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base del nitrógeno de la levadura, 0.5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracilo.

Las células huésped de levadura transformada por los vectores que contienen una secuencia promotora ADH2 pueden ser cultivadas para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es el que consiste del 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, y 1% de glucosa suplementado con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio.

Sistemas de Mamífero o Insecto

Sistemas de cultivo de célula huésped de mamífero o insecto también se pueden emplear para expresar los polipéptidos recombinantes. Sistemas de Bacculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan por Luckow et al., Bio/Technology, 6:47, 1988. También se pueden emplear líneas celulares establecidas de origen mamífero. Ejemplos de líneas de célula huésped de mamífero apropiadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell, 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hamster Chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y el derivado de la línea celular CV1/EBNA a partir de la línea celular CV 1 de riñón de mono verde Africano (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al., EMBO J., 10: 2821, 1991.

Métodos establecidos para la introducción de ADN en las células de mamífero han sido descritos por Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, pp. 15-69,1990. Protocolos adicionales utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como el reactivo lípido Lipofectamine (Gibco/BRL) o reactivo lípido Lipofectamine-Plus, pueden ser utilizados para la transfección de células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:7413-7417, 1987). Además, la electroporación puede ser utilizada para la transfección de células de mamífero utilizando procedimientos convencionales, tales como aquellos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. La selección de transformantes estables se pueden llevar a cabo utilizando métodos conocidos en el oficio, tales como, por ejemplo, resistencia a drogas citotoxicas. Kaufman et al., Meth. in Enzymology, 185:487-511, 1990, se describen varios esquemas de selección, tales como resistencia a reductasa dihidrofolato (DHFR). Una apropiada cepa huésped para la selección de DHFR puede ser la cepa CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77:4216-4220, 1980). Un plásmido que expresa la DHFR en el cADN puede ser introducido en la cepa DX-B11, y solo las células que contienen el plásmido pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden ser incorporados en un vector de expresión incluyen cADNs que confiere la resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que hospedan el vector pueden ser seleccionadas sobre la base de la resistencia a estos compuestos.

Las secuencias control transcripcionales y translacional para vectores de expresión de célula huésped de mamífero se puede tomar por escisión de genomas víricos. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras utilizadas normalmente se derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus del simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y retrasado, potenciador, sitios de empalme, y poliadenilación pueden ser utilizados para proveer otros elementos genéticos para expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tardíos y tempranos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma vírico como un fragmento, que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature, 273:113, 1978; y Kaufinan, Meth. in Enzymology, 1990). Los fragmentos SV40 pequeños o grandes también pueden ser utilizados para proveer la secuencia 250 bp aproximadamente que se extiende del sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el SV40 de origen viral del sitio replicación se incluye.

Las secuencias de control adicionales, mostradas para mejorar la expresión de genes heterólogos a partir de vectores de expresión de mamífero incluye tales elementos como el elemento de la secuencia que aumenta la expresión (EASE) derivado de las células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology. pp. 529-534, 1997; y PCT Application WO 97/25420) y el líder tripartito (TPL) y ARNs gen VA del Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem., 257:13475-13491, 1982). Las secuencias del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) de origen viral permiten que mARNs dicistrónicos sean traducidos eficientemente (Oh et al., Current Opinion in Genetics y Development, 3:295-300, 1993; y Ramesh et al., Nucleic Acids Research, 24:2697-2700, 1996). La expresión de un cADN heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) ha sido mostrado para mejorar la capacidad de transfección del huésped y la expresión del cADN heterólogo (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Vectores de expresión ejemplares que emplean mARNs dicistrónicos son pTR-DGGFP descritos por Mosser et al., Biotechniques, 22:150-161, 1997, y p2A51 descrito por Morris et al., Animal Cell Technology, pp. 529-534, 1997.

Un vector de alta expresión útil, pCAVNOT, ha sido descrito por Mosley et al., Cell, 59:335-348, 1989. Otros vectores de expresión para utilizar en las células huésped de mamífero pueden ser construidos como se revela por Okayama et al., (Mol. Cell. Biol., 3:280, 1983. Un sistema útil para un nivel alto de expresión estable de cADNs de mamífero en células epiteliales mamarias de murina C 127 puede ser construido sustancialmente como se describe por Cosman et al., Mol. Immunol., 23:935, 1986. Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, se describe por Cosman et al., Nature, 312:768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890. Vectores de expresión de mamífero adicionales útiles se describen en EP-A-0367566, y en WO 91/18982. En otra alternativa, los vectores pueden ser derivados de retrovirus.

Otro vector de expresión útil, pFLAG®, puede ser utilizado. La tecnología FLAG® se centra sobre la fusión de un péptido marcador FLAG®, de bajo peso molecular (1kD), hidrófilo al N-terminal de una proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG®. El pDC31 es otro vector especializado utilizado para la expresión de proteínas en células CHO. El pDC311 se caracteriza por una secuencia bicistrónica que contiene el gen de interés y un gen reductasa dihidrofolato (DHFR) con un sitio de enlace ribosoma interno para la traducción DHFR, un elemento de secuencia que aumenta la expresión (EASE), el promotor CMV humano, una secuencia líder tripartito, y un sitio de poliadenilación.

Respecto a los péptidos señal que pueden ser empleados, el péptido señal nativo puede ser reemplazado por un péptido señal heterólogo o secuencia líder, si se desea. La elección del péptido señal o líder puede depender de los factores tales como el tipo de células huésped en las cuales el polipéptido recombinante se produce. Para ilustrar, ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia señal para Interleucina-7 (IL-7) como se describe en la Patente United States 4,965, 195; la secuencia señal para el receptor de Interleucina-2 se describe en Cosman et al., Nature, 312: 768, 1984; el péptido señal receptor de Interleucina-4 se describe en EP 367,566; el péptido señal receptor de Interleucina-1 tipo I se describe en la Patente U.S. 4,968,607; y el péptido señal receptor de Interleucina-1 tipo II se describe en EP 460,846.

Purificación

La invención también incluye métodos de aislamiento y purificación de los polipéptidos y de los fragmentos de estos.

Aislamiento y Purificación

Los polipéptidos o fragmentos de estos "aislados" incluidos por esta invención son polipéptidos o fragmentos que no están en un ambiente idéntico a un ambiente en el cual este o ellos pueden encontrarse en la naturaleza. Los polipéptidos o fragmentos de estos "purificado" incluidos por esta invención son esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes tales como aquellos descritos anteriormente o como un producto purificado a partir de una fuente no-recombinante tales como células y/o tejidos que ocurren naturalmente.

En una modalidad preferida, la purificación de polipéptidos recombinantes o fragmentos pueden ser acompañados utilizando fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención con otro polipéptido para ayudar en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención. Tales asociados de fusión pueden incluir el poly-His u otros péptidos de identificación antigénicos descritos anteriormente así como las fracciones Fc descritas previamente.

Con respecto a cualquier tipo de célula huésped, como se conoce por el artesano experto, los procedimientos para la purificación de un polipéptido recombinante o fragmento variarán de acuerdo con tales factores como el tipo de células huésped empleado y si o no el polipéptido recombinante o fragmento se secreta en el medio de cultivo.

En general, el polipéptido recombinante o fragmento puede ser aislado de las células huésped si no se secreta, o del medio o sobrenadante si es soluble y se secreta, seguido por uno o más etapas de concentraciones, insolubilización por salado, intercambio iónico, interacción hodrofóbica, purificación de afinidad o cromatografía de permeación sobre gel. En cuanto a maneras específicas para lograr estas etapas, primero el medio de cultivo se puede concentrar utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Siguiente a la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración por gel. De manera alterna, una resina de intercambio iónico se puede emplear, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetil (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextran, celulosa u otros tipos empleados normalmente en purificación de proteínas. De manera alterna, una etapa de intercambio catiónico se puede emplear. Intercambios catiónicos apropiados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropil o carboximetil. Además, una etapa de cromatoenfoque puede ser empleada. De manera alterna, una etapa de cromatografía de interacción hodrofóbica puede ser empleada. Apropiadas matrices pueden ser fracciones fenil u octil unidas a resinas. Además, puede ser empleada, la cromatografía de afinidad con una matriz que selectivamente se une a la proteína recombinante. Ejemplos de tales resinas empleadas están las columnas de lectina, columnas de tinción, y columnas de metal-quelante. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) empleando medio hidrofóbico RP-HPLC, (por ejemplo, silica gel o resina de polímero grupos metil, octil, octildecil u otros grupos alifáticos pendientes) se pueden emplear para purificar adicionalmente los polipéptidos. Algunas o todas de las etapas de purificación antes mencionadas, en varias combinaciones, son conocidas y pueden ser empleadas para proveer una proteína recombinante aislada y purificada.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína enlace-polipéptido de la invención, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos de la invención, para polipéptidos expresados afinidad-purificado. Estos polipéptidos pueden ser retirados de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en una solución reguladora de elución alta en sal y luego se dializa en una solución reguladora de más baja sal para utilizar o para cambiar el pH u otros componentes que dependen de la afinidad de la matriz utilizada, o ser competitivamente retirados utilizando el sustrato que ocurre naturalmente de la fracción de afinidad, tal como un polipéptido derivado a partir de la invención.

En este aspecto de la invención, las proteínas enlace-polipéptido, tales como los anticuerpos de la invención anti-polipéptido u otras proteínas que pueden interactuar con el polipéptido de la invención, pueden ser unidos a un soporte de fase sólida tales como una columna de cromatografía matriz o un sustrato similar apropiado para identificación, separación, o purificación de células que expresan los polipéptidos de la invención sobre su superficie. La adherencia de las proteínas enlace-polipéptido de la invención a una fase sólida que contacta la superficie puede ser lograda por cualquier medio. Por ejemplo, microesferas magnéticas pueden ser cubiertas con estas proteínas enlace-polipéptido y sujetas en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células se contactan con la fase sólida que tiene tales proteínas enlace-polipéptido sobre estas. Las células que tienen los polipéptidos de la invención sobre sus superficies unidas a la proteína enlace-polipéptido se fijan y luego las células no-ligadas se retiran lavando. Este método de afinidad-enlace es útil para la purificación, selección, o separación de tales células que expresan polipéptido a partir de la solución. Los métodos de liberación de células seleccionadas positivamente de la fase sólida son conocidos en el oficio y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no-tóxicas y no-perjudiciales para las células y preferiblemente se dirigen a la división del enlace asociado en la superficie-celular.

De manera alterna, las mezclas de células con sospecha de contener células que expresan polipéptidos de la invención primero se pueden incubar con una proteína enlace-polipéptido biotinilada de la invención. Los periodos de incubación típicamente son de al menos una hora de duración para asegurar los suficientes enlaces a los polipéptidos de la invención. La mezcla resultante luego se pasa a través de una columna empacada con granulados revestidos con avidina, donde por la alta afinidad de la biotina por la avidina provee el enlace de las células enlace-polipéptido a los granulados. El uso de granulados revestidos con avidina es conocido en el oficio (Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). Lavar el material no-ligado y la liberación de las células ligadas se lleva a cabo utilizando métodos convencionales.

El grado de pureza deseado depende del uso pretendido de la proteína. Un grado de pureza relativamente alto se desea cuando el polipéptido es para ser administrado in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican a tal grado que ninguna banda de proteína corresponda a otras proteínas que son detectables bajo un análisis por electroforesis en gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Se reconocerá por alguien de habilidad en el pertinente campo que multiples bandas que corresponden al polipéptido pueden ser visualizadas por SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, procedimiento post-translacional diferencial, y similares. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica a homogeneidad sustancial, como se indica por una sola banda de proteína bajo un análisis por SDS-PAGE. La banda de la proteína puede ser visualizada por tinción de plata, tinción de azul de Coomassie, o (si la proteína es radiomarcada) por autorradiografía.

Ensayos

Los polipéptidos purificados de la invención (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros, y otras formas) pueden ser analizados por la capacidad de unir el enlace asociado en cualquier ensayo apropiado, tal como un ensayo de enlace convencional. Para ilustrar, el polipéptido puede ser marcado con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionúclido, cromóforo, enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares). El polipéptido marcado se contacta con las células que expresan el enlace asociado. Las células luego se lavan para retirar el polipéptido marcado no-ligado, y la presencia del marcador célula-ligada se determina por una técnica apropiada, escogida de acuerdo con la naturaleza del marcador.

Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de enlace es como sigue. Un vector recombinante de expresión que contiene el cADN de enlace asociado se construye utilizando métodos conocidos en el oficio. Las células CV1-EBNA-1 en platos de 10 cm^{2} se someten a transfección con el vector recombinante de expresión. Las células CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) constitutivamente expresan el antígeno-1 nuclear EBV conducido del potenciador/promotor inmediato-precoz CMV. La CV1-EBNA-1 se derivó de la línea celular CV-1 del riñón de Mono Verde Africano (ATCC CCL 70), como se describe por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las células transfectadas se cultivan por 24 horas, y las células en cada plato luego son fraccionadas en una placa de 24-pozos. Después del cultivo unas 48 horas adicionales, las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pozo) se lavan con BM-NFDM, que es el medio de enlace (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de azida de sodio, 20 mM de Hepes pH 7.2) al cual se le han adicionado 50 mg/ml de leche en polvo no grasa. Las células luego se incuban por 1 hora a 37ºC con varias concentraciones de, por ejemplo, un polipéptido soluble/Fc proteína de fusión hecho como se publica anteriormente. Las células luego se lavaron y se incubaron con una concentración de saturación constante de IgG anti-humano a^{125}I-de ratón en medio de enlace, con agitación suave por 1 hora a 37ºC. Después de un lavado amplio, las células se liberan vía tripsinisación.

El IgG anti-humano de ratón empleado arriba se dirige contra la región Fc de IgG humano y se puede obtener de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo es radioiodado utilizando el método cloramina-T estándar. El anticuerpo unirá a la porción Fc de cualquier polipéptido/Fc proteína que tiene unida a las células. En todos los ensayos, el enlace no-específico del 125I-anticuerpo se ensayó en la ausencia de la Fc proteína de fusión/Fc, así como en la presencia de la proteína de fusión Fc y un exceso molar de 200-veces anticuerpo IgG anti-humano de ratón no marcado.

El ^{125}I-anticuerpo célula-ligada se cuantifica en un Packard Autogamma counter. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y Acad Sci., 51:660, 1949) se generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) corriendo sobre un ordenador Microvax.

Otro tipo de ensayo de enlace apropiado es un ensayo de enlace competitivo. Para ilustrar, la actividad biológica de una variante se puede determinar mediante el análisis de la capacidad de la variante para competir con la proteína nativa para unirse al enlace asociado.

Ensayos de enlace competitivos se pueden llevar a cabo mediante metodologías convencionales. Los reactivos que se pueden emplear en ensayos de enlace competitivo incluye polipéptidos radiomarcados de la invención y células intactas que expresan el enlace asociado (endógeno o recombinante). Por ejemplo, un fragmento IL-1 zeta soluble radiomarcado pueden ser utilizado para competir con una variante IL-1 zeta soluble para unir a los receptores IL-1 zeta en la superficie celular. En lugar de células intactas, se podría sustituir una proteína de fusión enlace asociado/Fc soluble unido a una fase sólida a través de la interacción de la Proteína A o Proteína G (sobre la fase sólida) con la fracción Fc. Las columnas de cromatografía que contienen Proteína A y Proteína G incluyen aquellas disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Otro tipo de ensayo de enlace competitivo utiliza enlace asociado soluble radiomarcado, tal como un receptor IL-1 zeta/fusión Fc o ligando Xrec2/proteína de fusión Fc soluble, y células intactas que expresan el enlace asociado. Resultados cualitativos se pueden obtener los ensayos de enlace autorradiográficos competitivos, aunque se puede utilizar Scatchard plots (Scatchard, Ann. N. Y. Acad Sci., 51:660, 1949) para generar resultados cuantitativos.

Uso de ácido nucleicos o oligonucleotidos IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2 TDZ.3 y Xrec2

Además se utiliza para expresar los polipéptidos según se describe arriba, los ácidos nucleicos IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2, incluyendo ADN, ARN, ARNm, y oligonucleótidos de estos pueden ser utilizados:

-: como sondas para identificar el ácido nucleico que codifica las proteínas del ligando IL-1 y las familias receptor;

-: para identificar los cromosomas humanos 2 y X;

-: para mapas génicos de cromosomas humanos 2 y X;

-: para identificar los genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras condiciones asociadas con los cromosomas humanos 2 y X;

-: como oligonucleótidos sentido o antisentido monocatenario, para inhibir expresión de polipéptidos codificados por los genes IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 y Xrec2;

-: para ayudar a detectar genes defectuosos en un individuo; y

-: para terapia génica.

Sondas

Entre los usos de ácidos nucleicos revelados en esta, está el uso de los fragmentos como sondas o cebadores. Tales fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 17, al menos 30 o al menos 60, nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN.

Puesto que los homólogos de la SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7, de otras especies de mamífero, se contemplan en esta, las sondas basadas en las secuencias humanas de ADN de la SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7 pueden ser utilizadas para seleccionar librerías de cADN derivadas de otras especies de mamífero, utilizando técnicas de hibridización de cruzamiento de especies convencionales.

Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácido publicadas arriba, sets de oligonucleótidos degenerados se puede preparar. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), por lo cual los fragmentos de ADN se aíslan y amplifican.

Técnica de Cartografía cromosómica

Todos o una porción de los ácidos nucleicos de la IL-1 zeta de la SEQ ID NO: o las variantes de empalme IL-1 zeta de la SEQ ID NOs: 5, 6, y 7, incluyendo oligonucleótidos, pueden ser utilizados por aquellos de habilidad en el oficio utilizando técnicas conocidas para identificar el cromosoma humano 2, así como el emplazamiento específico de estos, que contiene el ADN de los miembros de la familia ligando IL-1. Además, todos o una porción de los ácidos nucleicos de Xrec2 de la SEQ ID NO: 2, incluyendo oligonucleótidos, pueden ser utilizados para identificar el cromosoma X humano, así como el emplazamiento específico de estos que contienen el ADN de los miembros de la familia receptor IL-1. Técnicas útiles incluyen, pero no limitan a, utilizando la secuencia o porciones, incluyendo oligonucleótidos, como una sonda en varias técnicas conocidas tales como elaboración de mapas de híbrido de radiación (resolución alta), hibridización in situ para distribución de cromosomas (resolución moderada), e hibridización Southern blot para líneas celulares hibridas que contienen cromosomas humanos individuales (resolución baja).

Por ejemplo, se pueden hacer mapas de los cromosomas por hibridización de radiación. El PCR se realiza utilizando el Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4 panel de 93 radiation hybrids (httn://www-
genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human STSreleases/july97/rhmap/g enebridge4.html). Los cebadores se utilizan lo que consiste en un exón putativo del gen de interés y que amplifica un producto de ADN genómico humano, pero no amplifica el ADN genómico hamster. Los resultados de los PCRs se convierten en un vector de datos que se someten al sitio Whitehead/MIT Elaboración de Mapas de Radiación en el Internet (http://www-seq.wi.mit.edu). Los datos se puntúan y se proporcionan la asignación y la colocación cromosómica relativa a conocidos marcadores de Sitios de Etiqueta de Secuencia (STS) en el mapa híbrido de radiación. El siguiente sitio web provee información adicional a cerca de como hacer mapas por hibridización de radiación:

http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/humanSTSreleases/july97// 07-97.INTRO.html).

Identificación de Enfermedades Asociadas

Como se publica abajo, se han hecho mapas de los ácidos nucleicos de IL-1 zeta de la SEQ ID NO: 1, y las variantes de empalme IL- 1 zeta de la SEQ ID NOs: 5, 6, y 7 por hibridización de radiación y secuenciación de alto rendimiento-al azar en la región 2q11-12 del cromosoma 2 humano. El cromosoma 2 humano se asocia con enfermedades específicas que incluyen pero no limitan a glaucoma, displacia ectodérmica, diabetes mellitus insulina-dependiente, síndrome de piel arrugada, leucemia/linfoma de célula-T., y distrofia muscular de la tibia. Se han hecho mapas de los ácidos nucleicos de Xrec2 de la SEQ ID NO: 2 por hibridación de radiación y secuenciación de alto rendimiento-al azar a la región Xp22 del cromosoma X humano. El cromosoma X humano se asocia con retinosquisis, lisencefalia, heterotopía en bandas generalizada, retraso mental, síndrome de Cowchock, síndrome de Bazex, hipertricosis, síndrome linfoproliferativo, inmunodeficiencia, Displasia mesomélica de Langer, y leucemia. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de la SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 7, y 2 o un fragmento de estos pueden ser utilizados por alguien de habilidad en el oficio utilizando técnicas conocidas para analizar anormalidades asociadas con cartografía genética para los cromosomas 2 y X. Este permite distinguir las condiciones en las que este marcador es reconfigurado o suprimido. Además, los nucleicos y moléculas de la SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, y 7 o un fragmento de estos pueden ser utilizados como un marcador posicional para hacer mapas de otros genes de localización desconocida.

El ADN puede ser utilizado en el desarrollo de tratamientos para cualquier desorden mediado (directamente o indirectamente) por defecto, o cantidades insuficientes de, los genes que corresponden a los ácidos nucleicos de la invención. El descubrimiento en esta de secuencias de nucleótidos nativos permite la detección de genes defectuosos, y el reemplazo de estos con genes normales. Los genes defectuosos se pueden detectar en ensayos de diagnóstico in vitro, y por la comparación de una secuencia de nucleótido nativa revelada en la de un gen derivado de una persona sospechosa de albergar un defecto en éste.

Sentido-Antisentido

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia monocatenaria de ácido nucleico (cualquiera ARN o ADN) capaz de unir a las secuencias ARNm blanco (sentido) o ADN (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido puede comprender un fragmento de ADN (SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6 y 7). Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una secuencia de cADN que codifica una dada proteína se describe en, por ejemplo, Stein et al., Cancer Res., 48:2659, 1988; y van der Krol et al., BioTechniques, 6:958, 1988.

El enlace de los oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácidos nucleicos blanco resulta en la formación de dúplex que bloquean o inhiben la expresión de la proteína por uno de varios medios, incluyendo la degradación mejorada del ARNm por RNAseH, inhibición del empalme, prematura terminación de transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido de esta manera pueden ser utilizados para bloquear la expresión de las proteínas. Además los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden oligonucleótidos que tienen esqueletos azúcar-fosfodiester modificados (u otros enlaces de azúcar; tales como aquellos descritos en WO91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (i.e., capaces de resistir la degradación enzimática) pero retiene la especificidad de la secuencia para ser capaz de unirse a las secuencias blanco de los nucleótidos.

Otros ejemplos de oligonucleótidos antisentido o sentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se ligan covalentemente a fracciones orgánicas, tales como aquellos descritos en WO 90/10448, y otras fracciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia blanco de ácido nucleico, tal como poli-(L-lisina). Adicionalmente aún así, agentes de intercalación, tales como ellipticina, y agentes de alquilación o complejos metálicos pueden ser unidos a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar la especificidad del enlace del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia blanco de nucleótido.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia blanco de ácido nucleico por cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediado-CaPO_{4}, electroporación, o utilizando vectores de transferencia génica tales como virus Epstein-
Barr.

Los oligonucleótidos sentido o antisentido también se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia blanco de nucleótido mediante la formación de un conjugado con un ligando de molécula enlace, como se describe en WO 91/04753. Apropiadas moléculas de enlace ligando incluyen, pero no limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de enlace ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de enlace ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

De manera alterna, un oligonucleótido sentido o un antisentido se pueden introducir en una célula que contiene la secuencia blanco de ácido nucleico por formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido-lípido preferiblemente se disocia dentro de la célula por una lipasa endógena.

Uso de polipéptidos IL-1 zeta. TDZ.1, TDZ.2 TDZ.3 y Xrec2 y polipéptidos fragmentados

Los usos incluyen, pero no limitan a, lo siguiente:

-: Purificación de proteínas y medida de la actividad de éstas

-: Agentes de Entrega

-: Reactivos Terapéuticos y de Investigación

-: Controles para fragmentación del péptido

-: Identificación de proteínas desconocidas

-: Preparación de Anticuerpos

Reactivos de Purificación

Cada uno de los polipéptidos de la invención encuentra uso como un reactivo de purificación de proteínas. Los polipéptidos pueden ser unidos a un material soporte sólido y utilizado para purificar las proteínas de enlace asociado por cromatografía de afinidad. En modalidades particulares, un polipéptido (en cualquier forma descrito en esta que es capaz de unir el enlace asociado) se une a un soporte sólido por procedimientos convencionales. Como un ejemplo, las columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionaran con grupos funcional sobre las cadenas laterales del aminoácido de proteínas están disponibles (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). En una alternativa, un polipéptido/Fc proteína (como se discutió arriba) se une a una Proteína A- o Proteína G-que contienen columnas de cromatografía a través de la interacción con la fracción Fc.

El polipéptido también encuentra uso en la purificación o la identificación de células que expresan el enlace asociado sobre la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía de columna o un sustrato similar apropiado. Por ejemplo, microesferas magnéticas pueden ser cubiertas con los polipéptidos y mantenidas en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen el enlace asociado que expresan células se contactan con la fase sólida que tiene los polipéptidos en esta. Las células que expresan el enlace asociado sobre la superficie celular unida a los polipéptidos fijos, y las células no-ligadas luego se retiran lavándolas.

De manera alterna, los polipéptidos pueden ser conjugados a una fracción detectable, luego se incuban con células para ser analizadas para la expresión del enlace asociado. Después de la incubación, la materia marcada no-ligado se retira y se determina la presencia o ausencia de la fracción detectable en las células.

En una alternativa adicional, las mezclas de células se sospecha que contienen células que expresan el enlace asociado, se incuban con polipéptidos biotinilados. Típicamente los periodos de incubación son de al menos una hora de duración para asegurar el enlace suficiente. La mezcla resultante luego se pasa a través de una columna empacada con granulados revestidos con avidina, por lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina provee el enlace de las células deseadas con los granulados. Son conocidos los procedimientos para usar granulados revestidos con avidina (Berenson et al., J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). El lavado para retirar el material no-ligado, y la liberación de las células ligadas, se llevan a cabo utilizando métodos convencionales.

Medida de la Actividad

Los polipéptidos también encuentran el uso en la medida de la actividad biológica de la proteína de enlace asociado en término de su afinidad de enlace. Los polipéptidos de esta manera pueden ser empleados por aquellos que conducen estudios "control de calidad", por ejemplo, para monitorear la vida de almacenamiento y estabilidad de la proteína bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser empleados en un estudio de afinidad de enlace para medir la actividad biológica de una proteína de enlace asociado que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o producida en diferentes tipos de células. Las proteínas también pueden ser utilizadas para determinar si la actividad biológica se retiene después de la modificación de una proteína de enlace asociado (por ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La afinidad del enlace de la proteína enlace asociado modificado se compara con aquella proteína enlace asociada no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones sobre la actividad biológica del enlace asociado. Por ejemplo, la actividad biológica de una proteína de enlace asociado de esta manera, puede ser verificada antes de su utilización en un estudio de investigación.

Agentes de Entrega

Los polipéptidos también encuentran uso como excipientes para agentes de entrega unidos a ellos en las células que soportan el enlace asociado. De esta manera, los polipéptidos pueden ser utilizados para entregar agentes de diagnóstico o terapéuticos para tales células (o para otros tipos de células encontrados para expresar el enlace asociado sobre la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Agentes detectables (diagnóstico) y terapéuticos que pueden ser unidos a un polipéptido incluye, pero no limitan a, toxinas, otros agentes citotóxicos, drogas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, con el agente particular que es escogido de acuerdo con la aplicación pretendida. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina difteria, Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, ribosómico que inactiva las proteínas, micotóxinas tales como tricotecenos, y los derivados y los fragmentos de estos (por ejemplo, cadenas sencillas). Radionúclidos apropiados para el uso diagnóstico incluyen, pero no limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y ^{76}Br. Ejemplos de radionúclidos apropiados para uso terapéutico son ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, 188Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu, y ^{67}Cu.

Tales agentes se pueden unir al polipéptido por cualquier procedimiento convencional apropiado. El polipéptido comprende grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácidos que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales sobre un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. De manera alterna, la proteína o agente pueden ser derivatizados para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede involucrar adherencia de uno de los reactivos acoplados bifuncionales disponible para unir varias moléculas a las proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Son conocidas, un número de técnicas para radiomarcación de proteínas. Por ejemplo, los metales radionúclidos se pueden unir a los polipéptidos utilizando un agente quelante bifuncional apropiado.

Conjugados que comprenden polipéptidos y un agente terapéutico o de diagnóstico apropiados (preferiblemente ligados covalentemente) se preparan de esta manera. Los conjugados se administran o por otra parte se emplean en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Agentes Terapéuticos

Los Polipéptidos de la invención pueden ser utilizados en el desarrollo de tratamientos para cualquier desorden mediado (directamente o indirectamente) por defecto, o cantidades insuficientes de los polipéptidos. Estos polipéptidos pueden ser administrados a un mamífero afligido con tal desorden.

Los polipéptidos revelados en esta pueden ser empleados en la inhibición de una actividad biológica del enlace asociado, en procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, Un polipéptido receptor Xrec2 purificado puede ser utilizado para inhibir el enlace del ligando Xrec2 con el receptor Xrec2 superficie celular endógena, o un polipéptido IL-1 zeta purificado, o cualquiera de sus variantes de empalme pueden ser utilizados para inhibir el enlace de la IL-1 zeta endógena o variantes de empalme a su receptor de la superficie celular. Los efectos biológicos que resultan del enlace del ligando Xrec2 con los receptores Xrec2 endógenos de esta manera son inhibidos.

Los polipéptidos de la invención pueden ser administrados a un mamífero para tratar un desorden mediado por el enlace asociado. Tales desórdenes mediados por el enlace asociado incluyen condiciones causadas (directamente o indirectamente) o exacerbadas por el enlace asociado.

Las composiciones de la presente invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en esta, tales como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos activos biológicamente. En modalidades particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprende los polipéptidos solubles de la invención.

Regiones particulares de interés en el polipéptido IL-1 zeta pueden ser derivadas del modelo molecular proporcionado en la Figura 2, que representa la estructura secundaria de la molécula. El modelo se basa en las estructuras de cristal de IL-1 \beta y IL-1ra. En la figura, \beta-cadenas se muestran en amarillo, con su dirección indicada por la punta de la flecha. Los giros \beta se muestran en azul, y las espirales se muestran en verde. El modelo demuestra que es posible cubrir la estructura IL-1 zeta en la estructura IL-1\beta y IL-1ra sin tensar la molécula. El alto grado de confianza de este modelo molecular permite ser utilizado en el diseño de medicamentos racionales para generar moléculas terapéuticas derivadas de IL-1 zeta.

Las composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluente, portador, o excipiente aceptable fisiológicamente, son proporcionadas en esta. Los polipéptidos se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos utilizados para preparar composiciones útiles farmacéuticamente. Se pueden combinar en preparados, tanto como el material activo solo o con otros conocidos materiales activos apropiados para una indicación dada, con diluentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones reguladoras de fosfato), preservativos (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsificadores, solubilizantes, adyuvantes y/o excipientes. Formulaciones apropiadas para composiciones farmacéuticas incluyen aquellos descritos en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^{th} ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.

Además, tales composiciones pueden ser acomplejadas con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporadas en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextran, etc., o incorporadas en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelar o multilamel, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influenciaran el estado físico, la solubilidad, estabilidad, rata de liberación in vivo, y rata de liquidación in vivo, y de esta manera se escogen de acuerdo con la destinada aplicación.

Las composiciones de la invención pueden ser administradas de cualquier manera apropiada, por ejemplo, vía tópica, parenteral, o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, por rutas subcutánea, intravenosa, o intramuscular, también incluyendo administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión. La liberación controlada de los implantes también se contempla. Alguien de habilidad en el pertinente oficio reconocerá que apropiadas dosificaciones variaran, dependiendo de tales factores como la naturaleza del desorden para ser tratado, el peso corporal del paciente, edad, y condición general, y la ruta de administración.

Las dosis preliminares se pueden determinar de acuerdo con pruebas con animales, y la escalada de dosificaciones para administración humana se realiza de acuerdo con prácticas aceptadas en el oficio.

También se contemplan, composiciones que comprenden ácidos nucleicos en formulaciones fisiológicamente aceptables. El ADN puede ser formulado por inyección, por ejemplo.

Agentes de Investigación

Otro uso de los polipéptidos revelados en esta es como herramienta de investigación para el estudio de los efectos biológicos que resultan de las interacciones de IL-1 zeta, o cualquiera de sus variantes de empalme, con su enlace asociado, y ofXrec2 con su enlace asociado, o de la inhibición de estas interacciones, sobre diferentes tipos de células. Los polipéptidos también pueden ser empleados en ensayos in vitro para la detección IL-1 zeta, Xrec2, los enlaces asociados respectivos o las interacciones de estos.

Los polipéptidos revelados en esta pueden ser utilizados para estudiar la transducción de la célula señal. Los ligandos de la familia IL-1 y los receptores juegan un papel central en la protección contra la infección y las respuestas inflamatorias inmunes que incluyen transducción de la célula de señal, activación de células endoteliales vasculares y linfocitos, inducción de citoquinas inflamatorias, proteínas de fase aguda, hematopoyesis, fiebre, resorción de huesos, prostaglandinas, metaloproteinasas, y moléculas de adhesión. Con el continuo incremento en el número de miembros de la familia IL-1 conocidos, un esquema de clasificación apropiado es uno basado en la comparación de la estructura del polipéptido así como la función (propiedades de activación y regulatorias). Por lo tanto, IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ. 2, y TDZ.3, como otros ligandos de la familia IL-1 (IL-1\alpha, IL-1\beta, y IL=18) y Xrec2, como otros de la familia IL-1R (IL- 1RI, IL-1RII, IL-1Rrp1, y AcPL), probablemente este implicado en muchas de las funciones notadas arriba así como promover respuestas inflamatorias y por consiguiente posiblemente estar involucrado en la causalidad y mantenimiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmune tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, y psoriasis. Como tales, alteraciones en la expresión y/o activación de los polipéptidos revelados en esta pueden tener efectos profundos sobre una plétora de procedimientos celulares, incluyendo, pero no limitando a, activación o inhibición de respuestas específicas de la célula y proliferación. La expresión de IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3, Xrec2 clonados, o de mutantes de estos inactivos funcionalmente pueden ser utilizados para identificar el papel que una proteína particular juega en la mediación específica de eventos de señalización.

La señalización celular frecuentemente involucra una cascada de activación molecular, durante la cual un receptor propaga una señal mediada o ligando-receptor por la activación específicamente de quinasas intracelulares que fosforila los sustratos blancos. Estos sustratos por ellos mismos pueden ser quinasas que se hacen activos después de la fosforilación. De manera alterna, pueden ser adaptadores de moléculas que facilitan la señalización de la secuencia corriente abajo a través de la interacción proteína-proteína seguida por la fosforilación. Independientemente de la naturaleza del sustrato de la molécula(s), versiones activas funcionalmente expresadas de Xrec2, IL-1 zeta, variantes de empalme IL-1 zeta, y sus enlaces asociados pueden ser utilizados para identificar que sustra-
to(s) fue reconocido y activado por los polipéptidos de la invención. Como tal, estos polipéptidos novedosos pueden ser utilizados como reactivos para identificar moléculas novedosas involucradas en sendas de transducción de
señal.

Identificación de Proteínas desconocidas

Un polipéptido o la huella digital peptídica puede ser registrada en o comparada con una base de datos de proteínas conocidas para ayudar en la identificación de la proteína desconocida utilizando espectrometría de masas (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5011-5015, 1993; Fenyo et al., Electrophoresis, 19:998-1005, 1998). Una variedad de programas software de ordenador para facilitar estas comparaciones son accesibles vía el Internet, tales como Protein Prospector (Sitio en internet: prospector. uscf.edu), MultiIdent (Sitio en internet: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Sitio en internet: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/
FRPeptideSearch Form.html), y ProFound (Sitio en internet: www.chaitsgi. rockefeller.edu/cgi-bin/ prot-id-frag.html). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de división y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia designada. Los programas comparan los pesos moleculares observados para predecir los pesos moleculares del péptido derivado de la secuencia del banco de datos para asistir en la determinación de la identidad de la proteína desconocida.

Además, un polipéptido o péptido digerido puede ser secuenciado utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y la secuencia resultante investigada contra el banco de datos (Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spec., 5:976-989, 1994; M. Mann et al., Anal. Chem., 66:4390-4399, 1994; y J.A. Taylor et al., Rapid Comm. Mass Spec., 11:1067-1075, 1997). Programas de investigación que pueden ser utilizados en este proceso existen en el Internet, tales como Lutefisk 97 (Sitio en internet: www.lsbc.com: 70/Lutefisk97.html), y el Proteína Prospector, Peptide Search y ProFound programas según se describen arriba.

Por lo tanto, la adición de la secuencia de un gen y su secuencia de proteína predicha y los fragmentos del péptido para una base de datos de la secuencia puede ayudar en la identificación de proteínas desconocidas utilizando espectrometría de masas.

Anticuerpos

Los anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos de la invención se proporcionan en esta. Tales anticuerpos específicamente unen a los polipéptidos vía los sitios enlace-antígeno del anticuerpo (contrariamente al enlace no-específico). Por lo tanto, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., según se publico arriba pueden ser empleados como "inmunógenos" en la producción de anticuerpos inmunoreactivo con eso. Más específicamente, los polipéptidos, fragmento, variantes, proteínas de fusión, etc. contienen determinantes antigénicos o epítopos que producen la formación de anticuerpos.

Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o adaptativos (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos de una sección única de aminoácidos del polipéptido, mientras los epítopos adaptativos o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de las diferentes regiones de la cadena del polipéptido que son traídas en proximidad cercana sobre el plegamiento de la proteína (C. A. Janee ay, JRH. y P. Traversa, Imano Biología. 3:9, Garland Publishing Inc., 2nd ed., 1996). Dado que las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es muy numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y de impedimentos estérico, el número de anticuerpos que verdaderamente une a los epítopos es menor que el número de epítopos disponibles (C. A. Janee ay, JRH. y P. Traversa, Imano Biología 2:14, Garlad Publishing Inc., 2nd ed., 1996). Los epítopos se pueden identificar por cualquiera de los métodos conocidos en el oficio.

Los epítopos antigénicos de los polipéptidos de la invención son útiles para construir anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, como se describe con más detalla abajo. Adicionalmente, epítopos de los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de enlace específico de las sustancias tales como suero policlonal o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopos o variantes de estos se pueden producir utilizando técnicas conocidas en el oficio tales como síntesis de fase-sólida, química o división enzimática de un polipéptido, o utilizando tecnología de ADN recombinante.

En cuanto a los anticuerpos que pueden ser producidos por los epítopos de los polipéptidos de la invención, si los epítopos han sido aislados o siguen siendo parte de los polipéptidos, ambos anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden preparar por técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Kennet et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, 1980; y Harlow y Land (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención también se contemplan en esta. Tales hibridomas se pueden producir e identificar por técnicas convencionales. Un método para la producción de tal línea celular de hibridoma comprende la inmunización de un animal con un polipéptido; cosecha de células de bazo del animal inmunizado; la fusión de dichas células de bazo para una línea celular de mieloma, por consiguiente la generación de células hibridoma; y la identificación de una línea celular hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar por técnicas convencionales.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murina. Tales anticuerpos humanizados pueden ser preparados por técnicas conocidas y ofrecer la ventaja de reducir la inmunogenicidad cuando los anticuerpos se administran a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murina (o solo el sitio de enlace del antígeno de estos) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. De manera alterna, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de enlace antígeno de un anticuerpo monoclonal murina y un fragmento de región variable (carente del sitio de enlace-antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de quiméricos y adicionalmente anticuerpos monoclonales artificiales incluyen aquellos descritos en Riechmann et al., Nature, 332:323, 1988; Liu et al., PNAS, 84:3439, 1987; Larrick et al., Bio/Technology, 7:934, 1989; y Winter et al., TIPS, 14:139, 1993. Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicamente pueden ser encontrados en GB 2, 272,440, US Patent Nos. 5, 569,825 y 5, 545,806 y patentes relacionadas reivindicando la prioridad de esto.

Los fragmentos de enlace-antígeno de los anticuerpos, que se pueden producir por técnicas convencionales, también son comprendidos por la presente invención. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no limitan a, fragmentos Fab y F (ab')2. Los fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética también se proporcionan.

En una modalidad, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos de la presente invención y no reaccionan en cruz con otras proteínas. Los procedimientos de selección por los cuales tales anticuerpos pueden ser identificados se conocen, y pueden involucrar cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo.

Usos de Éstos

Los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden ser empleados en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención por cromatografía de inmunoafinidad.

Aquellos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear el enlace de los polipéptidos de la invención con el enlace asociado pueden ser utilizados para inhibir una actividad biológica que resulta de tales enlaces. Tales anticuerpos bloqueados se pueden identificar utilizando cualquier procedimiento de ensayo apropiado, tal como prueba de anticuerpos para la capacidad de inhibir el enlace de IL-1 zeta, TDZ.1 o TDZ.2 en ciertas células que expresan los receptores IL-1 zeta. De manera alterna, el bloqueo de anticuerpos puede ser identificado en ensayos por la capacidad de inhibir un efecto biológico que resulta de los polipéptidos de la invención unidos a sus enlaces asociados para células blanco. Los anticuerpos pueden ser analizados por la capacidad para inhibir IL-1 zeta-mediado, o lisis de célula mediada por el enlace asociado, por ejemplo.

Tal anticuerpo puede ser empleado en un procedimiento in vitro, o administrado in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que genera el anticuerpo. Los desórdenes causados o exacerbadas (directamente o indirectamente) por la interacción de los polipéptidos de la invención con el enlace asociado de esta manera pueden ser tratados. Un método terapéutico involucra la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad efectiva en la inhibición de una actividad biológica mediada por el enlace asociado. Los anticuerpos monoclonales generalmente se prefieren para utilizar en tales métodos terapéuticos. En una modalidad, se emplea un fragmento del anticuerpo enlace-antígeno.

Los anticuerpos se pueden seleccionar por propiedades agonistas (i.e., imitando el ligando). Tales anticuerpos, bajo el enlace con el receptor de superficie celular, induce los efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando IL-1 se une con los receptores IL-1 de superficie celular. Los anticuerpos agonistas se pueden utilizar para activar las células endoteliales vasculares y linfocitos, inducir la destrucción tisular local y fiebre (Janeway et al., 1996), estimular los macrófagos y células endoteliales vascular para producir IL-6, y favorecer la expresión de las moléculas sobre la superficie de células endoteliales vasculares.

Las composiciones que comprenden un anticuerpo que se dirige contra los polipéptidos de la invención, y un diluente, excipiente, o vehículo fisiológicamente aceptable, se proporcionan en esta. Los componentes apropiados de tales composiciones son según lo descrito arriba para las composiciones que contienen los polipéptidos de la invención.

También proporcionados en esta, están los conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, de diagnóstico) o agente terapéutico, unido al anticuerpo. Ejemplos de tales agentes se presentan arriba. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo.

Los siguientes ejemplos son proporcionados adicionalmente para ilustrar las modalidades particulares de la invención, y no para ser construidos como limitante del alcance de la presente invención. Se debe observar que TDZ.3 y Xrec2 no caen dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de los Ácidos nucleicos IL-1 zeta y Xrec2

La secuencia de ácido nucleico IL-1 zeta humana se obtuvo por secuenciación EST IMAGE del clon 1628761, acceso \alm{1} AI014548, que codifica un marco de lectura abierta parcial (ORF). Un número de librerías de cADN se seleccionaron con cebadores internos para determinar la expresión patrón del polipéptido. Después de realizar un PCR utilizando dos cebadores internos de la secuencia IL-1 zeta humana, las siguientes librerías de cADN fueron positivas para las secuencias IL-1 zeta: estromal de médula ósea, tumor pancreático humano, y Raji (línea celular-B). Los clones IL-1 zeta se aislaron de librerías de las secuencias de ADN genómicas humanas, estromal de médula ósea y tumor pancreático humano, y se secuenciaron.

Las secuencias Xrec2 humanas se obtuvieron por secuenciación de alto rendimiento, PCR, y reacciones 5’ RACE. La secuenciación de alto rendimiento al azar de la región del cromosoma Xp11 produjo secuencias para los exones 4-6 de Xrec2 (Genbank números de acceso AL031466 y AL031575). Del mismo modo, la secuencia de la región del cromosoma Xp22-164-166 (Genbank número de acceso AC005748) produjo las secuencias para los exones 10 - 12 de Xrec2.

Un PCR (40 ciclos) se realizó en cADN de la cadena primera del cerebro humano utilizando cebadores (10 picomoles/reacción) dentro de los exones 5 y 11 y Hotstar Taq polimerasa (Qiagen, Valencia, CA), generando la secuencia para los exones 7-9. Las reacciones 5’ RACE luego se realizaron utilizando cADN de testículos y cebadores anidados dentro del exón 4 para obtener las secuencias del exón 3 que contiene la predicha metionina iniciadora. Ambos PCR y las reacciones 5’ RACE se realizaron utilizando protocolos estándar.

Ejemplo 2 Uso de IL-1 zeta Purificado y Polipéptidos Xrec2 ELISA Polipéptido-específico

Diluciones seriales de IL-1 zeta- o muestras que contienen Xrec2 (en NaHCO_{3} 50 mM, llevadas a pH 9 con NaOH) se bañaron en placas de microtitulación Linbro/Titertek 96 pozos flat bottom E.LA. (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) a 100: 1/pozos. Después de la incubación a 4ºC por 16 horas, los pozos se lavaron seis veces con 200:1 PBS que contienen 0.05% de Tween-20 (PBS-Tween). Los pozos luego se incubaron con FLAG® -enlace asociado a 1 mg/ml en PBS-Tween con 5% de suero de becerro fetal (FCS) por 90 minutos (100:1 por pozo), seguido por el lavado como arriba. A continuación, cada pozo se incuba con el anti- FLAG® (anticuerpo monoclonal M2 a 1 mg/ml en PBS-Tween que contiene 5% de FCS por 90 minutos (100:1 por pozo), seguido por el lavado como arriba. Posteriormente, los pozos se incuban con un anticuerpo conjugado de peróxidasa de rábano picante policlonal de cabra anti-mIgG1-específico (una dilución 1:5000 del stock comercial en PBS-Tween que contiene 5% de FCS) por 90 minutos (100:1 por pozo). El anticuerpo HRP-conjugado se obtiene de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama. Los pozos se lavaron seis veces, como arriba.

Para el desarrollo del ELISA, una mezcla del sustrato [100:1 por pozo de una premezcla 1:1 del Sustrato Peróxidasa TMB y Solución B Peróxidasa (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)] se adiciona a los pozos. Después de una reacción de color suficiente, la reacción enzimática se termina por la adición de H_{2}SO_{4} 2 N (50:1 por pozo). La intensidad de color (indica el enlace ligando receptor) se determina midiendo la extinción a 450 nm en un lector de placa V Max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ejemplo 3 Secuencia de Aminoácido

Las secuencias de aminoácido de IL-1 zeta y Xrec2 se determinaron por traducción de las secuencias de nucleótidos completas de la SEQ ID NOs:1 y 2, respectivamente.

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Ejemplo 4 Secuencias de ADN y Aminoácido

Las secuencias de ácido nucleicos IL-1 zeta y Xrec2 se determinaron por secuenciación bicatenaria estándar de la composición de la secuencia de los clones EST IMAGE (acceso #AI014548 (IL-1 zeta) y # AL031575 y #AC005748 (Xrec2)), y de secuencias adicionales obtenidas a partir de reacciones de PCR y 5’ RACE.

Las secuencias de nucleótido de la IL-1 zeta y Xrec2 ADN aislados y por consiguiente la codificada secuencia de aminoácido, se presentan en la SEQ ID NOs: 1-4. La secuencia del fragmento de ADN IL-1 zeta aislado por PCR corresponde a los nucleótidos 1 a 579 de la SEQ ID NO: 1, que codifica los aminoácidos 1 a 192 de la SEQ ID NO: 3; y la secuencia del fragmento de ADN Xrec2 también aislado por PCR corresponde a los nucleótidos 1 a 2088 de la SEQ ID NO:2, que codifica los aminoácidos 1 a 698 de la SEQ ID NO:4.

Las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 3 y 4 soportan homología significante a otros miembros de la familia ligando IL-1 y receptor conocidos, respectivamente.

Ejemplo 5 Anticuerpos Monoclonales que Unen a los Polipéptidos de la Invención

Este ejemplo ilustra un método para la preparación de anticuerpos monoclonales que unen el polipéptido IL-1 zeta. El mismo protocolo puede ser utilizado para producir anticuerpos monoclonales que ligan polipéptido Xrec2. Los inmunógenos apropiados que pueden ser empleados en la generación de tales anticuerpos incluyen, pero no limitan a, polipéptido IL-1 zeta purificado o un fragmento inmunogénico de estos tales como el dominio extracelular, o proteínas de fusión que contiene IL-1-zeta (por ejemplo, una proteína de fusión soluble IL-1 zeta/Fc).

El polipéptido IL-1 zeta purificado puede ser utilizado para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con este, utilizando técnicas convencionales tales como aquellas descritas en la Patente U.S. 4,411,993. Brevemente, los ratones son inmunizados con inmunógeno IL-1 zeta emulsificado en adyuvante de Freund completo, y se inyectaron en cantidades que oscilan desde 10-100 \mug subcutánea o intraperitonealmente. Diez a doce días después, los animales inmunizados se refuerzan con adicional IL-1 zeta emulsificado en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones se refuerzan periódicamente en lo sucesivo sobre un cronograma de inmunización semanal a bi-semanalmente. Las muestras de suero se toman periódicamente por sangrado retro-orbital o escisión en punta de cola para analizar los anticuerpos IL-1 zeta mediante el ensayo de transferencia en mancha, ELISA (prueba de Inmunoabsorción Enzimática) o inhibición del enlace receptor IL-1 zeta. Siguiendo con la detección de un apropiado título del anticuerpo, a los animales positivos se les proporciona una última inyección intravenosa de IL-1 zeta en suero fisiológico. Tres a cuatro días después, los animales se sacrifican, las células de bazo se cosechan, y las células de bazo se combinan con una línea celular de mieloma murina, por ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células hibridoma, que se colocan en placas en una placa microtituladora múltiple en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no-fundidas, hibridos de mieloma, e hibridos de célula de bazo.

Las células hibridoma se seleccionan mediante ELISA por reactividad contra IL-1 zeta purificado por adaptaciones de las técnicas reveladas en Engvall et al., Immunochem., 8:871, 1971 y en la Patente U.S. 4,703,004. Una técnica de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., J. Immunol., 144:4212, 1990. Las células hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones BALB/c singénicos para producir ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpos anti-IL-1 zeta monoclonales. De manera alterna, la célula hibridoma puede ser cultivada en frascos o frascos rotativos por varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden ser purificados por precipitación de sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión por gel. De manera alterna, la cromatografía de afinidad basada en el enlace del anticuerpo a la Proteína A o Proteína G también puede ser utilizada, al igual que la cromatografía de afinidad basada en el enlace a IL-1
zeta.

Ejemplo 6 Distribución Tisular de ARNm Xrec2

La distribución tisular de ARNm Xrec2 se investigó por un análisis Northern blot, como sigue. Una alícuota de una ribosonda Xrec2 se adicionó a dos Northern blots de tejido humano múltiple diferente (Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA). Las manchas se hibridizaron en 10X solución de Denhardt, Tris 50mM pH 7.5, NaCl 900 mM, pirofosfato de Na 0.1%, SDS 1%, 200 \mug/mL de ADN de esperma de salmón. La hibridización se condujo durante la noche a 63ºC en formamida al 50% como se describió previamente (March et al., Nature 315:641-647, 1985). Las manchas luego se lavaron con 2X SSC, SDS 0.1% a 68°C por 30 minutos. Las células y tejidos con los niveles más altos de ARNm Xrec2 se determinaron por comparación con el control de la prueba con una sonda \beta-actina-específico.

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El Xrec2 se detectó en cerebro humano y tejidos de corazón, y a una extensión pequeña en el ovario. En estos tejidos, dos mARNs Xrec2 se detectaron, una copia de 7.5 kb y una copia de 10.0 kb. Una copia de Xrec2 8.0 kb se detectó en el músculo esquelético. El análisis PCR de un panel de tejido de cADN humano detectado en ARNm Xrec2 en corazón, cerebro, y ovario, y a una extensión pequeña en amígdala, hígado fetal, próstata, testículo, intestino delgado y colon pero no en bazo, nódulo linfa, timo, médula ósea, leucocitos, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón o páncreas.

Siguiendo los procedimientos descritos arriba, un Northern blot de ARN aislado a partir de células tumorales se analizó con Xrec2. Una copia de 8.0 kb que hibridiza débilmente a la sonda se detectó en SW480, una línea celular de adenocarincoma colorectal. Las copias Xrec2 no se detectaron en HL-60 (leucemia promielocítica), S3 (célula HeLa), K-562 (leucemia mielógena crónica), MOLT-4 (leucemia linfoblástico), Raji (linfoma Burkitt), A5 49 (carcinoma de pulmón), o células G361 (melanoma).

Ejemplo 7 Ensayo de Enlace para IL-1 Zeta

IL-1 zeta de longitud completa puede ser expresada y probada por la capacidad para unir los receptores IL-1 zeta. El ensayo de enlace puede ser conducido como sigue.

Una proteína de fusión que comprende un péptido de cremallera de leucina fusionado al N-terminal de un polipéptido soluble IL-1 zeta (LZ-IL-1 zeta) se emplea en el ensayo. Una construcción de la expresión se prepara, esencialmente como se describe para la preparación de la construcción de la expresión -FLAG® (IL-1 zeta) en Wiley et al., Immunity, 3:673-682, 1995, por esto se incorpora por referencia, excepto que el ADN que codifica el péptido FLAG® se reemplaza con una secuencia que codifica un cremallera de leucina modificado que permite la trimerización. La construcción, en el vector de expresión pDC409, codifica una secuencia líder derivada de citomegalovirus humano, seguido por la fracción cremallera de leucina fundida con el N-terminal de un polipéptido IL-1 zeta soluble. La LZ-IL-1 zeta se expresa en células CHO, y se purifica del cultivo sobrenadante.

El vector de expresión designado pDC409 es un vector de expresión de mamífero derivado del vector pDC406 descrito en McMahan et al. EMBO J., 10:2821-2832, 1991, de esto se incorpora por referencia. Los rasgos adicionados al pDC409 (comparado con pDC406) incluyen sitios de restricción únicos adicionales en el sitio de clonación múltiple (mcs); tres terminaciones de codón (uno en cada marco de lectura) se posicionan en dirección 3´ corriente abajo del mcs; y una polimerasa promotor T7, en dirección 3´ del mcs, lo que facilita la secuenciación del ADN insertado en el mcs.

Para la expresión de proteína IL-1 zeta humano de longitud completa, la región codificada completa (i.e., la secuencia de ADN se presenta en la SEQ ID NO:1) se amplifica por la cadena de reacción de la polimerasa (PCR). La plantilla empleada en el PCR es el clon de cADN aislado de un banco de cADN (tumor pancreático), como se describe en el ejemplo 1. El ADN aislado y amplificado se inserta en el vector de expresión pDC409, para producir una construcción designada pDC409-IL-1 zeta.

El polipéptido LZ-IL-1 zeta se emplea para probar la capacidad de unión con las células huésped que expresan los receptores IL-1 zeta recombinante o endógeno, como se discute arriba. Las células que expresan el receptor IL-1 zeta se cultivan en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina, estreptomicina, y glutamina. Las células se incuban con LZ-IL-1 zeta (5 mg/ml) por aproximadamente 1 hora. Seguida la incubación, las células se lavan para retirar el LZ-IL-1 zeta no-ligado y se incuban con un anticuerpo monoclonal anti-LZ biotinilado (5 mg/ml), y estreptavidina conjugada con ficeritrina (1:400), antes del análisis por selección de célula activada por fluorescencia (FACS). El análisis citométrico se conduce en un FACscan (Beckton Dickinson, San Jose, CA).

Las células que expresan los receptores IL-1 zeta mostrarían enlace mejorado significativamente de IL-1=zeta, comparado con el control de células que no expresan los receptores IL-1 zeta.

Ejemplo 8 Identificación y Distribución Tisular de IL-1 Zeta y sus Variantes de Empalme, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3

La expresión de IL-1 zeta en varios tejidos humanos se examinó por RT PCR con cebadores IL-1 zeta específicos o por selección librerías de cADN con una sonda de ADN radiomarcada derivada de IL-1 zeta EST descrita en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla II.

En la Tabla II, "-" indica que en estos experimentos IL-1 zeta ARNm no se detectó en el tejido particular o la línea celular analizados. Dadas las limitaciones de los ensayos utilizados, se reconocerá que "-" indica solamente que IL-1 zeta no se detectó en un tejido particular en un experimento particular y no implica que IL-1 zeta nunca se exprese en ese tejido. Además, variando los patrones de expresión podrían ser explicados por diferentes lotes de material fuente de ARN que son utilizados para generar los paneles de tejido de cADN.

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Los resultados positivos se derivaron como sigue: "a", por análisis PCR de un panel de la primer cadena de cADNs (Clontech); "b", por selección de librería de cADN; "c", por la existencia de un EST; y "d", por análisis de PCR de un ARN individual. "e" indica que la expresión del gen se incrementó por la adición de LPS a las células. En la columna fuente para tejidos, "Agrupamiento" fue una mezcla de células B, testículo y pulmón fetal. En la columna fuente para líneas celulares humanas, "macrófago-1" fue THP-1, "macrófago-2" fue U937; "BM estroma" fue una línea celular estromal de médula ósea no publicada, IMTLH, derivado en Immunex; "Herat. Precoz" fue la línea precursor hematopoyética HL60; y "tumor panc." fue HPT-4.

Como se muestra en la Tabla, IL-1 zeta ARNm se detectó en nódulo linfa, timo, estroma médula ósea, pulmón, testículo y placenta humanos. Además, IL-1 zeta ARNm se detectó en líneas celulares macrófago humanas THP-1 y U937, línea celular precursor hematopoyética HL60, y línea celular tumor pancreático HPT-4.

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TABLA II

Fuente	IL-1 zeta
Tejido Humano
Bazo	-
Nódulo Linfa	a
Timo	a
Amígdala
Médula Espinal	a, b
Hígado Fetal
Leucocito
Corazón
Placenta	a
Pulmón	a
Hígado	-
Músculo Esquelético	-
Riñón	-
Páncreas	-
Tejido Humano
Próstata	-
Testículo	a
Ovario
Intestino Delgado
Colon
Tumor en Colon	c
Agrupamiento c

TABLA II (continuación)

Fuente	IL-1 zeta
líneas celulares Humanas
macrófago-1	d
macrófago-2	d, e
Estroma BM	d
Hemat. Precoz	d
Tumor Panc.	b

La distribución tisular de IL-1 zeta también se comparo con la distribución tisular de Tango-77 (WO 99/06426), alternativamente una forma de empalme de IL-1 zeta, utilizando RT PCR. Los cebadores utilizados en el RT PCR fueron cebadores 5’ específicos para ya sea el primer exón de Tango-77-(exón (1) en la Figura 1) o el primer exón de IL-1 zeta (exón (3) en la Figura 1) en combinación con un cebador 3’ común derivado del exón terminal común (exón (6) en la Figura 1). Las reacciones PCR se desarrollaron utilizando primero la cadena cADN de las fuentes de tejido humano múltiple adquirido de Clontech, Palo Alto, productos PCR CA del tamaño predicho así como se detectaron varios productos PCR adicionales de un diferente tamaño. Tres productos PCR de diferentes tamaños al tamaño predicho se aislaron y utilizados para obtener una información de secuencia de cADNs de tejido múltiple. El aislamiento y la caracterización de estos productos PCR revelaron tres variantes de empalme IL-1 zeta novedosos. La secuencia de ácidos nucleicos de estas variantes de empalme se representaron por la SEQ ID NO: 5, 6, y 7, que codifica la secuencias de aminoácido representados por la SEQ ID NOS: 8, 9, y 10, respectivamente. La organización y la relación de estas variantes de empalme se muestran en la Figura 1.

Las variantes de empalme se designaron TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3 (variantes Zeta Derivada de Testículo) porque cada una de ellas se expresa en el testículo. El testículo es un tejido de expresión común, sin embargo; no es el único tejido de expresión. La Tabla III muestra los resultados de un estudio de tejido de expresión para IL-1 zeta, Tango-77, TDZ.1, TDZ.2, y TDZ.3. TDZ.1 y TDZ.2 contiene los exones 4, 5, y 6, mostrados en la Figura 1, que corresponden a los tres últimos exones de IL-1 zeta y corresponden al dominio estructural conservado de la molécula. Cuando se alinea con otros miembros de la Familia IL-1, los exones 4, 5, y 6 muestran que contienen muchos residuos conservados dentro de los motivos estructurales conservados.

Un poliformismo de Tango 77 en el exón (2) de la Figura 1 se registra. En el cADNs aislado una valina ocurre en lugar de una glicina en el tercer residuo del exón (2). En la secuencia Tango-77, la secuencia de aminoácido es PAGSPLEP (SEQ ID NO: 14). En el poliformismo la secuencia es PAVSPLEP (SEQ ID NO: 15).

TABLA III Distribución tisular de IL-1 zeta y de las variantes de empalme IL-1 zeta

Tejido	IL-1z	Tango-77	TDZ.1	TDZ.2	TDZ.3
Riñón	-	-	+	-	-
Páncreas	-	-	-	-	-
Músculo esquelético	-	-	+	-	-
Corazón	-	+	-	-	-
Testículo	+	+	+	+	+
Próstata	+	-	+	-	-
Bazo	-	-	-	-	-
ovario	-	+	+	-	-
timo	-	-	-	-	-

TABLA III (continuación)

Tejido	IL-1z	Tango-77	TDZ.1	TDZ.2	TDZ.3
colon	+	+	+	-	-
leucocitos	-	-	-	-	-
intestino delgado	-	+	+	-	-
hígado	-	+	+	-	-
cerebro	+	-	-	-	-
placenta	+	+	+	-	+
pulmón	+	+	+	-	+
amígdala	-	+	+	-	-
hígado fetal	+	+	+	-	-
nódulo linfa	+	+	+	-	-
médula ósea	-	+	+	+	+

Ejemplo 9 Señalización de la Actividad de Xrec2

Un Xrec2 de longitud completa se clonó en el vector de expresión pDC304. El vector resultante y un plásmido reportero de luciferasa NF_{K}B-conducido se utilizaron para la transfección de las células COS7 por el método DEAE-Dextran como se describe previamente en Born et al., J. Biol. Chem., 273: 29445-29450, 1998, por esto se incorpora por referencia. Cuando las células transfectadas se estimularon por 4 horas con IL-1\alpha (10 ng/ml), IL-1\beta (10 ng/ml), o hIL-18 (40 ng/ml), no se detectó actividad de luciferasa.

Muchos miembros conocidos de la familia IL-1R son receptores huérfanos para los cuales no han sido identificados ligandos análogos conocidos. Ejemplos de tales receptores huérfanos incluyen IL-1Rrp2, T1/ST2 y SIGIRR. Muchos de estos receptores huérfanos pueden, sin embargo, mediar la activación transcripciónal en la respuesta para IL-1, cuando se expresa como moléculas quiméricas con la IL-1R extracelular y los dominios (IL-1Rextm) transmembrana fundidos con el dominio citoplasmático del receptor huérfano. Por ejemplo, una quimera IL-1Rextm que contiene el dominio citoplasmático de T 1 /ST2 es capaz de mediar la activación transcripciónal en respuesta a la estimulación de IL-1, como se esquematiza en Mitcham et al., J. Biol. Chem., 271: 5777-5783, 1996, por esto se incorpora por referencia.

Para probar la habilidad de Xrec2 para mediar la activación transcripciónal en la respuesta para IL-1, el dominio citoplasmático de Xrec2 (Xrec2cyto) (los aminoácidos 382-696 de la SEQ ID NO: 4) se expresa como una molécula quimérica con IL-1Rextm. El IL-1 Rextm-Xrec2cyto quimérico se sobre expresó en las células COS7 conjuntamente con un plásmido reportero luciferasa NF_{K}B-conducido, según se describe arriba. Siguiendo con la estimulación IL-1 de estas células, no se detectó la actividad de luciferasa. Como un control, IL-1R de longitud completa se sobre expresó en las células COS7, y se observó la inducción de la actividad transcripciónal en respuesta a la estimulación de IL-1 en estas células.

El experimento se repitió utilizando un receptor quimérico IL-1Rextm-Xrec2cyto con una cola citoplásmica truncada (aminoácidos 382-573 de la SEQ ID NO: 4). Otra vez, el receptor quimérico fue no-sensible a IL-1 en estos ensayos, indicando que diferente de algunos otros miembros de la familia IL-IR, el dominio citoplasmático de Xrec2 no media la transducción de señal a través de NF_{K}B.

Otros miembros de la familia receptor IL-1 funcionan como las subunidades accesorio, similares a la IL-1 R AcP, que es un componente de señalización requerido del tipo I IL-1R. Para evaluar si las funciones Xrec2 como una subunidad accesorio del receptor IL-1, se crearon una serie de receptores quiméricos. El dominio citoplasmático de cada miembro de la familia IL-1R prototípico identificado se fundió a los dominios extracelular y transmembrana de IL-1R y AcP, resultando en un panel de siete quimeras IL-1R y siete quimeras AcP. Las quimeras IL-1R y AcP se co-expresaron en todas las combinaciones posibles en una línea celular de linfoma murina célula T (S49.1) por electroporación, junto con un plásmido reportero de luciferasa NF_{K}B-conducido. Dos días después de la electroporación, las células se estimularon con IL-1\alpha (10 ng/ml) o IL-1 \beta (10 ng/ml) por 4 horas, y la actividad de luciferasa se evaluó, según se describe previamente en Bom et al., J Biol. Chem., 273: 29445-29450, 1998. Normalmente, las células S49.1 son no-sensibles a IL-1. Sin embargo, bajo la sobre expresión transitoria de IL-1R y AcP, Las células S49.1 se convierten en IL-1 sensibles. Mientras que otras moléculas similares a AcP cooperan en este sistema con otras moléculas similares a IL-1R para conferir la sensibilidad a IL-1 para las células 549.1, Xrec2 no lo hizo así ya sea una IL-1R o una quimera AcP.

<110> Sims. John E.

\hskip1cm Born. Teresa L.

\hskip1cm Smith, Dirk E.

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<120> VARIANTES DE EMPALME IL-1 ZETA, IL-1 ZETA Y ADNS XREC2 Y POLIPÉPTIDOS

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<130> 03260.0088-00304

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<140>

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<141>

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<150> 60/112,163

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<151> 1998-12-14

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<150> 60/146.675

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<151> 1999-11-10

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<160> 15

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<170> Patente En Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 579

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

12

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<210> 2

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<211> 2091

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

13

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<210> 3

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<211> 192

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

14

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<210> 4

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<211> 696

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

15

16

17

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<210> 5

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<211> 657

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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18

180

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<210> 6

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<211> 594

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

19

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<210> 7

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<211> 474

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

20

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<210> 8

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<211> 218

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

21

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<210> 9

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

22

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<210> 10

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<211> 157

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 10

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23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido antigénico utilizado en proteínas de fusión

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<400> 11

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\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

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<210> 12

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: polipéptido cremallera de leucina

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<400> 12

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\sa{Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln}

\sac{Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile}

\sac{Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu}

\sac{Arg}

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<210> 14

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia polimórfica del exón 2 de Tango 77

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<400> 14

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\sa{Pro Ala Gly Ser Pro Leu Glu Pro}

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<210> 15

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia polimórfica del exón 2 de Tango 77

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<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ala Val Ser Pro Leu Glu Pro}

Claims

1. Un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de

(a): un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 3;

(b): un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 8;

(c): un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 9;

(d): un polipéptido que es al menos 95% idéntico a un polipéptido de a) o c), en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL- 1R; y

2. Un polinucleótido aislado como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la molécula del ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 6.

3. Un polinucleótido aislado como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 es el aminoácido 52.

4. Un polinucleótido aislado como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 es el aminoácido 31.

5. Un polipéptido aislado que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de

(a): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 3;

(b): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 8;

(c): un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 9;

(d): un polipéptido que es al menos 95% idéntico a un polipéptido de a)-c), en donde el polipéptido se une a un miembro de la familia IL-1 R,

(e): un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 3 cuyo aminoácido N-terminal es seleccionado de los aminoácidos 21-51 y cuyo aminoácido C-terminal es seleccionado de los aminoácidos 188-192 y que se une a un miembro de la familia IL-IR, en donde el fragmento no pertenece a los aminoácidos 24-192, 28-192 o 34-192 de la SEQ ID NO: 3;

6. Un polipéptido aislado como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 8 es el aminoácido 52.

7. Un polipéptido aislado como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el aminoácido N-terminal del fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 9 es el aminoácido 31.

8. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de la reivindicación 8.

10. Un método para la preparación de un polipéptido, el método que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 9 bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido.

11. Un polipéptido oligomérico que comprende un polipéptido de la reivindicación 5, 6 o 7.

12. Un anticuerpo que se une a un polipéptido de la reivindicación 5, 6, 7 o 11.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.